JPH10505481A

JPH10505481A - メラノーマ抗原

Info

Publication number: JPH10505481A
Application number: JP7527821A
Authority: JP
Inventors: カワカミ，ユタカ; ローゼンバーグ，スティーブン・エイ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 1998-06-02
Also published as: EP0756604A1; WO1995029193A3; JP2006075161A; US20080289055A1; US7749719B2; US7763586B2; EP1630229A3; AU706443B2; EP1630229B1; US20080292647A1; US20030144482A1; US6537560B1; FI964235A0; JP4494315B2; US6965017B2; US20070254844A1; WO1995029193A2; CA2188432C; US7232887B2; FI121710B

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｔリンパ球により認識されるＭＡＲＴ−１と命名されたメラノーマ抗原をコードする核酸配列を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸配列、タンパク質または抗体を用いて、メラノーマまたは転移メラノーマにかかっている哺乳類を診断、評価または予後診断するためのバイオアッセイに関する。本発明はさらに、ＭＡＲＴ−１に由来する免疫原性ペプチドおよびｇｐ１００と命名された第二メラノーマ抗原も提供する。本発明はさらに、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原またはｇｐ１００抗原に由来し、免疫原性を高めるように修飾された免疫原性ペプチドも提供する。提供されたタンパク質およびペプチドは、メラノーマの予防または治療のための免疫原として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】メラノーマ抗原本出願は、米国特許出願０８／２３１，５６５（１９９４年４月２２日出願）の一部継続出願であり、ここにその全体を参照として取り入れる。発明の分野本発明は、ヒトの癌の予防および治療の分野内にある。より具体的には、本発明は、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原をコードする遺伝子、およびそれらに関連するタンパク質、ならびにこれらの遺伝子またはタンパク質を用いての予防、診断および治療への適用に関する。発明の背景メラノーマは、メラニン細胞またはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかから誘導される、攻撃的な、時として転移性の腫瘍である（”ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．、Ｌｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．編；Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４１）。メラノーマは全皮膚癌のおおよそ３％近くに達し、メラノーマの世界的増加は、女性の肺ガンを除く他のいかなる新生物も及ばない（”ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．、Ｌｅｃｈｔｉｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．編、Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４１；ＫｉｒｋｗoｏｄおよびＡｇａｒｗａｌａ、１９９３、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，７：１−１６）。メラノーマは、明らかに皮膚に局在している場合でさえ、最大で３０％の患者は、将来、全身に転移し、その大部分は死に至るであろう（ＫｉｒｋｗｏｏｄおよびＡｇａｒｗａｌａ、１９９３、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，７；１−１６）。メラノーマ治療の古典的様式には、外科手術、放射線および化学療法が含まれる。過去十年間では、免疫療法および遺伝子治療が、メラノーマ治療の新しい可能性のある方法として現れてきた。Ｔ細胞は、最多数のネズミ腫瘍モデルで腫瘍の退縮に重要な役割を演じている。単一の癌抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）は、多くのネズミ腫瘍から分離することができる。これらＴＩＬ＋インターロイキン２の適切な運搬は、確立された肺および肝臓への転移の退縮を仲介することが出来る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１３１８−１３２１）。さらに、ＴＩＬを注射することによるＩＦＮ−γの分泌は、腫瘍抗原によるＴ細胞の活性化を示唆し、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）でのネズミ腫瘍の退縮と明らかな相関を示す。（Ｂａｒｔｈ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：６４７−６５８）。腫瘍ＴＩＬを、転移性メラノーマ患者内に養子移入した場合、メラノーマ患者の３５から４０％の転移癌の退縮を仲介することが知られており、このＴＩＬの能力は、抗原を認識することの臨床上の重要性を証明している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８８、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，３１９：１６７６−１６８０；ＲＯｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：１８０−１９９）。ＣＢ８⁺Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターは、抗原性ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２の場合９−１０アミノ酸）、β−２ミクログロブリンおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ型重鎖（ヒトではＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）からなる複合体を認識する。内在的に合成されたタンパク質の消化によって生成したペプチドは、小胞体に輸送され、ＭＨＣ−Ｉ型重鎖およびβ２ミクロブロブリンと結合し、最終的に、細胞表面のＭＨＣ−Ｉ型の分子の溝に発現する。それ故、Ｔ細胞は、細胞表面上に発現した完全な分子を検出する抗体とは対照的に、細胞の内側のタンパク質を起源とする分子を検出することが出来る。それ故、Ｔ細胞によって認識される抗原は、抗体によって認識される抗原より、より有用であろう。癌に対する免疫応答がヒトに存在することの強力な証拠は、メラノーマ沈積物中にリンパ球が存在することによって提供される。これらのリンパ球は、分離すると、ＭＨＣ制限的に、自己のおよび同種移植のメラノーマに特異的な腫瘍抗原を認識する能力を持つ（Ｉｔｏｈ，Ｋ．ら、１９８６、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４６：３０１１−３０１７；Ｍｕｕｌ，Ｌ．Ｍ．ら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：９８９−９９５；Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３７１４−３７２５；Ｄａｒｒｏｗ，Ｔ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３３２９−３３３５；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１０：１５３−１６４；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：６３８−６４３；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１３：１８−３０；Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｂ．Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：１４１０−１４１８）。転移メラノーマ患者からのＴＩＬは、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）でメラノサイト−メラノーマ系に特異的な組織抗原を含む共有抗原を認識する（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１４：８８−９３；Ａｎｉｃｈｉｎｉ，Ａ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：９８９−９８８）。抗メラノーマＴ細胞は、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）では、おそらく腫瘍部位でのクローン拡張および蓄積の結果として、ＴＩＬ中に多く存在すると思われる（Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１２３１−１２４６）。多くのメラノーマ患者がこれらの腫瘍に対して細胞性応答および体液性応答を装備しているという事実、ならびにメラノーマがＭＨＣ抗原および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方を発現しているという事実は、メラノーマ患者を免疫治療するためには、さらなるメラノーマ抗原の同定および特徴付けが重要であることを示唆している。末梢血液リンパ球は、メラノーマ腫瘍抗原と思われる抗原の同定に用いられた。ＶａｎＤｅｒＢｒｕｇｇｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７は、生体内で変異誘発腫瘍細胞を用いて繰り返し免疫化した患者の末梢血液で確認されたＴ細胞クローンを用いて、ＭＡＧＥ−１と呼ばれるメラノーマ抗原をコードする遺伝子の特徴を調べた。メラノーマ患者の末梢血液リンパ球から誘導された細胞毒性Ｔ細胞は、抗原ペプチドをコードするＭＡＧＥ− １の同定に用いられた（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ，Ｃ．ら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１４５３−１４５７）。また、Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９−４９５は、生体外で、腫瘍で繰り返し刺激することによって感受性になった患者の末梢血液リンパ球を用いて、チロシナーゼと呼ばれるメラノーマ抗原をコードする遺伝子の特徴を調べた。さらに、メラノーマ抗原の治療への可能性の確認は、Ｂｒｏｗｎら（米国特許第５，２６２，１７７号）によって提供されている。Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，２６２，１７７号は、組換え体ワクシニアウイルスを基礎としたメラノーマワクチンに関し、この中で、メラノーマ抗原ｐ９７はネズミモデルで腫瘍細胞の挑戦を予防する効果を示すと報告している。さらなるメラノーマ抗原の特徴を調べることは、癌、特にメラノーマ、の免疫療法の新規戦略の開発のために重要である。発明の概要本発明は、一般的には、Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原をコードする核酸配列（ＭＡＲＴ−１）、ならびにこれらの配列によってコードされるタンパク質およびペプチドに関する。さらに、本発明は、これらの核酸配列、タンパク質およびペプチドのバイオアッセイを提供する。また、本発明は、ＭＡＲＴ−１アミノ酸配列より誘導され、それらの免疫原性を増強するように修飾したペプチドを提供する。また、本発明は、ここに記載された核酸配列、タンパク質、ペプチドまたは修飾ペプチドの治療への使用を、提供する。本発明の一般的な目的は、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原をコードする、実質的に精製され分離された核酸配列を提供することにある。本発明のその他の目的は、ベクターおよびＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全体または部分からなる組換え分子を提供することにある。本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全体または部分によってコードされる組換えタンパク質を作り出すことにある。本発明のさらなる目的は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドまたはその部分と反応するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供することにある。本発明の目的は、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１遺伝子またはＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡを検出する方法を提供することにある。本発明のその他の目的は、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドを検出する方法を提供することにある。本発明の目的は、ヒトの病気、特にメラノーマおよび転移性メラノーマ、の診断法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列の全部または部分およびその関連タンパク質またはＭＡＲＴ−１アミノ酸配列より誘導したペプチドからなる、予防的または治療的使用方法を提供することにある。また、本発明の目的は、ＭＡＲＴ−１をコードする核酸配列全体あるいは部分またはその関連タンパク質からなる、メラノーマを予防または治療するための、メラノーマワクチンを提供することからなる。本発明のさらなる目的は、ワクチンに用いるための、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列より誘導した免疫原性ペプチドを提供することにある。本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導したペプチドの免疫原性を増加させる、またはそれらペプチドのＭＨＣ分子との結合を強化することによって抗メラノーマ免疫応答の誘発を強化するように修飾した、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列誘導ペプチドを、ここに記載したような予防的または治療的方法に用いるために、提供することにある。さらに、本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体あるいは部分またはその関連タンパク質あるいはペプチド、および哺乳類動物内でメラノーマ抗原に対する抗体の生成を促進する能力を持つ少なくとも一つの免疫原性分子を提供することにある。本発明のその他の目的は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体あるいは部分またはその関連タンパク質を遺伝子治療の処方箋に従って用いて、メラノーマを予防または治療する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、ワクチンに用いるための、ｇｐ１００メラノーマ抗原タンパク質配列から誘導した免疫原性ペプチドを、提供することにある。本発明のさらなるその他の目的は、ｇｐ１００メラノーマ抗原配列から誘導されたペプチドの免疫原性を増加させる、またはＭＨＣ分子との結合を強化することによって抗メラノーマ免疫応答の誘発を強化するように修飾したｇｐ１００メラノーマ抗原誘導ペプチドを、ここに記載したような予防的治療的方法に用いるために、提供することにある。本発明のさらなるその他の目的は、ここに記載したワクチンを用いた、メラノーマの予防的治療的免疫化法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、免疫治療のための潜在的標的を構成するであろうメラノーマ抗原を同定する方法を提供することにある。本発明のさらなるその他の目的は、免疫療法に用いるための、ＭＡＲＴ−１配列またはｇｐ１００配列のいずれかより誘導した免疫原性ペプチド候補を同定する方法を提供することにある。図面の簡単な説明図１は、ＭＡＲＴ−１抗原をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す。疎水性領域を下線で示す。図２および２Ｂは、ＴＩＬによって認識されるＭＡＲＴ−１ペプチドの滴定について示している。Ｔ２細胞を、様々な濃度の精製ＭＡＲＴ−１ペプチド、Ｍ９ −１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−３、Ｍ１０−４およびＭ１０−５と共にインキュベーションし、ＴＩＬクローンＡ４２（図２Ａ）またはＴＩＬ細胞系ＴＩＬ１２３５（図２Ｂ）による溶解を、Ｅ（エフェクター）：Ｔ（標的）比をＡ４２では２０：１、ＴＩＬ１２３５では４０：１として、４ｈ−⁵¹Ｃｒ遊離細胞毒性アッセイによって測定した。ペプチドＭ９−２は、１ｎｇ／ｍｌの濃度でＴ２細胞を感受性にした。精製したペプチドＭ１０−４は、ＴＩＬ１２３５によって認識されたが、Ａ４２によっては認識されなかった（Ｍ９−１｜−｜、Ｍ９− ２ ●−●、Ｍ９−３ ■−■、Ｍ１０−２ ▲−▲、Ｍ１０−３ ▼−▼、Ｍ１０−４ ■−■、Ｍ１０−５＋−＋）。図３Ａは、自己由来の¹¹¹Ｉｎ標識ＴＩＬ１２００の養子移入を受け入れた後の転移性メラノーマ患者１２００の放射性核種走査を示す。矢印は、左腿の転移病巣に該当するＴＩＬ蓄積領域の一つを示す。図３Ｂは、ＴＩＬ１２００＋ＩＬ−２での治療の後の皮下の転移腫瘍の退縮を示す。治療は０日に開始した。図４Ａおよび４Ｂは、ｃＤＮＡ２５の全長の核酸配列を示す。開始コドンおよび停止コドンを下線で示す。図５Ａは、ｃＤＮＡ２５の全長のアミノ酸配列を示す。抗原性ペプチドを下線で示す。図５Ｂは、全長のｃＤＮＡ２５（ｃＤＮＡ２５ＦＬ）、端を切り取った形のｃＤＮＡ２５（ｃＤＮＡ２５ＴＲ）、Ｐｍｅ１１７、ＭＥ２０およびｇｐ１００のアミノ酸配列の比較を示す（・は欠損を示し；−は同一を示す）。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、メラノーマ（図６Ａ）および新生児メラノサイト細胞系（図６Ｂ）および様々な新鮮組織（図６Ｃ）（１０−２０μｇの全ＲＮＡ）と、ｃＤＮＡ２５プローブ（ｐＣＲＩＩ−ｃＤＮＡ２５のＳａｌＩ消化フラグメント）およびβ−アクチンプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とのノーザンブロット分析を示す。Ｃ３２、５８６ｍｅｌメラノーマ細胞系およびＮＨＥＭ５２９、ＮＨＥＭ５３０新生児メラノサイト細胞系は、非常に弱い陽性であった。図７Ａ−７Ｂは、ｇｐ１００エピトープおよびエピトープ分析で試験したＤＮＡフラグメントの位置ならびにＣＴＬによる認識を示す。図７Ａ；エピトープ分析で試験した５つのＤＮＡフラグメント（Ｄ３、Ｄ５、Ｄ４、Ｃ４、２５ＴＲ）を示す（−−−、同一アミノ酸）。同定されたエピトープの位置を下線で示す。図７Ｂ；ＩＦＮ−γ分泌アッセイによって、ＨＬＡ−Ａ２．１ｃＤＮＡと共に、ｐｃＤＮＡ３プラスミド中のそれぞれのＤＮＡフラグメントを移入したＣＯＳ７細胞のＣＴＬ（６２０−１、６２０−２、６６０−１、１１４３、１２００）による認識を示す（＋、認識；−、非認識）。図８Ａ−８Ｄは、ＣＴＬ溶解に対してＨＬＡ−Ａ２．１＋Ｔ２細胞を増感させることによるｇｐ１００の滴定を示す。ペプチドと共に前もってインキュベーションしたＴ２細胞の溶解は、４ｈ⁵¹Ｃｒ遊離細胞毒性アッセイで試験した。図８Ａ；Ｇ９₁₅₄（■）またはＧ１０₁₅₄（●）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ１２００による溶解。図８Ｂ；Ｇ９₂₀₉（■）またはＧ１０₂₀₈（●）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６２０による溶解。図８Ｃ；Ｇ９₂₈₀（ ■）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６６０−１による溶解。図８Ｄ；Ｇ１０−５（■）と共にインキュベートしたＴ２細胞のＴＩＬ６６０−２による溶解。発明の詳細な説明本発明をより完全に理解するために、以下の定義をここに記載する。核酸配列は、これに限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。ここで用いられる核酸配列は、分離精製した核酸配列をさす。ＭＡＲＴ−１メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ＭＡＲＴ−１遺伝子の生成物である一つあるいはそれより多くのＲＮＡ転写物をさす。ここで用いられている実質的に相同とは、図１に示すＭＡＲＴ−１核酸配列（配列番号：１）と任意のその他の核酸配列のそれとの間の実質的な一致をさす。実質的に相同とは、ＭＡＲＴ−１配列とその他の任意の核酸配列のそれとの間で、約５０−１００％の相同の相同性、望ましくは約７０−１００％の相同性、もっとも望ましくは約９０−１００％の相同性を意味する。さらに、ここで用いられる実質的に相同とは、図１に示すＭＡＲＴ−１抗原のアミノ酸配列（配列番号：２）と任意のその他のアミノ酸配列のそれとの間の実質的な一致をもさす。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む、異なる種に記載される組織適合性抗原のシステムを包括して意味する一般的な名称である。メラノーマという言葉は、限定するわけではないが、黒色腫（メラノーマ）、転移性黒色腫、メラニン細胞（メラノサイト）またはメラニン細胞関連母斑細胞のいずれかから誘導された黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、本来の位置（ｉｎｓｉｔｕ）の黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性ほくろ黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫、侵襲性黒色腫、または家族性非定型色素母斑−黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を含む。哺乳動物のそのような黒色腫は、染色体異常、退行性成長発達障害、分裂促進剤、紫外線照射（ＵＶ）、ウイルス感染、遺伝子の不適切組織での発現、遺伝子発現の変化、または発癌剤に原因を有する場合もある。前述の黒色腫は、本出願に記載した方法に従って、診断、評価または治療することが出来る。非定型色素母斑とは、異常かつ前癌状態の特徴を持つ色素母斑を意味する。黒色腫抗原または免疫原とは、哺乳動物中の細胞性あるいは体液性免疫応答の原因となりうる、ＭＡＲＴ−１タンパク質のすべてあるいはその部分またはＭＡＲＴ−１タンパク質配列を基礎としたペプチド、を意味する。そのような抗原はまた、ＭＡＲＴ−１タンパク質（配列番号：２）のすべて、一部または複数の部分を用いて免疫化された動物の抗体と反応するであろう。そのようなタンパク質またはペプチドは、本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列のすべてまたは部分によってコードされるであろう。免疫原性ペプチドとは、哺乳動物中で細胞性あるいは体液性免疫応答の原因となりうる、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導されたペプチドまたはｇｐ１００タンパク質配列、を意味する。そのようなペプチドは、ペプチドで免疫化された動物の抗体と反応するであろう。そのようなペプチドは、アミノ酸の長さが、約５−２０、望ましくは約８−１５、最も望ましくは約９−１０、である。当業者は、本発明のバイオアッセイが任意の脊椎動物種の生体サンプルまたは組織の分析に用いうることを理解するであろう。望ましい実施態様では、哺乳類の生体サンプルまたは組織が分析される。組織は、単細胞、器官全体およびその部分を含むが、これらに限定されるわけではない。生体サンプルは、組織、哺乳動物組織の初代培養、生体組織検査（生検）検体、病理検体、および検死検体を含むが、これらに限定されるわけではない。哺乳動物は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、ブタ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびヤギを含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、Ｔ細胞によって認識される、新規のメラノーマ抗原をコードする核酸配列を提供する。この新規のメラノーマ抗原は、ＭＡＲＴ−１（ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴ−ｃｅｌｌｓ−１）と呼ぶ。ＭＡＲＴ−１は、いかなる既知のメラノーマ抗原とも意味のある相同性を示さず、それ故新しいメラノーマ抗原であると言える。ＭＡＲＴ−１抗原は、アミノ酸２７−４７（配列番号：２）とそれに続く３つのアルギニン残基からなる高疎水性領域を含み、この配列はトランスメンブレンタンパク質を示唆している。タンパク質全体とは明らかな相同性は存在しなかったが、以前にネズミのナチュラルキラー細胞表面タンパク質ＮＫＲ−Ｐ１（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３２２９−３２３６）として認知された、ＩＩ型膜タンパク質と３７％の同一性を示す、２７のアミノ酸からなるセグメント（アミノ酸５７−８３；配列番号：２）が存在する。ＭＡＲＴ−１は、多くのＩ型膜タンパク質の特徴であるリーダータンパク質を含まない（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｊ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，６：２４７−２９６）。ＭＡＲＴ−１ＲＮＡの発現は、新しい培養したメラノーマおよびメラノサイト細胞系およびヒト網膜に限定されるようであり、この発現は、試験したその他のいかなる新しいまたは培養した組織またはその他の腫瘍組織にも見出されなかった。ＭＡＲＴ−１のｃＤＮＡ配列は、図１（配列番号：１）に示す。また、予想されるＭＡＲＴ−１タンパク質のアミノ酸配列を、図１（配列番号：１）に示す。図１（配列番号：１）に示すＭＡＲＴ−１の核酸配列は、本発明の望ましい実施態様を表している。しかしながら、遺伝子コードの縮重によって、図１（配列番号：１）に示すｃＤＮＡ配列を変化させても、依然として、ＭＡＲＴ−１タンパク質抗原をコードすることの出来るＤＮＡ配列が結果として得られるであろうことは、当業者に理解される。それ故、そのようなＤＮＡ配列は、図１（配列番号：１）に示した配列と機能的に等価であり、本発明の内に包括されるであろう。さらに、当業者は、図１（配列番号：１）に示すＭＡＲＴ−１核酸配列が与えられた種の中で対立遺伝子変化を自然に起こすことを理解するであろう。これらの変化もまた、本発明によって取り込まれるであろう。予想されるＭＡＲＴ−１抗原は、約１３Ｋｄの１１８アミノ酸からなるタンパク質である。本発明は、さらに、本発明のＭＡＲＴ−１抗原またはタンパク質と実質的に同一の機能を持つ、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドまたはその類似体を含む。そのようなタンパク質またはポリペプチドは、タンパク質のフラグメント、またはＭＡＲＴ−１タンパク質の置換、付加、あるいは欠損変異体を含むが、これらに限定されるわけではない。また、本発明は、ＭＡＲＴ−１抗原と実質的に相同であるタンパク質またはペプチドを包含する。実質的に相同とは、ＭＡＲＴ−１と任意のその他のアミノ酸配列またはタンパク質またはペプチドとの間の、約５０−１００％の相同性、望ましくは約７０−１００％の相同性、最も望ましくは約９０−１００％の相同性を意味する。「類似体」という言葉は、具体的にここに示したＭＡＲＴ−１配列（図１、配列番号：１）と実質的に同一なアミノ酸残基配列を持つ任意のポリペプチドであって、その一つまたはそれより多くの残基が機能的に同様の残基と保存的に置換され、かつここに記載したようなＭＡＲＴ−１抗原の機能的態様を示している、前記のポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基の一つをそれ以外の非極性残基と置換すること、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間、のように、極性（親水性）残基の一つをもう一つと置換すること、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような塩基性残基の一つをそれ以外の塩基性残基と置換すること、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性残基の一つをそれ以外の酸性残基と置換することが含まれる。また「保存的置換」という句は、非誘導残基の代わりに化学的に誘導した残基を用いることを含む。「化学的誘導体」とは、官能基側鎖の反応によって化学的に誘導した一つまたはそれより多くの基を持つ従属ポリペプチドをさす。そのような誘導分子の例としては、例えば、遊離アミノ基を誘導して、アミン塩酸塩、ｐ−トルエン硫酸基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するようなそれらの分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導して、塩、メチルおよびエチルエステルあるいはその他の型のエステルまたはヒドラジンを形成させても良い。遊離水酸基を誘導して、ｏ−アシルまたはｏ−アルキル誘導体を形成させても良い。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成させても良い。また、化学誘導体としては、２０の標準アミノ酸の一つあるいはそれより多くの自然発生アミノ酸誘導体を含む、タンパク質またはペプチドを含む。例えば：４− ヒドロキシプリンはプリンと置換されて良く；５−ヒドロキシリジンはリジンと置換されて良く；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されて良く；ホモセリンはセリンと置換されて良く；またオルニチンはリジンと置換されて良い。また、必要な活性が維持される限り、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、その配列がＭＡＲＴ−１のＤＮＡにコードされるポリペプチドの配列と関連する、一つあるいはそれより多く残基の付加および／または欠損を持つ任意のポリペプチドを含む。また、本発明は、ＭＡＲＴ−１核酸配列（配列番号：１）の全体または部分およびベクターからなる組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明で用いるに適した発現ベクターは、核酸配列に機能しうるように結合させた少なくとも一つの発現制御エレメントからなって良い。発現制御エレメントは、ベクター中に挿入され、核酸配列の発現を調節制御する。発現調節エレメントの例として、ｌａｃシステム、ファージラムダのオペレータおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レロトウイルスまたはＳＶ４０から誘導したプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、望ましいまたは必要とされる機能エレメントには、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主システム中で核酸配列を適切に転写し次いで翻訳するに必要なまたは望ましいその他の任意の配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当業者は、必要または望ましい発現調節エレメントの適切な組み合わせは、選択した宿主のシステムに依存することを理解するであろう。さらに、発現ベクターは、宿主システム中で核酸配列を含む発現ベクターを伝達し次いで複製するに必要なエレメントをさらに含むべきであることを、理解するであろう。そのようなエレメントの例としては、複製起源および選択マーカーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、当業者は、そのようなベクターが従来の方法を用いて容易に構築される（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、または商品として入手できることを理解するであろう。本発明のその他の態様は、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を含む組換え発現ベクターが挿入された宿主生物体に関する。本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列で形質転換される宿主細胞には、動物、植物、昆虫および酵母細胞のような真核生物、ならびに大腸菌のような原核生物が含まれる。遺伝子を運ぶベクターを細胞中に導入する手段としては、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムあるいはその他の当業者に既知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いたマイクロインジェクション、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、形質導入（トランスダクション）、またはトランスフェクションが含まれるが、これらに制限されるわけではない。望ましい実施態様では、真核生物細胞内で機能する真核生物発現ベクターが用いられる。そのようなベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、細菌発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなプラスミド、またはバキュウロウイルス伝達ベクターが含まれる。望ましい真核生物細胞系には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状突起細胞、または単核細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。特に望ましい実施態様では、組換えＭＡＲＴ−１タンパク質発現ベクターは、ＭＡＲＴ−１タンパク質に固有なプロセシングおよび修飾を確実にするために、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状突起細胞、または単核細胞のような哺乳動物細胞に導入される。別の実施態様では、ＭＡＲＴ−１ＤＮＡが、ＣＯＳ７（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、１９８１、Ｃｅｌｌ，２３：１７５−１８２）中に導入される。適当な細胞の選択は、当業者の内にある。ある実施態様では、発現した組換えＭＡＲＴ−１タンパク質は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を用いたコマジブルー染色およびウエスタンブロッティングを含むこの技術分野で既知の方法に従って、検出されるであろう。さらなる実施態様では、宿主細胞によって発現した組換えタンパク質は、粗溶解物として得られるか、または分別沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティーおよび免疫親和性クロマトグラフィーおよびその類似物などを含む、この技術分野で既知の標準的なタンパク質精製法によって精製することが出来る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。免疫親和性クロマトグラフィーの場合には、組換えタンパク質は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を結合させた樹脂を含むカラムを通過させることによって精製されるであろう（Ａｕｓｅｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。本発明の核酸配列またはその部分は、正常なおよび病的な組織中でのＭＡＲＴ −１遺伝子発現を検出するプローブとして有用である。それ故、本発明のその他の態様は、（ａ）本発明の核酸配列の全体または部分を、生体サンプルと、核酸配列とメッセンジャーＲＮＡとの間で複合体を形成させるような条件下で、接触させ、（ｂ）該複合体を検出し、さらに（ｃ）該メッセンジャーＲＮＡのレベルを定量する：段階からなる、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを検出するバイオアッセイに関する。ＲＮＡは、細胞全体のＲＮＡとして、またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡとして分離することが出来る。細胞全体のＲＮＡは、当業者に既知のいろいろな方法によって分離できる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。そのような方法には、分別沈殿によるＲＮＡ抽出（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．、１９８８、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６：１４８７−１４９７）、有機溶媒によるＲＮＡ抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９）、および強変性剤によるＲＮＡ抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９）が含まれる。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ａｖｉｖ，Ｈ．ら、１９７２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８−１４１２）によって、全細胞ＲＮＡから選択することが出来る。段階（ｃ）の細胞内メッセンジャーＲＮＡレベルを定量する方法の例としては、これに限られるわけではないが、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．ら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５０−５３５４）、ドットスロット −ハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．ら、１９７９、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，７：１５４１−１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１７４−１７９）、ＲＮアーゼ防御（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｒｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、ポリメラーゼ鎖反応（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９２、”ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ”、第二版、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）および核流出アッセイ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、増補９、１９９０、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）が含まれる。また、バイオアッセイの段階（ｂ）の複合体の検出は、様々な技術によって実行することが出来る。シグナル増幅による複合体の検出は、放射能標識および酵素を含むいくつかの従来の標識技術によって成し遂げることが出来る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。また、放射能標識キットは、商品として入手することが出来る。バイオアッセイの段階（ｃ）でプローブとして用いられるＭＡＲＴ−１核酸配列は、ＲＮＡであっても、またはＤＮＡであって良い。ＤＮＡ配列を標識する望ましい方法は、クレノウ酵素またはポリヌクレオチドキナーゼを用い、³²Ｐで標識する方法である。ＲＮＡまたはリボプローブ配列を標識する望ましい方法は、ＲＮＡポリメラーゼを用い、³²Ｐまたは³⁵Ｓで標識する方法である。さらに、ピリミジンおよびプリン環に化学基を付着させる方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら、１９７３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｈ，Ｒ．Ｆ．、１９６８、Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０：５５１８−５５２３）、化学蛍光によって検出する方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０）およびビオチニル化した核酸プローブを用いる方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．ら、１９８３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１２５−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら、１９８２、Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓ，５１：２４１−２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３−１２８）、および商品として入手できる製品を用いた蛍光による検出方法、を含む、放射能によらないシグナル増幅技術が知られている。このバイオアッセイ中で用いることの出来る生体サンプルの例としては、これらに限られるわけではないが、哺乳動物の初代培養、メラノサイト細胞系のような哺乳動物の連続細胞系、皮膚または網膜のような哺乳動物の器官、組織、生体組織検査検体、新生物、病理検体、および検死検体が含まれる。望ましい実施態様では、実施例１に例示されているように、³²Ｐ放射能標識ＭＡＲＴ−１プローブが用いられる。望ましいＭＡＲＴ−１プローブは、図１の全長のｃＤＮＡ（配列番号：１）である。おおよそ１．６キロベース（Ｋｂ）のｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、ベクター内へクローン化され、得られたプラスミドは、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２ＵＳＡに、１９９４年４月１４日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号７５７３８を与えられた。全長のＭＡＲＴ−１核酸配列は、ｐＣＲＩＩプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化することによって分離することが出来る。この１．６Ｋｂの核酸配列は、次に、プローブとして用いることが出来る。このプローブは、様々な組織あるいは生体サンプルから分離された全ＲＮＡまたはポリＡ⁺ＲＮＡ中のＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの検出に用いられる。その他の実施態様では、図１（配列番号：１）のＭＡＲＴ−１配列を基にしたオリゴヌクレオチド対の組み合わせは、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡを検出するためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして用いられる。これらのプライマーは、選択されたＲＮＡ核酸配列を増幅するための逆転写酵素 −ポリメラーゼ鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＰＣＲ）の過程に次いで、方法中で用いることが出来、その詳細は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”１５章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ、に記載されている。オリゴヌクレオチドは、様々な製造者によって販売されている自動装置によって合成することが出来るし、あるいは、本発明の核酸配列を基にして商品として製造することもできる。当業者は、サンプル中のＭＡＲＴ−１ＲＮＡを増幅させるための、ＭＡＲＴ−１核酸配列を基にしたＰＣＲプライマーを選択する方法を知るであろう。本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列またはその部分（図１：配列番号：１）は、正常または異常な哺乳動物組織中のＭＡＲＴ−１遺伝子の変化を検出するのに有用である。変化とは、ＭＡＲＴ−１遺伝子配列の付加、欠失、置換あるいは重複、またはＭＡＲＴ−１遺伝子配列の遺伝子増幅を意味する。それ故、本発明のその他の態様は、（ａ）本発明の核酸配列の全体または部分を、生体サンプルから分離したゲノムＤＮＡと、該核酸配列と該ゲノムＤＮＡの間で複合体が形成されるような条件下で、接触させ、（ｂ）該サンプルを検出し、さらに、（ｃ）対照サンプルと比較することによって、該ＭＡＲＴ−１遺伝子中の変化を決定する：段階からなる、生体サンプル中のＭＡＲＴ−１遺伝子の変化を検出するためのアッセイに関する。生体サンプルからＤＮＡを分離し、遺伝子中の変化を検出し、ＭＡＲＴ−１核酸プローブとゲノムＤＮＡ配列との複合体を検出するための、標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋのようなマニュアルに提供されている。また、本発明のＭＡＲＴ−１核酸配列（図１；配列番号：１）は、他の種のＭＡＲＴ−１同族体を分離するプローブとして用いることが出来る。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１ｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）は、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いられ、陽性クローンを選択し配列決定を行う。ｃＤＮＡライブラリーを組み立てうる組織源の例としては、皮膚、網膜、メラノサイト、新生児の皮膚および胎芽が含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましくは、哺乳動物のライブラリーは、プローブとしてＭＡＲＴ−１ｃＤＮＡ（図１；配列番号：１）を用いて、スクリーニングされる。当業者は、同族体の検出に用いられるに適当なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術のための従来からの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、１９８７、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体またはその部分は、メラノーマ細胞上に表示される抗原であることが知られている。それ故、本発明のその他の態様では、病気に苦しむ哺乳動物から分離した生体サンプル中のＭＡＲＴ−１ＲＮＡまたはＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡのレベルの変化の検出に用いられるＭＡＲＴ−１核酸プローブを提供する。そのような病気の例としては、これらに限られるわけではないが、メラノーマが含まれる。ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡレベルでの変化とは、対照となるサンプルと比較したＲＮＡレベルの増加あるいは減少、または対照サンプルと比較したＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの出現あるいは消滅を意味する。ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡの変化の検出は、病状の診断または評価を可能にするであろう。それ故、ＭＡＲＴ−１ｍＲＮＡレベルの変化は、罹患した哺乳動物の予後を予想するであろう。その他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳動物組織のそのままの位置でのハイブリダイゼーションに用いられ、組織内でのＭＡＲＴ−１遺伝子発現の正確な位置または細胞内での位置を決定することが出来る。ＭＡＲＴ−１核酸配列を標識する望ましい方法は、ＳＰ６ポリメラーゼを用いた生体外での転写による³⁵ Ｓ標識ＲＮＡプローブを合成することである。ＭＡＲＴ−１プラスミド（ＡＴＣＣ寄託＃７５７３８）では、センスストランドはＴ７プロモーターの制御下にあり、アンチセンスストランドは、ＳＰ６プロモーター制御下にある。プローブは、おおよそ４００−２００塩基対の長さのプローブに加水分解されることが望ましい。組織をその位置で調製し、プローブを合成し、シグナルを検出する従来の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ１４章、およびＶａｎｄｅｒＰｌｏｅｇ，Ｍ．，Ｒａａｐ，Ａ．Ｋ．、１９８８、”ＮｅｗＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｙｔｏｌｏｇｙ”Ｇｏｅｒｔｔｌｅｒ，Ｋ．，Ｆｅｉｃｈｔｅｒ，ＧＥ．，Ｗｉｔｔｅ，Ｓ．編、１３−２１頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋに見出すことが出来る。次いで、プローブを哺乳動物の組織切片と接触させ、そのままの位置で、従来の方法によって分析が行われる。用いられうる組織の例としては、哺乳動物の胎芽、皮膚、リンパ節および網膜のような哺乳動物成体組織、生検検体、病理検体および検死検体が含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１プローブは、元の位置で、メラノーマ病変の急激な増殖期を特徴とする侵略性初期メラノーマの病変組織中でＭＡＲＴ−１ＲＮＡの発現を上昇させるために、また組織内での病変の縁を評価するために、用いられても良い。本発明のさらなるその他の実施態様では、ＭＡＲＴ−１（配列番号：１）核酸配列の全体またはその部分は、形質転換動物を作り出すために用いることが出来る。望ましくは、ＭＡＲＴ−１遺伝子は、胎芽期、望ましくは一細胞期、一般的には八細胞期より以前に、動物または動物の祖先に導入される。ＭＡＲＴ−１遺伝子を持つ形質転換動物を作り出す手段はいくつかある。その一つの方法は、ＭＡＲＴ−１配列の全体または部分を持つレトロウイルスを使用することからなる。形質転換遺伝子を含むレトロウイルスは、トランスフェクションによって胎芽動物内に導入される。その他の方法は、胎芽内に形質転換遺伝子を直接注入することを含む。さらなるその他の方法としては、当業者に既知の胎芽幹細胞法または相同組換え法が用いられる。ＭＡＲＴ−１トランス遺伝子を導入できる動物の例としては、霊長類、マウス、ラットまたはその他の齧歯類が含まれるが、これらに限られるわけではない。そのようなトランス遺伝子動物は、メラノーマ研究用生体モデルとして、また、メラノーマの診断法または治療法を評価するために有用であろう。さらに、本発明は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、または、図１（配列番号：２）に定義したアミノ酸配列あるいはその唯一の部分を持つ、ペプチドまたは修飾ペプチドまたはその類似体と反応するひとつの抗体または複数の抗体類からなる。本発明の実施態様では、抗体は、起源的にモノクローナルまたはポリクローナルである。抗体を生成するために用いられるＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドは、天然物または組み換え体を源にして良く、化学合成によって合成しても良い。天然のＭＡＲＴ−１タンパク質は、哺乳動物の生体サンプルから分離することが出来る。生体サンプルには、新鮮なメラノーマ、皮膚、網膜のような、哺乳動物組織、メラノーマ培養物あるいは培養メラノサイトのような哺乳動物細胞の初代培養または連続培養が含まれるが、これらに限られるわけではない。天然ＭＡＲＴ−１タンパク質は、組換えタンパク質の分離法として上に記載した方法と同一の方法で分離しても良い。組換えＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドは、従来の方法で生成されて良く、また従来の方法で精製しても良い。合成ＭＡＲＴ−１ペプチドは、本発明から予想されるアミノ酸配列（図１；配列番号：２）を基にして特別注文するかあるいは商品として製造するか、または当業者に既知の方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、１９６３、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．８５：２１４９）によって合成しても良い。ＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２；配列番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ１０−３；配列番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（Ｍ１０−４；配列番号：１８）（ペプチドは、一文字のアミノ酸コードで表す）が含まれるが、これらに限られるわけではない。最も望ましいペプチドは、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）である。別の方法として、ＭＡＲＴ−１タンパク質配列から誘導したペプチドは、ペプチドが存在しているＭＨＣ分子とペプチドとの結合を強化することによってそれらの免疫原性を増加させるように修飾しても良い。用いられて良いそのような修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドの例は、表１４に示すペプチドであるが、これらに限定されるわけではない。望ましい実施態様では、Ｉ型ＭＨＣとの結合を強化するように修飾されたＭＡＲＴ−１ペプチドは、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）である。修飾ペプチドの例としては、ＡＬＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−２Ｌ）（配列番号：５０）、ＷＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−１Ｗ）（配列番号：５３）、ＦＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−１Ｆ）（配列番号：５４）およびＡＡＹＩＧＩＬＴＶ（Ｍ９−２−３Ｙ）（配列番号：５８）が挙げられる。ペプチドまたは修飾ペプチドは、ペプチドの抗原性を強化するためにキャリヤー分子と結合させても良い。キャリヤー分子の例としては、これらに限定されるわけではないが、ヒト−アルブミン、ウシ−アルブミン、リポタンパク質およびキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｆ．およびＴｅｒｒＡ．Ｉ．編、ＡｐｐｌｅｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ，ＮｏｒｗａｌｋＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。本発明の検出方法として用いられる典型的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、または、抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の部分であり、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）₂およびＦ（Ｖ）としてこの技術分野で既知のそれらの免疫グロブリン分子の部分を含む。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、この技術分野で既知の方法に従って生成されて良い（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｏｄｅｎｔａｎｄＨｕｍａｎＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｂｕｒｄｏｎら編、１９８５、”ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”第１３巻、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。また、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子工学によって作り出されても良い。大腸菌内で重鎖と軽鎖の両方の遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願：公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、ならびにＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１の主題である。本発明の抗体は、天然のまたは変性させたＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ペプチドあるいはその類似体と反応するであろう。抗体が用いられる具体的なイムノアッセイは、抗体に望ましいように行われるであろう。抗体は、ＭＡＲＴ−１タンパク質あるいはその部分に対して、またはＭＡＲＴ−１アミノ酸配列に相同な合成ペプチドに対して、高められて良い。一つの実施態様では、本発明の抗体は、生体サンプル中の新規のＭＡＲＴ−１タンパク質を検出するためにイムノアッセイに用いられる。この方法では、本発明の抗体を生体サンプルと接触させ、ＭＡＲＴ−１抗原と抗体の間の複合体の形成を検出する。本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイおよびその類似アッセイなどであって良い（”ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”、１９９１、ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄＪ．Ｎｅｏｍａｎ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。この技術分野で既知のＥＬＩＳＡの標準技術は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第二版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８０、およびＣａｍｐｂｅｌｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４、に記載されており、これらの両方はここに参照として取り入れられる。そのようなアッセイは、以下に記載されている、直接的、間接的、競合的または非競合的イムノアッセイであって良い（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”、１９９１、ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄＪ．Ｎｅｏｍａｎ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ；Ｏｅｌｌｉｒｉｃｈ，Ｍ．、１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：８９５−９０４）。そのような検出アッセイに適当な生体サンプルは、哺乳動物組織、メラノーマおよびメラノサイト細胞系、皮膚、胎芽、リンパ節、病理検体、検死検体、および生検検体を含む。タンパク質は、以下に記載の従来の方法で、生体サンプルから分離されて良い（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。本発明の抗体は、それ故、病気または疾病に苦しむ哺乳動物から分離した生体サンプル中の、ＭＡＲＴ−１抗原またはＭＡＲＴ−１抗原の発現レベルの変化を検出するイムノアッセイに用いることが出来る。生体サンプルの例としては、これらに限定されるわけではないが、哺乳動物組織、生検組織サンプル、メラノーマおよびリンパ節生検サンプル、病理および組織サンプルが含まれる。これらのイムノアッセイによって評価できる病気の例としては、これらに限定されるわけではないが、メラノーマおよびメラノーマが次に転移する部位の組織が含まれる。発現レベルの変化とは、対照サンプルと比較してのＭＡＲＴタンパク質あるいはその部分の増加または減少を意味する。また、変化とは、ＭＡＲＴ−１タンパク質の置換、欠失または付加変異を包含する。そのような変異は、ＭＡＲＴ−１タンパク質に特異的なエピトープと反応することが知られている本発明の抗体を用いることによって、また対照と比較してエピトープが存在するか否かを決定することによって、決定することが出来る。それ故、本発明の抗体は、病気に罹った哺乳動物を診断、評価、予知するためのイムノアッセイに用いることが出来る。望ましい実施態様では、本発明のＭＡＲＴ−１抗体は、免疫細胞化学の手法を用いてメラノーマに苦しむ哺乳動物の組織生検からＭＡＲＴ−１抗原の存在を評価するために、用いられる。そのような病気組織中のＭＡＲＴ−１抗原の詳述な評価は、病気に苦しむ哺乳動物の病気の進行を予知するために用いることが出来る。具体的には、ＭＡＲＴ−１抗体は、メラノーマ病害の急激な増殖期を特徴づけるために用いることが出来る。免疫組織化学のための従来の方法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８、”ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；に記載されている。その他の実施態様では、本発明の抗体は、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはその部分を精製するために用いられて良い。免疫親和性クロマトグラフィーは、当業者に既知の従来の方法によって行うことが出来る（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。その他の望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１タンパク質を特異的に認識する抗体を含むウサギの抗血清は、ウエスタンブロット分析で該タンパク質を検出するために用いられる。そのような抗血清は、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体あるいはその一つあるいはいくつかの部分、またはＭＡＲＴ−１タンパク質配列から合成したペプチドを直示する。望ましくは、ＭＡＲＴ−１の予想アミノ酸配列から誘導されたＭＡＲＴ−１合成ペプチドが用いられる（図１、配列番号：２）。別の方法として、修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドを用いても良い、ペプチドは、自動ペプチドシンセサイザーを用いて標準方法で合成され、実施例２に記載したような高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製される。精製したペプチドは、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９８４、”ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載のように、担体に結合させて良い。従来の方法を用いると、ウサギは、担体と結合させたＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチドで免疫化されて良い。望ましくは、アジュバンド中、約０．１から約１０（ｍｇ）の抗原が用いられて良く、最も望ましくは、アジュバンド中、約１ｍｇの抗原を用いて良い。動物は、同様の効能促進剤の投与を受け、抗血清力価は、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価される。抗血清の満足できるレベルは、抗ペプチド抗体力価がプラトーに達する時点で、得られる。この抗体は、上記の標準イムノアッセイに用いることが出来る。Ｔ−リンパ球は、ＭＨＣ分子と結合したペプチドフラグメントの形でＩ型またはＩＩ型のＭＨＣ分子と関連する抗原を認識する。与えられたＭＨＣ対立遺伝子と結合するペプチドの程度は、ペプチド内での特定位置のアミノ酸による（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４９：３５８０；Ｋｕｂｏら、１９９４、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５２：３９１３−３９２４；ＲｕｐｐｅｒｔＪ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ，７４：９２９−９３７；Ｆａｌｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ，３５１：２９０−２９６、これらは、それぞれ、ここに参照として取り入れられる）。それ故、本発明のその他の実施態様は、ペプチドの関連するＭＨＣ分子とペプチドとの結合を強化することによって、免疫原性を増加させるように修飾したＭＡＲＴ −１タンパク質配列（図１；配列番号：２）から誘導したペプチドに関する。例として、修飾は、与えられた免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の置換、欠失あるいは付加、与えられた免疫原性ペプチド配列内に存在するアミノ酸変異または与えられた免疫原性ペプチド配列内の存在するアミノ酸の誘導体を含んで良い。免疫原性ペプチド配列からなる任意のアミノ酸は、本発明に従って修飾されて良い。望ましい実施態様では、与えられた免疫原性ペプチド配列内で、少なくとも一つのアミノ酸が置換または置き換えられる。任意のアミノ酸が、免疫原性ペプチド配列内の与えられたアミノ酸を置換または置き換えるために用いられて良い。修飾ペプチドとは、修飾され、Ｔ−細胞に存在する場合に関連するＭＨＣ分子との結合強化を示す、任意の免疫原性ＭＡＲＴ−１ペプチドを含むつもりである。例として、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、９または１０のアミノ酸からなるペプチドを結合する。結合を強化するために変えても良いペプチドの位置の例としては、ペプチドの第一の位置、第二の位置、第三の位置、および最終位置が含まれるが、これらに限定されるわけではない。免疫原性ペプチド配列のこれらの位置を置換または置き換えるために、任意のアミノ酸が用いられて良い。ＨＬＡ−Ａ２との結合を強化するために、ペプチドの第二の位置のアミノ酸は、疎水性の脂肪族アミノ酸であることが望ましい。第二の位置で用いられて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、ロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、スレオニンまたはグリシンが含まれる。望ましくは、ロイシンまたはメチオニンがペプチドの第二の位置に見出される。ペプチドの最後のアミノ酸（ペプチドの長さによって９番目か１０番目かいずれかのアミノ酸）は、疎水性脂肪族アミノ酸が望ましい。ペプチドの最後の位置に用いても良いアミノ酸の例としては、バリン、メチオニン、ロイシン、アラニン、イソロイシン、スレオニンまたはグリシンが含まれるが、これらに限られるわけではない。望ましくは、バリンがペプチドの最後の位置に見出される。また、ペプチドの第一および第三の位置のアミノ酸は、Ｉ型ＭＨＣ分子とペプチドの結合を強化するために修飾されても良い。ペプチドの第一および第三の位置のアミノ酸は、任意のアミノ酸であって良い。望ましくは、第一および第三の位置のアミノ酸は、疎水性の脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。これらの位置に用いられて良いアミノ酸の例としては、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、グリシン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸またはリジンが含まれるが、これらに限られるわけではない。修飾されて良いＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（配列番号：１８）（ペプチドは一文字アミノ酸コードで表されている）が含まれる。例として、免疫原性ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）は、次式Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＩＧＩＬＴＸ₄（配列番号：１２２）、に従って修飾されて良い：式中、Ｘ₁は、任意のアミノ酸、望ましくは任意の疎水性脂肪族アミノ酸、または芳香族アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、リシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、スレオニン、グリシンまたはセリンが含まれる。Ｘ₂は、任意の疎水性アミノ酸、望ましくは脂肪族疎水性アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、スレオニン、アラニンまたはグリシンが含まれる。Ｘ₃は、任意のアミノ酸、望ましくは、任意の疎水性の脂肪族アミノ酸、または芳香族アミノ酸であって良い。用いて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、セリン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、またはスレオニンが含まれる。Ｘ₄は、任意の疎水性アミノ酸、望ましくは疎水性の脂肪族アミノ酸であって良い。用いられて良いアミノ酸の例としては、これらに限られるわけではないが、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、スレオニン、またはグリシンが含まれる。作り出されて良い修飾ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）ペプチド配列の例として、表１４（実施例５）にペプチドを示すが、これらに限られるわけではない。さらに、本発明は、修飾したＭＡＲＴ−１アミノ酸配列（図１；配列番号：２）から誘導したこれらの免疫原修飾ペプチドの類似体を含む。類似体という言葉は、これらの修飾ペプチドの機能的態様を示す任意のペプチドを含むつもりである。類似体という言葉は、また、上記のようなこれらの修飾ペプチドの保存的置換または化学誘導体を含む。これらの修飾ペプチドは、従来の方法に従って、合成によってまたは組換えによって作り出されて良い。組換えあるいは天然のＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体は、予防または治療のどちらかのためのワクチンとして用いられて良い。治療目的で提供される場合、ワクチンは、メラノーマのいかなる存在にも先だって提供される。ＭＡＲＴ−１ワクチンの予防投与では、哺乳動物内のメラノーマを防ぐまたは減退させるために供されるべきである。望ましい実施態様では、メラノーマに罹る危険性の高い哺乳動物、望ましくはヒト、は、本発明のワクチンで予防的に処置される。そのような哺乳動物の例としては、これらに限られるわけではないが、メラノーマの家族歴を持つヒト、異型色素性母斑歴を持つヒト、ＦＡＭ−Ｍ症候群歴を持つヒト、または以前にメラノーマを一部切除しそれ故再発の危険性のあるヒトが含まれる。治療目的で提供される場合、ワクチンは、メラノーマまたは転移性メラノーマ上に存在する腫瘍抗原への患者自身の免疫応答を強化するために提供される。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターを移入した細胞からの細胞溶解物、ＭＡＲＴ−１組換え発現ベクターを移入した細胞からの細胞溶解物、または発現したタンパク質を含む培養上澄み液であって良い。別の方法では、免疫原は、部分的にあるいは実質的に精製した組み換えＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾したペプチドあるいはその類似体である。タンパク質またはペプチドは、リポタンパク質と結合させるか、またはリポゾームの形であるいは補助剤と共に投与されて良い。免疫原は純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することが出来るが、医薬組成物、調合物または調製物として存在することが望ましい。本発明の調合物は、獣医学およびヒトへの両方に用いられるが、一つまたはそれより多くの医薬として受け入れうる担体、および所望するならばその他の治療成分と共に、上記のような免疫原からなる。担体は、調合物のその他の成分と矛盾せず、その宿主に有害でない範囲で「受け入れ可能」であらねばならない。調合物は、便宜上、単位投与の形で存在して良く、医薬分野で熟知されている任意の方法によって調製されて良い。すべての方法は、一つまたはそれより多くの補助成分を構成する担体と共に活性成分を組み合わせの中に持ち込む段階を含む。一般的には、調合物は、液体担体または微細に分割される固体担体またはその両方と共に活性成分を組み合わせの中に均一にかつ親密に持ち込み、次いで、必要であれば、望ましい調合物に生成物を適合させることによって、調製される。静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与に適した調合物は、宿主の血液と等張であることが望ましい溶液と共に、活性成分の無菌水溶液からなると便利である。そのような調合物は、便宜上、塩化ナトリウム（例えば０．１−２．０Ｍ）、グリシンおよびその類似物などのような生理学的に矛盾しない物質を含み、生理学的状態と矛盾しない緩衝ｐＨを持って水溶液を生成し、かつ該水溶液を無菌にするような水中に、個体活性成分を溶解することによって調製されて良い。これらは、ユニット中または複数の投与容器中、例えば密封アンプルまたはバイアル中に存在して良い。本発明の調合物は、安定化剤を組み込んでも良い。安定化剤の例としては、それらのみでまたは混合物として用いられるポリエチレングリコール、タンパク質、サッカライド、アミノ酸、無機酸および有機酸が挙げられる。これらの安定化剤は、望ましくは、免疫原重量当たり０．１１−１０，０００重量の量で混合される。二種類またはそれより多くの安定化剤が用いられる予定の場合、それらの総量は、上記の範囲であることが望ましい。これらの安定化剤は、適当な濃度およびｐＨの水溶液中で用いられる。そのような水溶液の具体的な浸透圧は、一般的には、０．１−３．０オスモルの範囲であり、望ましくは０．８−１．２の範囲である。水溶液ｐＨは、５．０−９．０の範囲内、望ましくは６−８の範囲内に調製される。本発明の免疫原の調合には、抗吸着剤を用いても良い。さらなる医薬的方法が、作用の持続期間を調節するために用いられても良い。調製物の遊離の調節は、タンパク質またはそれらの誘導体を複合または吸収するポリマーの使用を通して成し遂げられて良い。配達の調節は、適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）および高分子の濃度、ならびに遊離を調節するために組み込み方法を選択することによって、行われて良い。調製物の遊離を調節することによって作用持続期間を調節するためのその他の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体のような、重合体物質の粒子内に、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドおよびその類似体を組み込むことである。別法として、重合体粒子内にこれらの薬剤を組み込む代わりに、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、あるいは、ゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）ミクロカプセル）によって調製されたミクロカプセル内に、または、コロイド薬剤配達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内、およびマクロエマルジョン内に、これらの物質を閉じ込めることが可能である。経口調製物が所望される場合、組成物は、ラクトース、スクロース、デンプン、タルクステアリン酸マグネシウム、結晶化セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアゴムのような、典型的な担体と組み合わせて良い。本発明のタンパク質は、キットの形で、単独で、または上記の医薬組成物の形で供給されて良い。ワクチン注射は、従来の方法で行うことが出来る。例えば、免疫原は、塩類溶液または水のような適当な希釈液、または完全あるいは不完全な補助剤中で用いることが出来る。さらに、免疫原は、タンパク質免疫原性を作り出すために担体に結合させても良いが、させなくても良い。そのような担体分子には、これらに限られるわけではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風毒素、およびその類似物などが含まれる。また、免疫原は、リポタンパク質とカップリングさせても、またはリポソームの形であるいは補助剤と共に投与されても良い。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、およびその類似部位等のような、抗体生成に適した任意の経路によって投与することが出来る。免疫原は、一度に、または抗ＭＡＲＴ−１免疫細胞または抗ＭＡＲＴ−１抗体の有効な力価が作り出されるまで断続的な間隔で、投与されて良い。抗ＭＡＲＴ−１免疫細胞の存在は、免疫化される前および後のＭＡＲＴ−１抗原に対するＣＴＬ前駆体（細胞毒性Ｔリンパ球）の頻度を、ＣＴＬ前駆体分析アッセイ（Ｃｏｕｌｉｅ，Ｐ．ら、１９９２、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＯｆＣａｎｃｅｒ，５０：２８９−２９７）を用いて測定することによって評価されてであろう。抗体は、上記のイムノアッセイを用いて血清中で検出されるであろう。本発明のワクチンまたは免疫原の投与は、予防目的または治療目的のいずれかであって良い。予防目的で提供される場合、免疫原は、いかなる存在もに先んじて、またはメラノーマによるいかなる徴候にも先んじて、提供される。免疫原の予防投与では、哺乳動物内のメラノーマを予防するまたは弱毒化するために供される。治療目的で提供される場合、免疫原は、病気の始まりに（あるいはすぐ後に）または病気の任意の徴候の始まりに提供される。免疫原の治療投与は、病気を弱毒化するために供される。望ましい実施態様では、ワクチンは、組み換えＭＡＲＴ−１タンパク質またはペプチド発現ベクターを用いて調製される。個体にワクチンを供給するために、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分をコードする遺伝子配列を、上記のように発現ベクタ内に挿入し、免疫化される哺乳動物内に導入する。前述のワクチンに用いて良いベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、不完全なレトロウイスルベクター、アデノウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターが、含まれる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６− ９３２）。ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を運搬するウイルスベクターは、メラノーマのいかなる証拠も認められない間に、またはメラノーマに罹った哺乳動物の病気の退縮を仲介するためかのどちらかに、哺乳動物内に導入することが出来る。哺乳動物にウイルスベクターを投与するための方法の例としては、これらに限られるわけではないが、生体外（ｅｘｖｉｖｏ）でウイルスに細胞をさらすこと、罹患組織内へのレロトウイルスまたはウイルスの生産細胞系の注入、またはウイルスの静脈内投与が含まれる。別法として、ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を持つウイルスベクターは、医薬として受け入れうる担体内で、メラノーマ内に直接注入するまたは局所適用することによって、局所的に投与されて良い。ＭＡＲＴ−１核酸配列の全体または部分を持つ、ウイルスベクターの投与量は、ウイルス粒子の力価を基本とする。投与される免疫原の望ましい範囲は、哺乳動物、望ましくはヒト当たり、約１０⁶から約１０¹¹ウイルス粒子であろう。免疫化後のワクチンの効果は、特異的溶解活性あるいは特異的サイトカイン生成によってまたは腫瘍退縮によって評価されるのと同様に、抗原を認識する抗体または免疫細胞の生成によって評価することが出来る。当業者は、前述のパラメーターを評価する従来からの方法を知っているであろう。免疫化される哺乳動物が既にメラノーマまたは転移性メラノーマに罹っている場合、ワクチンは、その他の治療処置と共に投与することが出来る。その他の治療処置の例としては、これらに限られるわけではないが、Ｔ細胞免疫療法の採用、サイトカインまたはメラノーマ用のその他の治療薬剤の共投与が含まれる。代わりに、実質的にあるいは部分的に精製したＭＡＲＴ−１タンパク質の全体または部分を、医薬として受け入れうる担体内のワクチンとして投与しても良い。投与されて良いＭＡＲＴ−１タンパク質の範囲は、患者当たり約０．００１から約１００ｍｇであり、望まし投与量は、患者当たり約０．０１から約１００ｍｇである。望ましい実施態様では、ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）（一文字コードで表す）またはその類似体が、そのような治療を必要とする哺乳動物に治療目的でまたは予防目的で投与される。修飾ＭＡＲＴ− １ペプチドの代わりに、表１４に示した例を用いても良い。望ましい投与量は、約０．００１ｍｇから約１００ｍｇ、最も望ましくは約０．０１ｍｇから約１００ｍｇであろう。ペプチドは、合成によってまたは組換えによって作り出されて良い。免疫化は、抗免疫原抗体または免疫細胞の充分な力価が得られるまで、必要に応じて繰り返して行われる。さらなるその他の代わりの実施態様では、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを、哺乳動物細胞内へ導入することもできる。レトロウイルスベクターを導入することの出来る哺乳動物細胞の例としては、これらに限られるわけではないが、哺乳動物の初代培養または哺乳動物の継代培養、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、または２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）が含まれる。遺伝子を運搬するベクターを細胞内に導入する手段には、これらに限られるわけではないが、ミクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはＤＥＡＥデキストラン、リポフェクチン、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション、または当業者に既知のその他の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓＰｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）が含まれる。ＭＡＲＴ−１抗原を発現している哺乳動物細胞は、哺乳動物に投与することができ、ワクチンまたは免疫原として供される。ＭＡＲＴ−１抗原発現細胞を投与する方法の例としては、これらに限られるわけではないが、静脈内、腹腔内または病巣内が含まれる。望ましい実施態様では、ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）に関連するＭＡＲＴ−１核酸配列の部分が、ＭＡＲＴ−１発現ベクターに挿入され、哺乳動物細胞内に導入される。代わりに、ＭＨＣ分子とのそれらの結合を強化するように修飾されたＭＡＲＴ−１ペプチド関連核酸配列を用いても良い。例として、表１４に示す修飾ペプチドをコードする核酸配列を、発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞内に導入しても良い。本発明のワクチン調合物は、メラノーマ関連ＭＡＲＴ−１抗原のようなメラノーマ関連抗原に対して直接的な免疫応答を誘発する免疫原からなる。ワクチン調合物は、最初に動物モデルで、手始めに齧歯動物、次いでヒト以外の霊長類、最後にヒトで評価されて良い。免疫化法の安全性は、免疫化された動物の一般的健康状態への免疫化による影響（体重変化、発熱、食欲状態等）を探し出すことによって、また検死の病理学的変化を探し出すことによって、決定される。動物で最初に試験した後、メラノーマ癌患者で試験できる。従来からの方法を用いて、患者の免疫応答が評価され、ワクチンの効果が決定されるであろう。本発明のさらなるその他の実施態様では、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体、一つあるいはいくつかの部分、またはＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体を、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で培養された樹状突起細胞にさらして良い。培養樹状突起細胞は、樹状突起細胞修飾抗原または抗原でパルス処理した樹状突起細胞からなるＴ細胞依存性抗原を作り出す手段を提供し、樹状突起細胞内で、抗原は処理され抗原活性化樹状突起細胞上に発現する。ＭＡＲＴ−１抗原活性化樹状突起細胞または処理された樹状突起細胞抗原は、ワクチンまたはメラノーマ治療用の免疫原として用いられて良い。樹状突起細胞は、抗原が中に取り込まれ樹状突起細胞表面上に示されるに充分な時間、抗原にさらされるべきである。得られた樹状突起細胞または樹状突起細胞処理抗原は、次いで、治療を必要とする個体に投与することが出来る。そのような方法は、Ｓｔｅｉｎｍａｎら、ＷＯ９３／２０８１８５およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、ＥＰＯ出願Ｏ５６３４８５Ａ１に記載されており、ここに参照として取り入れる。本発明のさらなるその他の実施態様では、個体から分離されたＴ細胞は、生体外で（ｉｎｖｉｔｒｏ）、ＭＡＲＴ−１タンパク質あるいはその部分、またはＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体、またはＭＡＲＴ−１修飾ペプチドあるいはその類似体に、さらし、次いで、そのような治療を必要とする患者に治療上有効な量を投与することが出来る。Ｔ−リンパ球を分離できる例としては、これらに限られるわけではないが、抹消血液リンパ球（ＰＢＬ）（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、リンパ節、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）が含まれる。そのようなリンパ球は、処置した個体からまたは宿主から、この技術分野で既知の方法によって分離し、生体外で培養することが出来る（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：２４５３−３４６１）。リンパ球は、ＲＰＭＩあるいはＲＰＭＩ１６４０またはＡＩＭ−Ｖのような培地中で、１−１０週間培養される。生存能力は、トリパンブルー色素排除試験によって評価される。リンパ球は、培養の一部または全期間中、ＭＡＲＴ−１タンパク質の全体または部分にさらされる。望ましい実施態様では、リンパ球は、１０⁷細胞当たり約１から約１０μｇ／ｍｌの濃度で、リンパ球培養の全期間または一部期間、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：４）ペプチド（一文字コードで表す）にさらされる。ペプチドに感作させた後、Ｔ−リンパ球は、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与される。代わりに、表１４に示す修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドをリンパ球にさらしても良い。このような感作Ｔ細胞を哺乳動物に投与するための方法の例としては、これらに限られるわけではないが、静脈内、腹腔内、または病巣内が含まれる。これらの感作Ｔ−リンパ球の効果を測定し評価するパラメーターには、これらに限定されるわけではないが、治療される哺乳動物内での免疫細胞の生成または腫瘍の退縮が含まれる。従来からの方法が、これらのパラメーターを評価するために用いられる。そのような治療は、サイトカインまたは遺伝子修飾細胞と共に施すことが出来る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９９２、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，３：７５−９０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９９２、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，３：５７−７３）。ワクチンとしての使用に加えて、組成物は、ＭＡＲＴ−１抗原、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドおよびその類似体、に対する抗体を調製するために用いることが出来る。抗体は、抗メラノーマ薬剤として直接用いることが出来る。抗体を調製するために、宿主動物は、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ペプチドあるいはその類似体を、免疫原として用いて免疫化され、上記のようなワクチン用担体と結合される。宿主の血清または血漿は、適当な時間間隔で集められて、免疫原と反応する抗体からなる組成物を提供する。γ−グロブリン画分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウムあるいはＤＥＡＥセファデックス、またはその他の当業者に既知の技術を用いることによって、得ることが出来る。抗体は、化学療法のようなその他の抗癌薬剤と関連するであろう多くの不利な副作用とは実質上無関係である。抗体組成物は、潜在する不利な免疫システム応答を最小にすることによって、宿主システムとより一層矛盾なく作ることが出来る。この事は、外来種抗体のＦｃ部分の全体あるいは一部を除去することによって、または、例えばヒト／ヒトハイブリドーマからの抗体を用いると言ったような宿主動物と同一種の抗体を用いることによって、成し遂げられる。ヒトに適応させた（即ちヒトに非免疫原性である）抗体は、例えば、抗体の免疫原性部分を、類似しているが非免疫原性である部分で置き換える（即ち、キメラ抗体）ことによって、作られて良い。そのようなキメラ抗体は、一つの種からの抗体の反応性または抗原結合部分、および異なる種からの抗体のＦｃ部分（非免疫原性）を含んでよい。キメラ抗体の例としては、これらに限られるわけではないが、非ヒト哺乳動物−ヒトのキメラ、齧歯動物−ヒトのキメラ、ねずみ−ヒトおよびラット−ヒトのキメラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願第１８４，１８７号；ＴａｎｉｇｕｃｈｉＭ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４３９；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，４７：９９９；Ｗｏｏｄら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４６６；Ｓｈａｗら、１９８８、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８０：１５５５３、ここにそのすべてを参照として取り入れる）が含まれる。「人体に適用させた」キメラ抗体の一般的レビューは、ＭｏｒｒｉｓｏｎＳ．、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２によって、およびＯｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ，４：２１４によって提供される。適当に「人体に適用させた」抗体は、ＣＤＲまたはＣＥＡの置換によって代わりに作り出すことが出来る（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５５２；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｂｉｅｄｌｅｒｅｔら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：４０５３、これらのすべてはここに参照として取り入れる）。抗体または抗原結合フラグメントは、また、遺伝子工学によって作り出されても良い。大腸菌内での重鎖および軽鎖の両方の遺伝子を発現させるための技術は、以下のＰＣＴ特許出願；公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４、ならびにＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１の主題である。また、抗体は、免疫応答を強化する手段として用いることもできる。抗体は、抗体のその他の治療投与に用いられるそれと同様の量を投与することが出来る。例えば、プールしたγグロブリンは、患者当たり約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲で、投与される。このように、ＭＡＲＴ−１抗原と反応する抗体は、単独でまたはメラノーマに罹った哺乳動物への他の抗癌治療と共に、抵抗なく投与することが出来る。抗癌治療の例としては、これらに限られるわけではないが、化学療法、放射線治療、ＴＩＬの免疫療法採用療法が含まれる。代わりに、抗ＭＡＲＴ−１抗原抗体は、免疫原としての抗イディオタイプ抗体を投与することによって、誘発することもできる。便宜上、上記の方法に従って調製した精製抗ＭＡＲＴ−１抗体調製物を用いて、宿主動物に抗イディオタイプ抗体を誘発させる。組成物は、適当に希釈されて宿主動物へ投与される。投与の後、通常は繰り返し投与の後、宿主は、抗−イディオタイプ抗体を作り出す。Ｆｃ領域への免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同じ種によって作りだした抗体を用いるか、または投与した抗体のＦｃ領域を排除することが出来る。宿主動物内の抗イディオ抗体の導入に次いで、血清または血漿は、抗体組成物を提供するために、取り除かれる。組成物は、抗ＭＡＲＴ−１抗体のための上記の方法に従って、または親和性マトリックスに結合した抗ＭＡＲＴ−１抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。生成された抗イディオタイプ抗体は、標準的なＭＡＲＴ−１抗原とコンフォメーションが同じであり、ＭＡＲＴ−１タンパク質、ペプチド類似体またはその部分を用いるよりもむしろ、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原ワクチンを調製するために用いられて良い。動物に抗ＭＡＲＴ−１抗体を誘発させる手段として用いた場合、抗体を注入する方法は、ワクチン注射の目的と同じ、即ち、補助剤ととにまたは補助剤を用いずに、生理学的に適当な希釈剤中、有効濃度で、筋肉内、腹腔内、皮下、病巣内、またはその類似部位などに注射される。一種類またはそれより多くの効能促進剤の注入が望ましい。また、本発明のＭＡＲＴ−１誘導タンパク質またはペプチドまたは修飾ペプチドは、病気前後の予防を意図する抗血清の生成に用いるつもりである。ここでは、ＭＡＲＴ−１抗原、ペプチドあるいはその類似体、または修飾ＭＡＲＴ−１ペプチドあるいはその類似体は、適当な補助剤と調合され、ヒト抗血清を生成するための既知の方法に従って、ヒト志願者に注射により投与される。注射されたタンパク質に応答する抗体は、免疫化に次いで、数週間の間、抹消血清をサンプリングすることによって、抗ＭＡＲＴ−１血清抗体の存在を検出するために、ここに記載されたようなイムノアッセイを用いて、モニターされる。免疫化された個体からの抗血清は、進行性メラノーマの危険性のある個体の予防処置として投与されて良い。抗血清は、また、メラノーマに罹った個体の病後の予防治療にも有用である。ＭＡＲＴ−１抗原の抗体および抗イディオタイプ抗体のインビボでの使用および診断的使用の両方に対してモノクローナル抗体を使用するのが好適であろう。モノクローナルの抗−ＭＡＲＴ−１抗体または抗−イディオタイプ抗体は以下のように製造できる。免疫化動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化させるかまたは当業者には既知の方法によりハイブリドーマの製造に使用した。（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．１９８３．ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＰｌａｄｅｒｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．５６−９７）。ヒトーヒトハイブリドーマを製造するために、ヒトリンパ球供与者が選択された。ＭＡＲＴ−１抗原を運ぶメラノーマを持つことが知られている供与者が適したリンパ球供与者であろう。リンパ球は末梢血試料から単離でき、もし供与者が脾摘出を受けるならば脾臓細胞を使用してもよい。エプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）がヒトリンパ球の不死化に使用でき、ヒトーヒトハイブリドーマを産生するためにはヒト融合パートナーが使用できる。ペプチドによる一次インビトロ免疫化もまたヒトモノクローナル抗体の発生に使用できる。好適なＭＡＲＴ−１ペプチドの例としては、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列ＩＤ番号：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列ＩＤ番号：１７）およびＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（配列ＩＤ番号：１８）（ペプチドは単一文字アミノ酸コードで表されている）が挙げられるがそれらに制限されるわけではない。最も好適にはＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列ＩＤ番号：４）が免疫原として使用される。もしくは、ＭＡＲＴ−１アミノ酸配列から誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子への結合性を促進させるように修飾されたペプチドもまた使用される。例えば、表１４に示された修飾ペプチドが免疫原として使用されるであろう。不死化細胞により分泌される抗体をスクリーニングして所望の特異性を持つ抗体を分泌するクローンを決定する。モノクローナルＭＡＲＴ−１抗原またはペプチド抗体については、抗体はＭＡＲＴ−１抗原またはペプチドに結合しなければならない。モノクローナル抗イディオタイプ抗体については、抗体は抗ＭＡＲＴ −１抗体に結合しなければならない。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞が選択される。ここに記載された抗体またはキメラ抗体はまた常法により毒素分子、放射性同位元素および薬剤と結合させてもよい（Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．（１９９１）ｉｎ”ＢｉｏｌｏｇｉｃＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ”ＤｅＶｉｔａＶＴ，ＨｅｌｌｍａｎＳ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９１）ｉｎ”ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ” ＤｅＶｉｔａＶ．Ｔ．，ＨｅｌｌｍａｎＳ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔＣｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。抗体が結合されるであろう毒素の例としてはリシンまたはジフテリア毒素が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。薬剤または化学療法剤の例にはシクロホスファミドまたはドキソルブシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。放射性同位元素の例には¹³¹ Ｉが挙げられるが、それに限定されるわけではない。上記の薬品に共有結合で結合する抗体は癌免疫療法においてメラノーマに処置に使用できる。病変のある部位への局所的投与は、局所適用、注射および組換え的に注入液を発現している細胞を含む多孔性装置の移植、ＭＡＲＴ−１抗体またはキメラ抗体、毒素、薬剤または放射性標識またはそれらの一部が含まれた多孔性装置の移植を含む（これらに限定されるわけではない）本分野では既知の手段により達成される。上記の抗体およびそれらの抗原結合性断片はキット単独としてまたはインビボ使用のための医薬組成物として供給される。抗体は治療的使用、イムノアッセイにおける診断的使用またはここに記載したＭＡＲＴ−１蛋白質またはペプチドを精製するための免疫アフィニティー試薬としての使用において用いられるであろう。本発明はまた腫瘍浸潤リンパ球により認識される第二のメラノーマをコードしているｃ（相補的）ＤＮＡ２５（図４Ａおよび４Ｂ；配列ＩＤ番号：２６）と称される、実質的に精製され単離された核酸配列も提供する。ｃＤＮＡ２５によりコードされたメラノーマ抗原を認識するＴＩＬはインビボ腫瘍排除に関連している。ＴＩＬはＨＬＡ−Ａ２に関連してｃＤＮＡ２５によりコードされているメラノーマ抗原を認識した。ｃＤＮＡ２５核酸配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列ＩＤ番号：２６）とメラノサイトーメラノーマ特異的蛋白質ｇｐ１００をコードしている遺伝子の核酸配列との比較により、この配列はｇｐ１００として以前に同定された配列とは似てはいるが異なっていることが示された。ｇｐ１００として以前に同定された配列にはｇｐ１００（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３２２９５；ｇｐ９５とも称される）、Ｐｍｅｌ１７（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ７７３４８；Ｋｗｏｎｅｔａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８８：９２２８−９２３２）およびＭＥ２０（Ｍａｒｅｓｈｅｔａｌ．（１９９４）ＤＮＡａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１３：８７−９５）が挙げられる。ここに提供されるｃＤＮＡ２５配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列ＩＤ番号：２６）はＧｅｎｂａｎｋの以前に報告されたｇｐ１００配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３２２９５）とは２ヌクレオチド異なっており、Ｐｍｅｌ１７配列（Ｋｗｏｎｅｔａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８８：９２２８−９２３２）とは３ヌクレオチド異なっており、かつ２１塩基対が欠失し、およびＭＥ２０配列（Ｍａｒｅｓｈｅｔａｌ．（１９９４）ＤＮＡａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１３：８７−９５）とは１ヌクレオチド異なっている。アミノ酸レベルでは、ｃＤＮＡ２５によりコードされている蛋白質はＧｅｎｂａｎｋのｇｐ１００配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３２２９５）とは１６２位の１アミノ酸、Ｐｍｅｌ１７と比較すると１６２位および２７２位の２つのアミノ酸が異なっており、しかもＰｍｅｌ１７の５８８−５９４位に存在している７つのアミノ酸が含まれていない。従って、ｃＤＮＡ２５はｇｐ１００の遺伝子の異なった一つの形をコードしているように思われる。ｃＤＮＡ２５核酸配列（図４Ａおよび４Ｂ；配列ＩＤ番号：２６）およびアミノ酸配列（図５Ａ；配列ＩＤ番号：２７）と以前に報告されているｇｐ１００配列間の相違は多形、対立遺伝子変異または腫瘍中での突然変異によるものであろう。マウス腫瘍での実験でＴ細胞により認識される新規抗原は不活性化遺伝子のコード領域における点突然変異から生じることが示されている（Ｂｏｏｎ，Ｔ（１９９２）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５８：１７７−２１０）。本発明はまたここで提供されるｇｐ１００蛋白質配列またはその類似体から誘導される免疫原性ペプチドを提供する。（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および１２１）。これらの免疫原性ペプチドはＴＩＬにより認識されるｇｐ１００蛋白質の抗原性部分（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および１２１）を表している。免疫原性ペプチドの例にはＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（ペプチドＧ１０−４；配列ＩＤ番号：３３）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（ペプチドＧ１０ −５；配列ＩＤ番号：３４）、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ（ペプチドＧ１０−２２；配列ＩＤ番号：３５）、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ（ペプチドＧ９−１９；配列ＩＤ番号：３６）、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ（ペプチドＧ１０−８；配列ＩＤ番号：３７）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（ペプチドＧ１０−９；配列ＩＤ番号：３８）、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ（ペプチドＧ９−２１６；配列ＩＤ番号：３９）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ペプチドＧ９−２８０；配列ＩＤ番号：４０）、ＬＮＶＳＬＡＤＴＮ（ペプチドＧ１０−４００；配列ＩＤ番号：４１）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（ペプチドＧ９₁₅₄；配列ＩＤ番号：４６；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６２）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ（ペプチドＧ１０₁₅₄；配列ＩＤ番号：４７；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９₂₀₉；配列ＩＤ番号：４８；図７Ａ；アミノ酸２０９から２１７）およびＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ１０₂₀₈；配列ＩＤ番号：４９；図７Ａ；アミノ酸２０８から２１７）が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本発明はさらにｇｐ１００アミノ酸配列（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および１２１）から誘導されるこれらの免疫原性ペプチドの類似体も含んでいる。術語類似体とはこれらの免疫原性ペプチドの機能的特色を示す任意のペプチドを含んでいる。術語類似体はまた上記のペプチドの保存的置換体または化学誘導体も含んでいる。これらの免疫原性ペプチドはＭＡＲＴ−１に対して記載したように、同一の方法または様式により合成的にまたは組換えにより製造されるであろう。本発明のさらに別の態様では、ｇｐ１００配列（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および１２１）から誘導される免疫原性ペプチドは、Ｔ細胞に渡された場合にペプチドが会合するＭＨＣ分子への結合を促進することにより免疫原性を増加させるように修飾される。例えば、修飾には免疫原性ペプチド配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失または付加、または所定の免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の挿入、または所定の免疫原性ペプチド配列内に存在するアミノ酸の誘導体化、または所定の免疫原性ペプチド配列内のアミノ酸の突然変異が含まれるであろう。好適な修飾においては、所定の免疫原性ペプチド配列において少なくとも一つのアミノ酸が置換されるかまたは置き換えられる。所定の免疫原性ペプチド配列を構成する任意のアミノ酸は本発明により修飾されるであろう。任意のアミノ酸が免疫原性ペプチド配列内の所定のアミノ酸の置換または置き換えに使用されるであろう。修飾は免疫原性ｇｐ１００ペプチド内のどのアミノ酸位置で生じてもよい。修飾ｇｐ１００ペプチドにはＴ細胞に渡された場合にペプチドが会合するＭＨＣ分子への促進された結合を示す任意の修飾ｇｐ１００ペプチドが含まれるつもりである。例えば、ＨＬＡ−Ａ２に関連してＴ細胞に認識されるペプチドは９から１０のアミノ酸の長さである。好適には、ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの促進された結合のためには、ペプチド中の二番目の位置および最後の位置は疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。二番目の位置はロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシンまたはアラニンのような脂肪族疎水性アミノ酸であろうが、それらに限定されるわけではない。ペプチドの最後の位置は（ペプチドの長さに依存して九または十番目の位置）バリン、ロイシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、またはトレオニンのような脂肪族疎水性アミノ酸であろうが、それらに限定されるわけではない。免疫原性ペプチドの一番目および三番目の位置は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸で置換または置き換えられていてもよい。ペプチドの一番目および三番目の位置に使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本態様に従って修飾されるであろうｇｐ１００ペプチドの例としてはＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ（ペプチドＧ１０−４；配列ＩＤ番号：３３）、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（ペプチドＧ１０−５；配列ＩＤ番号：３４）、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ（ペプチドＧ１０−２２；配列ＩＤ番号：３５）、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ（ペプチドＧ９−１９；配列ＩＤ番号：３６）、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ（ペプチドＧ１０−８；配列ＩＤ番号：３７）、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ（ペプチドＧ１０−９；配列ＩＤ番号：３８）、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ（ペプチドＧ９−２１６；配列ＩＤ番号：３９）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ペプチドＧ９−２８０；配列ＩＤ番号：４０）、ＬＮＶＳＡＤＴＮ（ペプチドＧ１０−４００；配列ＩＤ番号：４１）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（ペプチドＧ９₁₅₄；配列ＩＤ番号：４６；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６２）、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ（ペプチドＧ１０₁₅₄；配列ＩＤ番号：４７；図７Ａ；アミノ酸１５４から１６３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９₂₀₉；配列ＩＤ番号：４８；図７Ａ；アミノ酸２０９から２１７）およびＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ１０₂₀₈；配列ＩＤ番号：４９；図７Ａ；アミノ酸２０８から２１７）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例えば、免疫原性ｇｐ１００ペプチドＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列ＩＤ番号：４６）から誘導される修飾ｇｐ１００ペプチドは式Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＧＱＹＷＱＸ₄（配列ＩＤ番号：１２３）を持っており、式中：Ｘ₁は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジンまたはセリン、アスパラギン酸またはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₂は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、グリシンまたはバリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。最も好適であるのは；ロイシン、メチオニンまたはイソロイシンである。Ｘ₃は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはアラニン、ロイシン、リジン、イソロイシン、グリシン、メチオニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはチロシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₄は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、トレオニンまたはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。修飾ペプチドの例は表１５に示されている。好適な修飾ペプチドはＫＩＷＧＱＹＷＱＶ（Ｇ９−１５４−２１）（配列ＩＤ番号：７０）である。もしくは、免疫原性ｇｐ１００ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（Ｇ９−２０９；配列ＩＤ番号：４８）が修飾され、そのような修飾ペプチドは一般式Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＱＶＰＦＳＸ₄（配列ＩＤ番号：１２４）を持っており、式中：Ｘ₁は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₂は任意の疎水性アミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、またはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₃は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₄は任意の疎水性アミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリンまたはトレオニンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＩＴＤＱＶＰＦＳＶから誘導される修飾ペプチドの例が表１６に示されている。好適にはペプチドＦＬＤＱＶＰＦＳＶ（ペプチドＧ９−２０９−１Ｆ２Ｌ）が使用される。例えば、免疫原性ｇｐ１００ペプチドＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（Ｇ９−２８０；配列ＩＤ番号：４０）から誘導される修飾ｇｐ１００ペプチドはまたＭＨＣクラスＩ分子、好適にはＨＬＡ−Ａ２またはそのサブタイプへの結合を促進するように修飾される。修飾ペプチドは一般式Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＰＧＰＶＴＸ₄（配列ＩＤ番号：１２５）を持っており、式中：Ｘ₁は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₂は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、またはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₃は任意のアミノ酸、好適には疎水性脂肪族アミノ酸または芳香族アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、トレオニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸またはセリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない；Ｘ₄は任意の疎水性アミノ酸、好適には脂肪族疎水性アミノ酸である。使用できるアミノ酸の例としてはロイシン、メチオニン、アラニン、イソロイシン、バリン、トレオニンまたはグリシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（Ｇ９−２８０；配列ＩＤ番号：４０）から誘導される修飾ペプチドの例は表１７に示されている。好適な修飾ペプチドはＹＬＥＰＧＰＶＴＶ（Ｇ９−２８０−９Ｖ）（配列ＩＤ番号：１０４）である。本発明にはここに開示したｇｐ１００配列（図５Ａ；配列ＩＤ番号：２７および図７Ａ；配列ＩＤ番号：１２１）から誘導されるこれらの修飾ペプチドの類似体もさらに含まれる。術語類似体には上記のこれらの修飾ペプチドの機能的特色を示す任意のペプチドが含まれるつもりである。これらの修飾ペプチドは常法により合成的にまたは組換え的に提供される。別の態様では、表１５−１７に示されたようなｇｐ１００アミノ酸配列または修飾ｇｐ１００ペプチドまたはそれらの類似体は治療的にまたは予防的にワクチンとして使用される。予防的には、ワクチンはメラノーマが明白になる前に投与される。これらのペプチドの予防的投与は哺乳類においてメラノーマを防止または減少させるために働くべきである。好適な態様において、メラノーマの高い危険性を持つ哺乳類（好適にはヒト）はこれらのワクチンで予防的に処置される。もしくは、メラノーマまたは転移性メラノーマで表される腫瘍抗原への患者自信の免疫応答を促進するために治療的にワクチンが投与されるであろう。免疫原として働くワクチンは細胞、ｇｐ１００免疫原性ペプチドをコードしている核酸配列を運ぶ組換え体発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現された蛋白質を含んでいる培養上清液であろう。これらの免疫原性ペプチドをコードしている核酸配列が導入される発現ベクターはＭＡＲＴ−１で記載したものと同一である。もしくは、免疫原は部分的または実質的に精製された組換え体ｇｐ１００ペプチドまたはそれらの類似体である。投与されるべき免疫原は純粋なまたは実質的に純粋な形でも可能であるが、上記ＭＡＲＴ−１で記載した医薬組成物、処方または製剤として存在させるのが好適である。ワクチン接種は前にＭＡＲＴ−１で記載したような常法により実施できる。本発明のさらに別の態様において、一つまたはそれ以上のメラノーマ抗原に対する多価ワクチンが提供される。そのような多価ワクチンはＭＡＲＴ−１蛋白質ペプチドまたは修飾ペプチドのすべてまたは一部、またはｇｐ１００ペプチドまたは修飾ペプチドまたはそれらの組み合わせを含んでいる。メラノーマ抗原をコードしている遺伝子の同定において従来は抗原で免疫化または前もって処置したメラノーマ患者から単離されたＰＢＬを利用していた（ＶａｎＤｅｒＢｒｕｇｇｅｎｅｔａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７；Ｂｒｉｃｈａｒｄｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５；Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ，Ｃ．，ｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４５３−１４５７）。好適な方法は腫瘍を持つ患者を免疫化することなく、該患者からのＴＩＬにより認識される腫瘍抗原をコードしている遺伝子を同定することである。同定された遺伝子は増殖している癌に対する自然の免疫応答に含まれた抗原をコードしているのでそのような方法で可能性が大きくなる。従って、本発明はメラノーマを持つ患者の腫瘍からの腫瘍浸潤性リンパ球単離物（ＴＩＬ）を用いるｃＤＮＡ発現クローニングを利用するメラノーマ抗原コード遺伝子の同定法も提供する。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）メラノーマを持つ哺乳類の腫瘍から腫瘍浸潤性リンパ球を単離し；（ｂ）哺乳類細胞株内にメラノーマｃＤＮＡライブラリーを導入し；（ｃ）該哺乳類細胞を該ＴＩＬに暴露し；（ｄ）該ＴＩＬにより認識される該哺乳類細胞中の該ｃＤＮＡによりコードされている抗原の発現をスクリーニングし；および（ｅ）該抗原に対応する該ｃＤＮＡを単離する。工程（ａ）の腫瘍浸潤性リンパ球はメラノーマを持つ患者の病巣、皮下組織または内臓を含む（しかしこれらに限定されるわけではない）から単離されるであろう。工程（ｂ）で使用されるｃＤＮＡライブラリーの製造に使用される細胞の例としては新鮮なまたは培養されたメラノーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。好適には、ｃＤＮＡライブラリーはメラノーマ抗原を発現していない哺乳類細胞内へ導入される。もしＴＩＬによる認識のための所望のＨＬＡハロタイプを発現していない非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞が工程（ｂ）で使用されるならば、そのような細胞は以下に記載するようにＨＬＡ遺伝子で同時トランスフェクションできる。工程（ｂ）で使用できる細胞の例としては乳癌細胞株ＭＤＡ２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ２６）またはＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）のような腫瘍細胞株が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。使用できるＭＨＣ遺伝子の例としてはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ −Ｃ遺伝子、好適であるのはＨＬＡ−Ａ２およびそのサブタイプ（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９２）ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４０：２２１ −２２８）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。使用するのに適したＭＨＣ遺伝子はｃＤＮＡライブラリー源であった腫瘍細胞のハロタイプにより決定される。標準的な方法がＴＩＬ単離物により認識されるハロタイプの決定に使用できる（ＡＳＨＩＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版１９９０）。ＴＩＬにより認識される抗原を発現しているｃＤＮＡクローンを含む細胞の認識を如何にして評価するかの例としてはγインターフェロンアッセイ、ＴＮＦ分泌（ＶａｎｄｅＢｒｕｇｇｅｎｅｔａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７）または認識された抗原をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の溶解などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは当業者には既知の常法により実施される。ｃＤＮＡを含むベクターの隣接部位に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによりメラノーマ抗原が単離できる。ＴＩＬにより認識される抗原に対応するｃＤＮＡを如何にして単離するのかの例としてはＰＣＲが挙げられるが、これに限定されるわけではない。メラノーマ抗原をコードしている遺伝子または核酸配列が同定されたら、次の工程はこれらの遺伝子によりコードされている蛋白質の抗原性部分またはエピトープを同定することである。従って、本発明のさらに別の態様では、ＭＡＲＴ− １蛋白質（図１；配列ＩＤ番号：２）またはｇｐ１００蛋白質（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および配列ＩＤ番号１２１）の予測されるアミノ酸配列から誘導されるペプチドの免疫原性を評価するための方法が提供される。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）ＭＡＲＴ−１（図１；配列ＩＤ番号：２）またはｇｐ１００（図５Ａおよび図７Ａ；配列ＩＤ番号：２７および配列ＩＤ番号１２１）アミノ酸配列に基づく多数のペプチドを調製し；（ｂ）少なくとも一つの該ペプチドと哺乳類細胞株をインキュベートし；（ｃ）該ペプチドとインキュベートした該哺乳類細胞を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に暴露し；および（ｄ）該ペプチドとインキュベートした該細胞をＴＩＬの認識でスクリーニングする。約２５から５のアミノ酸、より好適には２０から１０のアミノ酸、および最も好適には９−１０のアミノ酸のペプチドを使用するのが好ましい。工程（ｂ）で使用される細胞の例としてはＴ２細胞（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４５：４４９−４５２）またはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ペプチドとインキュベートされた細胞の認識をどのように評価するのかの例としては⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４５：４４９−４５２）またはγ−ＩＦＮまたはＴＮＦ分泌のようなリンホカインアッセイ（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ，Ｄ．ｅｔａｌ．，（１９９１）Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４６：３６７４−６８１）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。Ｔ細胞認識抗原はＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成する。すべての哺乳類種のＭＨＣ座は多数の遺伝子を含んでおり、高度に多形である。異なったＭＨＣ分子またはハロタイプ型は異なった抗原に結合する。ヒトにおいてＨＬＡ複合体はクラスＩ分子をコードしているＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子座を含んでいる。リンパ球はＨＬＡクラスＩ分子に関して腫瘍抗原を認識するであろう。もし組換え体ＭＡＲＴ−１発現ベクターを含む細胞がＴＩＬでスクリーニングされるがヒト細胞ではなく（ＣＯＳ細胞のような）、または所望のハロタイプを発現しないならば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を含む発現ベクターが細胞内へ導入されるであろう（実施例１参照）。これは本発明のさらに別の態様を表している。ＭＡＲＴ−１抗原およびＨＬＡ抗原を発現している細胞は特異的ＭＨＣクラスＩ制限型に関連して腫瘍抗原の存在を検出するためにＴＩＬでスクリーニングできる。適したハロタイプはライブラリーが誘導される腫瘍のハロタイプにより決定される。使用できるＭＨＣクラスＩ遺伝子の例としてはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好適なＭＨＣ特異性または制限型の例としてはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２．１サブタイプ（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９２）ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４０：２２１−２２８）のようなＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。最も好適であるのはＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子である。獣医学的な使用もまたここに記載された組成物および治療的応用により含まれているつもりである。本明細書で引用したすべての本、文献および特許は全文のまま引例として含まれている。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、その範囲を限定しているものではない。腫瘍内浸潤自己由来Ｔ細胞により認識される共有されたヒトメラノーマ抗原の遺伝子コードのクローニング実施例１細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生および細胞株の培養Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１に記載されているように、ＣＴＬは切り出された腫瘍標本から細胞の懸濁液を６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ−ＯｎｃｏｌｏｇｙＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐ．Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）と３０−７０日培養することにより発生させた。ＴＩＬ５０１およびＴＩＬ１２３５は主としてＣＤ８⁺であり、進行した転移性メラノーマを持つ患者の腫瘍標本から誘導された。ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローン、ＴＩＬ５０１．Ａ４２は限界希釈法により確立され、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と照射された（一週間の一度を４から６回）自己由来腫瘍細胞とともに培養された。メラノーマ細胞株３９７ｍｅｌ、５０１ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、５３７ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、９５２ｍｅｌおよびエプスタインーバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株、５０１ＥＢＶＢ、８３６ＥＢＶＢは我々の研究室で確立され、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭＤ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄＮ．Ｙ．）培地中で培養された（Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）。正常培養メラノサイト、ＮＨＥＭ４８３、ＮＨＥＭ４９３、ＮＨＥＭ５２７、ＮＨＥＭ５２９、ＮＨＥＭ５３０、ＮＨＥＭ５３３、ＮＨＥＭ６１６およびＮＨＥＭ６８０はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから購入され、ＦＭ７２５、ＦＭ８０１、ＦＭ９０２はＭ．Ｈｅｒｌｙｎ，ＷｉｓｔａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＰＡから提供を受け、ＨＡ００２はＲ．Ｈａｌａｂａｎ，Ｙａｌｅｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＴから提供を受け、メラノサイト増殖培地（ＭＧＭ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で培養した。メラノーマ細胞株Ｃ３２、ＲＰＭＩ７９５１、ＷＭ１１５、Ａ３７５、ＨＳ６９５Ｔ、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、結腸癌細胞株Ｃｏｌｌｏ、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒ、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１、ＭＣＦ７、ＨＳ５７８、ＺＲ７５、神経芽細胞腫細胞株ＳＲ−Ｎ−ＳＨ、膠腫細胞株Ｕ１３８ＭＧ、ＨＳ６８３、Ｈ４、肉腫細胞株１４３Ｂ、アデノウイルスタイプ５で形質転換された胎児性腎臓細胞株２９３はＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入され、腎癌細胞株ＵＯＫ１０８およびＵＯＫ１１７はＭ．ＬｉｎｅｈａｎＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。小細胞肺癌細胞株Ｈ１０９２はＪ．Ｄ．Ｍｉｎｎａ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｅｘａｓＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから提供された。Ｅｗｉｎｇ肉腫細胞株ＴＣ７１、ＲＤ−ＥＳ、６６７４はＭ．Ｔｓｏｋｏｓ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供された。神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳはＯ．Ｍ．ＥｌＢａｄｒｙ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。形質細胞腫細胞株ＨＭＹ −Ｃ１ＲおよびＭ１線維芽細胞株はＷ．Ｂｉｄｄｉｓｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。腎臓上皮細胞ＫＡＭ、ＷＬＣはＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣのＤ．Ｊ．Ｈａｚｅｎ−ＭａｒｔｉｎおよびＤ．Ａ．Ｓｅｎｓから提供された。サル腎臓細胞株ＣＯＳ７はＷ．Ｌｅｏｎａｒｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから提供を受けた。細胞毒性アッセイ ⁵¹Ｃｒ放出アッセイはＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１に記載されているように実施された。簡単に記すと、⁵¹Ｃｒで標識された５０００の標的細胞を異なった数のエフェクター細胞と混合し、５時間インキュベートした。次に上清液を集め、放射活性を測定して特異的溶解のパーセントを計算した。ＩＦＮ−γ放出アッセイ９６フラットウェルマイクロプレートを用い、ウェル当たり１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む３００μｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、５万から１０万の応答細胞および４ｘ１０⁴−１０⁵の刺激要因細胞を混合した。２０時間インキュベーションした後、１００μｌの上清を集め、抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ，ＣＡ）で被覆した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プレート（ＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に加えた。４℃で一夜インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γポリクローナル抗体（Ａｂ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍｅｒｉｌｌｏ，ＣＡ）の１：２０００希釈液を１００μｌ加えて３７℃で２時間インキュベートした。プレートは３回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｂ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の１：２０００希釈液を１００μｌ加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの４ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェノールホスフェート（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、室温、暗所にて１０−２０分インキュベートし、反応を停止させるために２５μｌの１ＮＮａＯＨを加えた。４０５ｎｍの波長で光学密度を測定し、同一のアッセイで測定された組換え体ＩＦＮ−γ標品（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と比較してＩＦＮ− γの濃度を計算した。ｃＤＮＡ発現クローニングｃＤＮＡライブラリーは（Ｍｉｋｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ；８３：１３７−１４６；Ｍｉｋｉｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｉ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５１６７−５１７１）に記載されているようにＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞株５０１ｍｅｌからのポリＡＲＮＡから構築された。簡単に記すと、第一鎖ｃＤＮＡはリンカープライマーＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ（Ｔ）₄₀（配列ＩＤ番号：４２）で合成され、続いて第二鎖ｃＤＮＡ合成が行われた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後、二つのオリゴヌクレオチドＣＣＡＩＴＣＧＣＧＡＣＣ（配列ＩＤ番号：４３）およびＧＧＴＣＧＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡ（配列ＩＤ番号：４４）からなるＳｆｉＩアダプターをｃＤＮＡの末端に連結した。ｃＤＮＡはＳｆｉＩで消化し、消化された断片はスパンカラムを通して単離された。ｃＤＮＡは次にＳｆｉＩ消化により調製されたバクテリオファージλｐＣＥＶ２７（Ｍｉｋｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８８：５１６７−５７７１）ベクターアームと混合し、インビトロパッケージングが実施された。メラノーマ抗原をスクリーニングするため、改良リン酸カルシウム法（ＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、約１０⁷クローンを含む増幅ｃＤＮＡライブラリーがＨＬＡ−Ａ２⁺抗原非発現細胞株、ＭＤＡ２３１クローン７およびＡ３７５クローン１−４内へトランスフェクトされた。Ｇ４１８（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）選択後、個々のコロニーを単離し、９６ウェルマイクロプレート中で培養してレプリカプレートを作製した。５ｘ１０⁴ＴＩＬ１２００および５ｘ１０⁴ＴＩＬ１２３５の混合物を、コンフルエント近くまで増殖しているトランスフェクト体を含むマイクロプレートのウェルに加え、２０時間インキュベートした。上清を集め、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。陽性トランスフェクト体のゲノムＤＮＡからトランスフェクトされた遺伝子を取り出すため、挿入された遺伝子に隣接するＳＰ６およびＴ７プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施された。増幅生成物はｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化さよびＸｈｏＩ断片が発現ベクターｐｃＤＮＡ３（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内へサブクローン化された。クローン化ｃＤＮＡが腫瘍抗原をコードしているかどうかを試験するため、クローン化遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３がＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｅｅｄ，Ｂ．およびＡｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：３３６５−３６９）によりＣＯＳ７細胞株内へ過渡的にトランスフェクトされた。簡単に記すと、６ウェルプレートを用い、ウェル当たり３ｘ１０⁵の細胞を１００μｇのＤＥＡＥデキストラン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのクロロキンおよびクローン化遺伝子および／またはｐｃＤＮＡ−ＨＬＡ−Ａ２．１（Ｚｅｍｍｏｕｒ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９２）ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４０：２２１−２２８）を含むｐｃＤＮＡ３を１μｇ含む０．７５ｍｌのＤＭＥＭ中、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去した後、１０％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ緩衝液を加えて２分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、７．５％ＦＣＳＤＭＥＭ中で２日間インキュベートした。２９３細胞株はリポフェクタミン（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用い、使用説明書に従って過渡的にトランスフェクトされた。インキュベーション後、トランスフェクトされたＣＯＳ７または２９３細胞のＴＩＬからＩＦＮ−γ放出を媒介する能力が評価された。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子の発現はフローサイトメトリーにより試験された。安定なトランスフェクト体はリン酸カルシウム法により作製され、個々のコロニーおよびプールされたトランスフェクト体は細胞毒性およびＩＦＮ−γ放出アッセイによりＴＩＬへの反応性が試験された。クローン化遺伝子のＤＮＡ配列決定はｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰを用いるジデオキシ鎖停止法により実施された。ＤＮＡおよび蛋白質配列はＧｅｎｅＢａｎｋのＧＣＧプログラム、ＥＭＢＬデータライブラリーヌクレオチドデータベースおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＧｅｎＰｅｐｔ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ蛋白質データバンク蛋白質データベースにより分析された。ノーザンブロット分析全ＲＮＡはグアニジンーイソシアネートー塩化セシウム遠心分離法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：５２９４）により単離された。正常組織からの全ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ，（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から購入された。全ＲＮＡの１０から２０μｇが１％アガロースホルムアルデヒドゲルの電気泳動にかけられ、ナイロン膜（Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶ膜、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）。クローン２２からの完全長ｃＤＮＡを含むＳａｌＩ消化断片およびβ−アクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）はランダムプライミングにより標識され、プローブとして使用された。プローブとのハイブリダイゼーションはＱｕｉｋＨｙｂプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って６８℃で２−１６時間行われた。膜を２回２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて６０℃にて１５分間、１回０．１ＸＳＳＣを用いて６０℃にて１５分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。メラノーマ患者からの培養ＴＩＬの特性付けＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ患者から複数のＴＩＬが確立され、ＨＬＡ−Ａ２⁺およびＨＬＡ−Ａ２^-患者からのメラノーマ細胞株の溶解が試験された。患者のＨＬＡ型検査は通常のＨＬＡ型検査技術により実施された。クラスＩＭＨＣ抗原を最もよく発現し、メラノーマ抗原の認識の優勢な制限要素であることが示されている（Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９２−１６９４）のでＨＬＡ−Ａ２が選択された。ＴＩＬ５０１、ＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ１２００はＨＬＡ−Ａ２制限様式で共有メラノーマ抗原の特異的認識を示した。ＴＩＬ５０１．Ａ４２は限界希釈によりＴＩＬ５０１から確立されたＴ細胞クローンであった。これらのＴＩＬは種々のＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマまたはメラノサイト株と同時培養された場合には溶解またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカインの放出を起こすが、ＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマ細胞株または乳癌細胞株ＭＤＡ２３１を含むＨＬＡ−Ａ２⁺非メラノーマ細胞株では起こさない。二つの代表的な実験が表１に示されている。従って、これらのＣＴＬはメラノサイト系特異的抗原から誘導される非突然変異体ペプチドを認識するように思われる。Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原のｃＤＮＡコードのクローニングＨＬＡ−Ａ２⁺５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株からのｃＤＮＡライブラリーを二つの非常にトランスフェクト可能なＨＬＡ−Ａ２．１⁺癌細胞株ＭＤＡ２３１およびＡ３７５内へトランスフェクトした。これらの細胞株はメラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解されないが、Ｍ１_59-66ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；一文字コード（配列ＩＤ番号：４５）、インフルエンザマトリックス蛋白質またはＭ１遺伝子を含む組換え体ワクシニアウイルスの感染を誘導（データは示されていない））でインキュベーション後にＨＬＡ−Ａ２制限インフルエンザＭ１特異性ＣＴＬにより溶解される。従って、これらの細胞株は正常抗原プロセッシングおよび発生能力を示すが、関連メラノーマ抗原の発現が欠けているためこれらのメラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解されない。Ｇ４１８で選択後、各々の細胞株から約６７００のトランスフェクトされたクローンが単離され、マイクロプレートで増殖された。ＩＦＮ−γ放出アッセイを用い、２１のＭＤＡ２３１および２７のＡ３７５陽性クローンが単離され、再スクリーニングされた。これらのクローンの内、８つのＭＤＡ２３１および７つのＡ３７５クローンが二回めのスクリーニングアッセイで陽性であった。組み込まれた遺伝子をとるため、これらの陽性トランスフェクト体からのゲノムＤＮＡを用い、挿入遺伝子に隣接するＳＰ６およびＴ７プライマーでＰＣＲが行われた。ＭＤＡ−２２およびＭＤＡ−２３トランスフェクト体からの１．６ｋｂバンドを含む１から２の鮮明なバンドを示した７つのトランスフェクト体かられ、さらにｐｃＤＮＡ３真核生物発現ベクター内へクローン化された。ｃＤＮＡ２２プローブによるノーザンブロット分析により検出された１．６ｋｂバンドは、この断片が完全長ｃＤＮＡであったことを示唆した。クローン２２または２３からのｃＤＮＡを含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＣＯＳ７または２９３細胞内への過渡的トランスフェクションはＨＬＡ−Ａ２．１と一緒に加えるとＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ５０１．Ａ４２にＩＦＮ−γの特異的放出により示される反応性を与えた（表２、実験１および２）。これらのｃＤＮＡ断片のＭＤＡ２３１またはＡ３７５ｍｅｌ細胞株内への安定なトランスフェクションもまたＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ５０１．Ａ４２に反応性を与えた（表２、実験３）。ＴＩＬ５０１．Ａ４２はｃＤＮＡ２２で安定にトランスフェクションされたＭＤＡ２３１を溶解できた（データは示されていない）。以上の結果は、メラノーマ患者からのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬにより認識されるメラノーマ抗原をこれらのｃＤＮＡがコードしていることを示している。別のクローン、ＭＤＡ−２５のトランスフェクションはＴＩＬ１２００のみからインターフェロン−γの放出を刺激した。このｃＤＮＡの特性付けにより、それはモノクローナル抗体ＨＭＢ４５により認識され、従来記述されているメラノーマ抗原ｇｐ１００とは類似しているものの異なっていることが明らかにされた。このクローンは実施例３により詳細に記載されている。ＴＩＬ５０１．Ａ４２およびＴＩＬ１２３５はほとんどのＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞株を溶解し、ＨＬＡ−Ａ２メラノーマおよびメラノサイトと培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。^*51 Ｃｒ放出アッセイはＴＩＬ５０１．Ａ４２に対してはＥ：Ｔ＝２０：１で、ＴＩＬ１２３５に対しては４０：１で行われた。乳癌細胞株ＭＤＡ２３１を除いてすべての標的はメラノーマ細胞株である。^** ＴＩＬおよび刺激細胞を２０時間一緒に培養した後、上清中のＩＦＮ−γが測定された。５０１ｍｅｌおよび５８６ｍｅｌはメラノーマ細胞株である。他のすべては正常メラノサイト株である。⁺ ＬＡＫ：リンホカイン活性化キラー細胞。⁺⁺ ＴＩＬ５８６はクラスＩＭＨＣ制限メラノーマ特異性ＴＩＬであり、ＨＬＡ −Ａ２により制限されない。クローン２２および２３のｃＤＮＡ配列はＰＣＲにより導入された変化と信じられる単一の塩基を除いて同一であった。二つの他の独立して増幅された断片もまたこの領域を明らかにするために配列決定され、共通配列が図１に示されている。この遺伝子中の最も長い読み枠は１３ｋｄの１１８アミノ酸蛋白質に対応する３５４の塩基から成っている。この配列は確立されたデータベース内のどの完全ヌクレオチドまたは蛋白質配列とも有意な類似性を示さなかった。アミノ酸２７−４７はＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド（Ｆａｌｋ，Ｋ．，ｅｔａｌ．（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ３５１：２９０−２９６；Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔａｌ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１２６１−１２６３；Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９３），Ｃｅｌｌ７４：９２９−９３７；Ｎｉｊｍａｎ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔａｌ．（１９９３），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１２１５−１２１９）を含むであろう疎水領域から成っている。ｃＤＮＡ２２および２３によりコードされている抗原はＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞−１により認識されるメラノーマ抗原）と称された。発生させた１０のＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬの９つがＭＡＲＴ−１を認識し、４つがここに記載し、単離されたｇｐ１００の型を認識したが（実施例３参照）、どれもＭＡＧＥ−１を認識しなかった（Ｚａｋｕｔ，Ｒ．，ｅｔａｌ．（１９９３），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：５−８；データは示されていない）。ＤＥＡＥデキストラン法によりＨＬＡ−Ａ２．１および／またはｃＤＮＡ２２を含むｐｃＤＮＡ３で過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ７または２９３細胞株（実験１＆２）、またはｃＤＮＡ２３で安定にトランスフェクトされたＡ３７５またはＭＤＡ２３１細胞株（実験３）と２０時間一緒にＴＩＬをインキュベートした後に上清中のＩＦＮ−γが測定された。ＩＦＮ−γはＴＩＬがｃＤＮＡ２２または２３でトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ２⁺とインキュベートされた場合のみに分泌された。^* 刺激剤なしのＴＩＬ単独により分泌されたＩＦＮ−γ（＜５０ｐｇ／ｍｌ）は差し引かれている。⁺ 実施されなかった。遺伝子２２の完全長ｃＤＮＡをプローブとして、１０−２０μｇの全ＲＮＡをノーザンブロット分析で調べた。ほとんどのメラノーマ、試験されたすべてのメラノサイト株および網膜が陽性であった。ＭＡＲＴ−１の発現ＭＡＲＴ−１をコードしている遺伝子の発現を評価するためメラノーマ、メラノサイトおよび非メラノーマ癌細胞株および正常組織を含む種々の細胞株のノーザンブロット分析が実施された（表３）。１０のＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株の内の７つ、４つのすべてのＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマ細胞株、試験された７つのすべてのメラノサイト株がＭＡＲＴ−１ＲＮＡ発現が陽性であった。最近我々の研究室で確立されたすべてのＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株はこのノーザン分析においてＭＡＲＴ−１ＲＮＡを発現した。表３に示した１０のＨＬＡ −Ａ２⁺メラノーマ細胞株においてＭＡＲＴ−１発現とＴＩＬ５０１．Ａ４２による溶解の間には完全な相関がある。ＭＡＲＴ−１Ａｇを認識するＴＩＬ５０１．Ａ４２は試験された１７のＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株の１３（７６％）を溶解させた（データは示されていない）。ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡ発現が試験された１０の正常ヒト組織では網膜のみが陽性であった。Ｔ細胞、Ｂ細胞、腎臓上皮細胞または線維芽細胞または１９の非メラノーマ腫瘍では陽性は観察されなかった。従って、ＭＡＲＴ−１は皮膚および網膜からのメラノサイト系細胞で発現され、またメラノーマ細胞でも発現されるこれまでに記載のない抗原であるようである。Ｔ細胞クローンおよび免疫選択メラノーマクローン（Ｋｎｕｔｈ．Ａ．，ｅｔａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：２８０４−２８０８；Ｗｏｌｆｅｌ，Ｔ．，ｅｔａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：７９７−８１０）の一団を用いた研究、並びにメラノーマ細胞からのＨＰＬＣ分画ペプチド分析の研究（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２９５５−２９６３；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９−３７２７）は免疫応答を惹起できる複数の抗原性ペプチドがメラノーマ上に存在することを示唆している。ｃＤＮＡクローニングにより、メラノーマ抗原をコードしている二つの遺伝子が同定されている；ＭＡＲＴ−１（図１；配列ＩＤ番号：１）およびｇｐ１００遺伝子（実施例３参照；図４Ａおよび４Ｂ；配列ＩＤ番号：２６）。ＭＡＲＴ−１およびここで同定されたｇｐ１００の型（図４＆５Ａ；配列ＩＤ番号：２６および２７）は両方ともＨＬＡ−Ａ２．１制限ＴＩＬで認識される。ＭＡＲＴ−１抗原は約１３ｋｄの１１８アミノ酸の蛋白質である。ＭＡＲＴ−１に関する遺伝子またはアミノ酸配列はこれまで報告されていない。ＭＡＲＴ−１ＲＮＡは１４のＨＬＡ−Ａ２．１陽性または陰性メラノーマ株の内の１１、７つのメラノサイト株の内の７つで発現された。網膜組織を除き、試験された正常組織、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、腎臓上皮株、線維芽細胞株または結腸、乳、脳、腎臓、肺または骨の癌からの１９の腫瘍細胞株ではＭＡＲＴ−１発現は観察されなかった。繰り返しのインビボまたはインビトロ免疫化に続いて末梢血リンパ球に由来するＴ細胞により認識される別のメラノーマ抗原、ＭＡＧＥ−１が記載されている（ＶａｎＤｅｒＢｒｕｇｇｅｎ，ｅｔａｌ．（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３−１６４７）。メラノーマ腫瘍抗原に関連した遺伝子の同定は、ウイルスまたは細菌ベクター系内へのこれらの遺伝子の導入に基づく癌患者の免疫療法において活性で特異的な免疫化法に対する新規な可能性を開くものである。ＭＡＲＴ−１のようなメラノサイトーメラノーマに対して誘導された免疫反応は正常細胞に対しても発生されるであろう可能性が存在する。多分抗メラノサイト免疫反応から生じる白斑がメラノーマ患者においての好ましい予後に付随することが報告されており（Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９８３），Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９：６８９−６９５）；Ｂｙｓｔｒｙｎ，Ｊ−Ｃ，ｅｔａｌ．（１９８７），Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２３：１０５３−１０５５）、化学免疫療法に応答しても報告されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１３３８−１３４３）。抗メラノサイトーメラノーマ反応性を持つＴＩＬが進行したメラノーマの患者に投与されており（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．（１９８８），ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３１９：１６７６−１６８０；ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１８０−１９９）、散在性白斑がこれらの患者に見られるが、網膜細胞上のこれらのメラノサイト抗原の発現に関係した不利な眼科学的影響は観察されなかった。ＨＬＡ−Ａ２は約５０％の個体に存在しており、ＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡＲＴ− １抗原もまたメラノーマ上に広く発現されているので、ＭＡＲＴ−１による免疫化は活性な免疫療法の開発に特に有用であろう。実施例２ＭＡＲＴ−１の免疫原性エピトープの特性付けＴＩＬからのメラノーマ特異的ＣＴＬ株およびクローンの発生メラノーマ特異性ＣＴＬ株は、前に報告されているように（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３）転移性メラノーマから作製される単一細胞懸濁液を６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２（Ｃｅｔｕｓ−ＯｎｃｏｌｏｇｙＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐ．Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）と培養することにより発生させた。Ｔ細胞クローン、Ａ４２は患者５０１から限界希釈法により確立された。ＣＴＬによる抗原認識の評価Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８に記載されているように、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＦＳおよびＴＮＦ −αを測定するために⁵¹Ｃｒ放出アッセイおよびＥＬＩＳＡを用いるサイトカイン放出アッセイが実施されＴＩＬの反応性が分析された（実施例１参照）。メラノーマ細胞株は本研究室で確立された。ＴＩＬによる既知の抗原の認識の分析のため、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００かまたはチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．，（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：２８０７）をコードしているｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞株、並びにＨＬＡ−Ａ２．１ｃＤＮＡがＴＩＬと２０時間インキュベートされ、上清へ分泌されたＩＦＮ−γが実施例１に記載されたようにＥＬＩＳＡにより測定された。プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤＩｅｇｏ，ＣＡ）中のＭＡＲＴ−１（実施例１参照）またはｇｐ１００（実施例３参照）コード化ｃＤＮＡはＴＩＬ１２３５またはＴＩＬ１２００を各々スクリーニングすることにより５０１ｍｅｌメラノーマｃＤＮＡからクローン化された（実施例１参照）。ｐＣＥＶ２７プラスミド中のチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）はｇｐ７５の報告されている配列（Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．（１９８０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：２８０７）に基づいたＰＣＲにより発生させたプローブを用いて５０１ｍｅｌメラノーマｃＤＮＡライブラリーから単離された。ペプチド合成および抗原性ペプチドの同定ペプチドはＧｉｌｓｏｎＡＭＳ４２２多ペプチド合成機を用いて固相法により合成された。ペプチドはＶｙｄａｃＣ−４カラムを用いて０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルで溶出するＨＰＬＣにより精製した。抗原性ペプチドを同定するため、各々のペプチドと２時間前もってインキュベートしたＴ２細胞株のＴＩＬ溶解が⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを用いて測定された。ＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＣＴＬ株およびクローン，Ａ４２は１０人のメラノーマ患者の腫瘍浸潤リンパ球から確立された。これらのＴＩＬはＨＬＡ −Ａ２を発現している自己由来およびほとんどの同種由来の新鮮または培養メラノーマを認識するが、ＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマまたはＨＬＡ−Ａ２⁺非メラノーマ細胞株（Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４８：６３８）を認識しない。またそれらは新生児皮膚から誘導されたＨＬＡ −Ａ２⁺正常培養メラノサイトも認識する（実施例１およびＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ１４：８８参照）。従って、これらのＴＩＬはＨＬＡ−Ａ２に関連してメラノーマおよびメラノサイトで発現される蛋白質から誘導された非突然変異体自己ペプチドを認識した。ＴＩＬによる別のメラノーマ蛋白質の認識ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００の一つの型（図５Ａ；配列ＩＤ番号：２６、実施例３参照）およびチロシナーゼ関連蛋白質（ｇｐ７５）を含む４つの単離されたメラノーマ蛋白質の認識の頻度を評価するため、ＣＯＳ７に対する反応性がＨＬＡ −Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡと、またはなしで、これらの３つの蛋白質をコードしているｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞株上で試験された。９のＴＩＬとのいくつかの実験の内の一つが表４に示されている。９つのＨＬＡ− Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬのうちの８つがＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ−Ａ２．１で同時にトランスフェクトされたＣＯＳ７とインキュベートした場合にＩＦＮ−γを分泌した。比較的オリゴクローナルＣＴＬ株であるＴＩＬ１２００（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：２８２９）のみがこのＣＯＳトランスフェクト体に応答しなかった。４つのＴＩＬ（６２０，６６０，１１４３，１２００）はＨＬＡ−Ａ２．１とともにトランスフェクトした場合にｇｐ１００を認識した。ＴＩＬ１２００はＴＩＬ６２０、６６０および１１４３と比較して多量のＩＦＮ−γを分泌しており、これらの後者の３つのＴＩＬ株中のＴ細胞の小さなサブセットのみがｇｐ１００を認識したことを示唆している。これらのＴＩＬのいずれもがこのアッセイを用いてもｇｐ７５を認識しなかった。従って、ＭＡＲＴ −１はメラノーマ患者から誘導されるほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬにより認識される共通のメラノーマ抗原である。ＴＩＬのためのＭＡＲＴ−１エピトープの同定これらのＴＩＬのためのＭＡＲＴ−１エピトープを同定するため、ＨＬＡ−Ａ２．１への既知のペプチドの結合モチーフ（Ｆａｌｋ，Ｋ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３５１：２９０；Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．ｅｔａｌ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１２６１；Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ７４：９２９）に基づいて２３のペプチドが選択され、合成され（＞９０％の純度）、および各々のペプチドとＴ２株をインキュベーション後にＴＩＬによるＨＬＡ−Ａ２．１⁺Ｔ２細胞株の溶解を試験することによりスクリーニングされた（表５）。Ｔ２細胞（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．ｅｔａｌ．；（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４５：４４９−４５２）細胞株は、ペプチドＭ９−２、Ｍ１０−３またはＭ１０−４と前もってインキュベートした場合、試験された４つすべてのＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬにより溶解された。両方とも１０のアミノ酸ペプチドであるＭ１０−３およびＭ１０ −４はＭ９−２配列を含んでおり、Ｍ１０−３はそのＮ−末端に追加のグルタミン酸を持ち、Ｍ１０−４はそのＣ−末端に余分のイソロイシンを持っている。これらのペプチドはＭＡＲＴ−１の疎水性の推定されるトランスメンブランドメインに位置している。これらのペプチドとインキュベートされた他のＨＬＡ−Ａ２⁺ 細胞を標的として使用した場合に同一の溶解が観察され、それらにはＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトされたＫ４Ｂ（Ｄｒ．ＷｉｌｌｉａｍＢｉｄｄｓｏｎ，ＮＩＨから提供を受けた；Ｓｔｏｒｋｕｓ．Ｗｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５１：３７１９−３７２７）および５０１ＥＢＶＢエプスタインーバールウイルス形質転換Ｂ細胞（Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔａｌ．１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５）またはＨＭＹ−ＣＩＲＢ細胞（Ｄｒ．ＷｉｌｌｉａｍＢｉｄｄｓｏｎ；ＮＩＨ；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９−３７２７）が含まれる（データは示されていない）。ペプチドＭ９−１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−２、Ｍ１０−３、Ｍ１０− ４およびＭ１０−５はさらに精製され、ＭＡＲＴ−１反応性ＴＩＬ１２３５またはＴ細胞クローンＡ４２（図２）によるＴ２細胞の溶解を感作する相対的能力を評価するために力価を測定された。精製されたペプチドＭ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−４は各々１ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌの最少濃度が必要とされた。精製されたＭ１０−４は図２に示したように１０ μｇでさえもＴＩＬクローンＡ４２により認識されなかった。Ｍ９−１、Ｍ９− ３、Ｍ１０−２およびＭ１０−５ペプチドはＡ４２またはＴＩＬ１２３５の両方で認識されなかった。ＨＬＡ−Ａ２．１と、またはなしで、メラノーマで発現される蛋白質をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞と一緒にＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異性ＴＩＬをインキュベートした後の上清でＩＮＦ−γは測定された。ＴＩＬ１２００を除くすべてのＴＩＬはＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ− Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７と培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。ＴＩＬ６２０、６６０、１１４３および１２００はｇｐ１００およびＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＯＳ７と培養した場合ＩＦＮ−γを分泌した。２３のペプチド（配列ＩＤ番号：３−２５）（１２の９−ｍｅｒおよび１１の１０−ｍｅｒ）（＞９０％純度）が合成され、異なった患者からのＴＩＬクローンＡ４２、ＴＩＬ株ＴＩＬ１２３５、ＴＩＬ６６０およびＴＩＬ１０７４による溶解され易さが各々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と前もってインキュベートされたＨＬＡ−Ａ２⁺Ｔ２細胞に対し、Ａ４２に対しては２０：１のＥ：Ｔ比で、他のＴＩＬ株に対しては４０：１での４時間の⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性アッセイで試験された。Ｍ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−４とインキュベートされた場合Ｔ２細胞はよく溶解された。Ｍ１０−３およびＭ１０−４は全Ｍ９−２配列（下線）を含んでいる。異なった患者から確立されたＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬによるＭＡＲＴ−１ペプチドの認識種々のＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡＲＴ−１特異性ＴＩＬがＭＡＲＴ−１抗原中の同一または異なったエピトープを認識するかどうかを評価するため、各々のペプチドと前もってインキュベートされたＴ２細胞の溶解（ＣｅｒｕｎｄｏｌｏＶ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４５：４４９−４５２）が１０人のメラノーマ患者から誘導されたＴＩＬで試験された。１０のＴＩＬの代表的な実験は表６に示されている。Ｍ９−２およびＭ１０−３は１０のＴＩＬの内の９つ、ならびにＡ４２クローンで認識され（ＴＩＬ１２００のみが陰性であった）、ＭＡＲＴ−１およびＨＬＡ−Ａ２．１をコードしているｃＤＮＡで同時にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞と溶解の同一のパターンであった。ＴＩＬ６２０およびＴＩＬ１０８８はペプチドなしでまたは無関係のペプチドの添加後に低レベルの非特異的溶解を示したが、Ｍ９−２、Ｍ１０−３およびＭ１０−５ペプチドと前もってインキュベートすると有意にＴ２細胞の溶解の増加を示した。Ｍ１０−４の認識はＴＩＬ内では異なっているが、Ｔ細胞クローンＡ４２またはＴ細胞株ＴＩＬ１２３５によるＭ１０−４への異なった反応性と似ていた（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｍ９−２またはＭ１０−３に必要とされるよりも、より高い濃度（１ μｇ／ｍｌ）が溶解のためにＭ１０−４では必要とされた。これらの１０のＴＩＬおよびクローンＡ４２はまた、Ｍ９−２またはＭ１０−３と前もってインキュベートされたＴ２細胞とインキュベートした場合、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含むサイトカインも分泌した（データは示されていない）。従って、Ｍ９−２またはＭ１０−３はＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬの大多数により認識される共通のエピトープである。１０人の患者から誘導されたＴＩＬクローンＡ４２およびＴＩＬ株による溶解性が精製されたペプチドＭ９−１、Ｍ９−２、Ｍ９−３、Ｍ１０−３、Ｍ１０−４およびＭ１０−５と前もってインキュベートされたＴ２細胞を用い、Ａ４２に対しては２０：１のＥ：Ｔ比で、他のＴＩＬ株に対しては４０：１での４時間の⁵¹ Ｃｒ放出細胞毒性アッセイで試験された。１０のＴＩＬの内の９つはＭ９−２またはＭ１０−３とインキュベートされたＴ２細胞を溶解した。１０のＴＩＬの内の７つは１μｇ／ｍｌの濃度のペプチドＭ１０−４とインキュベートされたＴ２細胞を溶解した。１０人のメラノーマ患者から誘導されたＴ細胞による既知のメラノーマ蛋白質の認識の相対的頻度が試験された。これらのＴＩＬの９つにより優性に認識されたＭＡＲＴ−１抗原中の共通のエピトープＭ９−２およびＭ１０−３が同定された。スクリーニングアッセイにおいて、ＴＩＬ１２３５を用いるｃＤＮＡ発現クローニングによりＭＡＲＴ−１をコードしているｃＤＮＡが単離された（実施例１参照）。ＭＡＲＴ−１は一つのトランスメンブランドメインを含む１１８のアミノ酸の蛋白質であり、実施例３に記載したｇｐ１００の一つの型のｃＤＮＡの発現パターンと類似し、ほとんどのメラノーマ細胞ならびに培養メラノサイトおよび網膜で発現される。ｇｐ１００は１０のＴＩＬの４つにより認識された。用量応答分析に基づくと、ペプチドＭ９−２が溶解について最も効果的にＴ２細胞を感作し（図２）、このペプチドが自然に加工され腫瘍細胞上に存在するかもしれないことが示唆される。Ｍ９−２を認識するＴ細胞はペプチドＭ１０−３またはＭ１０−４と反応するであろう（なぜなら、後者の１０−ｍｅｒペプチドはペプチドＭ９−２の９つのアミノ酸配列を含んでいるから）。異なったＴＩＬによるこれら３つのペプチドの認識にはいくらかの相違が存在する。例えば、Ｍ１０−４はＴ細胞クローンＡ４２によってはあまり認識されないが、いくつかのＴＩＬ株によってはよく認識される（しかしながら溶解を観察するにはより高いＭ１０−４の濃度が必要とされた）。このことはＨＬＡ−Ａ２に関連するＭ９− ２またはＭ１０−４ペプチドへのＴＣＰ親和性の変化によるものであろうし、もしくは、ＴＩＬ株はＭ９−２かまたはＭ１０−４のみを認識する異なったＴ細胞クローンを含んでいるかもしれない。ペプチドＭ１０−３およびＭ１０−４もまた自然に加工され腫瘍細胞上に存在するかもしれない。ＨＬＡ−Ａ２により示される多メラノーマ抗体の存在は種々のＴ細胞クローンによるメラノーマ細胞クローン認識分析（Ｋｎｕｔｈ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：２８０４；Ｗｏｌｆｅｌ，Ｔ．ｅｔａｌ．，１９８９Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：７９７）、またはＨＬＡ−Ａ２メラノーマ細胞から単離されたＨＰＬＣペプチド分画の分析（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃ．Ｌ．Ｊｒ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２９５５；Ｓｔｏｒｋｕｓ，Ｗ．Ｊ．ｅｔａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３７１９）により示唆されてきている。メラノーマ患者からのほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬがｇｐ７５を除いて共通のＭＡＲＴ−１ペプチドを認識するという観察結果は、Ｍ９−２またはＭ１０−３ＭＡＲＴ−１ペプチドがインビボでのＴ細胞応答を誘導する点で他の既知のメラノーマ抗原よりも強い免疫原であることを示唆している。本研究で使用されたいくつかのＴＩＬがＩＬ−２とともに自己由来患者に注射され、興味あることにｇｐ１００蛋白質（図５Ａ；配列ＩＤ番号：２７）を認識する４つのＴＩＬ（６２０、６６０、１０７４、１２００）すべてが有効な腫瘍退行を誘導した（腫瘍の５０％減少）。ＴＩＬ１２００を除くすべてはＭＡＲＴ−１も認識した。実施例３インビボ腫瘍拒絶に付随する腫瘍浸潤リンパ球により認識される第二のヒトメラノーマ抗原の同定ｃＤＮＡ発現クローニングｇｐ１００と称されるメラノーマ抗原の一つの型をコードしているｃＤＮＡ２５クローンは実施例１およびＭｉｋｉ，Ｔ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：５１６７−５１７１に記載されているような技術と類似の技術を用いてクローン化された。簡単に記すと、５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株から作製されたλｐＣＥＶ２７中のｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトされた乳癌細胞株ＭＤＡ２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ２６）をＴＩＬと同時培養した場合のインターフェロンλ（ＩＦＮ−γ）分泌の測定により抗原陽性をスクリーニングした。ＴＩＬ１２００はＫａｗａｋａｍｉ，Ｙ．，（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２１８３−２１９１に記載されているように発生させた。組み込まれたｃＤＮＡは陽性トランスフェクト体のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより回収され、哺乳類発現プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ｃＤＮＡ２５のための完全長ｃＤＮＡはｃＤＮＡ２５プローブを用いて５０１ｍｅｌ λファージライブラリーから単離された。完全長ｃＤＮＡ２５を含むλ ファージはＸｈｏＩで消化し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼで自己連結してプラスミドｐＣＥＶ２７−ＦＬ２５を作製した。もしくは、ｇｐ１００のために設計されたｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、続いてｐｃＤＮＡ３内へクローン化した（ｐｃＤＮＡ３−ＦＬ２５）。このｃＤＮＡがメラノーマ抗原をコードしているか否かを試験するため、ＣＯＳ７、Ａ３７５またはＭＤＡ２３１内へ再トランスフェクトし、得られたトランスフェクト体はＴＩＬ１２００の刺激で試験した。プラスミドクローンｐＣＥＶ２７−ＦＬ−２５のＤＮＡ配列を自動化ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ａ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）にて、ＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用い、使用説明書に従って決定した。ペプチド合成および抗原性ペプチドの同定ペプチドはＧｉｌｓｏｎＡＭＳ４２２多ペプチド合成機を用いて固相法により合成された。ペプチドはＶｙｄａｃＣ−４カラムを用いて０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルで溶出するＨＰＬＣにより精製した。抗原性ペプチドを同定するため、ペプチドと２時間前もってインキュベートしたＴ２ＲＥＴ細胞のＴＩＬ溶解が⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを用いて測定された。ＴＩＬ１２００を用いる転移性メラノーマ患者の処置広く転移したメラノーマを持ち、化学療法および放射線治療がうまくいかなかった２９才の男性患者（患者番号１２００）を２５ｍｇ／Ｋｇのシクロホスホアミドの単一用量で処置し、続いて１．６ｘ１０¹¹ＴＩＬ（９．１ｘ１０⁹のインジウム標識ＴＩＬを含む）に加えて７用量のＩＬ−２（７２０，０００ＩＵ／Ｋｇ）を８時間ごとに静脈注射した。ＴＩＬおよびＩＬ−２による２回目の処置は３週間後に行われた。放射性核種のスキャンはＴＩＬの腫瘍沈着による局在化を示した（図３Ａ）。処置後８および１１日目での皮下腫瘍のバイオプシは腫瘍へのＴＩＬの有意な局在化を示した（正常組織と比較した場合腫瘍におけるグラム当たりの注射物の比は各々１４．９および１４．０であった）。患者の癌は一回目の処置後急速に退行した。処置後三ヶ月では三つの肝臓病変の二つが消失し、三番目の病変も５０％縮んでいた。多数の皮下転移物も図３Ｂに示されているように（個々の病変の垂直面直径の結果が示されている）完全に退行していた。ＴＩＬ１２００のインビトロ機能の特性付けＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ患者から確立された多数のＴＩＬ株はクラスＩＭＨＺＣ制限様式でメラノーマ細胞株を溶解させ（Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４８：６３８−６４３）、同一の腫瘍細胞株と一緒に培養した場合ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子ーアルファ（ＴＮＦα）または顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を放出することが示されている（Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１３：１８−３０）。患者１２００の転移性皮下腫瘍塊から確立されたＣＤ８⁺ＣＴＬ株、ＴＩＬ１２００は新しい自己由来メラノーマ細胞、ならびに１５のＨＬＡ−Ａ２⁺同種由来メラノーマ細胞株の内の１０を溶解させるが、１８のＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマ細胞株の内の１６または８のＨＬＡ−Ａ２⁺非メラノーマ細胞株の内の６は溶解させない（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ，Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２８２９−２８３３、未発表データ）。表７はＴＩＬにより溶解される５つの代表的なＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株、ＴＩＬにより溶解されない４つの代表的なＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株および１つのＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマ細胞株に対する細胞毒性アッセイを示している。ＴＩＬ１２００はまた新生児包皮から確立されたＨＬＡ−Ａ２⁺正常培養メラノサイトならびにＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ細胞株が同時培養された場合ＩＦＮ−γを分泌した（表８）。従って、ＴＩＬ１２００はほとんどのメラノーマおよびＨＬＡ−Ａ２制限様式の培養新生児メラノサイトにおいて発現される非突然変異自己ペプチドを認識するようである。前に記載したように（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）４０：１のエフェクター：標的比で細胞毒性測定のために５時間−⁵¹Ｃｒ放出アッセイが実施された。モノクローナル抗体ＨＭＢ４５（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）により認められるＨＬＡ−Ａ２およびｇｐ１００の発現はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定された。ｇｐ１００ＲＮＡの発現はｃＤＮＡ２５をプローブとし、ノーザンブロットにより分析された。^* -/+は非常に弱い陽性を示している。ＴＩＬによるＩＦＮ−γ分泌は実施例１で前に記載したようにＥＬＩＳＡで測定した。ＴＩＬ単独で分泌されたＩＦＮ−γの量は差し引かれている（ＴＩＬ８８８に対しては８８ｐｇ／ｍｌ、ＴＩＬ１２００に対してはゼロ）。ＴＩＬ８８８はクラスＩＭＨＣ制限メラノーマ特異的ＣＴＬであるが、ＨＬＡ−Ａ２によっては制限されない。ＮＨＥＭ、ＦＭおよびＨＡは正常培養メラノサイト株に当てはまるが、他はすべてメラノーマ細胞株である。Ｔ細胞に認識されるメラノーマ抗原のためのｃＤＮＡコードのクローニングほとんどのＨＬＡ−Ａ２制限メラノーマ特異的ＴＩＬにより溶解されたＨＬＡ −Ａ２⁺５０１ｍｅｌメラノーマ細胞株からのλｐＣＥＶ２７中のｃＤＮＡライブラリーは、非常にトランスフェクトされ易いＨＬＡ−Ａ２⁺メラノーマ抗原陰性ＭＤＡ２３１クローン７またはＡ３７５クローン１−４内へ安定にトランスフェクトされた。Ｇ４１８耐性細胞を集め、各々の細胞株からの約６７００の個々のトランスフェクト体を単離し、ＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γ分泌を刺激する能力でスクリーニングした。２回目のスクリーニングで陽性であった４つのＭＤＡ２３１および１つのＡ３７５トランスフェクト体から、組み込まれたＤＮＡに隣接するＳＰ６／Ｔ７プライマーを用いるＰＣＲにより６つのＤＮＡ断片が単離され、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローン化された。ｐｃＤＮＡ３ベクター中のこれらの断片は、ｐｃＤＮＡ３−ＨＬＡ−Ａ２．１と、またはなしで、ＣＯＳ７細胞において一時的に発現させた。ＨＬＡ−Ａ２．１とともに試験されたｃＤＮＡの一つ、ｃＤＮＡ２５をＣＯＳ７内へトランスフェクトすると、再現性よくＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γの分泌を刺激する能力が与えられた。Ａ３７５内へのｃＤＮＡ２５の安定なトランスフェクションもまたＴＩＬ１２００からのＩＦＮ−γ放出を刺激した（表９、実験１および実験２）。ｃＤＮＡ２５プローブを使用したメラノーマのノーザンブロット分析により検出された２．２ｋｂバンドはクローン化１．６ｋｂ断片は完全長ｃＤＮＡではなかったことを示唆している。3つのcDNA25のクローンを独立にPCRで増幅して、 GeneBankデータベースのコンセンサスDNA 配列と比較したところ、cDNA25は、過去に登録された2つの遺伝子、すなわちgp100（GenBank Access No．M77348）およびPmel17（Kwon，B.S.，et al.（1991）Proc．Natl．Acad．Sci，USA 88，922 8-9232）とは異なることが判明した。cDNA25は、GenBankのgp100（Accession No ．M77348、gp95としても知られている。）とは2つのヌクレオチドが異なっており、Pmel17の配列（Kwon et al.（1991）Proc．Natl．Acad．Sci，USA88，9228- 9232）と比べると、3塩基の違いと、21塩基の欠失がある点で異なっていた（図5 B）。一部を欠損させたcDNA25を含むpcDNA3(pcDNA3-25)に安定に感染させたHLA-A2⁺ A375(実験1)、またはpcDNA3-25(実験2)、cDNA25の全長を含むpcDNA3(pcDNA3-FL2 5)、またはcDNA25の全長を含むpCEV27-FL25)(実験3)を、HLA-A2.1を含むpcDNA3( HLA-A2.1)と共に一時的に感染させたCOS7を、TIL1200 とともに加温したところ、TIL1200 はIFN-γを分泌した。HLA-A2の発現は、フロー・サイトメトリーにより決定され、インターフェロン−γの分泌は、ELISA により測定された。 cDNA25の全長（FL25）を、2つのプラスミド、pCEV27-FL25またはpcDNA3-FL25 に単離した。いずれのプラスミドもpcDNA3-HLA-A2.1と共にCOS7に感染させたところ、TIL1200によるIFN-γの分泌を誘導する能力が、COS7に付与された。全長のDNAにHLA-A2.1を付け加えたものを感染させたCOS7により刺激された、IFN-γ の分泌の量は、501melの刺激による量と同程度であり、一部を欠損したcDNA25に感染させたCOS7の刺激による量よりも高かった。これはおそらく一部欠損のcDNA 25において、通常のAUG開始コドンでの翻訳開始が変化したことによると思われる(Table 9,実験2,3)。あるいは、一部欠損のcDNA25で失われた5'領域が、TIL12 00においてクローンにより認識される他のエピトープ（抗原決定基）を含んでいるのかもしれない。TIL1200からのIFN-γの放出にはHLA-A2.1の発現が必要であったこと、および、感染した細胞が、無関係なTILからのIFN-γの分泌を刺激しなかったという事実（データは示していない）は、cDNA25が、HLA-A2.1の存在下でTIL1200により認識される抗原をコードしていたこと、および、T細胞からのIF N-γの放出を非特異的に誘導する分子をコードしていなかったことを示す。 501mel cDNAライブラリーから、cDNA25プローブを用いたスクリーニングによりクローニングされた、一部欠損のcDNA25および全長のcDNA25の塩基配列、および、対応するアミノ酸配列（図 5A）を、通常のメラニン細胞から単離されたPme l17、およびメラノーマ細胞系列MEL-1から単離されたgp100のGenBankの配列（図 5B）と比較した。全長のcDNA25は、gp100のアミノ酸配列と比べると、162番目において異なっていた。このアミノ酸の相違は、おそらく多型または腫瘍における突然変異により生じたのであろう。Pmel17と比較すると、cDNA25は、162番目および274番目の2つのアミノ酸が異なり、Pmel17では588-594番目に存在した7つのアミノ酸を含まなかった。オリジナルのMDA231感染体から単離された一部欠損のcDNA25のアミノ酸配列は、3'末端（649番目から最後まで）に、1つの余分なシチジル酸の付加によるフレームシフトに伴う、異なる配列を持つ。この相違が、真に異なる対立遺伝子であることによるのか、または、DNAを操作する過程で生じた突然変異によるのかは明確ではない。とはいえ、TIL1200は、236番目から64 8番目までの間に位置する、突然変異のないペプチドを認識するようである。cDN A25はまた、アミノ酸配列において、ウシの網膜色素上皮で特異的に発現するcDN A RPE1（Kim，R.，and Wistow，G.J.（1992）Exp．Eye Res．55: 657-662）と87 %の類似性、および、ニワトリの色素上皮細胞から単離されたメラノソーム基質蛋白質をコードするcDNA MMP115（Shilyansky，J.，et al.（1993）Proc．Natl ．Acad．Sci，USA，91，2829-2833）と60%の類似性を示した。 gp100蛋白質は、モノクローナル抗体HMB45により認識されることが知られていた（Adema et al.,（1993）Am．J．Pathology，143: 1579-1585）。全長のcDNA2 5に感染させたCOS7細胞は、フロー・サイトメトリーで、このモノクローナル抗体を用いて検出された。pCEV27-FL25またはpcDNA3-FL25のいずれかを一過的に発現した後、COS7は、HMB45により検出される抗原を発現した（データは示していない）。 cDNA25に対するRNAの発現 cDNAの組織特異的発現を評価するため、cDNA25プローブを用いてノザン・ブロット解析を行った。15のメラノーマ細胞系列のうち10系列、および、6つのメラニン細胞系列のすべてが、cDNA25を発現していた（図 6Aおよび6B）。多くの通常の組織では、網膜のみで発現がみられた（図 6C）。T細胞（TILA，B）由来の7 つの細胞系列、B細胞（501EBVB，836EBVB）、および繊維芽細胞（M1）、および2 0のメラノーマでない腫瘍細胞系列（結腸癌のCollo，SW480，WiDr、および乳癌のMDA231，MCF7，HS578，ZR75、および神経芽腫のSK-N-AS，SK-N-SH、およびEwi ng肉腫のTC75，RD-ES，6647、および肉腫の143B、および神経膠腫のU138MG，HS6 83、および腎細胞癌のUOK108，UOK117、および小細胞肺癌のH1092、およびBurki ttリンパ腫のDaudi、および骨髄腫のHMY）はすべてcDNA25を発現していなかった（データは示していない）。したがって、この遺伝子は、モノクローナル抗体であるHMB45、NKI/betab、またはHMB-50を用いて解析したとき（Adema，G.J.，et al.（1993）Am．J．Pathology 143: 1579-1585、Gown，A.M.，et al.（1986）Am J Pathol 123: 195-203、Colombari，R.，et al.（1988）Virchows Archiv A P athol Anat 413: 17-24、Vennegoor，C.，et al.（1988）Am．J．Pathol．130: 179-192、Vogel，A.M.，and Esclamado，R.M.（1988）Cancer Res．48: 1286-12 94）の、過去に単離された形のgp100の発現パターンと同様に、メラニン細胞系列で特異的に発現していることが明らかとなった。cDNA25プローブにより、新生児の培養メラニン細胞系列で検出されたRNAの発現レベルは、メラノーマ細胞系列での発現に比べて有意に低かった。cDNA25を用いたノザン・ブロット解析およびHM B45抗体を用いたフロー・サイトメトリーにより検出されたgp100の発現、および 10のHLA-A2⁺メラノーマ細胞系列でのTIL1200によるメラノーマの溶解の間には、 Table 7に示すように完全な相関があった。 gp100でのエピトープの同定一部欠損した形のcDNA25のアミノ酸配列を、HLA-A2.1の既知の結合領域（Falk ，K.，et al.（1992）Nature 351: 290-296、Hunt，D.F.，et al.（1992）Scien ce 255: 1261-1263、Ruppert，J.，et al.（1993）Cell 74: 929-937）と比較することにより、cDNA25をもとに、9または10アミノ酸の長さをもつ30のペプチドを合成した。TIL1200は、LLDGTATLRL配列のペプチド（SEQ ID NO:27、457-486残基。図 5A、SEQ ID NO:33）と共に加温したときのみ、HLA-A2⁺の細胞系列である T2を溶解したが、他の29のペプチドと共に加温したときには、溶解しなかった（ Table 10，図 5A）。LLDGTATLRL配列のペプチド（SEQ ID NO:33）のみが、TIL12 00によるIFN-γの分泌をも刺激することができた（データは示していない）。 TIL由来の多くのメラノーマ特異的CTLが、メラニン細胞−メラノーマ系列に特異的な蛋白質に由来する、突然変異のない自己のペプチドを認識するようである。なぜなら、これらのTILは、適切な制限エレメント（restriction element）を共有する、ほとんどのメラノーマ細胞系列、および正常の培養メラニン細胞を認識するからである（Anichini，A.，et al.（1993）J．Exp．Med．177: 989-998 、Kawakami，Y.，et al.（1993）J．Immunother．14: 88-93）。メラノーマの患者の免疫治療に有益なメラノーマ抗原を単離および同定する目的で、TIL1200が用いられた。TILは転移癌の患者に投与すると、腫瘍部位に局在し、かつ腫瘍の劇的な退行を伴った。活性化されていないリンパ球、およびリンフォカインで活性化されたキラー細胞とは対照的に、自己のTILは、腫瘍部位に局在することが示されている。この局在は、これらのTILが腫瘍の退行を仲介する能力と相関していた（データは示していない）。複数のCTL種を含むTIL系列の1つであるTIL1200 は、最も高頻度で発現するクラスI MHC抗原（約50%の人がもつ）であり、かつメラノーマ特異的CTLの誘導における主要な制限エレメントであることが示されているHLA-A2の存在下で腫瘍抗原を認識した（Crowley，N.J.，et al.（1991）J． Immunol．146，1692-1699）。 T細胞による認識をスクリーニングに用いてcDNA発現クローニングを行うことにより、TIL1200によって認識される抗原をコードし、かつ、モノクローナル抗体であるHMB45、HMB50、またはNKI/betabによっても認識される膜局在糖蛋白質g p100の1つの形として同定された、1つのcDNA（図 4Aおよび4B、SEQ ID NO: 26）が同定されている（Adema，G.J.，et al.（1993）Am．J．Pathology 143，1579- 1585、Gown，A.M.，et al.（1986）Am J Pathol 123，195-203、Colombari，R. ，et al.（1988）Virchows Archiv A Pathol Anat．413，17-24、Vennegoor，C. ，et al.（1988）Am．J．Pathol．130，179-192、Vogel，A.M.，and Esclamado R.M.（1988）Cancer Res．48，1286-1294）。これらの抗体は、メラニン細胞系列の組織に高度に特異的で、かつほとんどのメラノーマ細胞を強く染色する。NK I/betabは、成人の通常の皮膚のメラニン細胞とも相互作用する（Vennegoor，C. ，et al.（1988）Am．J．Pathol．130，179-192）。HMB45またはNKI/betab抗体のいずれかを用いた免疫電子顕微鏡の研究によって、gp100タンパク質は主に膜および細胞質内の第IおよびII期のメラノソームの繊維状マトリックスに位置することが明らかになった(Vennegoor，C.，et al.（1988）Am．J．Pathol．130， 179-192; Schaumburg-Lever，G.，et al.（1991）J．Cutan．Pathol．18，432-4 35)。まったく独立な手順によって、別の型のgp100をコードするcDNAがgp100に対するウサギのポリクローナル抗血清を用いたスクリーニングによって単離され (Adema，G.J.，et al.（1993）Am J Pathology 143:1579-1585)、TIL1200はこの cDNAクローンをトランスフェクションさせたHLA-A2⁺細胞系列も溶解した(Bakker ，A.B.H．et al.（1994）J．Exp．Med．179:1005-1009)。 _*TIL1200は、LLDGTATLRL（457-466残基）の10量体ペプチドと共に刺激するとT2 細胞を溶解したが、他の29のペプチド(ＳＥＱＩＤＮＯ：27)(273-281，297- 306，373-381，399-407，399-408，409-418，456-464，463-471，465-473，476- 485，511-520，519-528，544-552，544-553，570-579，576-584，576-585，585- 593，592-600，597-605，597-606，602-610，602-611，603-611，605，614，606 -614，606-615，619-627，629-638)の場合は溶解しなかった。⁺ TIL1235は、HLA-A2に制限されるメラノーマ特異的CTLであり、gp-100を認識しない。_** E:Tは50:1である。⁺⁺ ＮＤは、行っていないことを示す。腫瘍内自己抗原gp100と反応性のあるT細胞の存在および抗原反応細胞の特異的な蓄積および増加から考えられる結果としての腫瘍部位におけるこれらのT細胞の豊富化の可能性(Sensi，M．et al.,（1993）J．Exp．Med．178:1231-1246)は、癌の成長における自己抗原への免疫反応の性質および自己抗原に対する免疫寛容の機構について重要な疑問を提起する。ノーザンブロット解析によって示されたメラノサイトにおけるgp100の発現の増加と比べてメラノーマ細胞におけるgp100 の発現が増加していること、または腫瘍部位に独特の炎症状態（サイトカインの分泌および細胞表面の補助刺激性分子の発現と関係していると思われる）が存在することが、gp100に対する寛容を発生させる可能性がある。脱色素化が、優れた予後と関連し(Nordlund，J.J.，et al.（1983）J．Am．Acad．Dermatol．9:68 9-695; Bystryn，J-C，et al.（1987）Arch．Dermatol.，123:1053-1055)、そしてメラノーマ患者への化学免疫治療に対する臨床の応答(Richards，J.M.，et al .（1992）J．Clin．Oncol．10:1338-1343)とも関連することが報告されている。メラノーマ特異的TILが投与された患者には散発性の白斑が見られるが、メラノサイトの破壊に関連する不都合な眼科学的作用は観察されていない。患者1200は白斑またはいかなる眼科的副作用も生じなかった。 TIL1200とIL2の患者1200への導入が癌の退縮に関連していたため、gp100タンパク質(図5A; SEQ ID NO: 27)および同定された10アミノ酸からなるペプチドはヒトの腫瘍拒絶抗原を代表すると思われる。IL2もまた腫瘍の拒絶に関連しているであろうが、生体内(in vivo)におけるTIL2000の腫瘍沈澱への到達および抗腫瘍応答の急速性はTIL治療の応答の特徴である。MART-1同様にgp100を認識した他の3種のTIL系列の養子免疫投与(adoptive transfer)も腫瘍の退縮に関連していた(データは示していない)。チロシナーゼ(Brichard，V.，et al.（1993）J．Exp．Med．178，489-495)およびMART-1(実施例1を参照)はHLA-A2制限されたCTLによって認識されたメラノーマ抗原として同定されている。もう一つの抗原であるMAGE-1はHLA-A1制限されたメラノーマ特異的なCTLによって認識され、精巣および様々な癌細胞において発現している(Van Der Bruggen，P．et al.（1991）Science，254:1643-1647)。しかし、近年開発された10種のHLA-A2制限されたTILはいずれもMAGE-1を認識しないと思われている(Zakut，R.，et al.（1993）Cancer Res．53:5-8)。患者の50%に存在している、メラノーマにおけるgp100タンパク質の広範な発現、腫瘍に侵入するT細胞によるペプチドの認識、HLA-A2による制限、および抗gp1 00反応性と患者1200における癌の退縮との関連は、gp100抗原、特にgp100アミノ酸配列に由来する新規の免疫原ペプチド(図5A; SEQ ID NO: 27)がメラノーマの患者に対する有効な免疫治療の開発に有用であることを示唆する。実施例4 生体内(in vivo)腫瘍認識に関連するTILによるヒトメラノーマ抗原の複エピトープの認識材料と方法 TILからのCTLの生成および転移性メラノーマの患者の治療メラノーマ特異的なCTLは、以前に記載された方法(Kawakami，et al.,（1988 ）J．Exp．Med．168:2183)に従って、6000 IUのIL2を含む培地においてTILから誘導および増殖させた。Surgery Branch，NCIの自家移植の患者に投与された、全ての使用可能なHLA-A2制限されたメラノーマ特異的CTLが本研究において使われた。TILは以前に報告されているように(Rosenberg，S.A.，et al.,（1988）N Engl J Med 319:1676; Rosenberg，S.A.，et al.,（1994）J．NCI．86:1159)、I L2とともに転移性メラノーマの自家移植の患者の静脈内に投与した。Fisherの精密検定を使用して、TILによるgp100の認識とTIL処理に対する外科的応答との関連の決定、並びにMART-1認識との関連の決定を行った。。ペプチドの合成ペプチドはペプチド合成機(モデル AMS 422; Gilson Co．Inc.，Worthington ，OH)を使用して固相法により合成した(純度>90%)。合成されるペプチドは、報告されているHLA-A2.1結合モチーフに基づくヒトのgp100の配列から選択した(Fa lk，K.,（1991）Nature 351:290; Hunt，D.F.，et al,（1992）Science 255:126 1; Ruppert，J.，et al.,（1993）Cell 74:929; Kubo，RT，et al.（1994）J Im munol．152:3193)。次のペプチドも試した: 8個の8量体ペプチド(199，212，218 ，237，266，267，268，269の残基から始まる; 図7A参照)、84個の9量体ペプチド (残基が2，4，11，18，154，162，169，171，178，199，205，209,216，241，24 8，250，255，262，266，267，268，273，278，280，283，286，287，298，290 ，309，316，332，335，350，354，358，361，371，373，384，389，397，399， 400，402，407，408，420，423，425，446，449，450，456，463，465，485，48 8，501，512，536，544，563，570，571，576，577，578，583，585，590，592 ，595，598，599，601，602，603，604，606，607，613，619，648から始まる; 図7A参照)および77個の10量体ペプチド(残基が9，17，57，87，96，154，161，1 69，177，197，199，200，208，216，224，232，240，243，250，266，267，268 ，272，285，287，289，297，318，323，331，342，350，355，357，365，380， 383，388，391，395，399，400，406，407，409，415，432，449,453，457，462 ，476，484，489，492，511，519，536，543，544，548，568，570，571，576， 577，584，590，595，598，599，601，602，603，605，611，629から始まる; 図 7A参照)を合成した。第1のスクリーニングにおいて同定された、可能性のあるエピトープはC-4カラム(VYDAC，Hepseria，CA)を用いてHPLCによって精製し(純度> 98%)、ペプチドの分子量は以前に記載されているように(実施例3; Kawakami，Y. ，et al.,（1994）J．Exp．Med．180:347; Kawakami，Y.，et al.,（1994）Proc Natl Acad Sci（USA）91:6458)、質量分析測定によって確認された。ペプチドのHLA-A2.1への結合分析以前に記述されているように(Ruppert，J.，et al.,（1993）Cell 74:929; Ku bo，RT，et al.,（1994）J Immunol．152:3913; Sett A.，et al.,（1994）Mole cular Immunol．31:813)、可溶性HLA-A2.1重鎖、ヒトβ2-マイクログロブリン、放射性標識したペプチドHBc_18-27(FLPSDYFPSV)および様々な濃度の試料ペプチドを、プロテアーゼ阻害剤の存在下で2日間室温でともにインキュベートした。HLA -A2.1に結合した標識ペプチドのパーセント割合はゲルろ過による分離の後に計算され、標識ペプチドの結合の50%を阻害するのに必要な試料ペプチドの濃度を計算した。ペプチドのHLA-A2.1への相対親和性についても、以前に記載されたように(Sett A.，et al.,（1994）Molecular Immunol．31:813)、比(標識ペプチドの結合の50%を阻害するための標準HBc_18-27ペプチドの濃度／標識ペプチドの結合の50%を阻害するための試料ペプチドの濃度)として計算した。ペプチドの結合は、強(<50nMで50%を阻害，比>0.1)、中(50-500nM,比 0.1-0.01)、または弱(> 500nM,比<0.01)として定義する(Ruppert，J.，et al.,（1993）Cell 74:929; Ku bo，RT，et al.,（1994）J Immunol．152:3913; Sett A.，et al.,（1994）Mole cular Immunol．31:813)。 gp100の全長のcDNAを含むpcDNA3プラスミド(実施例3; Kawakami，Y.，et al. （1994）Paoc Natl Acad Sci（USA）91:6458)をXhoIおよびXbaIで切断した。α- ホスホロチオン酸デオキシヌクレオシド3リン酸をXbaI部位へ取り込ませた後、E xo Size Deletion Kit(New England Biolabs，inc.，Beverly，MA)を用いて標準エクソヌクレアーゼIII段階切除(nested deletion)を行なった。切除したクローンはセルフライゲーションおよび増幅を行なった。それぞれのクローンの正確な切除はDNA配列決定によって確認した。エピトープを含む領域を同定するために、全長のgp100 cDNAの3'末端からエクソヌクレアーゼによる連続切除によって作製されたcDNA断片(D3，D5，D4，C3)並びに5'-コード領域を欠く欠失型gp100 cDN A(25TR)（実施例63; Kawakami，Y.（1994）Proc Natl Acad Sci（USA）91:6458) を含むpcDNA3プラスミド(Invirogen，San Diego CA)をHLA-A2.1 cDNAとともにCO S7細胞にトランスフェクションさせ、トランスフェクションされたCOS細胞のTIL による認識をIFN-γ放出分析を用いて評価した(実施例1; Kawakami，Y.，（1994 ）Proc Natl Acad Sci（USA）91:3515)。 T細胞による抗原認識の評価 T細胞による抗原認識を調査するために、⁵¹Cr放出分析またはIFN-γ放出分析を以前に記載されている方法によって行なった(実施例1,2; Kawakami，Y.，etal .,（1994）Proc Natl Acad Sci（USA）91:3515; Kawakami，Y.，et al.,（1988 ）J．Exp．Med．168:2183)。メラノーマ抗原をコードするcDNAおよびHLA-A2.1 c DNAをトランスフェクトされたCOS7細胞またはペプチドと事前にインキュベートしておいたT2細胞のいずれかを刺激因子としてIFN-γ放出分析に使用した。ペプチドで刺激したT2細胞は細胞毒性分析の標的としても使用した(Kawakami，Y.，e t al.,（1994）J．Exp．Med．180:347)。 TIL処理に対する臨床的応答に相関したTILによるgp100の認識 14種の、TILに由来するHLA-A2制限されたメラノーマ特異的CTLの中の4種がgp1 00を認識し、13種がMART-1を認識した(3種はgp100およびMART-1の両方を認識した)。メラノーマ抗原をコードするcDNAをHLA-A2.1 cDNAとともにトランスフェクトしたCOS7細胞に対するTILの反応性によって調べたところ、いずれもチロシナーゼまたはgp75を認識しなかった(実施例2; Kawakami，Y.，et al.,（1994）J． Exp．Med．180:347)。これらの4種のCTLのHLA-A2制限およびgp100反応性認識特異性については以前に行われている(実施例1-3; Kawakami，Y.，et al.,（1994 ）Proc Natl Acad Sci（USA）91:6458; Kawakami，Y.，et al.,（1992）J Immun ol 148:638; O'Neil，B.H.，et al.,（1993）J Immunol 1410:1418;Shilyansky ，J.，et al.,（1994）Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）91:2829)。14種のCTLのうち10種をIL2とともに自家移植の患者に投与した。表11に要約されるように、g p100を認識可能なCTLによって治療した患者4人全てが客観的な部分的応答(>50% 腫瘍の退縮)を生じた。TIL治療に対する臨床的応答はTILのgp100に対する反応性と関連した(p=0.0048)が、MART-1とは関連しなかった(p=0.4)。これらのデータはgp100が生体内で(in vivo)腫瘍の縮退に関与しうるエピトープを含むことを示唆した。 gp100反応性TILによって認識されるエピトープの同定これら4種のgp100反応性CTLによって認識されるエピトープを同定するために、HLA-A2.1結合モチーフを含む169個のペプチドを合成した。ペプチド認識は、それぞれのペプチドとともに予めインキュベートしたHLA-A2.1+ T2細胞に対するこれらのCTLの反応性を細胞毒性分析およびIFN-γ放出分析を用いて試験することによって評価した。表12に示すように、細胞毒性分析において7個のペプチドがgp100反応性TILによって認識された。同時に行われたIFN-γ放出分析の結果は細胞毒性分析の結果と矛盾しないものであった。TIL620(620-1，620-2)またはTI L660(660-1，660-2，660-3)の別々のサブカルチャーを、自家移植の患者に投与したTIL培養から成長させて別々に培養すると、少しずつ異なる特異性をもっていたが、これは恐らく試験管内(in vitro)で異なるクローンが増殖したことによると思われる。G9₂₀₉（ITDQVPFSV）(SEQ ID NO:48)およびG9₂₀₉のN末端に余分のスレオニンを持つG10₂₀₈（TITDQVPFSV）(SEQ ID NO:49)はTIL620によってのみ認識された。G9₁₅₄（KTWGQYWQV）(SEQ ID NO:46)およびG9₁₅₄のC末端に余分にロイシンを持つG10₁₅₄（KTWGQYWQVL）(SEQ ID NO:47)はTIL1200、TIL620-2およびTIL 660-2によって認識された。G10-4（LLDGTATLRL）(SEQ ID NO:33)は示したように (実施例3)、TIL1200によって認識された。ペプチドG9₂₈₀（YLEPGPVTA）(SEQ ID NO:40)はTIL660およびTIL1143によって認識された。TIL660-3はG9₂₈₀同様にG10- 5（VLYRYGSFSV）(SEQ ID NO:34)も認識した。G10-5とともに予めインキュベートしたT2細胞の破壊は反復的に低く、これは恐らく、T細胞クローン中の小サブセットがこのエピトープに特異的であったためである。既知のHLA-A2.1結合モチーフを用いたエピトープの同定を補うために、もう一つの方法がエピトープを含む領域の同定に使用された。5種のgp100 cDNA断片すなわち、4種はcDNA(D3，D4，D5，C4)の3'末端からのエクソヌクレアーゼ切除法により作製され、1種は5'コード領域の最初の705塩基対を欠く部分的なcDNAクローン(25TR)であり、これらをpcDNA3プラスミドに挿入し、HLA-A2.1 cDNAとともにCOS7細胞にトランスフェクションさせた。断片の位置は図7Aに示してある。４種のgp100反応性TILによるこれらのトランスフェクション細胞の認識はIFN-γ放出分析を用いて評価した(図7B)。TIL1200は25TR，D5，D4またはC4断片をトランスフェクションしたCOS細胞を認識したが、D3については認識せず、少なくとも2 個のエピトープがアミノ酸残基146-163および236-661の領域に存在していることを示唆している。146-163の領域にHLA-A2.1結合モチーフを含むペプチドはG9₁₅₄ およびG10₁₅₄のみに過ぎず、両者ともTIL1200によって認識された。G10-4は領域 236-661に位置し、TIL1200によって認識された。TIL620-1はC4をトランスフェクションしたCOS細胞を認識したが、D3，D5，D4または25TRについては認識せず、エピトープは残基187-270の内部に存在することを示唆している。TIL620-1によって認識されたG9₂₀₉およびG10₂₀₈はこの領域に位置した。TIL620のもう一つのサブカルチャーであるTIL620-2もまたD5およびD4をトランスフェクションした細胞を認識したがD3は認識せず、および147-163の領域内のG9₁₅₄およびG10₁₅₄を認識した（これらはTIL1200によっても認識された）。TIL660-1およびTIL1143はC4または25TRをトランスフェクションした細胞を認識したがD3，D5，またはD4は認識せず、エピトープが187-270および236-661の2領域に存在することを示唆している。25TR断片内に位置するがC4断片内には位置しないG9₂₈₀はTIL660およびTIL11 43によって認識された。メラノーマのエピトープの試験管内での(in vitro)ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性Ｔ２細胞をＣＴＬ溶解に対し感受性にするために１μｇ／ｍｌの濃度が必要であるＧ１０−４を除き(実施例３；kawakami,Y.,et al.,(1994)Proc Natl Acad S ci(USA)91:6458)，この研究で同定されたすべてのｇｐ１００エピトープはＴ２細胞をＣＴＬ溶解に対し１ｎｇ／ｍｌの濃度で感受性にした（図８Ａ−８Ｄ）。Ｇ１０−５は１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度ではＣＴＬでの細胞毒活性を阻害するようであった。なぜなら、ペプチドが培養液中に細胞毒性検定の間４時間完全に存在する条件の下、１０ｎｇ／ｍｌ以上のＧ１０−５と共に保温したＴ２細胞の溶解は、この検定を１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で行ったときより低くなったからである（図８Ｄ）。これらのエピトープのＨＬＡ−Ａ２．１に対する相対的な結合親和性も試験管内の競合的結合検定を用いて測定された（表１３）。Ｇ９₁₅₄のＨＬＡ−Ａ２・１分子との結合親和性（１１ｎＭで標準的ペプチドの５０％阻害）はＧ９₁₅₄のＣ末端に余計にロイシンを含むＧ１０₁₅₄（１０１０ｎＭ）より高く、Ｇ１０₁₅₄よりも低濃度でＴ２細胞を感受性にすることが出来た（図８Ａ）。Ｇ９₂₀₉のＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和性（８４ｎＭ）はまた、Ｇ９₂₀₉のＮ末端に余分のスレオニンを含むＧ１０₂₀₉より（２０８０ｎＭ）高く、Ｇ１０₂₀₈ よりも低濃度でＴ２細胞を感受性にすることが出来た（図８Ｂ）。ゆえに、９量体のペプチドは対応している１０量体のペプチドより、Ｔ２細胞をＣＴＬ溶解に感受性にする効果が大きく、ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性も、より高かった。これは、同定されたＭＡＲＴ−１の９及び１０アミノ酸ペプチド（Ｍ９− ２，Ｍ１０−３，Ｍ１０−４）にもあてはまった(実施例２；kawakami ,Y.,et a l., (1994).J.Exp.Med．180:347)。Ｔ２細胞の溶解検定の結果得られたペプチドの力価は試験管内で検定した、ＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和性の測定結果に一致した。他のｇｐ１００エピトープ、Ｇ９₂₈₀，Ｇ１０−４またはＧ１０−５は、ＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性を持ち、各々９５ｎＭ、４８３ｎＭまたは１３ｎＭで５０％阻害を示した。以前に同定されたＨＬＡ−Ａ２のＨＬＡ−Ａ２．１結合親和性はＭＡＲＴ−１中のメラノーマエピトープを制限した。(実施例２；kawakami ,Y.,et al.,(1994).J.Exp.Med．180:347)そして、チロシナーゼ(Wol fel，T.,(1994)Eur.J.Immunol．24:759; SEQ ID NOS: 31 and32)も同様に測定された。(M9-2(397nM),M10-3(2272nM)M10-4(5555nM),T9₁(333nM),T9₃₆₉(40nM))１０量体ペプチド(G10₁₅₄,G10₂₀₈,G10-3,G10-4)の他に、これを含んでいる９量体エピトープ(G9₁₅₄,G9₂₀₉,M9-2)が存在し、すべてのメラノーマエピトープはいずれも高いＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合親和性(G9₁₅₄,G10-5,T9₃₆₉)または、中程度の結合親和性(G9₂₀₉,G9₂₈₀,G10-4,M9-2,T9₁)を持っている。考察自家移植患者へ移した時の腫瘍の後退にかかわる４つのＴＩＬによって認識される、人のメラノーマ抗原ｇｐ１００の複数のエピトープはこの研究で同定された。この研究で記載された５つのエピトープのうち、Ｇ９₁₅₄またはＧ１０₁₅₄が最も一般的に認識されるようであった。これらは異なる患者由来の４つのｇｐ１００に反応的なＴＩＬのうち３つによって認識されるからである。Ｇ９₂₈₀ペプチドは異なる患者のＰＢＬ由来の５つすべてのＣＴＬによって認識されることが報告されているが、(Cox,A.L.,et al.,(1994)).Science.264:716),この研究では、これは４つのｇｐ１００反応的ＴＩＬのうち２つにしか認識されていない。この違いは、使われたＴ細胞の源（ＴＩＬとＰＢＬ）によって生じたのだろう。ＭＡＲＴ−１ペプチドのM9-2はM9₂₇とも呼ばれ、ＭＡＲＴ−１ペプチドM10-3 はM10₂₆とも呼ばれ、そしてＭＡＲＴ−１ペプチドのM10-4はM10₂₇とも呼ばれることは理解されよう。ｇｐ１００ペプチドのG10-4もまたG10₄₅₇と呼ばれ、ｇｐ１００ペプチドのG10-5もまたG10₄₇₆と呼ばれることも認められるであろう。ＴＩＬによる、ＭＡＲＴ１抗原決定基、Ｍ９−２（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）及びｇｐ１００細胞決定基、Ｇ９₁₅₄（ＫＴＷＧＯＹＷＱＶ）、Ｇ１０₁₅₄（ＫＴＷＧＱＹＷＧＶＬ）、Ｇ９₂₀₉（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、Ｇ１０₂₀₈（ＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、Ｇ９₂₈₀（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）、Ｇ１０−４（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）、Ｇ１０−５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ）の１μｇ／ml（^* 1ng/ml）と共に前もって保温したＴ２細胞の溶解は、４ｈ−⁵¹Ｃｒ遊離検定で測定された。ＴＩＬ６２０−１，−２またはＴＩＬ６６０−１，−２，−３は、自己移植した患者にほどこされたＴＩＬと同じＴＩＬから増殖させたが、但し別々に培養した。６２４ melは、ＨＬＡ−Ａ２⁺，ｇｐ１００⁺，ＭＡＲＴ−１⁺のメラノーマ細胞系列であり、３９７melは、ＨＬＡ−Ａ２^-メラノーマ細胞系列であり、Ｔ２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２⁺Ｔ細胞−Ｂ−細胞ハイブリドーマである。アンダーラインの数値は統計的に有意な溶解である。実施例５メラノーマの修飾免疫性の改良のためのエピトープ材料と方法ペプチド合成とＨＬＡ−Ａ２．１結合検定ペプチドは固相法によって多ペプチド合成機を用いて合成され、前に記載したようにＨＰＬＣによって精製された(Rivoltini,L et al.(1995)Journal of Immuno logy Volume 154:2257-2265)。ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１に対する結合の相対比は、放射線標識した標準ペプチドの可溶化した標的ＭＨＣ分子に対する結合の阻害に基づいて、前に記載したように測定された(Rivoltini,L et al.(1995)Jou rnal of Immunology Volume 154:2257-2265)。手短かにいうと、様々な濃度の試験ペプチド（１００μＭから１ｎＭの範囲）を５ｎＭの放射線標識したＨｂｃ１８−２７（ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ）（配列番号：１２５）ペプチド及びＨＬＡ− Ａ２．１重鎖及びβ２−ミクログロブリンと共に室温において２日間プロテアーゼ阻害剤存在下で保温した。ＭＨＣ結合の放射線活性のパーセント割合はゲル濾過によって決定し、各々のペプチドについて５０％阻害する量が計算された。ペプチド特異的ＣＴＬの誘導：ＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ患者及び正常な供与者の末梢血液からフィコール-Hypaque勾配遠心によって分離され、新鮮な状態または低温保存の試料として用いられた。ペプチド特異的ＣＴＬ系列は次のように生成された。０日目に、ＰＢＭＣを１．５×１０⁶／ｍｌの濃度で２４穴プレート（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）の１０％のヒトのＡＢ血清、Ｌ−グルタミン、抗生物質（ＣＭ）を含み、１μｇ／ｍｌのペプチドが存在するIscove's培地に培養した。２日後、１２ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）(Chiro n Co.,Emeryville，CA)を培養液に加えた。リンパ球は次のように弱く再び刺激された。：応答細胞を回収し、一度洗浄し、２４穴プレートに2.5×10⁵細胞／ｍｌの濃度になるようＣＭ存在下で移した。自家移植したＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、５−８×１０⁶細胞／ｍｌの濃度にＣＭに懸濁する。そして１ μｇ／ｍｌペプチドと１５ｍｌの円錐型チューブ（５ｍｌ／チューブ）中において３時間３７℃で反応させた。これらのＰＢＭＣ（刺激剤）に３０００radsの線量の放射線を照射して、一度ＰＢＳで洗浄し、応答細胞に応答細胞：刺激物の比が１：３から１：１０の間の範囲で加えた。次の日、１２ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を培養液に加えた。これらのＣＴＬの活性は最低２回の（１４日間）ペプチドの刺激の後に細胞毒性検定によって試験された。ＴＩＬからＣＴＬを生成するため、単離した腫瘍の懸濁液を１−２日間、腫瘍細胞の接着を許す１０％ＦＣＳＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。非接着画分から採られたリンパ球は前に記載したようにペプチド特異的ＣＴＬの誘導に用いられた。ＣＴＬによる抗原認識の評価：⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性検定をＣＴＬによるペプチドとメラノーマ細胞の認識を検出するために行った。ペプチドの認識を解析するためＴ２細胞系を１μｇ／ｍｌのペプチドと共に３７℃で２時間前もって保温した。そして、洗浄してから⁵¹Ｃｒ放出細胞毒性検定に用いた。メラノーマ細胞系６２４ｍｅｌは我々の研究所において確立された。（実施例１参照）抗メラノーマＴ細胞の誘導のために、自然のメラノーマエピトープより抗原性の強いペプチドを生成する目的で、特異的ＭＨＣクラスＩ対立形質に結合するペプチドの普遍的モティーフをもとに、少なくとも１つのアミノ酸が変化するように様々なペプチドを作製した(Falk，et al.(1991)Nature．351:291; Kubo et al .(1994)J.Immunol.152:3913; Parker,K.et al.(1992)Journal of Immunology.14 9:3580;Ruppert,J.et al(1993)Cell 74:929-937)(表１４、１５、１６、及び１７)。ほとんどの従来単離されたウィルス性のエピトープ及び自然に処理されたＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドは２つ目の主要な錨部位に、ロイシンまたはメチオニン、最後の主要な錨部位（支配的な錨アミノ酸）にはバリンを含み、ＨＬＡ −Ａ２．１、に対し高い結合親和性を持っていたが、単離されたＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００メラノーマエピトープは、主要な錨部位にアラニン（Ｍ９−２の２つ目の部位，及びＧ９−２８０の９つ目の部位）や、スレオニン（Ｇ９−１５４、及びＧ９−２０９の２つ目の部位）のような非優勢アミノ酸を含む。Ｍ９− ２，Ｇ９−２０９及びＧ９−２８０は、高い親和性の結合者ではない。ＨＬＡ− Ａ２のペプチドとの結合に対し重要であるが、Ｔ細胞受容体による認識にそれほど重要でない１、２、３、または９番目の部位のアミノ酸の変化によって、人工的にＨＬＡ−Ａ２．１により高い親和性で結合し、しかも天然のエピトープ特異的Ｔ細胞によって認識されるペプチドが作られるであろう。修飾されたＭ９−２、Ｇ９−２８０、Ｇ９−２０９、Ｇ９−１５４ペプチドのうちで、Ｍ９−２−２Ｌ、Ｍ９−２−１Ｆ、Ｍ９−２−３Ｙ、Ｇ９−２８０−９Ｖ、Ｇ９−２８０−９Ｌ、Ｇ９−２８０−９１、Ｇ９−２８０−１Ｆ、Ｇ９−２０９−２Ｌ、Ｇ９−２０９−２Ｍ、Ｇ９−２０９−２１、Ｇ９−２０９−１Ｆ、Ｇ９−２０９−１Ｙ、Ｇ９−２０９−１Ｗ２Ｌ、Ｇ９−２０９−１Ｆ２Ｌ、Ｇ９ −２０９−１Ｙ２Ｌは、より高い結合親和性を持ち、もとのメラノーマ反応性Ｔ細胞によって認識される（表１４、１５、１６、及び１７）。Ｇ９−１５４−２Ｉ、Ｇ９−２０９−１Ｆ２ＬまたはＧ９−２８０−９Ｖ（表１８、１９及び２０）を作用させた自己ＰＢＭＣで刺激したＰＢＬは、元のエピトープのみならずメラノーマ瘍細胞（６２４ｍｅｌ）をも天然のエピトープ（Ｇ９−１５４、Ｇ９− ２０９、Ｇ９−２８０）で刺激したＰＢＬよりもよく認識し、溶解させた。これらの結果は、修飾したペプチドは天然のエピトープのかわりに抗腫瘍Ｔ細胞の誘導のために使うことが出来ることを示した。我々の研究で使われた特定のＴ細胞によって認識されなかったがＨＬＡ−Ａ２．１に対して高い結合親和性を持つほかのペプチドは、試験管内(in vitro)または生体内(in vivo)で元のメラノーマエピトープを認識することの出来る異なるＴ細胞の組を誘導するであろう。これらの修飾したペプチドは試験管内(in vitro)での抗メラノーマＴ細胞の誘導、及びメラノーマの患者の治療またはメラノーマの予防のために、患者に対し免疫予防注射に用いることが出来るだろう。＊標準的な放射性標識したＨＢＣ１８−２７ペプチドを５０％阻害するのに必要な試料ペプチドの濃度。ププチドは、高結合親和性（＜５０nMで５０％阻害）、中結合親和性（５０−５００nM）、および低結合親和性（＞５００nM）として定義される。（実施例４参照）Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激した後に行った。Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激したあとに行った。Ｃｒ放出測定は、ペプチドであらかじめインキュベートした自己のＰＢＭＣで４回刺激したあとに行った。実施例６哺乳動物におけるメラノーマの治療のためのMART-1ワクチン MART-1ワクチンは、メラノーマにくるしむ哺乳動物を治療するのに効果的であろう。例えば、MART-1は、個体に投与できる。哺乳動物は、約1mgから約100mgの範囲でMART-1タンパク質、ペプチドまたは本明細書中に記載した改変ペプチドで免疫できる。または、哺乳動物、好適にはヒトは、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは鶏ポックスウイルスのようなウイルスベクター中に挿入したMART -1核酸配列で免疫できる。免疫性MART-1ペプチドまたは改変ペプチドまたはその類似体に相当する、MART-1核酸配列を持つ約１０⁶個から約１０¹¹個の範囲のウイルス粒子を、哺乳動物個体、好適にはヒトに投与できる。哺乳動物は、免疫原に対する抗体、または免疫原を認識する細胞毒性リンパ細胞（CTL）の増加について従来の方法によって、または病気の臨床的症状の緩和について測定する。評価の対象となる特定の変数は、ワクチン抗原または腫瘍退縮を認識する免疫細胞の生産を含む。このようなワクチンは、予防的にまたは治療的に投与される。哺乳動物は、また、レトロウイルスベクターに挿入したgp-100核酸配列またはGP-1 00免疫原性ペプチドまたは改変ペプチドまたはその類似体で免疫できる。使用されるレトロウイルス中の抗原の示唆される量の範囲は、哺乳動物、好適にはヒト、一体につきウイルス粒子約１０⁶個から約１０¹¹個である。レトロウイルスワクチンの反応および効能は、上述したように測定される。実施例７メラノーマに苦しむ哺乳動物を治療的に処置するためのメラノーマ抗原由来の免疫原ペプチドに対して感作されたリンパ細胞の使用メラノーマ抗原によってあらかじめ感作されたT-リンパ細胞は、メラノーマに苦しむ哺乳動物を治療的に処方するのに効果的である。T-リンパ細胞は、末梢血液リンパ細胞または腫瘍浸潤リンパ細胞より単離し、in vitroにおいてMART-1タンパク質またはペプチドにさらす。T-リンパ細胞は、末梢血液またはメラノーマ懸濁液から単離し、in vitroにおいて培養する(川上,Y.ら(1988)J.Exp.Med.168: 2183-2191)。T-リンパ細胞は、約1から約10mg/mlの濃度にて1-16時間のあいだM ART-1ペプチドAAGIGILTVにさらす。抗原にさらされたT-リンパ細胞は、哺乳動物、好適にはヒトに、哺乳動物にたいして約１０⁹個から約１０¹²個リンパ細胞として投与される。あるいは、T-リンパ細胞は、改変MART-1ペプチドにさらされる。リンパ細胞は、静脈注射、腹膜内または傷害部に投与される。この処置は、サイトカイン、放射治療、メラノーマ病変の外科的切除および化学治療薬、養子免疫法によるTリンパ細胞治療のような他の治療的処置とともに同時に投与できる。または、T-リンパ細胞を、gp100免疫原ペプチドまたは本明細書中に記載した改変免疫原ペプチドにさらしてもよい。寄託した態様は本発明の一つの側面についての単なる例示であり、本発明は寄託した核酸配列の範囲に限らず、機能的に同等であるいかなる配列も本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に示し、記載したものに加えて発明を様々に改変することは、前の記載および以下の図により当業者には可能である。このような改変は、請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/82 Ｃ０７Ｋ 14/82 16/32 16/32 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ローゼンバーグ，スティーブン・エイアメリカ合衆国メリーランド州20854，ポトマック，アイロン・ゲート・ロード 10104

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＡＲＴ−１をコードする単離された核酸配列。２．図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す配列を有する、請求項１の核酸配列。３．図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す配列のアリル変異体である、請求項１の核酸配列。４．図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す配列のホモログ体である、請求項１の核酸配列。５．図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す配列の変異体である、請求項１の核酸配列。６．請求項１の核酸配列によりコードされる組換えタンパク質。７．請求項２の核酸配列によりコードされる組換えタンパク質。８．請求項３の核酸配列によりコードされる組換えタンパク質。９．請求項４の核酸配列によりコードされる組換えタンパク質。１０．請求項５の核酸配列によりコードされる組換えタンパク質。１１．図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に示すアミノ酸配列またはそれと実質的にホモロガスな配列を有する単離および精製されたタンパク質。１２．ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、またはＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）の配列を有するペプチド。１３．請求項１の組換えタンパク質を製造する方法において、 (a) 図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す核酸配列を、発現ベクターに挿入し、 (b) 該発現ベクターを宿主細胞内に移入し、 (c) 該ベクターの増幅および該タンパク質の発現に適する条件下で該宿主生物を培養し、そして (d) 該タンパク質を収穫することよりなる、上記方法。１４．発現ベクターが真核発現ベクターまたは原核発現ベクターである請求項１３の方法。１５．発現ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項１３の方法。１６．宿主細胞が真核細胞または原核細胞である請求項１３の方法。１７．真核細胞が昆虫細胞である請求項１３の方法。１８．請求項１の核酸配列の全部または一部を含む組換え発現ベクター。１９．前記組換え発現ベクターによりコードされる前記タンパク質の発現を可能にするように、請求項１８の組換え発現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主生物。２０．請求項１１のタンパク質またはその一部分に反応する抗体。２１．抗体がモノクローナル抗体である請求項２０の抗体。２２．抗体がポリクローナル抗体である請求項２０の抗体。２３．生物学的サンプル中のＭＡＲＴ−１メッセンジャーＲＮＡを検出する方法において、 (a) 図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す核酸配列の全部または一部を、前記生物学的サンプルと、該核酸配列と該メッセンジャーＲＮＡとの間に複合体が形成される条件下で接触させ、 (b) 該複合体を検出し；そして (c) 該メッセンジャーＲＮＡのレベルを決定することよりなる上記方法。２４．サンプルが、哺乳類組織、哺乳類細胞、剖検サンプル、病理サンプル、および生検サンプルからなる群から選択される、請求項２３の方法。２５．生物学的サンプルが病気状態になった哺乳類からのものである、請求項２４の方法。２６．ｍＲＮＡのレベルの決定が、病状の診断、評価または予後診断に用いられる、請求項２５の方法。２７．生物学的サンプルが、メラノーマまたは転移メラノーマにおかされた哺乳類からのものである、請求項２６の方法。２８．生物学的サンプルのＭＡＲＴ−１タンパク質を検出する方法において、 (a) サンプル中の上記タンパク質と特異的に反応して複合体を形成する試薬を接触させ；そして (b) 該タンパク質と該試薬との間に該複合体が形成されることを検出することからなる上記方法。２９．サンプルが、哺乳類組織、哺乳類細胞、剖検サンプル、病理サンプル、および生検サンプルからなる群から選択される、請求項２８の方法。３０．試薬が抗体またはその断片である、請求項２８の方法。３１．試薬がモノクローナル抗体である請求項２８の方法。３２．試薬がポリクローナル抗体である請求項２８の方法。３３．生物学的サンプルが病気状態になった哺乳類からのものである、請求項２８の方法。３４．前記タンパク質のレベルの決定が、病状の診断、評価または予後診断に用いられる、請求項２８の方法。３５．病気状態がメラノーマまたは転移性メラノーマである、請求項３４の方法。３６．生物学的サンプル中のＭＡＲＴ−１ゲノム核酸配列を検出する方法において、 (a) 図１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示す核酸配列の全部または一部を、該核酸配列と該ゲノムＤＮＡ配列との間に複合体が形成される条件下で生物学的サンプルと接触させ、 (b) 該ゲノム配列の変化を決定することよりなる上記方法。３７．上記変化が、該ゲノムＤＮＡ配列の欠失、置換、挿入または増幅である、請求項３６の方法。３８．ＭＡＲＴ−１配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）またはそのアナログ体に由来するコンティギュアスなアミノ酸配列を有する、免疫原性ペプチド。３９．ペプチドの長さが少なくとも約９ないし１０アミノ酸である、請求項３８の免疫原性ペプチド。４０．(i)ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、(ii)ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）、(iii)ＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）、および(i)〜(iii)のいずれか一つのアナログ体からなる群から選択される配列を有する、請求項３８の免疫原性ペプチド。４１．ＡＡＧＩＧＩＬＴＶである、請求項４１のペプチド。４２．ペプチド配列が、ＭＨＣ分子へのペプチドの結合を増強するために、ＭＡＲＴ−１配列の少なくとも一つのアミノ酸の修飾を有する、請求項３８の免疫原性ペプチド。４３．ペプチドの長さが少なくとも約９ないし１０アミノ酸である、請求項４２の免疫原性ペプチド。４４．修飾が、ペプチド配列中の少なくとも一つのアミノ酸配列の置換を含むものである、請求項４２のペプチド。４５．アミノ酸配列の置換が、ペプチド配列中の(i)１位、(ii)２位、(iii)３位、(iv)９位、(v)１０位、および(vi)上記(i)〜(v)のうちの少なくとも二つの組み合わせ、からなる群から選択される部位に存在する、請求項４４のペプチド。４６．アミノ酸配列の置換が２位および９位に存在する、請求項４５のペプチド。４７．式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＩＧＩＬＴＸ₄ （式中、Ｘ₁は任意のアミノ酸であり、Ｘ₂は任意の疎水性脂肪族アミノ酸であり、Ｘ₃は任意のアミノ酸であり、Ｘ₄は任意の疎水性脂肪族アミノ酸である。）で表される免疫原性ペプチド。４８．Ｘ₁がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはアスパラギン酸からなる群から選択される請求項４７のペプチド。４９．Ｘ₂がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリンまたはスレオニンからなる群から選択される請求項４７のペプチド。５０．Ｘ₃がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジン、セリンまたはアスパラギン酸からなる群から選択される請求項４７のペプチド。５１．Ｘ₄がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリンまたはスレオニンからなる群から選択される請求項４７のペプチド。５２．ペプチドが表１４に示される配列を有する請求項４７のペプチド。５３．ｇｐ１００配列に由来するコンティギュアスなアミノ酸配列を有する免疫原性ペプチド。５４．長さが少なくとも約９〜１０アミノ酸である請求項５３の免疫原性ペプチド。５５．下記の群から選択される、請求項５４の免疫原性ペプチド：ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ(SEQ ID N :33)、ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ(SEQ ID N :34)、ＶＬＫＲＣＬＬＨＬ(SEQ ID N :36)、ＡＬＤＧＧＮＫＨＦＬ(SEQ ID N :35)、ＶＬＰＳＰＡＣＱＬＶ(SEQ ID N :37)、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ(SEQ ID N :40)、ＳＬＡＤＴＮＳＬＡＶ(SEQ ID N :38)、ＳＶＳＶＳＱＬＲＡ(SEQ ID N :39)、ＬＮＶＳＬＡＤＴＮ(SEQ ID N :41)、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ(SEQ ID N :46)、ＫＴＷＧＱＹＷＱＶＬ(SEQ ID N :47)、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ(SEQ ID N :48)、およびＴＩＴＤＱＶＰＦＳＶ(SEQ ID N :49)。５６．ペプチドがｇｐ１００配列に少なくとも一つのアミノ酸修飾を含む、請求項５３、５４または５５の免疫原性ペプチド。５７．修飾がペプチド配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項５６のペプチド。５８．アミノ酸配列の置換が、ペプチド配列中の(i)１位、(ii)２位、(iii)３位、(iv)９位、(v)１０位、および(vi)上記(i)〜(v)のうちの少なくとも二つの組み合わせ、からなる群から選択される部位に存在する、請求項５６のペプチド。５９．次式：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＧＱＹＷＱＸ₄、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＱＶＰＦＳＸ₄、およびＸ₁ Ｘ₂Ｘ₃ＰＧＰＶＴＸ₄からなる群から選択され、式中、Ｘ₁は任意のアミノ酸であり、Ｘ₂は任意の疎水性脂肪族アミノ酸であり、Ｘ₃は任意のアミノ酸であり、Ｘ₄は任意の疎水性脂肪族アミノ酸である、免疫原性ペプチド。６０．Ｘ₁がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、バリン、チロシン、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジンまたはアスパラギン酸からなる群から選択される請求項５９のペプチド。６１．Ｘ₂がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、またはスレオニンからなる群から選択される請求項５９のペプチド。６２．Ｘ₃がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、リジンまたはアスパラギン酸からなる群から選択される請求項５９のペプチド。６３．Ｘ₄がメチオニン、ロイシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリンまたはスレオニンからなる群から選択される請求項５９のペプチド。６４．ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ₂制限腫瘍浸潤リンパ球により認識される、請求項３８、４７、５３または５９の免疫原性ペプチド。６５．ペプチドが天然、合成または組換えペプチドである、請求項３８、４７、５３または５９の免疫原性ペプチド。６６．請求項６の組換え蛋白質および許容される助剤、希釈剤または担体からなる医薬組成物。６７．請求項６６の医薬組成物を、哺乳類動物へ、防御抗体または免疫細胞の生産を刺激するのに有効な量で投与することよりなる、メラノーマの予防または治療方法。６８．薬学的に許容される担体中の請求項６６の組換え蛋白質からなる、哺乳類を免疫するためのワクチン。６９．請求項３８、４７、５３または５９のペプチドおよび許容される助剤、希釈剤または担体からなる医薬組成物。７０．請求項６９の組成物を、哺乳類動物へ、防御抗体または免疫細胞の生産を刺激するのに有効な量で投与することよりなる、メラノーマの予防または治療方法。７１．薬学的に許容される担体中の請求項３８、４７、５３または５９のペプチドからなる、哺乳類の免疫のためのワクチン。７２．請求項３８、４７、５３または５９のペプチドをコードする、精製され、単離された核酸配列。７３．請求項７２の少なくとも一つの核酸配列を含む組換え発現ベクター。７４．発現ベクターが真核発現ベクターまたは原核発現ベクターである、請求項７３のベクター。７５．請求項７４の組換え発現ベクターで、該組換え発現ベクターによりコードされるタンパク質が発現するように、トランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主生物。７６．請求項３８、４７、５３または５９の免疫原性ペプチドと反応しうる抗体。７７．モノクローナル抗体である請求項７６の抗体。７８．ポリクローナル抗体である請求項７６の抗体。７９．腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocytes：ＴＩＬ）を用いてメラノーマ抗原をコードする遺伝子を同定する方法において、 (a) メラノーマにおかされた哺乳類の腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球を取り； (b) 哺乳類の細胞ラインにメラノーマｃＤＮＡライブラリーを導入し； (c) 該哺乳類細胞（工程ｂからのもの）を前記ＴＩＬに暴露し； (d) 該ＴＩＬにより認識された哺乳類細胞中のｃＤＮＡによりコードされる抗原の発現をスクリーニングし；そして (e) 該抗原に相当するｃＤＮＡを単離することからなる上記方法。８０．工程(b)の細胞が腫瘍細胞ラインまたはＣＯＳ７細胞からなる群から選択される、請求項７９の方法。８１．図１；ＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列を有するＭＡＲＴ−１タンパク質または図５Ａ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２７もしくは図７１；ＳＥＱＩＤＮＯ：１２１の配列を有するｇｐ１００タンパク質のアミノ酸配列に由来するペプチドの免疫原性を評価する方法において、 (a) ＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００のアミノ酸配列に基づいて複数のペプチドを調製し； (b) 該ペプチドの少なくとも一つを哺乳類細胞ラインとインキュベーションし； (c) 該ペプチドとインキュベーションした哺乳類細胞を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に暴露し；そして (d) 該ペプチドとインキュベーションした細胞によるＴＩＬの認識をスクリーニングすることよりなる上記方法。８２．工程(a)のペプチドが約９ないし１０アミノ酸のものである請求項８１の方法。８３．工程(b)の細胞が、ＣＯＳ細胞、Ｔ２細胞、またはＥＢＶでトランスフォームされたＢ細胞ラインからなる群から選択される、請求項８１の方法。８４．少なくとも８つのコンティギュアスなアミノ酸からなり、図１；ＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列を有するＭＡＲＴ−１配列またはｇｐ１００配列に由来し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に反応性であるペプチドをコードする、精製および単離された核酸配列。８５．請求項８４の核酸配列を少なくとも一つ含む組換え発現ベクター。８６．医薬品製造における、請求項３８、４７、５３または５９の免疫原性ペプチドの使用。８７．メラノーマの治療または予防における、請求項３８、４７、５３または５９の免疫原性ペプチドの使用。８８．医薬品製造における、請求項１０、７３または８４の組換え発現ベクターの使用。８９．メラノーマの治療または予防における、請求項１８、７３または８４の組換え発現ベクターの使用。９０．医薬品製造における、請求項１ないし７３の核酸配列の使用。９１．メラノーマの治療または予防における、請求項１または７３の核酸配列の使用。