JPH07503134A - 細胞障害性ｔ細胞前駆体の測定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 細胞障害性Ｔ細胞前駆体の測定方法 発明の分野 本発明は、腫瘍に特徴的又は特異的な抗原に対して特異的な細胞障害性Ｔ細胞の 前駆体の測定方法に関する。より具体的には、本発明は、上記前駆体を測定する ための「限界希釈Ｊ分析の自明でない適用及び変法に関する。その適用には、治 療体制及び、免疫応答を含む特定の処置に対する目的応答をモニターできること が含まれる。

背景及び従来技術 免疫学的応答に見出される事象を測定及び分析できることは、病的状態又は疾患 の経過の研究において興味深くかつ重要なことである。Ｔ−細胞応答を伴う場合 には当然に、Ｔ細胞の測定及び研究が関係する。

Ｔ細胞は、以下において「ＣＴＬ」という細胞障害性Ｔ細胞を含む、様々な型の リンパ球の混合物を構成する。ＣＴＬは、Ｔ細胞レセプターにより、標的細胞に より示された分子と相互作用する。その相互作用の後、ＣＴＬは標的細胞を溶解 する。

ＣＴＬにより認識される事実上の標的はしばしば、抗原に言及され、以下におい てもこの用語を使用する。

以前の研究により、様々な腫瘍は、Ｔ−細胞介在応答の対象でありうる抗原をも たらすことができること及び実際にもたらすこと、そしてその結果として拒絶を 導くことが立証された。ブレーン（Ｐｒｅｈｎ）ら著、Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎ ｃ、　Ｉｎ５ｔ、　１８．７６９〜７７８頁（１９５７年）、クライン（Ｋｌｅ ｉｎ）ら著、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、２０．１５６１−１５７２頁（１９６０年）、 オールド（Ｏｌｄ）ら著、Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　１０１ ．８０〜１０６頁（１９６２年）、クリプケ（Ｋｒｉｐｋｅ）ら著、Ｊ、Ｎａｔ 、Ｃａｎｃ、　１ｎｓｔ、５３．１３３３〜１３３６頁（１９７４年）、パンペ ル（ＶａｎＰｅｌ）ら著、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１５７．１９９２〜２ ００１頁（１９８３年）による初期の研究により、現在では−まとめにして「腫 瘍拒絶抗原」と呼ばれるこれらの細胞に発現する抗原は、ウィルス、化学薬品及 び紫外線照射により引き起こされるネズミの腫瘍に存在し、また、自然発生腫瘍 にも存在することが立証された。いくつかの腫瘍組織において、これらの腫瘍拒 絶抗原は細胞障害性Ｔ細胞応答を生じることも分かり、ネズミの腫瘍拒絶抗原に 対して高い特異性を持つＣＴＬが単離された。ブルーナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）ら 著、Ｊ、　Ｉｏｕｎｕｎｏｌ、　１２４．１６２７〜１６３４頁（１９８０年） を参照されたい。

ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて部分的免疫拒絶（ｐａｒｔｉａｌ　１ｎｉｎｕｎｅ　ｒ ｅｊｅｃｔｉｏｎ）を逃れる腫瘍細胞ＣＴＬの標的抗原は、同系宿主による認識 に関係がある。ウイテンホツブ（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅ）ら著、Ｊ、　ＥＸＩ） 、　Ｍｅｄ、　１５７．１０４０〜１０５２頁（１９８３年）を参照されたい。

クローン化したＣＴＬを用いた養子移入は、大きな腫瘍を保持する動物における 腫瘍細胞を根絶させることができる。カスト（Ｋａｓｔ）ら著、Ｃｅ１ｌ　５９ ．６０３〜６１４頁（１９８９年）を参照されたい。ネズミの腫瘍Ｐ８１５は、 ファンデアインド（Ｖａｎ　ｄｅ　［！ｙｎｄｅ）ら著、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ ｄ、１７３．１３７３〜１３８４頁（１９９１年）の通りに同定され単離された 遺伝子である腫瘍拒絶抗原をコードしている。この遺伝子は、正常マウス細胞に 発現しうるちのと同様であるが、正常の大人マウス組織には少しもないかあるい は発現していないことが見出された。

リンパ球腫瘍細胞混合培養物（ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｔｕｍｏｒ 　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（「ＭＬＴＣ」）ハ、ｆチｓうにキーｙ−（ｒ ＮＫＪ　）細胞、自己ＥＢＶ転換Ｂ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ＥＶＢ　ｔｒ ａｓｆｏｒｍｅｄ　Ｂ　ｃｅｌｌ）又は自己腫瘍細胞を溶解することなく、自己 腫瘍細胞を溶解する応答性リンパ球をしばしば生じることが、ヒトにまで拡張さ れた研究により見出された。アニチ＝（Ａｎｉｃｈｉｎｉ）ら著、Ｉｎｔ、　Ｊ 、　Ｃａｎｃｅｒ　３５．６８３〜６８９頁（１９８５年）を参照されたい。そ の応答は、抹消血単核細胞（ＰＢＭの又は腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ　ｉｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　ＩｙｍｐｈｏｃｙｔｅＸＴＩＬ）を使用して、ＭＬＴＣ においてメラノーマについて研究され、それらは、ムーエルジ（Ｍｕｋｈｅｒｊ ｉ）ら著、Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５Ｂ　、２４０〜２４５頁（１９８３年）、ヌース（Ｋｎ ｕｔｈ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓモ堰B ８６．２８０４〜２８０Ｂ頁（１９８９年）、ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）ら著、Ｉｎ ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｅ、３９．３９０〜３９６頁（１９８７年）、トポリアン（ Ｔｏｐｏｌ　１ａｎ）ら著、Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　０ｎｃｏ１．６．８３９〜８ ５３頁（１９８８年）に報告された。ＰＢＭＣから誘導された１ｆｆＬｃは、培 養の２週間後に分析した時、腫瘍細胞及びＮＫツタ−ットの両方を溶解するよう に働く応答性細胞を一般的に含む。

さらに２又は３週間後、腫瘍細胞に対する溶解活性は増加し、ＮＫターゲ・ノド に対する溶解活性は消失する。ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）らによるｌｉｄ文献を参照 された０゜腫瘍に完全に特異的であると思われるＭＬＴＣ応答物からＣＴＬを誘 導することが可能となった。これらＣＴＬにより腫瘍細胞上に認識される抗原は 、新鮮な転移腫瘍組繊細胞にも存在することが見出されたので、それらは培養に よるアーチファクトとは思われない。ムーエルジの上記文献、）ユンの上記文献 、ｌ二乙の上記文献を参照されたい。自己ＣＴＬのパネルは、ヒトメラノーマ上 の４つの異なる安定な抗原の同定を認めた。ファンデンアインド（Ｖａｎ　ｄｅ ｎ　［！ｙｎｄｅ）ら著、Ｉｎ　ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ４４．６３４〜６４ ０頁（１９８９年）を参照されたい。抗原が同定された患者から得たさらに７０ のＣＴＬを分析すると、ＣＴＬにより認識されたすべての主要で安定な抗原は、 ４つのこのセットに含まれることが分かった。

腫瘍細胞に特異的なＣＴＬの役割の評価には、患者におけるそれらの前駆体の頻 度を分析する能力が要求される。これは、もし可能ならば、例えば、免疫治療ア プローチのような治療プロトコールの評価及びこれらがＣＴＬ前駆体（ＣＴＬ− Ｐｓ）にどのように影響を及ぼすのかということの評価を可能とするであろう。

Ｔ細胞の成分を測定する基本的な方法は、限界希釈分析によるものである。この 周知の技術は、例えば、シャロック（Ｓｈａｒｒｏｃｋ）ら著、１ｍｍｕｎｏ１ ．Ｔｏｄａｙ　１１（８）、２８１〜２８５頁（１９９０年）に記載されており 、この記載は参照文献としてここに含まれるものとする。これらの分析は、混合 集団における細胞の特定のタイプの頻度を測定するように設計されている。特定 の応答は、多くの異なるサンプルについて研究され、負の応答は、さらなる予測 に使用された。正の応答が特定の細胞に関係しつるかどうかを知ることは直接的 に可能ではないので、負の応答が使用される。本質的に、一群の試験細胞である 「応答性細胞」は、第二の群である「刺激性細胞」と混合され、その後いかなる 反応も研究された。応答性細胞は、使用される特定のプロトコールに基づいて変 えることができる、公知あるいは所定の数において使用される。これらの分析は 、好適な標的細胞、一般的には、フンカナバリンＡ又はフィトヘムダルチニンに より刺激される芽細胞を選択することの重要性を論じたシャロック（Ｓｈａｒｒ ｏｃｋ）の報告に従って、ＣＴＬについて行われた。他の標的と混合するならば 、エプスタイン−バーウィルス形質転換体を使用することもできる。その方法は 有用であるが、ンヤロックらによる研究の初期の段階にあると記載されている。

この参照文献は、応答性細胞としてＰＢＭＣの使用を教示しているが、刺激物質 の選択数が制限されていることを示している。

腫瘍抗原に特異的なＣＴＬ−Ｐ細胞を、実際に分析できることを見出した。この タイプの分析法は、当技術分野には示されておらず、また、先行技術を構成する 参照文献によって示唆されていない。従って、限界希釈分析を使用するＣＴＬ− Ｐの分析方法が本発明の主題である。この方法の適用には、以下に説明するよう に、治療上の処置に対して目的とする応答のモニタリングが含まれる。

図面の説明 図１は、溶解パターン及びそれらの分類の特徴を描写するものである。

図２は、限界希釈微小培養による腫瘍細胞の溶解のレベルとそのデータのポアソ ン分析結果を示すものである。

図３は、競合物質（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）Ｋ２Ｏ２を加えた時、限界希釈による 腫瘍細胞の溶解を示すものである。

図４は、Ｋ２Ｏ２がある時及びない時において、抗−腫瘍障害性エフェクターの 頻度について得られた結果を示すものである。

図５は、ＰＢＭＣ，ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の間での障害性エフェクターの頻 度を示すものである。

好ましい態様の詳細な説明 以下の実施例では、様々な状況において異なる試薬及び細胞を使用している。

提示を簡単にするために、ここで一定の説明を与える。

「培地ｊという語句を使用する時、特に規定しない限り、０．５５１＋１ＭＬ− アルギニン、０．２４ｍＭ　Ｌ−７スパラギン、１．５ｍ１ＪＬ−グルタミン及 び５Ｘ１０−’　２−メルカプトエタノールで補足したイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ ）培地をいう。

以下に「Ｈ８」と略書するヒト血清は、健康なドナーから得た、プールしたタイ プのＡ、Ｂ及びＯ血清をいう。Ｈ８は、５６℃、３０分間処理することにより補 体除去し、それを遠心（４５分、１７．　ＯＯＯｇ）濾過及び滅菌することによ り部分的に脱脂したものである。

ウシ胎児血清を、ｒＦＢｓ　Ｊと略書する。

インターロイキン−２及びインターロイキン−４を、ＩＬ−２及びＩＬ−４とそ れぞれ略書する。以下の実験において、組み換え体ヒト型インターロイキンを使 用したが、他の型も同様に働くことが予期されるであろう。使用する濃度は、す べての実験において、３００／ｍｌ　（ＩＬ−２）及び５０／ｍ１（ＩＬ−４） であった。ＩＬ−２の１ユニット／ｍｌを、ＣＴＬＬ−２細胞系の最大増殖の半 分を維持する濃度と定義した。ＩＬ−４の１ユニツトは、フィトヘムアグルチニ ン−Ａ　（ｒＰＨＡＪ　’）と前もって処理したヒトＴ細胞の５０％最大増殖を 生じる濃度のものである。

サイトカイン「ガンマインターフェロン」をｒｌＦＮ−γ」と略書する。

実施例１ 抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は精製したサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）を患者か ら得た。患者のサンプルを密度勾配遠心分離にかけ、ＪａＴに記載する限界希釈 分析に使用する前に凍結保存した。これらのサンプルからＣＤ４＋及びＣＤ８” 　Ｔ細胞を分離するために、標識した抗−Ｌｅｕ　３抗体（螢光）、抗−Ｌｅｕ 　２抗体（フィコエリトリン）を使用して、フローサイトメトリーによる選別を 利用した。選別の特質は、本発明に特に関係しておらず、ＰＢＭＣ，ＣＤ４＋及 びＣＤ８＋の精製は標準的な方法によって簡単に行うことができる。通常、選別 した一区分の純度は９７．５％より高い。

実施例２ 限界希釈分析を、上記のＰＢＭＣ又はサブセットのいずれかの様々な量を用いて 計画した。数の範囲は、約２００〜１０．０００であった。

特定の量、即ち所定数の選択したＰＢＭＣ／サブセットを、１０４個の照射した 自己腫瘍細胞（即ち、ＰＢＭＣの源と同し患者から採取した腫瘍細胞）と共に、 ９６Ｖ−底ミクロウエルに播種した。腫瘍細胞を予め使用して細胞系を確認し、 照射した細胞をそれらから取り出した。照射は、Ｃｓ源（１００００ｒａｄ）を 使用して行った。

照射した腫瘍細胞を、刺激性細胞として使用した。混合物を培養するために使用 したヨ照培地を、ＩＥのｌＯ％Ｈ３及びＩＬ−４で補った。ウェルを３分間、１ ００ｇで遠心分離し、８％の００２中、３７℃でインキュベートした。インキュ ベーションの３日目に、上記の！Ｌ−２を加えた。

培養の７日目に、新鮮な培地（１００μｌ）を、ＩＬ−２、ＩＬ−４及び１０４ 個の追加の照射した細胞と共に加えた。

培養の１４４日目、１００μｍの培地を廃棄し、細胞を平底のミクロウェルに移 し、ＩＬ−２、ＩＬ−４及び上記の照射した細胞を加えた。

培養の過程の間、サンプル中のＣＴＬ前駆体の増殖率を、放射標識したチミジン 及び従来の方法を使用して測定した。そのような日々において、細胞の４０１１ １の４つのアリコートをミクロウェルに移し、溶解活性を分析した。同時に、Ｉ Ｌ−２、ＩＬ−４及び照射した細胞をさらに含む１６０μｌの培地を加えること により、残りのサンプルを再び刺激した。少なくとも１００の培養を、番数のＰ ＢＭＣについて行った。

よ？のタイプの刺激は、十分な量の細胞の増殖を導き、腫瘍細胞に対する溶解活 性の分析を可能にした。

実施例３ 増殖した細胞の溶解活性を測定するために、これらを以下に記載の方法において 、自己腫瘍細胞を用いて試験した。

使用すべき自己腫瘍細胞を、４８時間、５００／ｎｌ　ＩＦＮ−γを含有する培 地中でブレインキュベートした。このことにより、組織適合性分子及び付着分子 の発現が高められる。非活性ナチュラルキラー細胞（１照のｒＫ５６２Ｊ　）を 加えた時、これらはそれほど処理されなかった。ＩＦＮ−γは、ＮＫ様エフェク ターによる溶解に対するこれらの細胞の感受性を改質しなかった。

ｌＯ％Ｈ３で補足した培地中、１０’細胞／ｍｌの腫瘍細胞を懸濁し、２００ｍ 　”Ｃｒ　Ｃｉ／ｍｌを使用して、３７℃で６０分間インキュベートすることに より、該腫瘍細胞を標識した。標識した細胞を培地と２％Ｈ５で３回洗い、その 後１０４細胞／ｍｌで培地に懸濁した。この後、２％Ｈ３又は追加の５　ｘｌＯ ’　Ｋ５６２細胞／ウェルで増加した６０μｌの培地を、予め刺激された細胞を 含むウェルに加えた。このインキュベーション（３７℃）の１時間後、１０００ 個の腫瘍細胞を１００μｌの培地におけるウェルごとに加えた。その混合物を遠 心分離しく４分間、２００ｇ）　、その後、８％ｃｏ、雰囲気中、３７℃で、４ 〜５時間インキュベートした。上澄みのアリコート（１００μｌ）を集め、ＳＩ Ｃ，の特定の放出を計算した。以下の式を使用した：％放出＝　（ＥＲ−５Ｒ） Ｘｌ　００　（ＭＲ−８Ｒ）式中、ＥＲは実験の５１Ｃ「放出値であり、ＳＲ＝ 自発的な放出（即ち、培地のみにおいてインキュベートした細胞による放出）、 及びＭＲは「最大放出」、即ち、０．１５％ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００において 腫瘍細胞をインキュベートすることにより得られたものである。ＳＲは、ＭＲｃ ）１５％を決して超えなかった。

図２は、２人の患者（ＬＢ−３３及びＬＢ−３０）から採取したサンプルを使用 し、ＰＢＭＣの数を変えて使用して得られた結果及び患者から採取したメラノー マ細胞の溶解の百分率を示す。高い程度の溶解が、いくつかの微小培養において 観察された。コントロールの培養、即ち、腫瘍細胞を含まず、それ故に抗原が存 在しないものにおいて、溶解は見られなかった。

ＰＢＭＣの数が減少するにつれて、陽性の微小培養物の両分も減少したが、溶解 のレベルは予期した以上に減少しなかった。

溶解パターンを分析することにより、陽性と陰性の差別を簡単にする明らかなビ モーダル（ｂｉｍｏｄａｌ）分布が存在しないことが分かった。このことは、異 なるエフェクター細胞は異なる増殖率を示し、従って溶解の程度に影響するとい う初期の観察と一致する。

溶解活性が欠けている微小培養の百分率をＰＢＭＣの数の関数としてプロットし 、ポアソン分布のゼロ次項（ｚｅｒｏ　ｏｒｄｅｒ　ｔｅｒｍｓ）を使用した時 、ＰＢＭＣの量が増加した時に陰性のウェルの両分の対数は線状に減少した。５ ％あるいは１０％のどちらの溶解を陽性の閾値として選択するかにかかわらず、 図２はこのことが真実であることを示している。

実施例４ 過去において、応答性細胞から誘導された安定な障害性クローンには、ナチュラ ルキラー（ＮＫ）細胞の標的である細胞系に５６２をほとんど溶解しないか全く 溶解しないことを示す抗−腫瘍ＣＴＬ及びに５６２を溶解する他のクローンが含 まれることが報告された。（Ｋ２Ｏ２は、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン、例えば受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ　２４３から意のままに入手可能なヒト慢 性骨髄性白血病細胞系である）。この細胞系は、例えばＪ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎ ｃ、　Ｉｎ５ｔ、　５９．７７〜８３頁（１９７７年）に、ＮＫ分析においてｉ ｎ　ｖｉｔｒｏの標的に高感受性と記載された。Ｋ２Ｏ２に特異的な障害性クロ ーンを「照様」といい、それらが存在するか否かを決定することが重要であった 。

このことを行うために、ＩＦ限界希釈物を、ＮＫ標的であるに５６２に対する影 響について分析した。サンプル中の腫瘍細胞の数に比べて５０倍過剰の成育不能 なに５６２を含む場合と含まない場合の両方における分析を行った。分析には、 ヨ照のクロム放出方法論を使用した。結果から、刺激されたＰＢＭＣサンプルは ４つのパターンのうちの一つに属することが分かった：■、　いくつかの微小培 養物は、腫瘍細胞を溶解するが、Ｋ２Ｏ２を溶解しない。そのような培養物にお いて、非標識に５６２による競合は、腫瘍細胞の溶解を決して有意に減少しなか った。

乙　腫瘍細胞とに５６２を共に溶解した。［冷Ｊ　Ｋ２Ｏ２との競合において、 標識したに５６２の溶解をほとんど阻止したが、腫瘍細胞の溶解を阻止しなかっ た。そのような培養物は、腫瘍特異的クローン及び照様クローンの混合物を示し た。

３、腫瘍及びに５６２細胞の両方を溶解し、冷に５６２との競合がすべての溶解 を阻止した。そのような培養物は、少なくとも一つのＮＫ様ツクローン含むと思 われる。

４、Ｋ２Ｏ２のみの溶解。そのような培養物は、洲様クローンを明らかに含むが 、腫瘍特異細胞を含まない。

ｒｌＪ、「２」及び「３」の合計は、ＩＥの抗−腫瘍障害性クローンの全量に相 当する。パターンｒｌＪ及び「２」は、抗−腫瘍ＣＴＬを示し、ＣＴＬ前駆体の 頻度を測定するのに使用することができる。表１は、ヨ扛列挙した４つのタイプ を一つの分類結果にまとめたものである。ここに使用した略書ｒＬＤＡ　Ｊは、 ［限界希釈分析」を表している。

競合物に５６２の存在において、ＰＢＭＣ数が減少しても、多数のＣＴＬクロー ンを含む培養物が損失した場合に予期されうる以上に腫瘍細胞の溶解を減少しな かった。

これらの結果を図３に示す。

表１　腫　し　において観察した溶解Ｒターン実施例５ 抗−腫瘍ＣＴＬと考えられるクローンを特異性について試験した。この試験（よ 、様々な標的上で障害性培養物を試験することにより行った。患者（ＬＢ−３３ ）のＰＢＭＣを、自己腫瘍細胞、Ｋ２Ｏ２、自己ＰＨＡ芽細胞及び患者ＬＢ−３ ０及びＬＢ−３４から得た腫瘍細胞に対して試験した場合のデータのｌセ・ノド を以下の表２に示した。これらの個のＰＢＭＣを使用し、ｌｉＥのような溶解分 析を設定した２８日後に測定した。ＰＨＡ−芽細胞の場合において、１００００ ／ｍｌのＩＬ−２で１０日間活性化した自己ＰＢＭＣを使用して、溶解をチェッ クした。

実施例６ 様々な患者の抗−腫瘍ＣＴＬ前駆体細胞の頻度を評価した。示した材料のすべて を使用し、１尺のように、ＰＢＭＣを使用して限界希釈培養を設定した。溶解活 性を、図４のパネルにおいて示した日数（例えば、ｒｄ２０Ｊ　）において測定 し、障害性エフェクターの頻度を算出した。抗−腫瘍及びすべての障害性エフェ クターの全数を示す。

加えたＰＢＭＣの数と抗−腫瘍ＣＴＬを含まない微小培養物の両分の対数との関 係は、線状であることが分かる。このことは、腫瘍に特異的な溶解が単一のＴ細 胞クローンの活性の結果らしいという、ｌｌ、−提起した点をサポートしている 。多様な変化が、異なる患者において、すべての腫瘍細胞障害性細胞の頻度及び 抗−腫瘍特異性ＣＴＬの前駆体の両方に観察された。その上、これら２つの間の 比は、大きな差をしばしば示した。

実施例７ 抗−腫瘍ＣＴＬ前駆体の頻度と同様に、限界希釈分析の２０日付近を検出するよ うに、ＮＫ一様エフェクタークローンの頻度を測定するために分析を行った。こ れらを以下の表３に示す。

表３　異なるメラノーマ患者の抗−腫瘍ＣＴＬ−Ｐの頻度頻度 ＬＢ−３３１２０１／２２９０　１／１１６０４　ｉｌｌ　１１９１０　１／１ ０２０ＬＢ−３４２１ｕホＷＩ／９１０ ＬＢ−２５１８＋／７１２０　１７２５０辺・２　１”　２６　＄　１／９８０ ＬＢ−３０１”　２５　１／１０１ｉ００　１／４２０２　２７　圧工ｍ　１／ ２０５０ ＬＢ−１７３１１／１７９００　１／ｇ３０ＬＧ−２２０４ｊツー　＞１７４０ ０ この表は、成育不能なに５６２を含むものと含まないものの両方における、自己 腫瘍細胞に対する活性を示すものである。パターン「１」又は「２」の微小培養 物を使用して、ＣＴＬ前駆体（ＣＴＬ−Ｐ）の頻度を評価し、パターン「２」、 １３」又は「４」を使用し、ＮＫ一様エフエクター細胞の頻度を評価した。

活性を有する微小培養物の数が時間と共に幾らか減少しても、一定の頻度のＣＴ Ｌ−Ｐが観察されたことに注目する。この理由は、使用する条件の下、たいてい はおそらく支持細胞を含まないので、たいていのＣＴＬクローンは、無制限に増 加しないことにある。

ＮＫ一様活性を有する培養物は、１４〜３０日の間により激しく減少し、そのこ とは、ヘリン（Ｈｅｒｉｎ）ら著、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３９：　３ ９０〜３９６頁、（１９８７年）による先の観察と一致する。

実施例８ １５日付近の限界希釈による抗−腫瘍ＣＴＬクローンの単離を導く先の実験は、 ＣＤ４　′″及びＣＤ８”細胞の両方を示したが、抗−腫瘍ＣＴＬの大部分はＣ Ｄ８＋であった。これは培養条件がＣＤ８＋細胞の産生を好むからなのか否かを 測定するため、研究を行った。１尺の適した方法論を使用して、たいていのＣＴ Ｌ−ＰがＣＤ８＋であることを見出した。

上に示した実施例の幾つかの特徴は、論評に値する。まず、微小培養は、培養に おいて支持細胞を使用しなかった。多くのの患者について、望ましい支持細胞で ある自己ＰＢＭＣを十分な量で得ることは困難である。また、一般的に適用可能 な限界希釈分析を提供することが望まれた。本発明者によって行われたがここに 報告していない実験において、自己の照射したＰＢＭＣを支持細胞として使用し た時、抗−腫瘍ＣＴＬの頻度の増加が観察されたが、これは高い照一様頻度に結 びつけて考えられる。

ＮＫ−阻害物質、即ち成育不能なに５６２細胞を使用する実験により、抗−腫瘍 ＣＴＬと腫瘍細胞の溶解もするＮＫ様エフェクターの間の差別が認められる。Ｎ Ｋ様エフェクターは、Ｋ５６２細胞に結合することにより阻害される。なぜなら 、それらは成育不能であり、′ＩＣ「放出を示さないからである。他のＮＫ標的 細胞を含む、混合物におけるＮＫ及び／又はＮＫ様細胞の効果を評価するための 他の方法を使用することもできる。

腫瘍細胞の抗原特性に特異的なＣＴＬ−Ｐ　ノ頻度は、Ｉ／３３０００−１／９ ００　ＰＢＭＣテある。

患者ＬＢ−３３により得られた後者の数は、腫瘍に対する自己免疫応答から得ら れた結果であってもよい。観察された数を、以下の数、ポリシーブイックス（Ｂ ｏｒｙｓｉｅｗｉｃｚ）ら著、Ｂｕｒ、　Ｊ、　１ｍ＋ｎｕｎｏ１．１８：２６ ９〜２７５−頁（１９８８年）により得られたＣＭＶに関するｌ１５０００〜２ ０．０００、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄ）ら著、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４ ０．３６１０〜３６１６頁（１９８８年）の１（ＳＶに関する１／４０００〜８ ０００、あるいはヒフリング（１−ｔｉｃｋｌｉｎｇ）ら著、Ｊ、ｖｉｒｏｌ、 ６１．３４６３〜３４６９頁（１９８７年）の水痘帯状庖疹に関すル１／１６０ ０〜９００００と比較すべきである。ンヤロック（Ｓｈａｒｒｏｃｋ）のＩｍｏ ＋ｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　１１．２８１〜２８６頁（１９９０年）は、同種異型 反応性の頻度１１５００〜５０００００を論じている。

従って、本発明は、腫瘍細胞の抗原特性に特異的な細胞障害性Ｔ細胞前駆体を限 界希釈分析により測定することができるという方法を教示するものである。本方 法論において、ＣＴＬ−Ｐを含有する所定数の抹消血単核細胞を、腫瘍型の特徴 、即ち、腫瘍型に特に関連している抗原と接触する。これにより、その後培養さ れる物質の混合物を生じる。腫瘍抗原からの刺激は、ＣＴＬ−Ｐ細胞を活性な細 胞障害性Ｔ細胞に進化させる。混合物に入れるか加えるかして腫瘍細胞の溶解を モニタリングすることにより、この進化をモニターする。

使用するＰＢＭＣの数を変えてもよいが、好ましくはおおよそ約２００〜約１ｏ ｏｏｏを分析ごとに使用する。ＰＢＭＣを、混合したサンプルにおいて加えるか 、あるいはＰＢＭＣの純粋培養として使用してもよい。

腫瘍に特徴的な抗原を、一般的に成育不能な腫瘍細胞の形態において、理想的に 加える。腫瘍細胞を、例えば照射により、成育不能にすることができる。腫瘍細 胞は、それらの細胞表面上の抗原をさらに示し、ＣＴＬ−Ｐとの反応に関係した 増殖が続く。また、抗原を、例えば純粋な形態において加えることができるが、 これは好ましい態様ではない。

腫瘍細胞の自己サンプル、即ち、Ｐ［ＩＭＣと同し患者から採取した腫瘍細胞を 施すことが特に好ましい。理想的なものとしては、細胞のサンプルは、腫瘍細胞 に向けられていないＣＴＬ−Ｐとそれらの標的との反応を妨げるのにてきるだけ 純粋なものである。しかし、これはいつも可能ではなく、従って、混合物を処理 し、それらに含まれるナチュラルキラー（ｒＮＫＪ　）様細胞を除去することが 好ましい。用語「ナチュラルキラ一様」には、ナチュラルキラー細胞及び同じ又 は同等の方法で働く細胞が含まれる。これを行うための１つのアプローチは、例 えば、ＮＫインヒビターを加えることである。

障害性の測定を、上記の５１（：ｒ放出方法を含む、当技術分野に周知の方法に より完了することができる。

望ましくは、ここに記載した混合物を培養する時、支持細胞を使用せずに行うが 、これは必要条件ではない。

ＣＴＬ−Ｐをモニターする可能性は、応答、例えば患者の腫瘍に関する患者の免 疫応答のモニターを可能にする。ＣＴＬ−Ｐレベルの変化は、免疫応答の変化を 示し、それは、時間を通しての変化が患者の健康の悪化又は改善を示すことがで きるという重要な診断上の関数として働く。

ここに記載した方法の様々な改良法が示されてきた。他のものは、当技術分野に 明らかであり、ここに繰り返さない。

使用した用語及び表現は、記載上の用語として使用したものであり、これらに限 定されるものではなく、そのような用語及び表現の使用において、示し記載した 特徴又はそれらの一部と同等のいかなるものをも排除することを意図するもので はなく、様々な変更が本発明の範囲において可能なことが認められる。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、Ｃ１，ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ。

ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　５ Ｅ （７２）発明者　ポーン　ティエリー ベルギー　ベー１２００　ブリュッセル　ユセエル　７４５９　アベニュー　イ ッポクラート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．腫瘍の抗原特性に特異的な細胞障害性Ｔ細胞の前躯体の測定方法であって、 （１）被験者から採取した所定数の抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、該腫瘍に特 徴的な抗原と接触して混合物を形成し、 （２）該抗原に特異的なＰＢＭＣ由来の細胞障害性Ｔ細胞の発育に好ましい条件 下で前記混合物を培養し、かつ、 （３）被験者における該前躯体の指標として、混合物に加えた腫瘍細胞の溶解を 、細胞障害性Ｔ細胞により測定すること、を含むことを特徴とする上記方法。 ２．所定数が、約２００〜約１００００である、請求項１記載の方法。 ３．腫瘍特異抗原が腫瘍拒絶抗原である、請求項１記載の方法。 ４．ＰＢＭＣを得たのと同じ被験者から得た腫瘍細胞を含むサンプルをＰＢＭＣ に加えて混合物を形成する、請求項１記載の方法。 ５．混合物を処理して、ここに含まれるナチュラルキラー様細胞を不活性にする 、請求項４記載の方法。 ６．処理が、ナチュラルキラー細胞インヒビターを該混合物に加えることを含む 、請求項５記載の方法。 ７．該インヒビターが、ナチュラルキラー細胞の標的細胞である成育不能な細胞 である、請求項６記載の方法。 ８．ナチュラルキラー細胞の標的がＫ５６２である、請求項７記載の方法。 ９．支持細胞を含まない該混合物を培養することを含む、請求項１記載の方法。 １０．腫瘍に関連した状態の処置に対して個体の応答をモニターする方法であっ て、（１）被験者の腫瘍に関連する抗原に特異的な、被験者により形成された前 駆体細胞障害性Ｔ細胞を、第一の時点において測定すること、（２）腫瘍に関連 する抗原に特異的な前駆体細胞障害性Ｔ細胞を、第二の時点において測定するこ と、及び （３）（１）と（２）で得られた値を比較することを含み、これらの差は、免疫 応答の変化の指標となる上記方法。 １１．腫瘍に関連した状態の個体から採取した所定数のＰＢＭＣを、該被験者か ら採取した腫瘍サンプルと培養すること及び細胞障害性Ｔ細胞の尺度として腫瘍 サンプル中の細胞の溶解を測定することにより、前駆体細胞障害性Ｔ細胞を測定 することを含む、請求項１０記載の方法。 １２．腫瘍細胞が成育不能である、請求項４記載の方法。 １３．抗原が腫瘍拒絶抗原である、請求項３記載の方法。 １４．所定数のＰＢＭＣの範囲が約２００〜約１００００である、請求項１１記 載の方法。 １５．腫瘍サンプルが、腫瘍拒絶抗原を示すサンプルである、請求項１１記載の 方法。