JP4223072B2 - p15及びチロシナーゼ黒色腫抗原並びに診断及び治療方法におけるそれらの使用 - Google Patents
p15及びチロシナーゼ黒色腫抗原並びに診断及び治療方法におけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
この発明は、ヒトの癌の予防及び治療の分野における発明である。より詳しくは、この発明は、T−細胞により認識される黒色腫抗原をコードするp15遺伝子及びそれらの対応するタンパク質並びにこれら遺伝子、タンパク質又はペプチドを用いる予防的、診断的及び治療的用途に関する。この発明は、黒色腫抗原をコードするチロシナーゼペプチドを用いる予防的、診断的又は治療的用途にも関する。
発明の背景
黒色腫は、メラノサイト又はメラノサイト関連母斑細胞のいずれかから誘導される攻撃性で頻繁に転移する腫瘍である(“Cellular and Molecular Immunology”(1991), Abbas A.K., Lechtman A.H., Pober J.S. 編;W.B. Saunders Company, Philadelphia: pp.340-341)。黒色腫は、皮膚癌全体の約3%を構成しており、黒色腫の世界的増加は、女性における肺癌を除いては他の如何なる新生物形成によっても凌駕されない(“Cellular and Molecular Immunology”(1991), Abbas A.K., Lechtman A.H., Pober J.S. 編;W.B. Saunders Company, Philadelphia: pp.340-342;Kirkwood and Agarwala(1993)Principles and Practice of Oncology 7:1-16)。黒色腫が皮膚に明らかに局在するときでさえ、それら患者の30%までは全身に転移が進み、その大部分は死に至ることになる(Kirkwood and Agarwala(1993)Principles and Practice of Oncology 7:1-16)。黒色腫を治療する古典的な療法には、外科手術、放射線療法及び化学療法が含まれる。ここ10年間に、免疫療法及び遺伝子療法が新規かつ有望な黒色腫を治療する方法として出現した。
T細胞は、殆どのマウス腫瘍モデルにおける腫瘍退縮において重要な役割を果たす。独特な癌抗原を認識する腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を多くのマウス腫瘍から単離することができる。これらTIL+インターロイキン−2の養子免疫伝達は、樹立された肺及び肝臓転移の退縮を媒介することができる(Rosenberg, S.A. ら,(1986)Science 233:1318-1321)。加えて、注射したTILによるIFN−γの分泌が、マウス腫瘍のin vivo退縮と有意に相関しており、このことはこれら腫瘍抗原によるT細胞の活性化を示唆するものである(Barth, R.J. ら,(1991)J. Exp. Med. 173:647-658)。転移性黒色腫を患っている患者に腫瘍TILを養子的に移したときに腫瘍TILが35〜40%の黒色腫患者において転移癌の退縮を媒介するという公知の能力は、認識される抗原の臨床的重要性を証明するものである(Rosenberg, S.A. ら,(1988)N Engl J Med 319:1676-1680;Rosenberg, S.A. ら,(1992)J. Clin. Oncol. 10:180-199)。
CD8+細胞上のT細胞受容体は、抗原性ペプチド(HLA−A2についての9〜10アミノ酸)、β−2ミクログロブリン及びI型主要組織適合性複合体(MHC)重鎖(ヒトにおけるHLA−A、B、C)からなる複合体を認識する。内生的に合成されたタンパク質の消化により生成するペプチドが、その小胞体の中に輸送され、I型MHC重鎖とβ−2ミクログロブリンに結合し、そして最終的にその細胞表面内でI型MHC分子の溝の中に発現される。従って、T細胞は、細胞表面上で発現される無傷の分子を検出する抗体とは対照的に、細胞の内側でタンパク質から生じる分子を検出することができる。従って、T細胞により認識される抗原は、抗体により認識される抗原よりも有用であり得る。
癌への免疫応答がヒトにおいて存在するという強力な証拠は、黒色腫沈積物内でのリンパ球の存在により与えられる。これらリンパ球を単離すると、MHC制限様式で、自己及び同種黒色腫上の特異的腫瘍抗原を認識することができる(Itho, K.ら,(1986)Cancer Res. 46:3011-3017;Muul, L.M.ら(1987)J. Immunol. 138:989-995;Topalian, S.L.ら(1989)J. Immunol. 142:3714-3725;Darrow, T.L.ら(1989)J. Immunol. 142:3329-3335;Hom, S.S. ら(1991)J. Immunother. 10:153-164;Kawakami, Y.ら(1992)J. Immunol. 148:638-643;Hom, S.S. ら(1993)J. Immunother. 13:18-30;O’Neil, B.H.ら(1993)J. Immunol. 151:1410-1418)。転移性黒色腫を患っている患者からのTILは、メラノサイト−黒色腫系列特異的組織抗原を含む共通した抗原をin vitroで認識する(Kawakami, Y.ら(1993)J. Immunother. 14:88-93;Anichini, A.ら(1993)J. Exp. Med. 177:989-998)。抗黒色腫T細胞は、腫瘍部位におけるin vivoでのクローン拡大及び蓄積の結果として、おそらくTILが豊富化されているようである(Sensi, M. ら(1993)J. Exp. Med. 178:1231-1246)。多くの黒色腫患者がこれら腫瘍に対して細胞性及び体液性応答を開始するという事実及び黒色腫がMHC抗原と腫瘍関連抗原(TAA)の両方を発現するという事実は、更なる黒色腫抗原の同定及び特性決定が黒色腫を患っている患者の免疫療法にとって重要であろうことを示唆している。
末梢血リンパ球は、潜在的黒色腫腫瘍抗原を同定するのに用いられてきた。Van Der Bruggenら(1991)Science 254:1643-1647は、MAGE−1と名付けられた黒色腫抗原をコードする遺伝子を、突然変異誘発した腫瘍細胞でin vivoで繰り返し免疫感作された患者の末梢血から樹立したT細胞クローンを用いて特性決定し、これまでに記載されたことのない多遺伝子ファミリーに属することを見出した(Gaugler, B. ら(1994)J. Exp. Med. 179:921)。黒色腫を患っている患者の末梢血リンパ球(PBL)から誘導した細胞毒性T細胞を用いて、MAGE−1をコードする潜在的抗原性ペプチドが同定された(Traversari, C.ら(1992)J. Exp. Med. 176:1453-1457)。Brichardら(1993)J. Exp. Med. 178:489-495も、チロシナーゼと名付けられた黒色腫抗原をコードする遺伝子を、腫瘍で繰り返しin vitro刺激することによって感作された患者からの末梢血リンパ球を用いて特性決定した。MAGE−3と名付けられた黒色腫抗原は、自己の腫瘍で繰り返し免疫感作された患者のPBLからのT細胞を用いて同定され、HLA−A1−制限CTLにより認識された(Van Der Bruggen, P. ら(1991)Science(Washington DC), 254:1643-1647;Gaugler, B. ら(1994)J. Exp. Med. 197:921-930)。最近、黒色腫抗原MART−1及びgp100がクローン化され、HLA−A2−制限TILにより認識された(Kawakami, Y.ら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci.(USA.), 91:6458-6462;Bakker, A.B.H.ら(1994)J. Exp. Med. 179:1005-1009;Kawakami, Y.ら(1994)Proc. Natl. Acad. Sci.(USA.), 91:3515-3519)。MART−1及びgp100のいずれも黒色腫及びメラノサイトにおいて特異的に発現される。黒色腫抗原の治療的潜在性についての更なる支持は、Brownら(米国特許第5,262,177号)により与えられる。Brownら(米国特許第5,262,177号)は組換えワクシニアウイルス基剤黒色腫ワクチンに関するもので、そこでは黒色腫抗原p97が両方のマウスモデルにおいて腫瘍細胞攻撃からの防護作用を示したと報告されている。更なる黒色腫抗原の特性決定は、癌、特に黒色腫の免疫療法のための新たな戦略の開発にとって重要である。
発明の要旨
この発明は、広くは、Tリンパ球により認識される黒色腫抗原をコードする核酸配列及びこれら配列によりコードされるタンパク質及びペプチドに関する。この発明は、更に、これら核酸配列、タンパク質及びペプチドについてのバイオアッセイを提供する。この発明は、本明細書中に記載された核酸配列、タンパク質及びペプチドについての治療的用途も提供する。
p15黒色腫抗原をコードする実質的に精製されそして単離された核酸配列を提供することが、本発明の一般的な目的である。
ベクター、及びp15をコードする核酸配列の全部又は一部を含む組換え分子を提供することが、この発明の他の目的である。
p15をコードする核酸配列の全部又は一部によりコードされる組換えタンパク質を製造することが、この発明の他の目的である。
p15タンパク質、ペプチド又はそれらの部分と反応性のモノクローナル又はポリクローナル抗体を提供することが、この発明の更なる目的である。
生体サンプル中のp15遺伝子又はp15mRNAを検出する方法を提供することが、この発明の目的である。
生体サンプル中のp15タンパク質又はペプチドを検出する方法を提供することが、この発明の他の目的である。
ヒトの疾患、特に黒色腫及び転移性黒色腫についての診断方法を提供することが、この発明の目的である。
p15及びその対応するタンパク質又はp15アミノ酸配列から誘導されるペプチドをコードする核酸配列の全部又は一部を包含する予防的又は治療的使用方法を提供することが、この発明の更なる目的である。
p15又はその対応するタンパク質をコードする核酸配列の全部又は一部を含む、黒色腫を予防又は治療するための黒色腫ワクチンを提供することも、この発明の目的である。
p15タンパク質配列から誘導される免疫原性ペプチドをワクチンに使用するために提供することが、この発明の更なる目的である。
加えて、p15核酸配列の全部又は一部又はその対応するタンパク質又はペプチド及び哺乳動物内で黒色腫抗原に対する抗体の産生を引き出すことができる少なくとも1種の他の免疫原性分子を含む多価ワクチンを提供することが、この発明の他の目的である。
p15核酸配列の全部又は一部又はその対応するタンパク質を用いて遺伝子治療手順で黒色腫を予防又は治療する方法を提供することが、この発明の他の目的である。
チロシナーゼタンパク質配列から誘導される免疫原性ペプチドをワクチンに使用するために提供することが、この発明の更なる目的である。
ここに記載したワクチンを用いて黒色腫の予防的又は治療的免疫感作の方法を提供することが、この発明のいま1つの目的である。
免疫療法についての潜在的標的を構成する黒色腫抗原を同定する方法を提供することが、この発明の更なる目的である。
図面の説明
図1は、p15cDNAクローンの配列(配列番号:1)を示す。最も長いオープンリーディングフレームが、第1インフレームメチオニンで開始して翻訳された(配列番号:2)。
図2は、正常なヒトの脾臓(レーン1)、睾丸(レーン2)、胸腺(レーン3)、胎児肝臓(レーン4)、肝臓(レーン5)、腎臓(レーン6)、脳(レーン7)、副腎(レーン8)、肺(レーン9)、網膜(レーン10)、1290mel(レーン11)、501mel(レーン12)、888mel(レーン13)、及び888EBV B(レーン14)からのRNAを示す。これらを実施例1の「材料及び方法」に記載したp15のフラグメントでプローブした(上方のパネル)。このゲルを負荷についての対照として臭化エチジウムで染色した(下方のパネル)。
図3は、EBV B細胞RNAからのRT−PCRにより単離されたクローンの部分配列(配列番号:20及び22)を示す。コーディング領域の第1メチオニンで始まるクローンの配列(配列番号:21及び23)をp15の配列と比較した。同一残基を付点により示した。
図4は、p15ペプチドの力価測定示す。ペプチドp1510-18−■−及びp159-18−●−を888EBV B細胞と共に示した濃度で2時間インキュベートした後、4時間51Cr放出アッセイにおいて40:1のエフェクター(E):標的(T)比でTIL1290と共にインキュベートした。
図5は、TIL1413により認識されるチロシナーゼエピトープ領域の位置を示す。完全長クローン及び種々の切形クローンをブラックボックス内に示した。ヌクレオチドは開始コドンから番号を付した。次いで、これら完全長遺伝子及び切形クローンをCOS−7細胞内に単独で又はHLA−A24遺伝子と共に形質移入した。これらCOS形質移入体と共にインキュベートしたときにTIL1413により放出された顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)の量をその右側に示した。
図6は、TIL1413による認識についてのチロシナーゼペプチドの力価分析を示す。888EBVB標的細胞を51Crで一晩標識してから、種々の濃度の精製ペプチドT9206及びT10206と共にそれぞれ2時間(h)ずつインキュベートした。TIL1413による標的細胞の溶解を、40:1のエフェクター:標的比での4時間のインキュベーション後に51Cr放出量として測定した(T9206−●−,T10206−■−)。
図7A〜Dは、チロシナーゼ核酸(配列番号:18)及びアミノ酸配列(配列番号:19)(1文字表記)を示す。
発明の詳細な説明
本発明をより完全に理解するために、以下の定義について説明する。核酸配列には、DNA、RNA又はcDNAが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いる核酸配列とは、単離された核酸配列のことをいう。p15メッセンジャーRNA(mRNA)とは、p15遺伝子の産物である1又はそれを越えるRNA転写産物のことをいう。本明細書で用いる実質的に相同性とは、図1に示したp15の核酸配列(配列番号:1)と他の何らかの核酸配列との間の実質的な一致のことをいう。実質的に相同性とは、p15配列と他の何らかの核酸配列との間の約50〜100%相同性、好ましくは約70〜100%相同性、そして最も好ましくは約90〜100%相同性を意味する。更に、本明細書で用いる実質的に相同性とは、図1に示したp15抗原のアミノ酸配列(配列番号:2)と他の何らかのアミノ酸配列との間の実質的な一致のことをもいう。
主要組織適合性複合体(MHC)は、ヒト白血球抗原(HLA)を含む、異なる種において記載された組織適合抗原系を包含するよう意図された一般名称である。
黒色腫という用語には、黒色腫、転移性黒色腫、メラノサイト又はメラノサイト関連母斑細胞のいずれかから誘導される黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、in situ黒色腫、表面拡散性黒色腫、結節性黒色腫、ほくろ性悪性黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫、侵食性黒色腫又は家族性非定型母斑及び黒色腫(FAM−M)症候群が含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物におけるかかる黒色腫は、染色体異常、変性増殖及び発生障害、分裂促進物質、紫外線照射(UV)、ウイルス感染、遺伝子の不適切組織発現、遺伝子の発現における変化、及び細胞上での現出、又は発癌性物質によって起こり得る。上述の黒色腫は、本願に記載した方法により、診断され、評価され又は治療されることができる。
非定型母斑により、本発明者らは、異常でありそして前癌性であり得る特徴を有する母斑を意味させようとしている。
黒色腫抗原又は免疫原により、本発明者らは、p15タンパク質の又は哺乳動物において細胞性又は体液性免疫応答を起こすことができるp15タンパク質配列に基づくペプチドの全部又は一部を意味させようとしている。かかる抗原は、p15タンパク質(図1;配列番号:2)の全部、一部又は一部の寄せ集めで免疫感作された動物からの抗体と反応性でもあり得る。そのようなタンパク質又はペプチドは、この発明のp15核酸配列の全部又は一部によりコードされることができる。
免疫原性ペプチドにより、本発明者らは、哺乳動物において細胞性又は体液性免疫応答を起こすことができる、p15タンパク質配列(図1;配列番号:2)から誘導されるペプチド又はチロシナーゼペプチド(配列番号:7及び配列番号:8)を意味させようとしている。かかるペプチドは、それらペプチドで免疫感作された動物からの抗体と反応性でもあり得る。かかるペプチドは、約5〜20アミノ酸の長さ、好ましくは約8〜15アミノ酸の長さ、そして最も好ましくは約9〜10アミノ酸の長さであることができる。
当業者は、本発明のバイオアッセイをあらゆる脊椎動物種からの生体サンプル又は組織の分析に用い得ることを理解するであろう。好ましい態様においては、哺乳動物の生体サンプル又は組織を分析する。
組織には、単細胞、器官全体及びその部分が含まれるがこれらに限定されない。生体サンプルには、組織、哺乳動物組織の一次培養物、生体組織検体、病理学検体、及び剖検検体が含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ及びヤギが含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、T細胞により認識される新規な黒色腫抗原をコードする核酸配列を提供する。この新規な黒色腫抗原をコードする遺伝子はp15と呼ばれる。このp15cDNAは、如何なる公知の黒色腫抗原又はタンパク質とも有意な相同性を示さないので、新たな黒色腫抗原をコードする遺伝子に該当する。このcDNA内の唯一の長いオープンリーディングフレームは、第1インフレームメチオニンで始まる約15キロダルトン(kd)の分子量(MW)を有する128アミノ酸ポリペプチドをコードする。p15は、何らかの公知の遺伝子ファミリーのメンバーとしてそれを特定する如何なる特徴も含んでいないように見え、そして通常のリーダー配列、並びにN−連結グリコシル化のためのコンセンサス部位及び何らかの拡大疎水性ドメインを欠いている。
p15RNAは、培養された黒色腫及びメラノサイト細胞系、及び網膜、睾丸、及び脳の如き多種多様なヒトの組織において発現される。P15についてのcDNA配列を図1(配列番号:1)に示し、P15タンパク質についての推定アミノ酸配列も図1(配列番号:1)に示す。
図1(配列番号:1)に示したp15についての核酸配列は本発明の好ましい態様に該当する。しかしながら、遺伝子コードの縮退のために、図1(配列番号:1)に示したcDNA配列における変異体も、依然としてp15タンパク質抗原をコードすることができるDNA配列をもたらすであろうことが、当業者により理解される。従って、かかるDNA配列は、図1(配列番号:1)に記載した配列と機能的に等価であるので、本発明の範囲内に包含されることを意図するものである。更に、当業者は、図1(配列番号:1)に示したp15核酸配列の所与の種の中に天然に存在する対立変異体があることを理解するであろう。これら変異体も、本発明の範囲内に包含されることを意図するものである。やはり、この発明の範囲内に包含されることが意図されるのは、図1に示したp15核酸配列に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる核酸配列に相補的である核酸配列である。低ストリンジェンシー条件、及び低ストリンジェンシー条件を得るために必要な変性により意味されるものを当業者は理解するであろう。ストリンジェンシーをもたらすために変動させてもよい要素には、塩濃度又は温度が含まれるがこれらに限定されない(Ausubel ら,(1987)“Current Protocolsin Molecular Biology”, John Wiley and Sons, New York, New York)。
本発明はさらに、本発明のp15抗原またはタンパク質と実質的に同一の機能を有するp15タンパク質またはそのペプチドまたはアナログを包含する。そのようなタンパク質またはポリペプチドには、タンパク質の断片、あるいはp15タンパク質の置換、付加または欠失変異体が含まれるがこれらに限定されない。本発明はまた、p15抗原と実質的に相同であるタンパク質またはペプチドを包含する。「アナログ」という用語は、本書中に特定的に示されるp15配列(図1;配列番号:2)と実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含み、この場合1以上の残基は機能的に同様の残基により保存的に置換されており、これは本書中に記載したp15抗原の機能的側面を示す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの1個の非極性(疎水性)残基による別の残基の置換、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間などの1個の極性(親水性)残基による別の残基の置換、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの1個の塩基性残基による別の残基の置換、あるいは、アスパラギン酸またはグルタミン酸などの1個の酸性残基による別の残基の置換が挙げられる。
「保存的置換」という用語はまた、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基の使用を含む。「化学的誘導体」とは、機能的側鎖基の反応により化学的に誘導された1以上の残基を有する対象ポリペプチドのことを指す。そのような誘導された分子の例としては、例えば、遊離アミノ基が誘導されてアミン塩酸塩、p−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導して、塩、メチルおよびエチルエステル、または他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導してO−アシルまたはO−アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導してN−im−ベンジルヒスチジンを形成してもよい。20個の標準アミノ酸の1以上の天然由来のアミノ酸誘導体を含むタンパク質またはペプチドもまた、化学誘導体として含まれる。例えば:4−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに置換してもよい;5−ヒドロキシリジンをリジンの代わりに置換してもよい;3−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに置換してもよい;ホモセリンをセリンの代わりに置換してもよい;そしてオルニチンをリジンの代わりに置換してもよい。また本発明のタンパク質またはポリペプチドには、必要な活性が維持される限り、コードされる配列がp15のDNAであるポリペプチドの配列に関連する残基の1以上の付加および/または欠失を有する任意のポリペプチドが含まれる。
本発明はまた、p15核酸配列(配列番号1)の全部または一部とベクターとを含む組み換えDNA分子を提供する。本発明で使用するのに適した発現ベクターは、核酸配列に作動的に連結された少なくとも1個の発現調節要素を含む。発現調節要素はベクター中に挿入されて、核酸配列の発現を調節および制御する。発現調節要素の例としては、lacシステム、ラムダファージのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター並びにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはSV40から誘導されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。追加の好ましいまたは必要な作動要素としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、並びに宿主系の中で核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳のために必要なまたは好ましい任意の他の配列が含まれるが、これらに限定されない。必要なまたは好ましい発現調節要素の正確な組み合わせは選択される宿主系に依存するであろうということは当業者により理解されるであろう。さらに、発現ベクターは、核酸配列を含む発現ベクターの宿主系中への移動およびその中でのその後の複製のために必要な追加の要素を含むべきであることも理解されるであろう。そのような要素の例としては、複製の起点および選択可能なマーカーが含まれるが、これらに限定されない。そのようなベクターは慣用的方法(Ausubel et al.,(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”において、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)を使用して容易に構築されるか、商業上入手可能であることは当業者により理解されるであろう。
本発明の別の側面は、p15核酸配列の全部または一部を含む組み換え発現ベクターが挿入されている宿主生物に関する。本発明のp15核酸配列で形質転換された宿主細胞としては、真核細胞、例えば動物、植物、昆虫および酵母細胞、並びに原核細胞、例えばE.coliが含まれる。遺伝子を運搬するベクターを細胞に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、またはDEAE−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション、または当業者に既知の他の方法(Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press、Plainview, ニューヨーク)が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい態様においては、真核細胞において機能する真核発現ベクターが使用される。そのようなベクターの例としては、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、プラスミド、例えばpCDNA3(Invitrogen、サンジエゴ、CA)、またはバキュロウイルス形質転換ベクターが含まれるが、これらに限定されない。好ましい真核細胞株としては、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、NIH/3T3細胞、293細胞(ATCC#CRL1573)、T2細胞、樹木様(dendritic)細胞、または単核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このましい態様においては、組み換えp15タンパク質発現ベクターは、NIH/3T3、COS−7、CHO、293細胞(ATCC#CRL1573)、T2細胞、樹木様(dendritic)細胞、または単核細胞などの哺乳動物細胞中に導入され、p15タンパク質の正確なプロセシングおよび修飾が保証される。例えば、p15cDNAはCOS7細胞に導入されて(Gluzman, Y. et al.(1981)Cell 23: 175-182)、発現する。
一つの態様においては、発現された組み換えp15タンパク質は、クマシーブルー染色およびp15タンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングを含む、本技術分野で既知の方法により検出することができる。
さらに別の態様においては、宿主細胞により発現された組み換えタンパク質は、粗溶解物として得ることができ、あるいは、示差(differential)沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーなどを含む、本技術分野で既知の標準的タンパク質精製法により精製することができる(Ausubel et al.(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”において、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)。イムノアフィニティクロマトグラフィーの場合、組み換えタンパク質は、p15タンパク質に特異的な抗体(樹脂に結合)を有する樹脂を含むカラムを通過させることによって精製することができる(Ausubel et al.(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”において、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)。
本発明の核酸配列またはその一部は、正常および疾患組織におけるp15遺伝の発現の検出のためのプローブとして有用である。従って、本発明の別の側面は、生物試料中においてp15タンパク質をコードするメッセンジャーRNAを検出するためのバイオアッセイ法であって、(a)生物試料を本発明の核酸配列の全部または一部と、上記核酸配列と上記メッセンジャーRNAとの間に複合体が形成されるような条件下で接触させる工程、および(b)上記複合体を検出する工程を含む方法に関する。この方法はさらに、上記メッセンジャーRNAのレベルを測定する工程(c)を含むことができる。
RNAは、全細胞RNAとして、またはポリ(A)+RNAとして単離することができる。全細胞RNAは、当業者に既知の種々の方法により単離することができる(Ausubel et al.,(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”において、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)。そのような方法としては、示差沈殿によるRNAの抽出(Birnboim, H.C.(1988)Nucleic Acids Res., 16: 1487-1497)、有機溶媒によるRNAの抽出(Chomczynski, P. et al.(1987)Anal. Biochem., 162: 156-159)および強い変性剤によるRNAの抽出(Chirgwin, J.M. et al.(1979)Biochemistry, 18:5294-5299)が挙げられる。ポリ(A)+RNAは、オリゴd(T)カラム上でのアフィニティクロマトグラフィーにより全細胞RNAから選択することができる(Aviv, H. et al.(1972)Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1408-1412)。工程(c)のための細胞メッセンジャーmRNAのレベルを測定するための方法の例としては、ノザーンブロッティング(Alwine, J.C. et al.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5350-5354)、ドットおよびスロットハイブリダイゼーション(Kafatos, F.C. et al.(1979)Nucleic Acids Res., 7: 1541-1522)、フィルターハイブリダイゼーション(Hollander, M.C. et al.(1990)Biotechniques; 9:174-179)、RNaseプロテクション(Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press、Plainview, NY)、ポリメラーゼ連鎖反応(Watson, J.D. et al.(1992)“Recombinant DNA”第2版、W.H.Freemanおよびカンパニー、ニューヨーク)および核ランオフ(run-off)分析(Ausubel et al.,(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”Supplement 9(1990)、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)が挙げられるが、これらに限定されない。
バイオアッセイ法の工程(b)の複合体の検出も種々の技術によって実施することができる。シグナル増幅による複合体の検出は、放射標識および酵素(Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press、Plainview, ニューヨーク;Ausubel et al.,(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク)を含む複数の慣用的標識技術により達成することができる。放射標識キットも商業上入手可能である。バイオアッセイの工程(a)でプローブとして使用されるp15核酸配列は、RNAでもDNAでもよい。DNA配列を標識する好ましい方法は、Klenow酵素またはポリヌクレオチドキナーゼを使用する32Pによるものである。RNAまたはリボプローブ配列を標識する好ましい方法は、RNAポリメラーゼを使用する32Pまたは35Sによるものである。さらに、シグナル増幅のための非放射活性技術が知られており、例えば、ピリミジンおよびプリン環に化学成分を付着させる方法(Dale, R.N.K. et al.(1973)Proc. Natl. Acad. Sci., 70:2238-2242; Heck, R.F.(1968)S. Am. Chem. Soc., 90:5518-5523)、ケミルミネッセンスによる検出を可能にする方法(Barton, S.K. et al.(1992)J. Am. Chem. Soc., 114: 8736-8740)およびビオチン化核酸プローブを利用する方法(Johnson, T.K. et al.(1983)Anal. Biochem., 133:125-131; Erickson, P.F. et al.(1982)J. of Immunology Methods, 51:241-249; Matthaei, F.S. et al(1986)Anal. Biochem., 157:123-128)および商業上入手可能な製品を使用する蛍光による検出を可能にする方法が挙げられる。非放射活性標識キットもまた商業上入手可能である。
本バイオアッセイ法で使用することができる生物試料の例としては、初代哺乳動物培養物、メラノサイト細胞株などの継続哺乳動物細胞株、皮膚または網膜などの哺乳動物器官、組織、バイオプシー試料、新生物、病理試料、および検死試料が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい態様では、実施例1に例示するような32P放射標識p15プローブが使用される。約0.9キロベース(kb)のcDNA(図1;配列番号1)がpCDNA3ベクター中にクローニングされ、得られたプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USAに1995年1月9日にATCC寄託番号97015により寄託された。全長p15核酸配列は、BstXIおよびNotI制限酵素による消化によってpCDNA3プラスミドから単離することができる。この0.9kbの核酸配列は次いでプローブとして使用することができる。このプローブを使用して、種々の組織または生物試料から単離された全RNAまたはポリA+RNA中のp15mRNAを検出する。あるいは、p15プローブは、p15遺伝子からの462塩基対のBamHI/PstI断片である(図1;配列番号1;核酸15から476)。
別の態様においては、図1中のp15配列に基づいたオリゴヌクレオチド対の組み合わせをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用し、生物試料中のp15mRNAを検出する。これらのプライマーは、Ausubel et al.,(eds)(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”、第15章、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨークに詳述されるような、選択されたRNA核酸配列を増幅するための逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を伴う方法で使用することができる。オリゴヌクレオチドは、多様な製造業者によって販売される自動化された機器により合成することができ、あるいは本発明の核酸配列に基づいて商業的に調製することができる。当業者ならば、試料中のp15RNAを増幅するためのp15核酸配列(図1)に基づいたPCRプライマーの選択の仕方を知っているであろう。例えば、M2aと命名されたオリゴヌクレオチドプライマー(5’−CAACAACGACAAGCTCTCCAAGAG−3’)(配列番号:3 図1;核酸36−58)およびM2bと命名されたオリゴヌクレオチドプライマー(5’−GGAACACTGCCGCAAACGTC−3’)(配列番号:4 図1;核酸768−748)を使用してp15配列を増幅することができる。
本発明のp15核酸配列またはその一部(図1:配列番号:1)は、正常または疾患を有する哺乳動物組織中のp15ゲノムDNAまたはp15遺伝子の変化を検出するのに有用である。変化とは、本発明者は、p15遺伝子配列中の付加、欠失、置換、再構成または重複、あるいはp15遺伝子配列の遺伝子増幅を意味する。従って、本発明の別の側面は、生物試料中のp15ゲノムDNAまたはp15遺伝子の変化を検出するためのアッセイ法に関する。そのようなアッセイ法は、本発明の核酸配列の全部または一部を生物試料から単離されたゲノムDNAと、上記核酸配列と上記ゲノムDNAとの間に複合体が形成するような条件下で、接触させる工程(a)と、上記複合体を検出する工程(b)とを含むことができる。上記p15遺伝子中の変化の測定は、対照試料との比較によりあるいは他の慣用方法により行うことができる。
生物試料からDNAを単離し、遺伝子中の変化を検出し、そしてp15核酸プローブとゲノムDNA配列との間の複合体を検出するための標準法は、Sambrook et al.(eds)(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press、Plainview, ニューヨーク;Ausubel et al.,(eds)(1987)、“Current Protocols in Molecular Biology”、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨークなどのようなマニュアル中に提供されている。
また、本発明のp15核酸配列(図1;配列番号:1)の全部または一部をプローブとして使用して他の試料中のp15ホモログを単離することができる。好ましい態様においては、p15cDNA(図1;配列番号:1)を使用して哺乳動物のcDNAライブラリーをスクリーニングする;陽性クローンを選択し、配列決定する。cDNAライブラリーを合成することができる組織源の例としては、皮膚、網膜、メラノサイト、新生児脳、精巣および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、プローブとしてp15核酸配列(図1;配列番号1)を使用してメラノーマライブラリーをスクリーニングする。当業者ならばホモログを検出するために使用するべき好適なハイブリダイゼーション条件を理解するであろう。核酸ハイブリダイゼーション、ライブラリーの構築およびクローニング技術の慣用方法は、Sambrook et al.,(eds)(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press、Plainview, ニューヨーク;およびAusubel et al.,(eds)、“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)、John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨークに記載されている。
本発明者は、p15タンパク質の全部またはその一部がメラノーマ細胞上に存在する抗原であることを決定した。従って、疾患を患う哺乳動物から単離された生物試料中のp15RNAまたはp15mRNAのレベルの変化を検出するのに利用できるp15核酸プローブを提供することは本発明の別の側面である。そのような疾患の例としては、メラノーマが挙げられるがこれに限定されるわけではない。p15mRNAのレベルの変化とは、本発明者は対照試料に対するRNAのレベルの増加または減少、あるいは対照試料に対するp15mRNAの出現または消滅を意味する。p15mRNAの変化の検出により、疾患状態の診断または評価が可能になる。従って、p15mRNAのレベルの変化は、罹患した哺乳動物の予後を予測できるかもしれない。
別の態様においては、本発明の核酸の全部またはその一部を哺乳動物組織上でのin situハイブリダイゼーションにおいて使用して、組織内でのp15遺伝子の発現の正確な位置または細胞レベル以下の位置を決定することができる。p15核酸配列を標識する好ましい方法は、当業者に公知のポリメラーゼを利用するin vitro転写によって35S−標識RNAプローブの合成である。in situ用の組織の調製、プローブの合成およびシグナルの検出のための慣用的方法は、Ausubel et al.,(eds)、(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”John WileyおよびSons、ニューヨーク、ニューヨーク第14章、並びにVander Ploeg, M., Raap A.K.(1988)“New Frontiers in Cytology”Goerttler, K., Feichter, GE, Witte. S.(eds)pp 13-21 Springer-Verlag, ニューヨーク中に見いだされる。プローブを次いで哺乳動物組織切片と接触し、慣用的方法によりin situ分析を行う。使用することができる組織の例としては、哺乳動物胎児(embryos)、成熟哺乳動物組織、例えば皮膚、リンパ節および網膜、バイオプシー試料、病理試料および検死試料などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、p15in situプローブを使用して侵入性初期メラノーマのための疾患組織におけるp15RNA発現を評価して、メラノーマ損傷の放射状および垂直的成長期を同定し、当業者に公知の組織内における疾患の限界点を評価することができる。
本発明のさらに別の側面においては、p15(配列番号:1)核酸配列の全部またはその一部を使用してトランスジェニック動物を作成することができる。好ましくは、p15遺伝子は、胚段階において、好ましくは1細胞段階においてそして一般的には約8細胞段階以前において、動物または動物の先祖中に導入される。p15遺伝子を有するトランスジェニック動物を作成することができる方法は複数存在する。一つの方法は、p15配列の全部または一部を運搬するレトロウイルスの使用を含む。トランス遺伝子を含むレトロウイルスは、トランスフェクションによって胚(embryonic)動物中に導入される。別の方法は、トランス遺伝子を胚中に直接注入することを含む。さらに別の方法は、本技術分野の研究者に公知の胚幹細胞法または相同組み換え法を使用する。p15トランス遺伝子を導入することができる動物の例としては、非ヒトの霊長目動物、ネズミ、ラットまたは他のげっ歯動物が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなトランスジェニック動物は、メラノーマの研究のための生物モデルとして、そしてメラノーマの診断および治療方法を評価するのに有用である場合がある。
本発明には、さらに、図1で定義されたアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)、またはその独特の部分を有するp15タンパク質またはペプチドと反応する抗体、または抗体群が含まれる。本発明のこの態様において、抗体は元来はモノクローナル、またはポリクローナルである。抗体を作製するために用いられるp15タンパク質またはペプチドは、天然もしくは組換え体の発生源からのものであるか、または化学合成により作製することができる。天然のp15タンパク質は哺乳動物の生物試料より単離できる。生物試料には、新生した黒色腫(melanoma)、皮膚、網膜、黒色腫の培養組織または培養したメラノサイト等の哺乳動物の一次または連続的な培養組織、および繊維芽細胞等の正常組織等の哺乳動物の組織が含まれるが、これらに限定されるものではない。天然のp15タンパク質は、組換え体タンパク質のために上述したものと同様の方法により単離可能である。組換え体p15タンパク質またはペプチドは、慣用された方法により作製し、精製することができる。合成p15ペプチドは、本発明の予想されるアミノ酸配列(図1;SEQ ID NO:2)に基づいて、特別注文、または商業的に作製するか、または当業者に知られている方法(Merrifield, R.B.(1963)J. Amer. Soc. 85:2149)により合成することが可能である。p15ペプチドの例には、AYGLDFYIL(p1510-18;SEQ ID NO:5)、およびEAYGLDFYIL(p159-18;SEQ ID NO:6)(ペプチドは一文字のアミノ酸コードで示されている)が含まれるが、これらに限定されるものではない。もしもペプチドが抗原とするのに短過ぎるのであれば、ペプチドの抗原性を高めるために、担体分子に結合させることができる。担体分子の例には、ヒトのアルブミン、ウシのアルブミン、およびスカシガイのヘモシアニン(”Basic and Clinical Immunology”(1991)Stites, D.P.および、Terr A.I.(編集)AppletonおよびLange, Norwalk Connecticut, San Mateo, California)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の検出法に用いる典型的な抗体分子は、天然の免疫グロブリン分子、実質的に天然の免疫グロブリン分子、または抗体の結合部位を含み、当該技術分野においてF(ab), F(ab’); F(ab’)2およびF(v)として知られている免疫グロブリン分子の一部を含む免疫グロブリン分子の一部分である。ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体は、当該技術分野において知られている方法(KohlerおよびMilstein(1975)Nature 256, 495-497;Campbell”Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas”Burdorら(編集)(1985)”Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, 第13巻, Elsevier Science Publishers, Amsterdam)により作製することができる。抗体、または抗原結合断片もまた、遺伝学的手法により作製可能である。重鎖および軽鎖の両方の遺伝子のE. coli内での発現の技法は、以下のPCT特許出願の主題である:公開番号WO 901443、WO 901443およびWO 9014424、およびHuseら(1989)Science 246:1275-1281、に掲載)
本発明の抗体は、天然の、または変性させたp15タンパク質、またはペプチドまたはその類似物と反応することができるだろう。抗体を使用する特異的な免疫学的検定により、どの抗体が望ましいかが指示されるであろう。抗体はp15タンパク質、またはその一部分に対して、またはp15のアミノ酸配列に相同的な合成ペプチドに対して産生させることが可能である。
ある態様においては、本発明の抗体は、免疫学的検定において、生物試料中の新規のp15タンパク質を検出するのに用られる。本方法においては、本発明の抗体は生物試料と接触しており、p15抗原と抗体との間の複合体の形成が検出される。本発明の免疫学的検定には、放射線免疫学的検定、ウエスタンブロット分析、免疫蛍光法、酵素免疫学的検定、化学蛍光法、免疫組織学的分析等が可能である(”Principles and Practice of Immunoassay”(1991)Christopher P. PriceおよびDavid J. Neoman(編集), Stockton Press, New York, New Yorkに記載; Ausubelら(編集)(1987)、”Current Protocols in Molecular Biology”John WileyおよびSons, New York, New York、に記載)。ELISAについて当該技術分野で知られている標準的な技法は、Methods in Immunodiagnosis, 第2版, RoseおよびBigazzi, 編集, John WileyおよびSons, New York 1980、およびCampbellら、Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc., 1964、に記載されており、これらは両方とも本明細書中に参考文献として援用されている。このような分析は、当該技術分野において記載されているように(”Principles and Practice of Immunoassay”(1991)Christopher P. PriceおよびDavid J. Neoman(編集), Stockton Pres, NY, NY; Oellirich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904、に記載)、直接的、間接的、競合的、または非競合的な免疫学的検定になり得る。そのような検出分析に適した生物試料には、哺乳動物組織、黒色腫および黒色腫細胞株、皮膚、網膜、リンパ節、病理学標本、剖検標本、および生検標本が含まれる。タンパク質は、生物試料から、(Ausubelら、(編集)(1987)”Current Protocols in Molecular Biology”John WileyおよびSons, New York, New York、に記載)に記載の慣用された方法により単離することが可能である。
本発明の抗体は、病気または疾患を患った哺乳動物から単離された生物試料中において、p15抗原またはp15抗原の発現レベルでの変化を検出するための免疫学的検定に用いることができる。生物試料には、哺乳動物組織、剖検組織試料、黒色腫およびリンパ節の剖検試料、病理学試料、および組織試料が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの免疫学的検定により評価可能な病気の例には、黒色腫、および黒色腫の転移の第二の部位となる組織が含まれるが、これらに限定されるものではない。発現レベルの変化により、p15タンパク質またはその一部分の、対照の試料と比較した増加または減少が意味付けられる。変化はまた、間違った細胞内区画におけるp15タンパク質またはその一部分の存在と同様に、p15タンパク質の置換、欠失、再配列、または付加変異を含むことを意味している。そのような変異は、p15タンパク質の特異的な抗原決定基と反応することが知られている本発明の抗体を用いること、および、どの抗原決定基が対照試料に関して存在しているかを決定することにより、決定できる。それゆえに、本発明の抗体は、病気を患った哺乳動物を診断し、評価し、予知するための免疫学的検定において利用できる。
より好ましい態様においては、本発明のp15抗体は、免疫細胞化学を用いて、黒色腫にかかった哺乳動物の組織剖検からp15抗原の存在を査定するのに用いる。そのような、病気の組織におけるp15抗原の描写の査定は、病気にかかった哺乳動物の病気の進行を予知するのに利用できる。特に、p15抗体は、黒色腫の組織障害の放射状および垂直方向の増殖面を特定するのに利用できる。免疫組織化学のための慣用された方法は、(HarlowおよびLane(編集)(1988)”Antibodies A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York、に記載;Ausbelら、(編集)(1987)Current Protocols In Molecular Biology, John WileyおよびSons(New York, New York)、に記載)に記載されている。
別の態様においては、本発明の抗体は、p15タンパク質またはその一部分を精製するのに利用することができる。免疫アフィニティー・クロマトグラフィーは、当業者に知られている慣用的な方法(Ausubelら、(編集)(1987)”Current Protocols in Molecular Biology”John WileyおよびSons, New York, New York、に記載)により行うことができる。
別の態様においては、p15を特異的に認識する抗体を含むウサギの抗血清が、ウエスタンブロット分析において上述のタンパク質を検出するのに用いられる。そのような抗血清は、p15タンパク質またはp15タンパク質配列由来の合成ペプチドのすべて、または一部、または複数部分を標的にしている。好ましくは、p15の予想されるアミノ酸配列由来の合成p15ペプチドを用いる(図1;SEQ ID NO:2)。ペプチドは自動ペプチド合成機を用いて標準的な方法により合成し、実施例1に記載されているようにして高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製する。精製したペプチドは、(M. Bodanszky(1984)”Principles of Peptide Synthesis”, Springer Verlag, New York, New York)に記載されているようにして、担体に結合させることが可能である。慣用の方法を用いて、ウサギをp15タンパク質、または担体に結合させたペプチドで免疫できる。例として、アジュバント中約0.1から10(mg)の抗原を使用し、より好ましくは、アジュバント中約1mgの抗原を用いる。動物は同様の量の追加抗原刺激を受け、抗血清の力価はELISA分析により評価する。十分なレベルの抗血清は、抗ペプチド抗体の力価が定常状態に達した時に得られる。この抗体は上述の標準的な免疫学的検定に用いることができる。
組換え体のまたは天然のp15タンパク質、ペプチド、またはそれらの類似物(analogs)は、予防または治療上のいずれかにおいてワクチンとして利用できる。予防に供給するときには、ワクチンは黒色腫が事実になるのに先だって供給する。p15ワクチンを予防的に投与することにより、哺乳動物における黒色腫を防いだり、または弱めるのに役立つであろう。より好ましい態様においては、黒色腫の危険が大きい哺乳動物、好ましくはヒトは、本発明のワクチンで予防する。そのような哺乳動物の例には、黒色腫の家系をもつ人、不定型のほくろの家系をもつ人、FAM-M症候群の家系をもつ人、または、以前に切除し、そのために再発の危険がある黒色腫にかかった人が含まれるが、これらに限定されるものではない。治療上供給するときには、ワクチンは、黒色腫または転移黒色腫に存在する腫瘍抗原への患者自身の免疫応答を高めるために供給する。抗原としての役割を果たすワクチンは、細胞、組換え体発現ベクターをトランスフェクションした細胞由来の細胞溶解物、p15組換え体発現ベクターをトランスフェクションした細胞由来の細胞溶解物、または発現タンパク質を含む培養上清が可能である。あるいは、免疫原は、部分的にまたは実質的に精製された組換え体p15タンパク質、ペプチド、またはそれらの類似物である。タンパク質またはペプチドは、リポタンパク質と結合させるか、またはリポソームの形状かまたは慣用の方法論を用いてアジュバントとともに投与することが可能である。
免疫原を純粋または実質的に純粋な形で投与することは可能であるが、それは薬剤組成物、処方、または調製として与えることがより好ましい。
獣医学的および人の両方に使用する本発明の処方は、上記免疫源、ならびに1つまたはそれ以上の薬学的に受容可能なキャリヤーおよび所望により他の治療成分を含む。キャリヤーは、処方の他の成分と適合し、投与した患者に害を及ぼすことがないという意味において”受容可能”でなくてはならない。処方は従来どうり一回の服用量の形態で作成し、薬学において既知の方法で調製する。
すべての方法は、有効成分を1つまたはそれ以上の補助的な成分を含むキャリヤーと結合させる段階を含む。一般に、処方は有効成分と液状のキャリヤーまたは適切に分割した固体キャリヤーまたはその両方を結合して、それから必要であれば、望ましい処方になるように産物を成形して一様に調製する。
静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、または腹腔内投与に適した処方は、便利には、有効成分の無菌溶液と好適には受容者の血液と等張な溶液を含む。このような処方は、従来、食塩(例えば0.1-2.0M)、グリシンなどのような生理的に受容可能な物質を含む水に固体状の有効成分を溶解し、生理的条件に適合するようにpHを緩衝化して水溶液を作成し、溶液を無菌状態にすることによって調整する。これらは、例えば、封印したアンポールまたはバイアルのような一回の服用量または数回の服用量を含む形態として調製する。
本発明の処方は、安定剤を含んでもよい。明らかな安定剤は、それ自身でまたは添加物として使用できるポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、および有機酸である。これらの安定剤は、好適には免疫源の重さが1に対して重さで0.11-10,000の割合で加える。もし、2つまたはそれ以上の安定剤を使用する場合には、総量は好適には上記に特定した範囲内である。これらの安定剤は、適切な濃度およびpHの水溶液にて使用する。このような水溶液の特定の浸透圧は、一般に0.1-3.0オズモルの範囲内であり、好適には0.8-1.2の範囲内である。水溶液のpHは、5.0-9.0の範囲内であり、好適には6-8の範囲内である。本発明の免疫源を処方する際に、抗吸着剤を使用する。
活性の存続を制御するために、さらなる薬剤的な手法を使用してもよい。放出を制御された調製物は、タンパク質またはその誘導体と複合体を形成または吸着するためのポリマーを使用して作製できる。制御された運搬は、適切な巨大分子(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、酢酸エチレンビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン)、巨大分子の濃度、および放出を制御するための取込み方法を選択することによって行われる。放出を制御された調整物によって活性の存続を制御する別の可能な方法は、p15タンパク質、ペプチドおよびその類似体を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ(酪酸)またはエチレンビニルアセテートポリマーのような多量体物質分子に取り込むことである。あるいは、これらの薬剤を多量体分子に取り込むかわりに、例えば、共集積技術または例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンミクロカプセルおよびポリ(メチルメタクレート)ミクロカプセルのような界面多量化によって調製したマイクロカプセル、または例えばリポソーム、アルブミン微小球、微小乳剤、ナノ顆粒、およびナノカプセルのようなコロイドによる薬剤運搬システムまたはマクロ乳剤によって調製した物質を取り込むことが可能である。
経口調剤が望まれる場合には、組成物は、ラクトース、スクロース、でんぷん、タルクマグネシウム脂肪、クリスタリンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギニンナトリウム、またはアラビアゴムのような典型的なキャリヤーと結合させてもよい。
本発明のタンパク質は、上記に記載したように、キット、単独、または薬剤組成物の形態で供給され得る。
ワクチン接種は、従来の方法で行うことができる。例えば、免疫源は、食塩水または水のような適切な溶媒、または完全または不完全な補助薬中で使用できる。さらに、免疫源はタンパク質を免疫源にするためにキャリヤーに結合させてもさせなくてもよい。このようなキャリヤー分子の例には、ウシ血清アルブミン(BSA)、スカシガイのヘモシアニン(KHL)、テタヌス類毒素のようなものが含まれるがこれに限らない。免疫源はまた、リポタンパク質に結合してリポソームの形態または補助薬と共に投与できる。免疫源は静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下などのような抗体産生に適した経路で投与可能である。免疫源は、抗p15免疫細胞または抗p15抗体が有意な量生産されるまで、一度にまたは継続的に投与してもよい。抗p15免疫細胞の存在については、CTL前駆体解析アッセイ(Coulie,P.ら(1992)International Journal Of Cancer 50:289-297)により、免疫の前と後においてp15抗原に対するCTL前駆体(細胞傷害性Tリンパ細胞)の存在を計測して測定できる。抗体は、上述した免疫測定を使用して血清中で検出できる。
本発明のワクチンまたは免疫源の投与は、予防または治療の目的のどちらにも使用できる。予防として提供する場合には、免疫源は病気に先んじて提供され、または黒色腫の症状に先んじて提供される。免疫源の予防的な投与によって、哺乳類における黒色種が予防または減少する。治療として投与する場合には、免疫源は病気が現れた時(またはそのすぐ後)または病気の症状が現れはじめたときに提供される。免疫源の治療的な投与によって、病気が回復する。
例として、組換えp15タンパク質またはペプチドを発現するベクターを使用して調製したワクチンを使用できる。患者にワクチンを投与するために、すべてまたは部分的なp15の核酸配列をコードする遺伝的配列を上記に記載したように発現ベクターに挿入し、免疫するために哺乳動物に導入する。前述のワクチンに使用するベクターの例には、欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ニワトリポックスウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターが含まれるがこれに限らない(Mulligan,R.C.,(1993)Science 260:926-932)。すべてまたは部分的なp15核酸配列を持つウイルスベクターは、黒色種の症状がでる前または黒色種に苦しむ哺乳動物の病気を軽減するために哺乳動物に導入できる。ウイルスベクターを哺乳動物に投与する方法の例には、細胞を生体外でウイルスにさらす、または患部組織へのレトロウイルスまたはウイルスを生産する細胞系列の注入またはウイルスの静脈内投与をが含まれるがこれに限らない。あるいは、全てのまたは部分的なp15核酸配列を持つウイルスベクターを、黒色腫患部に直接局部的に注入または薬学的に受容可能なキャリヤーの応用によって投与する。例として、p15ペプチドAYGLDFYIL(p1510-18;SEQ ID NO:5)またはEAYGLDFYIL(p159-18;SEQ ID NO:6)に相当した核酸配列をウイルスベクターに取り込むことが可能である。全てのまたは部分的なp15核酸配列を持つウイルスベクターの投与量は、ウイルス粒子の力価にもとづく。例として、投与される免疫源の範囲は、哺乳動物1個体あたり、好適にヒトでは、106から1011個のウイルス粒子である。免疫したのちに、ワクチンの効率は、特定の溶解活性または腫瘍の退化による特定のサイトカインの生産で測定するように、抗原を認識する免疫細胞の抗体の生産によって測定可能である。当業者は、前述したパラメーターを測定する従来の方法を理解している。免疫された哺乳動物がすでに黒色種または転移性黒色種を患っている場合には、ワクチンは他の治療的処置と組み合わせて投与できる。他の治療的処置の例には、T細胞免疫治療、黒色腫に対するサイトカインまたは他の治療薬と同時に投与することが含まれるがこれに限らない。
あるいは、相当にまたは部分的に精製されたp15タンパク質の、全てまたは一部分を、薬学的に適切な担体中でワクチンとして投与してもよい。例えば投与されるp15タンパク質の量の範囲は患者一人当たり0.001から100mgであり得、望ましい投与量は患者一人当たり0.01から100mgである。一つの望ましい態様において、p15ペプチドAYGLDFYIL(p1510-18;SEQ ID NO:5)またはEAYGLDFYIL(p159-18;SEQ ID NO:6)(一文字表記)またはそれらの類似物を、そのような治療を必要としている哺乳動物に治療的にまたは予防的に投与してもよい。例えば、投与量は0.001mgから100mgであり得、望ましい投薬量は0.01mgから100mgである。ペプチドは化学合成的にまたは組み換えDNA技術によって調製され得る。予防注射は充分な力価の抗免疫原抗体または免疫細胞が得られるまで必要に応じて繰り返される。
さらにもう一つの別の態様においてはレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターが哺乳類細胞に導入され得る。レトロウイルスベクターが導入され得る哺乳類細胞の例は哺乳類初期培養細胞または哺乳類継続培養細胞、COS細胞、NIH3T3,または293細胞(ATTC #CRL 1573)が含まれるがこれらに限られる訳ではない。当該遺伝子を持つベクターを細胞に導入する方法にはマイクロインジェクション、電気穿孔法、形質転換またはDEAEデキストランを用いた形質転換、リポフェクション、リン酸カルシウムまたはその他の当業者に知られた方法(Sambrook et al.(eds)(1989)”Molecular cloning.A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Press,Plainview,New York)が含まれるがこれらに限られる訳ではない。p15抗原を発現している哺乳類細胞は哺乳類に投与され得、ワクチンまたは免疫原として働き得る。p15抗原を発現している細胞がどのように投与され得るかの例には静脈注射,腹腔内注射,または病変内注射が含まれるがこれらに限られる訳ではない。望ましい態様においてはペプチドAYGLDFYIL(p1510-18;SEQ ID NO:5)およびEAYGLDFYIL(p159-18;SEQ ID NO:6)に対応するp15の核酸配列の一部分がp15発現ベクターに挿入され哺乳類細胞に導入される。
本発明のワクチンの処方は黒色腫関連p15抗原のような黒色腫関連抗原に対する免疫応答を誘導する免疫原を含む。ワクチンの定式化ははじめ動物モデルにおいて、または非人類霊長類において、最後にヒトにおいて評価され得る。予防接種の手順の安全性は予防接種された動物の一般的な健康状態(体重変化、体温、摂食行動)への予防接種の影響および解剖における病理学的変化を観察することによって決定される。初めの動物における試験の後に、黒色腫患者が試験され得る。ワクチンの効率を決定するために、慣例的な方法が患者の免疫応答を評価するのに用いられる。
さらにまた別の本発明の態様においてはp15タンパク質またはp15ペプチドの、全体若しくは一部分、または部分の集合を、in vivoで培養された樹枝状細胞に暴露させてもよい。樹状細胞は、樹状細胞によって修飾された抗原、あるいは、抗原が加工され、そして抗原によって活性化された樹状細胞上に発現しているところの抗原にさらされた樹状細胞、を含むT細胞依存性抗原を調製する方法を提供する。p15抗原によって活性化された樹状細胞または加工された樹状細胞抗原は、黒色腫のワクチンまたは治療のために用いられ得る。抗原が中に入り、樹状細胞の表面に提示されるのを許すに充分な時間、樹状細胞は抗原に対しさらされるべきである。その結果得られる樹状細胞または樹状細胞によって加工された抗原は治療を必要とする個体に投与され得る。そのような方法は本明細書の参考文献としてあげるSteinman et al(WO93/208185)およびBanchereau et al(EPO Application 0563485A1)に記載されている。
本発明のさらにもう一つの態様においては個体から単離されたT細胞がin vitroにおいてp15タンパク質またはその一部分にさらされ得、そのような治療を必要とする患者に治療上効果的な量投与され得る。Tリンパ球が単離され得る場所の例には末梢血液細胞のリンパ球(PBL)、リンパ節または腫瘍浸透リンパ球が含まれるがこれらに限られる訳ではない。このようなリンパ球は治療されるべき個体または供与個体から当該技術分野において知られた方法で単離され、in vitroで培養され得る(Kawakami,Y.et al.(1989)J.Immunol.142:2453−3461)。リンパ球はRPMIまたはRPMI1640またはAIM Vといった培地内で1−10週間培養される。生存率はトリパンブルー色素排除試験によって評価される。リンパ球はp15タンパク質の全体または一部分に培養期間の一部または全部の間さらされる。望ましい態様においてはリンパ球はAYGLDFYIL(p1510-18;SEQ ID NO:5)ペプチドまたはEAYGLDFYIL(p159-18;SEQ ID NO:6)(一文字表記)にさらされる。例えば107細胞当たり1−10マイクログラム(μg)/mlペプチドの濃度をリンパ球の培養期間の全部または一部のあいだ用いることができる。Tリンパ球はペプチドに感作された後このような治療を必要とする哺乳類に投与され得る。どのようにそのような感作されたT細胞が哺乳類に投与されるかの例には静脈注射、腹腔内注射または病変内注射が含まれるがこれらに限られる訳ではない。これらの感作されたTリンパ球の効果を決定するために評価され得るパラメーターは治療中の哺乳類内の免疫細胞の産生または腫瘍の減退を含むがこれらに限られる訳ではない。慣例的な方法がこれらのパラメーターを評価するのに用いられる。これらの治療はサイトカインまたは遺伝子を修飾された細胞と合同で用いられ得る。(Rosenberg,S.A et al.(1992)Human Gene Therapy,3:75−90;Rosaenberg,S.A.et al.(1992)Human Gene Therapy,3:57−73)。
ワクチンとしての使用に加え、その組成物はp15抗原、ペプチド、またはそれらの類似体(analog)に対する抗体の調製に用いることが可能である。抗体は直接抗黒色腫剤として用いることが可能である。抗体の調製のために、宿主動物をp15タンパク質、ペプチド、またはそれらの類似体を抗原として用いて免疫処理し、前述のワクチンの時のように担体に結合させる。抗原に対して活性を有する抗体を含む組成物を得るため、適切な時間の間隔をおいて宿主の血清または血漿を回収する。例えば、飽和硫酸アンモニウム、またはDEAEセファデックス、または該当技術分野において知識を有する者に知られる他の技術を用いることにより、ガンマグロブリン画分またはIgG抗体を得ることが出来る。この抗体には実質的に、化学療法などの他の抗癌剤と作用するような不都合な効果はない。
潜在的に有害な免疫システムの反応を最小化することにより、抗体組成物はより宿主のシステムと両立できるようにすることが可能である。これは、外来種の抗原のFc部位の全体または部分的除去、または宿主動物と同じ種の抗原の使用、例えば人/人雑種細胞由来抗原の使用など、により達成される。人体に適応した抗体(即ち、人において非抗原性である)は、例えば抗体の抗原性部位とそれに相当する非抗原性部位部位の置換により作製される(即ち、キメラ抗体)。そのようなキメラ抗体は、ある種由来の抗体の反応的または、抗原結合部位および、別の種由来の(非抗原性)抗体のFc部位を含む。キメラ抗体の例は、非ヒト哺乳類-ヒトキメラ、ゲッシ類-ヒトキメラ、マウス-ヒトキメラ、そしてラット-ヒトキメラに限定しないが、これらを含む。(Robinson et al., 国際特許出願第184,187号; Taniguchi M.,ヨーロッパ特許出願第171,496号;Morrison et al.,ヨーロッパ特許出願第173,494号;Neuberger et al.,PCT特許出願第WO86/01533号; Cabilly et al., 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.米国84:3439;Nisimura et al.,1987 Canc.Res.47:999;Wood et al.,1985 Nature 314:446;Shaw et al.,1988 J.Natl.Cancer Inst.80:15553,全て参考文献として援用される。)
「人体に適応した」キメラ抗体の全体的な概観はMorrison S.,1985 Science 229:1202およびOi et al.,1986 BioTechniques 4:214により提供されている。
適当な「人体に適応した」抗体は、あるいはCDRもしくはCEAの置換によりに産生されることも可能である。(Jones et al., 1986 Nature 321:552; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534;Biedleret al.1988 J.Immunol.141:4053,全て参考文献として援用される。)
抗体または抗原結合断片は、遺伝学的技術により生産できる。重鎖と軽鎖の両遺伝子は大腸菌内での発現の技術はPCT特許出願;公開番号第WO901443,およびWO 9014424、およびHuse et al.,1989 Science 246:1275-1281の主題である。
この抗体は免疫応答の増強の方法としても使用可能である。この抗体は、他の治療的抗体の投与に於ける使用と同等の量の投与が可能である。例えば、ガンマグロブリンは患者あたりおよそ1-100mgの範囲で使用される。p15抗原に対し活性のある抗体は受動的に単独または、他の抗ガン治療とあわせて黒色種を患っている哺乳動物に投与することが可能である。抗ガン治療のなかには、化学治療、放射線治療、TILによる養子免疫治療に限定しないが含まれる。
抗p15抗原抗体は抗イディオタイプ抗体を免疫源として施すことにより代替的に誘導することが可能である。便利には、前記のように調製した精製抗p15抗体の調製物を宿主動物中での抗イディオタイプ抗体の誘導のために用いる。組成物は宿主動物に対し適切な希釈剤中で投与される。投与後、通常は連続投与後、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Fc領域に対する免疫応答を除くために、宿主動物と同じ種により産生された抗体を使用すること、または投与した抗体のFc領域を取り除くことが可能である。続く宿主動物における抗イディオタイプ抗体の誘導後、血清または血漿を抗体組成物を提供するために単離した。組成物は抗p15抗体に対して前に記載したように、または親和性マトリクスに結合した抗p15抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能である。産生された抗イディオタイプ抗体は真正のp15抗原と同様の構造であり、p15黒色種抗原ワクチンの調製のためにp15タンパク、類似ペプチドまたは一部の使用よりむしろよく使用されるだろう。
動物中で抗p15抗体の誘導の方法として用いたとき、抗体の注射の方法は予防接種の目的で行うときと同様である。即ち、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、病変注射など、効果的な濃度で生理学的に適切な希釈において、アジュバントとともに、またはアジュバントなしに行う。1回またはより多くの注射が望ましい。
本発明のp15由来タンパク質またはペプチドは病気の前または後の防御の為に設計した抗血清の産生を行うときに使用する事が目的である。ここで、p15抗原、ペプチド、またはその類似体を、適切なアジュバントと共に処方し、人の抗血清を産生するための既に知られた方法に従い、志願者に対して注射により投与した。注射したタンパク質に対する抗体の応答は、免疫化後数週間の間、断続的な血清の回収を行い、ここに記載した免疫検定法を用いて抗p15抗体の存在を検出することによりモニターされる。
免疫化した個体の抗血清は黒色種の発達する危険性のある個体に予防のために投与されるだろう。抗血清は黒色種を患っている個体に対しても、病後防御として有効である。
in vivoでのp15抗原に対する抗体、および抗イディオタイプ抗体の使用と分析のための使用の両方において、モノクローナル抗体の使用が好ましい。モノクローナル抗p15抗体または抗イディオタイプ抗体は、以下のように作製される。免疫化した動物の脾臓またはリンパ球は単離され、不死化されるか、あるいは該当技術分野に於て知識を有するものに知られる方法により雑種細胞を調製する為に使用される。(Goding,J.W.1983.モノクローナル抗体:原理と実践,Pladermic Press, Inc.,NY,NY,pp.56-97)人-人雑種細胞の作製の為に人のリンパ球提供者は選ばれる。p15抗原を保有する黒色種を有することが知られている提供者は適切なリンパ球提供者として働く。リンパ球は末梢血試料から単離される、または提供者が脾臓摘出に従うなら脾臓細胞が用いられる。エプスタイン-バールウィルス(EBV)は人のリンパ球、または人-人雑種細胞を作製するために用いられる人の融合相手細胞を不死化するために用いられる。直接的なin vitroでのペプチドによる免疫化もまた人のモノクローナル抗体の産生のために有効である。p15ペプチドの例として、AYGLDFYIL(p1510-16;SEQ ID NO:5)およびEAYGLDFYIL(p159-16;SEQ ID6)(ペプチドは、アミノ酸一文字表記で表した)に限定しないが、含む。
不死化した細胞により分泌された抗体は望みの特異性を持った抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーングに掛けられる。モノクローナルp15抗原またはペプチド抗体に対し、抗体はp15抗原またはペプチドに結合しなければならない。モノクローナル抗イディオタイプ抗体に対し、抗体は抗p15抗体に結合しなければならない。所望の特異性の抗体を産生する細胞は選択される。
本明細書中に記載されている抗体またはキメラ抗体は、また、慣用された方法によって毒素分子放射性同位体および薬剤と結合させてもよい(Vittera et al.(1991)”Biologic Therapy of Cancer”De Vita VT, Hellman S., Rosenberg, S.A.(eds)J.B.Lippincott Co. Phiradelphiaにおいて; Larson, S.M. et al.(1991)”Biological Therapy of Cancer”De Vita VT, Hellman S., Rosenberg, S.A.(eds)J.B.Lippincott Co. Phiradelphiaにおいて)。抗体が結合する毒素の例にはリシン(ricin)またはジフテリア毒素(diphtheria toxin)を含むが、これに限らない。薬剤または化学的治療試薬の例には、シクロホスファミド(cyclophosphamide)またはドクソラビシン(doxorubcin)を含むが、これに限らない。放射性同位元素の例には131Iを含むが、これに限らない。前述の物質に共有結合している抗体はメラノーマ治療のための癌の免疫治療に使用される。
患部への局部的な投薬は、局所的投薬、挿入、注入物を組換え的に発現する細胞を含む浸透性の装置の移植、p15抗体またはキメラ抗体、毒素に結合した抗体、薬剤または放射性標識物、またはそれらが部分的に含まれる浸透性の装置の移植を含むがこれに限らないような当該技術分野において知られている手段によって遂行される。
上記の抗体および抗体結合断片は単独のキットの態様で、または生体内で使用するための薬剤組成物として供給される。抗体は治療目的、免疫アッセイにおける診断目的、または、本明細書に記載されているようにp15蛋白質またはペプチドを精製するための免疫親和性物質として使用される。
本発明はまた、チロシナーゼ核酸配列およびアミノ酸配列(図7A-7D; SEQ ID NOS. 9および10)およびそのチロシナーゼタンパク質配列に由来する抗原または免疫原ペプチドを提供する。本明細書に報告されているチロシナーゼ核酸配列(図7A-7D; SEQ ID NO. 9)は、すでに報告されているチロシナーゼ配列(Bouchard, et al.(1989)J.Exp. Med. 169:2029-2042)とは94番目のヌクレオチドがAからTに変化し、S(一文字表記)残基からR(一文字表記)への置換を引き起こしている点で異なる。この変化は他のチロシナーゼアリルまたは変異体においては観察されていない(Spritz, R.A.(1993)Sem. Dermatol, 12:167-172; Oetting, W.S. et al.(1993), Hum Mutat 2:1-6, Tripathi, R.K., et al.(1992)Am. J. Med. Genet.43:865-871)。チロシナーゼ配列(図7A-7D)に由来する免疫原ペプチドは、HLA-A24制限されたTILによって認識されるチロシナーゼ蛋白質の抗原部位(図5)を表す。免疫原ペプチドの例は、AFLPWHRLF(SEQ ID NO:7)および重なったペプチドAFLPWHRLFL(SEQ ID NO:8)が含まれるが、これに限らない。本発明はさらに、チロシナーゼアミノ酸配列に由来するこれらの免疫原ペプチドのアナログ(analog)も含む。用語「アナログ」はこれらの免疫原ペプチドの機能の様相を呈するあらゆるペプチドを含む。用語「アナログ」はまた、上記のようなペプチドの保存された置換体または化学誘導体を含む。これらの免疫原ペプチドは合成的または組換え的に、p15に対する上記の手法と同様の手法または方法で産生してもよい。
もう一つの態様において、チロシナーゼアミノ酸配列に由来する免疫原ペプチド(SEQ ID NO: 7および8)は、治療的または予防的にワクチンとして使用される。供給されたならば、メラノーマ(melanoma)の何らかの兆候が現れる前に予防的にワクチンが供給される。これらのむペプチドの予防的投薬は哺乳類におけるメラノーマを予防したり、または弱めるのに役立つ。
一つの態様において、メラノーマに対して高い危険を負っている哺乳類、特に人間はこれらのワクチンによって予防的に治療される。あるいは、そのワクチンは患者がメラノーマまたは転移性メラノーマにおいて処方された腫瘍抗原に対する自己の免疫反応を高めるために治療的に供給されうる。免疫原として働くそのワクチンは、チロシナーゼ免疫原ペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターに感染した細胞、その細胞の破砕物、または発現した蛋白質を含む培養液の上清でもよい。これらの免疫原ペプチドをコードする核酸配列が導入されうる発現ベクターはp15に対する上記のものと同一である。あるいは、免疫原は部分的または実質的に精製された組換えチロシナーゼペプチドまたはそのアナログである。
免疫原が純粋または実質的に純粋な状態で投薬されることが可能であるが、p15に対する上記のように、それを前述したような薬剤組成物、処方、または調製物として提示することが好ましい。ワクチン化は、p15に対して既に記載した慣用の方法によっておこなわれ得る。
チロシナーゼ免疫原ペプチドおよびそれらをコードする核酸配列は、バイオアッセイに、またはp15に対して既に記載したものと同様の方法または手法によって抗体を産生することに用いられる。
本発明の別の態様においては、1またはそれ以上のメラノーマ抗原に対する、多面的価値をもったワクチンが提供される。それらの多面的価値を有するワクチンは、本明細書中に開示されたp15蛋白質またはペプチドまたはチロシナーゼペプチド、またはそれらを組み合わせたものの全部または一部を含む。あるいは、本明細書中に開示されたp15蛋白質またはペプチドまたは免疫原チロシナーゼペプチドを含む多価ワクチンは、他の既知のメラノーマ抗原と結合して多価のメラノーマワクチンを産生する。既知のメラノーマ抗原の例にはMART-1、gp-100 MAGE-1およびMAGE-2が含まれるが、この限りではない。
メラノーマ抗原をコードする遺伝子または核酸配列が一度同定されれば、次の工程は、これらの遺伝子によってコードされる蛋白質の抗原部位または抗原決定基を決定することである。それゆえ、本発明の別の態様において、p15蛋白質の予想されるアミノ酸配列(図1; SEQ ID NO:2)に由来するペプチドの免疫原性を査定する方法が提供される。その方法は、(a)p15(図1; SEQ ID NO:2)アミノ酸配列に基づく多数のペプチドを調製し;(b)少なくとも一つの上記のペプチドを哺乳類細胞系列とインキュベートし;(c)上記のペプチドと保温した上記の哺乳類細胞の腫瘍侵入リンパ球(TIL)への露出し;そして(d)上記のペプチドと保温した上記の細胞によるTILの認識を検索する、という工程を含む。約25から5アミノ酸のペプチドが使用されるのが好ましいが、より好ましいのは20から10アミノ酸、および最も好ましいのは9-10アミノ酸である。工程(b)に使用される細胞の例にはT2細胞(Cerundolo, V. et al.(1990)Nature, 345:449-452)、またはEMB感染B細胞系列(Topalian et al.(1989)J.Immunol. 142:3714-3725)を含まれるが、これに限らない。ペプチドと保温した細胞の認識の査定方法の例には51CR放出細胞傷害性アッセイ(Cerundolo, V. et al.(1990)Nature, 345:449-452)、またはγ-IFN、GM-CSFまたはTNF選択などのリンホカインアッセイ(Schwartzentruber, D. et al.,(1991)J.of Immunology 146:3674-3681)が含まれるが、これに限らない。
T細胞はMHCクラス1分子と結合している抗原を認識する。全ての哺乳類におけるMHC遺伝子座は多数の遺伝子を含み、非常に多型である。異なるMHC分子またはハプロタイプは異なる抗原と結合する。ヒトにおいて、HLA複合体はクラス1分子をコードするHLA-A, HLA-B, HLA-C遺伝子座を含む。リンパ球はHLAクラス1分子の情況によって腫瘍抗原を認識する。もし組換えp15発現ベクターを含む細胞がTILによって検索されるがCOS細胞などのヒトの細胞でないか、または望まれるハプロタイプが発現しないならば、MHCクラス1遺伝子を含む発現ベクターも細胞に導入すべきである。これは、本発明のもう一つの択一的な態様を表す。p15またはチロシナーゼ抗原およびHLA抗原を発現している細胞は、特異的MHCクラス1制限型の情況において腫瘍抗原の存在を検出するためにTILによる検索が可能である。特定のハプロタイプはライブラリーが由来する腫瘍のハプロタイプによって決定される。使用されるMHCクラス1遺伝子の例にはHLA-A, HLA-B、およびHLA-C遺伝子を含むが、これに限らない。好ましいMHC特異性または制限型の例にはHLA-A2.1サブタイプなどのHLA-A1, HLA-A2、またはHLA-A24(Zemmour, J. et al.(1992)Tissue Antigens 40:221-228)。
本明細書中に参考にしたすべての本、記事、および特許は参考文献として援用する。次に続く実施例は本発明のさまざまな局面を説明するものであり、決してその範囲を制限する意図のものではない。
実施例1 黒色腫特異的HLA-A24限定的腫瘍浸潤リンパ球によって認識されるp15遺伝子のクローン化
材料および方法
細胞系列
黒色腫特異的CTLを培養し、Rosenberg,S.A.,et al.(1988),N Engl J Med 319:1676に記載されたように、TILから6000IUのIL2(Cetus-Oncogen Division,Chirion Corp,Emeryville,CA)を含む培地に広げた。簡略に述べると、腫瘍を細かく砕き、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびDNaseで一晩消化した。生存不可能な細胞と赤血球を除去するために、生じた単細胞懸濁液を一段階勾配処理し、生存可能な細胞を含む界面を回収した。腫瘍および単核細胞の混合物を、6000IU/mlのIL2、10%のヒトAB血清(BioWhittaker,Walkersville,MD)を含むRPMI培地中で2.5から5×105まで培養した。さらに、リンホカイン刺激した同種異系のキラー細胞の4日培養液由来の馴化培地を最終濃度20%になるように加えた。これらの条件下で、純粋なリンパ球の選択的な増殖が確立され、45から70日の培養物から細胞をアッセイした。黒色腫細胞系列888、1290、928、1300、397および624を出願人の研究室で確立し(Topalian,S.L.,et al.(1990)J. Immunol 144:4487-4495)、293ヒト腎臓細胞系列はJoel Jesse博士から入手し(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)、COS-7細胞はW.Leonardから入手した(国立衛生研究所)。黒色腫細胞系列NEHM680(HLA-A29、A31、B44およびB60を発現する)およびNEHM2488(HLA-A2、A24、B35およびB39を発現する)はClonetics(San Diego)から入手した。
cDNAライブラリーの構築およびスクリーニング
黒色腫細胞系列888から調製したcDNAライブラリーの構築およびスクリーニングは、以前に記載されたように行った(Robbins,P.F.,et al.(1994)Cancer Research 54:3124)。簡略に述べると、Promega Riboclone cDNA合成システム(Promega,Madison,WI)を用い、cDNAを逆転写酵素およびoligo-dT NotIプライマーアダプターを用いて合成した。BstXIリンカー(Invitrogen,San Diego,Calif.)を加えた後、cDNAをNotIで消化し、cDNAをpCDNA3にライゲーションした。このDNAをMax Efficiency DH5α細胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)に形質転換し、50から100の細菌細胞をプールし、培地中で4から6時間培養した。QIA prep 8プラスミドキット(Qiagen,Chatsworth,CA)を用いて細菌からDNAを精製した。cDNAプールの一時的な感染は、HLA-A24を発現する293細胞(293-A24)の安定な感染細胞を用いて行った。293細胞を、RT-PCRによって888黒色腫細胞から単離したHLA-A24(Zemmour,J,et al.(1992)Tissue Antigens,40:221-228)遺伝子に感染させた。HLA-A24遺伝子をpCDNA3にクローン化し、安定な細胞系列を選択した。293-A24細胞(105)を50から100のcDNAを含むプールに18から24時間感染させ、1×105TILを感染細胞と18から24時間保温し、GM-CSFの放出を測定した。
ノーザンブロット解析
総RNAをイソチオシアン酸グアニジン/塩化セシウム法によって単離した。ヒト正常組織由来の総RNAをClonetech(Palo Alto,CA)から購入した。20μgの総RNAを1%アガロースホルムアミドゲルで電気泳動し、ナイロン膜に吸着させた。この膜をQuickHyb(Stratagene)でプレハイブリダイゼーションし、標準的なランダムプライマー法を用いて32Pで標識したp15 cDNAの462bp BamHI/PstI断片とハイブリダイゼーションさせた(図1;ヌクレオチド15から476)。ハイブリダイゼーションは、製造者の手引に従ってQuickHybを用いて行い、膜は放射線写真撮影の前に0.1×SSCで55℃で30分(min)洗浄した。
配列決定およびPCR解析
DNA配列決定はSequenase2.0キット(USB,Cleveland,OH)を用いて行った。塩基配列および推定されるアミノ酸配列のデータベース検索は、BlastおよびFasta配列比較計算法(Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8,September 1994,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)によって行った。細胞の総RNAをイソチオシアン酸グアニジン/塩化セシウム遠心法によって単離した。2μgのRNA試料を、0.5μgのoligo(dT)、0.5mM dNTP、10mMDTTおよび200UのSuperscript逆転写酵素(BRL,Gaithersburg,MD)を含む最終体積20μlの一次鎖合成緩衝液に加えた。42℃で50分反応した後、それぞれ5’および3’の非翻訳領域に位置するプライマーM2a(5’-CAACAACGACAAGCTCTCCAAGAG-3’)(SEQ ID NO:3)およびM2b(5’-GGAACACTGCCGCAAACGTC-3’)(SEQ ID NO:4)を用い、RT反応の1μlを用いてPCRを行った。PCRは、反応液を94℃で5分熱し、続いて94℃で30秒、対合を55℃で30秒、伸長を72℃で1分の増幅反応を30サイクル行うことによった。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、Prime PCR cloner(5prime-3prime,Boulder,CO)を用いて修飾し、EcoRV消化したpCDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)にクローン化した。
ペプチド合成および解析
ペプチドは、標準的なFmoc化学反応を用いてGilson AMS 422 Multipleペプチド合成機によって合成した。ペプチドを、0.05%TFAを含む水中の1%から60%のアセトニトリル勾配を用いてR2逆相HPLCカラム(PerSpective Biosystems)によって精製し、精製度は95%以上であった。
患者888(1990)由来の培養されたTIL系列、TIL888は、HLA-A24限定的に黒色腫を認識することが以前に示されており(Schwartzentruber,D.J.,et al.,(1991).J.Immunol,146:3674)、TIL888によって認識される抗原をコードする遺伝子(チロシナーゼ)が黒色腫細胞cDNAライブラリーからクローニングされていた(Robbins,P.F.,et al.(1994).Cancer Research 54:3124;図7A-7D)。TIL888を患者MGに注入した結果、種々の転移が完全に緩解した。しかし、3年後にこの患者から再発した骨盤腫瘍が除去され、第二のTIL系列、TIL1290がこの腫瘍から確立された。TIL1290を用いた細胞毒性試験によって、HLA-A24を発現する黒色腫の大多数が溶解していることが示された(表1)。新鮮な、培養されていない自家由来の黒色腫細胞(1290 fresh melanoma)並びに培養されていない他のHLA-A24黒色腫と同じく、TIL1290によって溶解したが、A24を発現しない2つの黒色腫397TCおよび624TC、患者MGから確立された888EBV-B細胞、Daudi(Bリンパ芽球腫細胞系列、American Type Culture Collection,Rockville,MD,ATCC #CCL213)およびK562(慢性骨髄性白血病細胞系列、American Type Culture Collection,ATCC #CCL243)細胞は溶解しなかった。これらの結果から、TIL888と同様にTIL1290は、HLA-A24に関して共通の1つまたはそれ以上の黒色腫抗原を主として認識することが示唆される。
TIL1290およびTIL888の特異性は、次にサイトカイン放出アッセイにおいて試験された(表2)。結果からは、888および1290の両メルがTIL888およびTIL1290を強く刺激することが示される。他の2つのHLA-A24発現メラニン形成細胞、928および1300メルは、TIL1290および888から放出されたサイトカインを強く刺激したのに対して、HLA-A24を発現しない2つのメラノーマ397および624は、これらのTILから放出されたサイトカインを顕著に刺激しなかった。HLA-A24を発現する397メラノーマの安定なトランスフェクタントは888および1290TILの両者から放出されたサイトカインを顕著に刺激したことから、該細胞系の制限が証明された。TIL888および1290の制限パターンは同一ではなかったが、HLA-A24発現メラニン形成細胞系NEHM2488は、低いながらも顕著なレベルのGM-CSFのTIL888(160pg/ml)からの放出を刺激し、TIL1290からの放出は刺激しなかったからである。
TIL1290系は、チロシナーゼの認識、並びにHLA-A2で制限されるメラノーマに特異的なT細胞により認識されることが最近示された(Kawakami, Y., S. et al.,(1994). Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6458-6462;Kawakami, Y., S. et al.,(1994). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3515)2つの抗原MART-1およびgp100の認識に関して試験された。さらに、メラニン形成細胞系列蛋白質gp75をTIL1290による認識に関して試験したが、この糖蛋白質がHLA-A31で制限されたTILにより認識されるという結果が示されたからである。TIL888は、チロシナーゼプラスHLA-A24で一時的にトランスフェクトされたCOS細胞により強く刺激されたが、MART-1、gp100またはgp75でトランスフェクトされた場合は刺激されず、チロシナーゼ並びにMART-1、gp100またはgp75のトランスフェクタントは何れもTIL1290を刺激しなかった(表2)。MART-1プラスHLA-A2を発現するCOSのトランスフェクタントはTIL1235を刺激し、そしてgp100プラスHLA-A2を発現するトランスフェクタントはTIL1200を刺激したが(表2)、これらは以前に報告されたとおりである(Kawakami, Y., S. et al.,(1994). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 印刷中;Kawakami, Y., S. et al.,(1994). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3515)。さらに、gp75プラスHLA-A31を発現するトランスフェクタントはTIL586を刺激した。これらの結果から、TIL1290は以前に記載されなかったメラノーマ抗原を認識したことが示された。
この抗原をコードする遺伝子を単離するために、888メラノーマcDNAライブラリーから調製されたクローンのプール(Robbins, P. F.,(1994). Cancer Research 54:3124)を、HLA-A24発現細胞293に一時的にトランスフェクトし(293-A24)、TIL1290から放出されたGM-CSFを刺激する能力に関して試験した。トランスフェクションは、50から100のcDNAを含む176のcDNAプールを用いて実施された。プールのほぼ3つのトランスフェクタントがTIL1290からの8pg/ml未満のGM-CSFの放出を刺激したが、サイトカインアッセイの感度の限界であった。該3つの陽性プールのトランスフェクタントは、TIL1290からの17、28および11pg/mlのGM-CSFの放出を刺激したが、繰り返しのアッセイにおいては第3番目の陽性プールのみがTIL1290からのサイトカインの顕著な放出を再び刺激した。陽性サブクローンはこのプールから単離され、そして293-A24細胞のトランスフェクションに際してTIL1290を強く刺激するがTIL888は刺激しない単一cDNAを単離した(表3)。
このcDNAクローンを配列決定したところ、以前に報告されていない遺伝子に相当することがわかった(図1)。このクローン中の唯一の長いオープンリーディングフレームは、フレーム中の第1番がメチオニンから始まる約15kDの分子量の128のアミノ酸ポリペプチドをコードしていた。この遺伝子は、あらゆる公知遺伝子ファミリーのメンバーとして同定されるためのあらゆる特徴を含まないらしく、慣用的なリーダー配列並びにN−結合グリコシレーションおよび任意の拡張された親水性ドメインのためのコンセンサス部位を欠いていた。遺伝子産物は、したがって、未知の機能を有する小さなサイトプラズムまたは核の蛋白質に相当するらしく、p15と名付けた。
次にノーザンブロット分析を実施して、この遺伝子の発現パターンを測定した(図2)。これらの結果から、さまざまな正常な組織がメラノーマ細胞に見いだされるのに匹敵するメッセージレベルを発することが示された。試験された正常組織は、脾臓、精巣、胸腺、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、肺、および網膜組織、並びに患者888から単離されたEBV B細胞を含んだ。EBV B細胞に見いだされた低レベルの発現はこのサンプルの不完全な負荷によるらしいが、なぜなら、相対的に同等の量のp15のメッセージが1290メラノーマおよびEBV B細胞並びに患者888から単離された繊維芽細胞において発現されたことが、引き続くブロットにより示されたからである。
TIL1290により認識されたエピトープがp15遺伝子産物の変異によりもたらされたか否かを決定するために、RT-PCRを用いて888 EBV B細胞において発現される遺伝子を単離した。EBV B RNAからRT-PCRにより単離された産物、クローン1の一つの配列は、配列決定された領域においてp15配列と同一であり(図3)、そして完全長のクローンに相当するらしい。EBV B細胞からRT-PCRにより単離された9クローンのうちの3つは、末端を削除された(truncated)挿入物を含むらしかった。末端削除されたクローンの一つ、クローン2の配列は、p15遺伝子の残基199と738の間の組換えによりもたらされたらしい(図3)。クローン2は、p15配列のコドン8の一つのヌクレオチドの置換も含んだが、該置換はアスパラギン酸からアスパラギンへの置換をもたらす。
TIL1290により認識されるエピトープの発現は、次に、888 EBV B細胞から単離された完全長の遺伝子並びに末端削除された遺伝子(それぞれクローン1および2)のトランスフェクションにより試験された。何れかの構築物(クローン1または2)を用いた293-A24のトランスフェクションは、元のp15 cDNAクローンにより刺激されたサイトカイン放出に匹敵するレベルに刺激する能力を付与することが見いだされた(表4)。このデータから、この抗原をコードする遺伝子も患者のB細胞において発現されたことが示された。
TIL1290により認識されたクローンの配列は、p15配列において同定された推定コーディング領域の18アミノ酸のみを含んだ。このHLA制限要素を単離することにより、そして合成ペプチド中の最後の残基位置におけるアミノ酸を置換することにより、あるモチーフがHLA-A24-結合ペプチドに関して最近定義された(Kubo, R. T. et al.,(1994)J. Immunol 152:3913)。このモチーフは、第2番目の芳香族残基またはメチオニンおよび最後の位置におけるフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンの何れかからなった。p15蛋白質の最初の18アミノ酸を内の単一ペプチド9マー、AYGLDFYIL(p1510-18;配列番号:5)はこのモチーフからなった。このペプチド並びに重複する10マーのEAYGLDFYIL(p159-18;配列番号:6)を次に合成し、51Cr放出アッセイ(Kawakami, et al.,(1988)J. Exp. Med., 168:2183-2191)においてTIL1290による細胞溶解のために888 EBV B細胞を感作する能力を試験し(図4)、そしてTIL1290からのサイトカイン放出を刺激した(図5)。p1510-18ペプチドは、1ng/mlの最小濃度において溶解のために細胞を感作することができ、そして10ng/mlのp159-18ペプチドが感作に必要であった。両方のペプチドを用いた888 EBV B細胞のインキュベーションにより、最小濃度10ng/mlにおいてTIL1290からの顕著なGM-CSF放出を刺激できることが見いだされた。
TIL1290により認識される別の抗原を単離するため、約35,000のcDNAクローンを含む別の700プールのスクリーニングを実施した。TIL1290を強く刺激する第2のcDNAクローンが単離された。このクローンの部分配列決定から、該クローンがp15遺伝子の転写物からなり、p15の5’非翻訳領域の末端から8塩基対のみを欠くことが明らかになった。
TIL1290により認識される抗原をコードする遺伝子p15は、公知遺伝子との顕著な同一性を有さない。TIL1290はペプチドでパルスされなかった自己EBV B細胞を認識しなかったが、正常繊維芽細胞はHLA-A24の構造(context)中の特定のメラノーマ抗原を認識した。ノーザンブロットから、EBV B細胞(図2)および繊維芽細胞を含む正常組織がこの蛋白質をコードするRNAを顕著なレベルで含むことが示された(図2)。p15蛋白質をコードする遺伝子はEBV B細胞からも単離することができ、且つ293-A24細胞に対するTIL1290の反応性を授けたことから、これが非変異正常遺伝子に相当することが示唆された。
患者888は悪性メラノーマを有することがわかり、そして888と称されたTILおよびメラノーマ系が1989年に確立された。TIL888はIL2と共に患者自身に注入され、そして皮下、粘膜、および肺転移の完全な寛解が観察された(Rosenberg, S.A., et al.,(1990). N. Engl. J. Med. 323:570)。888メルから調製されたcDNAライブラリーをスクリーニングするためのTIL888の使用は、チロシナーゼ遺伝子のクローニング(Robbins, P. F., et al.,(1994). Cancer Research 54:3124)、およびHLA-A2制限CTLにより認識されることも分かっている遺伝子のクローニング(Brichard, V., et al.,(1993). J. Exp. Med. 178:489)をもたらした。患者MGへのTIL888の注入後の治療に対する劇的な応答から、これがHLA-A24に関する重要な腫瘍拒絶抗原であるらしいことが示唆される。患者888において骨盤の腫瘍が処置から3年後に再発し、切除された。この腫瘍1290メルはチロシナーゼの抗原損失変異を示さなかったが、それは888TILがこの腫瘍に強く応答したためである。腫瘍の再発に必須の因子が未知であったため、再発腫瘍に由来するTIL1290の混合物並びにTIL888を患者888に注入した。この処置は再発性骨盤癌の完全な腫瘍の退行をもたらし、そしてこの患者はこの治療後2年間疾患を有さずにいた。即ち、TIL1290により認識される抗原は、治療のための癌退行抗原の重要性も説明する。
メラノーマにおいてこれまで記載された腫瘍抗原のすべては、正常組織において発現される非変異遺伝子の産物を代表するらしい。蛋白質MART-1およびgp100、gp75およびチロシナーゼを正常な培養されたメラニン形成細胞において発現させ、且つ網膜並びに正常皮膚メラニン形成細胞においてインビボ発現させる。gp75およびチロシナーゼはメラニンの合成に関与していることが示された。
実施例2
HLA−A24制限腫瘍浸潤リンパ球(TIL)によって認識されるチロシナーゼエピトープの同定
材料と方法
細胞ライン
5%ヒトAB血清と6000国際単位/mlのインターロイキン2(IL−2)(Cetus−Oncogen Division,Chiron Corp.カリフォルニア州,エメリービル)とを含有するAIM−V培地(Life Technologies,Inc.,メリーランド州,ガイザースブルグ)中で、腫瘍バイオプシーから得たリンパ球を既述されたように(Rosenberg,S.A.等,予備レポート,New Engl.J.Med.,(1988)319:1676〜1680)30〜70日間培養することによって、TIL1413細胞ラインを得た。
黒色腫細胞ライン(888mel、938mel、397mel及び586mel)と、Epstein−Barrウイルス形質転換B細胞ライン(888EBVB)とは、我々の研究室において確立し、10%ウシ胎児血清(FCS)を含有するRPMI1640倍地中で培養した(Topalian,S.L.等,J.Immunol.144:4487〜4495)。サル腎臓細胞ラインCOS−7はW.Leonard,NIHから入手した。
チロンシナーゼ遺伝子のエクソヌクレアーゼIII欠失
チロシナーゼcDNAをpcDNA3のBstXI部位中にクローン化した(Robbins,P.F.等,(1994)Cancer Res.,54:3124〜3126;図7A−7D)。プラスミドをNotIとXbaIとによって消化させた。Xba部位にα−ホスホロチオエートデオキシヌクレオシドトリホスフェートを組み入れた後に、標準エキソヌクレアーゼIII(ExoIII)ネステッド欠失をExo−Size Deletionキット(New England Biolab,Inc.,マサチューセッツ州,ベバリー)を用いておこなった。切頭DNAフラグメントを連結し、E.coli中にトランスフォームし(transformed)(DH5a,Life Technologies,Inc.,メリーランド州,ガイザースブルグ),cDNAフラグメントを含有するプラスミドを精製した。種々なcDNAクローンのヌクレオチド配列をUBS配列決定キット(Amersham,オハイオ州,クリーブランド)を用いて調べた。
TIL1413によって認識されるcDNAフラグメント含有エピトープの同定
既述されたように(Robbins,P.F.等,(1994)Cancer Res.,54:3124〜3126)リポフェクタミン方法を用いて、切頭チロシナーゼcDNAとHLA−A24cDNAとを含有するプラスミドによって、COS−7細胞をトランスフェクトした。簡単に説明すると、1X105COS−7細胞を平底96孔マイクロプレート中の血清を含まないDulbeccoの改良イーグル培地(Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Biofluids,メリーランド州,ガイザースブルグ)中で培養した。次に、切頭遺伝子を含有するプラスミド(200ng)に100mlのDMEM中の2mgのリポフェクタミンを15〜45分間にわたって混合し、COS細胞に加え、15時間インキュベートした。翌日、トランスフェクション培地を取り出し、細胞をDMEMによって2回すすぎ洗いして、1X105TILを各孔の60国際単位/mlのIL−2を含有するAIM−V培地中に加えた。18時間(H)インキュベートした後に、100mlの上澄み液を回収して、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)ELISAキット(R+D Systems,ミネソタ州,ミネアポリス)を用いて、GM−CSF産生に関して分析した。
ペプチド合成と抗原ペプチドの同定
多重合成器(multiple synthesizer)(Model AMS 422,Gilson Co.Inc.,オハイオ州,ワーリントン)を用いて、ペプチドを固相方法によって合成した。ペプチドをR2逆相カラム(Perseptive Biosystems,マサチューセッツ州,ケンブリッチ)上での、0.05%TFA/水中のアセトニトリル勾配によるTPLCによって精製した。これらのペプチドの同定は質量分光法によって実証した。エピトープは、上述したGM−CSF放出分析と、Kawakami,Y.等の(1988)J.Exp.Med.168:2183〜2191に述べられている細胞毒性分析とを用いて各ペプチドと共にプレインキュベートした888EBVB細胞に対するT細胞の反応性によって同定した。
HLA−A24+患者1413から単離されたTIL1413ラインは、HLA−A24+黒色腫細胞ラインと共にインキュベートしたときにGM−CSFを放出したが、A−A24−黒色腫細胞ライン又はHLA−A24+888EBVBラインと共にインキュベートしたときには放出しなかった(表6)。さらに、TIL1413はHLA−A24+同種黒色腫細胞ラインを軽度に溶解もした(表7)。これらの試験は、共有される(shared)黒色腫抗原がHLA−A24に関してTIL1413によって認識されうることを示唆した。
チロシナーゼ(共有される黒色腫抗原)は、2種類の異なるクラスのI HLA対立遺伝子(HLA−A2とHLA−A24)に関してT細胞によって認識されることが既に判明している(Brichared,V.等,(1993)J.Exp.Med.,178:489〜495;Robbins,P.F.等,(1994)Cancer Res.,54:3124〜3126)。TIL1413がHLA−A24によって提示されるチロシナーゼ抗原を認識することができるかどうかを試験した。チロシナーゼとHLA−A24cDNAの両方によってトランスフェクトされたCOS細胞は、TIL1413からのGM−CSE放出を明確に刺激した。単独ではチロシナーゼもHLA−A24トランスフェクタント(transfectant)もこの反応を刺激することができなかった(表6)。したがって、TIL1413はHLA−A24制限式(in an HLA-A24 restricted fashion)にチロシナーゼを認識するように思われた。
TIL1413によって認識されるエピトープを同定するために、エキソヌクレアーゼIII欠失方法を用いて多重の切頭チロシナーゼcDNAクローンを試験した。生成したエキソヌクレアーゼIIIはNot部位において3’→5’方向にヌクレオチドを除去して、チロシナーゼcDNAの3’端部から単方向ネステッド欠失を生じた。連結し、単離した後に、これらの切頭チロシナーゼcDNAを次にCOS−7細胞中にHLA−A24cDNAと共にトランスフェクトして、GM−CSF放出分析を用いてトランスフェクトされたCOS細胞に対するTIL反応性を試験することによってエピトープをコードする領域(region encoding epitope)を確認した。切頭cDNAクローンの配列を決定することによって、エピトープをコードする領域は、チロシナーゼcDNA遺伝子の537bpと683bpとの間に明確に表された(図5)。
この領域内の11個のペプチドをHLA−A24に対する提案されたペプチド結合モチーフに基づいて合成した(Kubo,R.T.等,(1994)J.Immunol.152:3913〜3924)。これらのエピトープを、HLA−A24+888EBVB細胞をTIL溶解に対して感作させるそれらの能力と、888EBVB細胞にTILからのGM−CSF放出を刺激させるそれらの能力とを試験することによってスクリーニングした(表7)。TIL1413はペプチドT9206又はT10206によってパルスされた(pulsed)888EBVB細胞を溶解したが、他のペプチドによっては溶解しなかった、また、上記2種類のペプチドによってパルスされた888EBVB細胞と共にインキュベートされたときにGM−CSFを放出した。ペプチドT9206とT10206とは一部重複ペプチドであり;T10206はCOOH末端に付加的なロイシン残基を含有する。
ペプチドT9206(AFLPWHRLF;配列番号:7)とT10206(AFLPWHRLFL;配列番号:8)とを、TIL溶解に対して888EBVB細胞を感作させるそれらの相対的能力を評価するために、さらに精製して、滴定した。両方のペプチドが標的細胞の感作において同様な活性を有し、これらのペプチドによってパルスされた888EBVB細胞の最大溶解は約40%であった(図6)。
チロシナーゼ(メラニン合成に関与する酵素)は、2種類の異なるHLA制限因子、HLA−A2とHLA−A24に関連して、T細胞によって認識された(Brichard,V.等,(1993)J.Exp.Med.178:489〜495;Robbins,P.F.等,(1994)Cancer Res.,54:3124〜3126)。HLA−A2制限CTLによって認識された2種類のチロシナーゼエピトープは既に述べられているが(Wolfel,T.等,(1994)Eur.J.Immunol.24:759〜764)、HLA−A24に関連して提示されるチロシナーゼエピトープは同定されていない。
患者1413からのHLA−A24制限TILによって、チロシナーゼが認識されることができることは実証され、TIL1413によって認識されたチロシナーゼエピトープも同定されている。チロシナーゼが、2種類の異なるHLA制限因子、HLA−A2とHLA−A24に関連して、黒色腫患者からのT細胞によって認識されることは既に判明している(Brichard,V.等,J.Exp.Med.178:489〜495,(1993);Robbins,P.F.等,Cancer Res.,54:3124〜3126,(1994))。別のHLA−A24制限チロシナーゼ特異性TILである、TIL888の選択的転移(adoptive transfer)は完全な癌退行を生じた(Robbins,P.F.等,(1994),Cancer Res.,54:3124〜3126)、このことはチロシナーゼが重要な腫瘍阻止抗原であることを示唆している。
エキソヌクレアーゼIII遺伝子欠失方法によって形成された一連の切頭cDNAによってトランスフェクトされたCOS細胞の使用を適用して、チロシナーゼの抗原エピトープを含有する領域を探知した。単方向欠失を生じるために、このベクターをXbaIによって切断し、プラスミドをエキソヌクレアーゼIIIによる切断から保護するα−ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドを充填した。このベクターをNotIによっても消化させた、これは消化の出発点として役立った。この欠失は消化時間を変えることによって制御されうるので、この方法によって種々なサイズの切頭遺伝子を形成することができ、エピトープ含有領域を縮小することができる。
滴定分析に基づくと、T9206(配列番号:7)とT10206(配列番号:8)とのペプチドは標的細胞を溶解に対して同じような効率で感作させた(図6)。クラスI MHC分子から溶離したペプチドの主要なサイズは9アミノ酸であると報告されているので(Hunt,D.F.等,(1992)Science(ワシントン,DC),255:1261〜1263)、9マーペプチド(T9206)は腫瘍表面の天然プロセシング済み(naturally processed)ペプチドを表すと考えられる。患者1413のPBLからのT9206ペプチドを用いて形成されたCTLラインも、HLA−A24+黒色腫細胞を溶解することが発見されており、このことはこのペプチドがプロセシングされて、黒色腫細胞の表面に供給されることができることを示唆している。このことは、T9206を認識したポリクローナルTIL集団内の同じ細胞が黒色腫細胞を溶解することができることのさらなる証拠をも提供する。
MAGE−1、MAGE−3、gp100、MART−1及びチロシナーゼを包含する、今までに同定された全ての黒色腫抗原は、非突然変異自己抗原である(Van der Bruggen,P.等,(1991)Science(ワシントン,DC),254:1643〜1647;Gaugler,B.等,(1994)J.Exp.Med.197:921〜930;Kawakami,Y.等,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),91:6458〜6462;Bakker,A.B.H.等,(1994),J.Exp.Med.179:1005〜1009;Kawakami,Y.等,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),91:3515〜3519;Brichard,V.等,J.Exp.Med.(1993),178:489〜495;Robbins,P.F.等,Cancer Res.,(1994),54:3124〜3126(1994))。黒色腫の腫瘍抗原に関連した、遺伝子と抗原ペプチドとの同定は、癌患者の免疫療法への有効な特異的免疫化アプローチの新規な可能性を開く。
実施例4
哺乳動物における黒色腫の治療法としてのP−15ワクチン
P−15ワクチンは、黒色腫に罹患した哺乳動物を治療するために有効であると考えられる。例えば、p15ワクチンは個体に投与することができる。哺乳動物は本明細書に述べる組換えタンパク質によって1mg〜100mgの範囲内で免疫性を与えられることができる。或いは、例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス又は禽痘ウイルスのようなウイルスベクターに挿入されたp15核酸配列によって哺乳動物(好ましくは、ヒト)に免疫性を与えることができる。例として、p15抗原ペプチドをコードする核酸配列、AYGLDFYIL(p1510-18;配列番号:5)とEAYGLDFYIL(p159-18;配列番号:6)とを用いることができる。p15核酸配列を有する約106〜1011ウイルス粒子を哺乳動物(好ましくはヒト)当たりに投与することができる。この抗原(immunogen)に対する抗体に関して又はこの抗原を認識する細胞毒性リンパ球(CTL)の増加に関して、慣用的方法によって又は活性疾患の臨床徴候及び症状の軽減によって、哺乳動物をモニターする。評価されるべき特定のパラメータはワクチン抗原を認識する免疫細胞の産生又は腫瘍退行を包含する。このようなワクチンは予防的にも治療的にも投与することができる。レトロウイルスベクター中に挿入されたp15核酸配列によっても、哺乳動物に免疫性を与えることができる。レトロウイルス中抗原の提案された投与量範囲は哺乳動物(好ましくはヒト)当たり106〜1011ウイルス粒子である。レトロウイルスワクチンの反応と効力は、上述したように評価される。或いは、HLA−A24抗原チロシナーゼペプチドに相当する核酸、AFLPWHRLF(配列番号:7)とAFLPWHRLFL(配列番号:8)とをベクター中に挿入して、ワクチンとして用いることができる。
実施例5
黒色腫抗原に由来する抗原ペプチドに感作させたリンパ球の、黒色腫に罹患した哺乳動物を治療的に処置するための使用
黒色腫抗原に予備感作させた(presensitized)T−リンパ球は、黒色腫に罹患した哺乳動物の治療的処置に有効であると考えられる。T−リンパ球を末梢血リンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球から単離し、インビトロでp15タンパク質又はペプチドに暴露させる。T−リンパ球を末梢血又は黒色腫の腫瘍懸濁液から単離して、インビトロで培養する(Kawakami,Y.等,(1988)J.Exp.Med.168:2183〜2191)。ペプチドの例は、非限定的に、AYGLDFYIL(配列番号:5)、EAYGLDFYIL(p159-18;配列番号:6)、AFLPWHRLF(配列番号:7)及びAFLPWHRLFL(配列番号:8)を包含する。本質的に既述された通りに(Cellis等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:2105〜2109)、ペプチド特異性細胞を形成することができる。簡単に説明すると、適当なMHCクラスI対立遺伝子を発現する抗原提示細胞(antigen presenting cell)をp15又はチロシナーゼペプチドに約1〜10μg/mlの濃度で1〜16時間の期間暴露させることができる。抗原提示細胞は、非限定的に、末梢血単核細胞、EBVB細胞、精製単球、マクロファージ及び樹状細胞を包含する。次に、T細胞をペプチド−パルスされた(peptide-pulsed)抗原提示細胞と共に約7〜10日間の期間インキュベートし、約3〜10回同じ方法で反復刺激することができる。抗原に暴露されたT−リンパ球を哺乳動物(好ましくはヒト)に約109〜1012リンパ球/哺乳動物で投与する。このリンパ球は静脈内、腹腔内又は病巣内(intralesionally)に投与することができる。この治療法は他の治療法(例えば、サイトカイン、放射線療法、黒色腫病巣の外科的切除及び化学療法薬、選択可能なT−リンパ球療法)と同時に投与することができる。
寄託された実施態様は本発明の1態様の単なる例示として意図されるので、本発明は開示された又は寄託された核酸配列によって範囲を限定されるものではなく、機能的に同等である配列は本発明に含まれる。実際に、本明細書に示し、説明した発明の他に、種々な本発明の変更が上記説明と添付図面とから当業者に明らかになるであろう。このような変更も本明細書に添付される請求の範囲に含まれるものと意図される。
配列表
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Claims (30)
- メラノーマ抗原をコードする単離された核酸であって、
(a)配列番号1のヌクレオチド配列;
(b)配列番号2、5、6、21又は23のアミノ酸配列を含んでなるメラノーマ抗原をコードするヌクレオチド配列;
(c)(a)又は(b)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記単離された核酸。 - 請求項1記載の核酸によりコードされる組換え蛋白質。
- 配列番号5、6、21又は23のアミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸1ないし18を含んでなる、請求項3記載の単離されたペプチド。
- 天然の、合成の、又は組換えの蛋白質である、請求項3又は4記載の単離されたペプチド。
- 請求項3〜5いずれか1項記載のペプチドをコードする単離された核酸。
- 配列番号1で示される核酸を含むベクターで形質転換した宿主細胞を、蛋白質の発現をもたらす条件下で培養することを含んでなる、配列番号2で示される組換えp15蛋白質の製造方法。
- ベクターが真核発現ベクターである請求項7記載の方法。
- ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項7記載の方法。
- 宿主細胞が真核細胞である請求項7記載の方法。
- 真核細胞が昆虫細胞である請求項10記載の方法。
- 請求項1又は6記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。
- 請求項12記載の組換え発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞。
- 請求項2記載の蛋白質又は請求項3〜5いずれか1項記載のペプチドと反応性を有する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
- モノクローナル抗体である、請求項14記載の抗体。
- インビトロで請求項2記載の蛋白質又は請求項3〜5いずれか1項記載のペプチドに暴露された細胞。
- T細胞又は樹状細胞である、請求項16記載の細胞。
- 生物学的サンプル中の請求項2記載の蛋白質をコードするメッセンジャーRNAを検出する方法であって、下記の工程:
(a)生物学的サンプルを、配列番号1で示される核酸若しくはその一部分と、該核酸若しくはその一部分と前記メッセッジャーRNAとの間に複合体が形成される条件下で接触させること;そして
(b)該複合体を検出すること;
を含んでなる、前記検出方法。 - サンプルが、哺乳類組織、哺乳類細胞、剖検サンプル、病理サンプル及び生検サンプルからなる群から選択される、請求項18記載の方法。
- 生物学的サンプル中の配列番号2で示されるp15蛋白質を検出する方法であって、下記の工程:
(a)サンプルを、前記蛋白質と特異的に反応して該蛋白質との複合体を形成する抗体又はそれらの断片と結合する抗原と接触させること;そして
(b)複合体の形成を検出すること;
を含んでなる、前記検出方法。 - サンプルが、哺乳類組織、哺乳類細胞、剖検サンプル、病理サンプル及び生検サンプルからなる群から選択される、請求項20記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項20記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体である請求項20記載の方法。
- 生物学的サンプル中の配列番号2で示されるp15蛋白質をコードするゲノム核酸を検出する方法であって、下記の工程:
(a)生物学的サンプルを、配列番号1で示される核酸の少なくとも一部分と、該核酸若しくはその一部分と前記ゲノム核酸との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させること;そして
(b)複合体の形成を検出すること
を含んでなる、前記検出方法。 - 請求項2記載の組換え蛋白質及び受容される助剤、希釈剤又は担体を含んでなる、メラノーマを予防若しくは治療する医薬組成物。
- 請求項3〜5いずれか1項記載のペプチド及び適当な助剤、希釈剤又は担体を含んでなる、メラノーマを予防又は治療するための医薬組成物。
- 配列番号2で示されるp15蛋白質の5〜20アミノ酸残基の配列を含むペプチドの免疫原性を評価する方法であって、下記の工程:
(a)配列番号2で示されるp15蛋白質の5〜20アミノ酸残基の配列を含むペプチドを複数調製すること;
(b)上記ペプチドの少なくとも一つをHLA−24を発現する哺乳類細胞ラインと共にインキュベートすること;
(c)上記哺乳類細胞ラインの前記哺乳類細胞ラインの前記細胞を、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)に暴露すること;そして
(d)上記細胞のTILによる認識をスクリーニングすること;
を含んでなる、前記評価方法。 - 工程(a)のペプチドが9ないし10アミノ酸の長さである、請求項27記載の方法。
- 工程(b)の上記哺乳類細胞ラインの前記細胞が、COS細胞、T2細胞、又はEBVでトランスフォームされたB細胞からなる群から選択される、請求項27記載の方法。
- 請求項1又は6記載の核酸又は請求項12記載の組換え発現ベクターを含んでなる、メラノーマを予防又は治療するための医薬組成物。
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