CN108697734A - 表现出适应性表型的nk细胞以及制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开描述了一种适应性NK细胞、一种分离的适应性自然杀伤(NK)细胞的群体、一种包括适应性NK细胞的组合物、以及用于产生、制备、以及使用适应性NK细胞或分离的群体或包括适应性NK细胞的组合物的方法。所述适应性NK细胞可以用于治疗病毒感染或肿瘤。

Description

表现出适应性表型的NK细胞以及制备和使用方法

继续申请数据

本申请要求2015年9月14日提交的美国临时申请序列号62/218,366和2016年2月16日提交的美国临时申请序列号62/295,708的权益，所述美国临时申请中的每一件以引用的方式并入本文。

政府资助

本发明是在政府支持下根据由国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的基金号CA111412、CA65493、CA197292、以及HL122216作出的。政府拥有本发明的某些权利。

发明内容

本公开描述了一种表现出适应性表型的NK细胞、一种包括适应性NK细胞的组合物、一种分离的适应性NK细胞的群体、以及制备和使用所述组合物和分离群体的方法。由于适应性NK细胞与常规的NK细胞相比具有功能上独特的能力，当与常规的NK细胞相比时，所述功能上独特的能力容许所述适应性NK细胞提供额外的抗肿瘤能力或抗病毒能力，因此所述的组合物、群体、以及制备和使用那些组合物和群体的方法可以用于治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒感染。

在一个方面，本公开描述了一种组合物，所述组合物包括适应性NK细胞。适应性NK细胞与常规的NK细胞相比具有功能上独特的能力并且当与常规的NK细胞相比时可以提供额外的抗肿瘤能力或抗病毒能力。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD3^-、CD56⁺、以及CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、和CD45RA^-中的至少一种。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是长寿命的。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少两种。举例来说，所述适应性NK细胞可以是CD57⁺和NKG2C⁺。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少三种。举例来说，所述适应性NK细胞可以是SYK^-、FcεRγ^-、以及EAT-2。

在一些实施方案中，与常规的NK细胞相比，在适应性NK细胞中早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子的表达降低。举例来说，所述PLZF表达可以降低至少90％。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞不表达所述转录因子早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞显示出抗肿瘤活性。所述肿瘤可以包括造血组织和/或淋巴组织的肿瘤。所述肿瘤可以是实体肿瘤。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于在包含IL-15、IL-21、IL-18、IL-12、IL-2、IFN-α、或IFN-β中的至少一种的培养基中培养的细胞；在包含雷帕霉素(rapamycin)的培养基中培养的细胞；在包含Notch配体的培养基中培养的细胞；和/或在包含NKG2C受体激动剂的培养基中培养的细胞。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是在体内制备的。在一些实施方案中，所述制备包括向受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗；向受试者施用灭活的巨细胞病毒(CMV)；向受试者施用细胞因子；和/或向受试者施用Notch配体。所述细胞因子可以包括例如IL-15、IL-21、IL-12、IL-18、以及GM-CSF中的至少一种。在一些实施方案中，所述细胞因子或细胞因子的组合可以高剂量施用。在一些实施方案中，所述制备包括诱导受试者的Notch配体的表达。在一些实施方案中，所述受试者是CMV血清阳性的。

本公开还描述了一种用于在受试者中治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含适应性NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述癌症包括骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌、造血系统癌症、或淋巴癌。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。

本公开还描述了一种抑制受试者的肿瘤生长的方法。所述方法包括向所述受试者施用包含适应性NK的组合物。在一些实施方案中，所述肿瘤包括实体肿瘤。在一些实施方案中，所述病毒包括慢病毒或疱疹病毒。在一些实施方案中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

本公开还描述了一种用于在受试者中治疗或预防癌症或癌前病况的方法，其中所述方法包括体内制备适应性NK细胞。在一些实施方案中，所述癌症包括骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌、造血系统癌症、或淋巴癌。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。

本公开还描述了一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括体内制备适应性NK细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤包括实体肿瘤。在一些实施方案中，所述方法还包括施用包含治疗剂的组合物。在一些实施方案中，所述治疗剂可以是非天然存在的和/或可以非天然存在的量施用。所述治疗剂可以包括例如细胞因子、趋化因子、治疗性抗体、佐剂、抗氧化剂、或化学治疗剂中的至少一种。

本公开还描述了一种制备适应性NK细胞的方法。在一些实施方案中，在体外制备所述适应性NK细胞。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于来自未感染过巨细胞病毒(CMV)的来源的细胞、从血液中分离的细胞、多潜能干细胞、胚胎干细胞、从脐带血中分离的细胞、和/或诱导多潜能干细胞(iPSC)。

在另一个方面，本公开描述了获得适应性NK细胞的方法。所述方法包括从受试者获得血液样品以及培养所述血液样品的NK细胞的群体。在一些实施方案中，在包括IL-15、IL-21、以及Notch配体中的一种或多种的培养基中培养所述NK细胞的群体。在一些实施方案中，将所述NK细胞群体与CMV肽补充的成熟树突状细胞一起培养。在一些实施方案中，将所述NK细胞群体与自体单核白细胞和IL-15一起培养。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

在另一个方面，本公开描述了一种组合物，所述组合物包括通过本文所述的方法获得的适应性NK细胞。在另一个方面，本公开描述了所述组合物包括NK细胞的群体，所述NK细胞的群体是针对通过本文所述的方法所获得的适应性NK细胞富集的。

在另一个方面，本公开描述了一种分离的NK细胞群体，其中所述细胞是CD56^暗、以及NKG2C⁺、CD57⁺、和TIGIT^低中的一种或多种。在另一个方面，本公开描述了一种分离的NK细胞群体，其中所述分离的群体是针对CD56^暗和NKG2C⁺的NK细胞富集的。本公开还描述了包括本文所述的分离群体的组合物。

词语“优选的”和“优选地”指的是在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同的或其它情况下，其它实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选的实施方案的叙述并不意味着其它实施方案不可用，并且不意图将其它实施方案排除在本发明的范围之外。

术语“包含”和其变化形式在这些术语在说明书和权利要求书中出现的情况下没有限制性含义。

除非另外说明，否则“一个(种)(a/an)”、“所述”以及“至少一个(种)”可互换使用并且意指一个(种)或多于一个(种)。

此外在本文中，通过端点对数值范围的叙述包括该范围内所包括的所有数字(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于包括不连续步骤的本文所公开的任何方法，所述步骤可以按照任何可行的顺序进行。并且适当时，两个或更多个步骤的任何组合可以同时进行。

本发明的上述发明内容不意图描述本发明的每一个公开的实施方案或每一个实施方式。随后的说明更具体举例说明了说明性实施方案。在贯穿本申请的几处，经由实例的清单提供指导，这些实例可以各种组合使用。在每一种情况下，所述的清单仅用作代表性组并且不应当被解释成排他性清单。

附图说明

图1(A-D)示出了巨细胞病毒(CMV)重新激活在降低强度预处理(RIC)造血干细胞(HCT)接受者中与降低的复发风险和较好的无病存活率有关，但是在清髓性(MA)造血干细胞(HCT)接受者中不是这样。由RIC接受者的CMV状态分层的复发率(图1A)和无病存活率(DFS)(图1B)的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)。由MA接受者的CMV状态分层的复发率(图1C)和DFS(图1D)。短划线表示对于CMV血清阴性接受者所计算的趋势。点线表示对于未经历病毒重新激活的CMV血清阳性接受者所计算的趋势。实线表示对于经历病毒重新激活的CMV血清阳性接受者所计算的趋势。对于趋势计算每一个图中所示的p值。

图2(A-B)示出了在经历CMV重新激活的RIC HCT接受者中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺适应性NK细胞的优先扩增。示出了具有适应性CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺表型的CD56⁺NK细胞的平均百分比(图2A)和绝对数量(每微升血液的细胞数)(图2B)。在移植后第100天(RIC n＝44，MA n＝32)、6个月(RIC n＝35，MA n＝23)、以及1年(RIC＝31，MA＝21)时CMV血清阴性接受者的值示于左图中。在移植后第100天(RIC n＝22，MA n＝12)、6个月(RIC＝13，MA＝14)以及1年(RIC＝11，MA＝8)时没有CMV重新激活的CMV血清阳性接受者的值示于中图中。在病毒诊断(RIC n＝28，MA n＝18)、诊断后2周(RIC n＝26，MA n＝14)、诊断后4周(RIC n＝29，MA＝23)、诊断后8周(RIC n＝24，MA n＝15)、移植后6个月(RIC n＝29，MA n＝17)以及移植后1年(RIC n＝26，MA n＝10)时重新激活CMV的CMV血清阳性接受者的值示于右图中。*＝RIC相较于MA，p≤0.05。误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。

图3(A-D)示出了在CMV重新激活时的绝对单核白细胞计数与CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增有关。绘制在病毒重新激活时28个CMV血清阳性接受者的绝对单核白细胞计数与在6个月或1年时来自这些接受者的外周血液样品中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量(图3A)或百分比(图3B)的关系图。还绘制在病毒诊断时相同接受者的绝对淋巴细胞计数与在6个月或1年时外周血液样品中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量(图3C)或百分比(图3D)的关系图。

图4(A-B)示出了与其它NK细胞子集相比，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞以高频率产生TNF和IFN-γ。将来自CMV血清阳性供体的PBMC与K562靶细胞或不与K562靶细胞以2:1的比率一起培养，并且在CD56^暗NK细胞的子集中分析功能性应答。图4A：对于代表性供体，与单独培养的效应细胞(灰色阴影线)相比，与K562靶细胞一起培养的NK细胞中TNF表达(空心黑线)和细胞内IFN-γ表达(空心黑线)的直方图。图4B：来自5个供体的与K562靶细胞一起培养的NK细胞的累积TNF和IFN-γ表达数据。进行两次独立实验。*＝p≤0.05，**＝p≤0.005。使用双侧成对t检验确定显著性。误差棒表示SEM。

图5(A-C)示出了高剂量IL-15、IL-21、以及Notch信号转导支持终末分化的CD57⁺适应性NK细胞和SYK^-适应性NK细胞的扩增。将从脐带血分离的单核细胞进行CD3/CD16耗尽并且在天然或DL1转导的OP9基质细胞上用所示的细胞因子培养14天。图5A：在每一种培养条件下来自代表性供体的CD56^暗NK细胞在第7天和第14天时的CD57表达和SYK表达的荧光激活细胞分选(FACS)图。还示出了在培养14天之后来自6个脐带血供体的表达表面CD57(图5B)和缺乏细胞内SYK(图5C)的CD56^暗NK细胞的百分比的累积数据。进行两次独立实验。误差棒表示SEM。

图6(A-B)示出了在用IL-21培养的CD56^暗SYK^-NK细胞中转录因子早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)下调。图6A：在所示的培养条件下14天之后来自代表性供体的脐带血来源的CD56^暗NK细胞中细胞内PLZF表达的FACS图。图6B：显示在每一种培养条件下14天之后来自6个供体的PLZF^-NK细胞的百分比的累积数据。进行两次独立实验。误差棒表示SEM。

图7(A-D)示出了雷帕霉素促进适应性NK细胞分化并且增强NK细胞功能。将来自健康CMV血清阳性供体的耗尽CD3/CD19的PBMC用DMSO或10微摩尔/升(μM)的雷帕霉素培养4天。图7A：来自代表性供体的CD57表达和NKG2C表达的FACS图。图7B：显示在刚刚分离后和在培养之后来自4个供体的CD57⁺NKG2C⁺适应性NK细胞的百分比的累积数据。通过FACS在存在或不存在CD16刺激的情况下分析在上述条件下培养的细胞的脱颗粒(CD107a)和TNF产生。图7C：来自代表性供体的FACS图。图7D：来自4个供体的累积脱颗粒数据。*＝p<0.05，**＝p<0.01。

图8(A-C)示出了来自成人CMV血清阳性供体的外周血液的适应性NK细胞可以在体外用高剂量IL-15、IL-2、以及CD16刺激来扩增。图8A：来自代表性CMV血清阳性供体的CD57相对于NKG2C、SYK、以及CellTrace的FACS图。来自4个CMV血清阳性供体的表达NKG2C的NK细胞的百分比(图8B)和缺乏SYK的NK细胞的百分比(图8C)的累积数据。*＝p<0.05。

图9(A-B)示出了髓源性抑制细胞(MDSC)抑制T细胞和NK细胞增殖以及NK细胞功能。图9A：将来自健康献血者的纯化的T细胞和NK细胞通过CellTrace Violet标记并且在CD3/CD28珠粒(40个珠粒/1×10⁵个细胞)和IL-15(每毫升1纳克(ng/mL))(对于T细胞)或单独的IL-15(10ng/mL)(对于NK细胞)存在下与细胞因子诱导的自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以不同的比率共培养。在第3天或第4天评估增殖，并且示出了六次独立实验的代表性数据。图9B：在IL-15(10ng/mL)存在下将纯化的NK细胞与单核白细胞或MDSC以2:1比率共培养5天。将细胞在染色之前用激动性CD16(抗CD16；每毫升1微克(μg/mL))刺激6小时并且评价脱颗粒(CD107a)和IFN-γ产生。一个代表性等值线图并且累积(n＝8)数据被示为平均值±SEM。使用司图顿氏t检验(Student's t-test)进行统计分析。

图10(A-B)示出了适应性NK细胞能抵抗MDSC抑制。在IL-15(10ng/mL)存在下将来自健康献血者的纯化的NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率在细胞接触下(图10A)或在仅允许可溶性因子交换的嵌套小室(transwell)中(图10B)共培养5天。将细胞在染色之前6小时用抗CD16刺激，并且通过流式细胞术各自评估脱颗粒、IFN-γ(图10A、图10B)和TNF产生(图10A)、以及增殖(Ki67)(图10A)。常规(Conv)NK细胞被鉴定为CD56⁺CD3^-CD57⁺NKG2C^-并且适应性NK细胞被鉴定为CD56⁺CD3^-CD57⁺NKG2C⁺FcεRγ^-。5次-7次独立实验的汇集数据被示为平均值±SEM并且使用司图顿氏t检验进行统计分析。

图11(A-D)示出了常规的NK细胞与适应性NK细胞相比表达更高的TIGIT。图11A：在染色之前将来自健康献血者的纯化的NK细胞在不存在或存在单独的IL-15(10ng/mL)的情况下或在IL-12(10ng/mL)和IL-18(100ng/mL)的另外的刺激下培养18小时或在用抗CD16(1μg/mL)刺激的情况下培养6小时。示出了四次独立实验之一。在IL-15(10ng/mL)存在下将NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率一起培养5天。在分析前6小时用抗CD16刺激细胞。DNAM-1(图11B)和TIGIT表达(图11C)的代表性直方图并且TIGIT表达的综合数据(n＝8)被示为平均荧光强度(MFI)±SEM。使用双因素方差分析进行统计分析。图11D：分析在与单核白细胞或MDSC共培养之前和之后NK细胞的DNAM-1和TIGIT的共表达。示出了3次独立实验和7个平行测定的代表性数据。

图12(A-E)示出了MDSC对常规NK细胞的TIGIT依赖性抑制。图12A：将单核白细胞、MDSC、以及NK细胞用CellTracker Blue标记，在载片上共培养过夜，然后用抗CD16刺激，之后用抗CD155(绿色)和抗TIGIT(红色)染色，继而进行共聚焦显微镜术。单独的细胞类型示于上图中或在共培养时示于下图中。示出了2次独立实验和6个供体的代表性数据。在IL-15和IgG对照(10μg/ml)或针对TIGIT的阻断抗体(10μg/ml)存在下将NK细胞与单核白细胞或MDSC一起培养5天。在多克隆NK细胞(图12B)、常规NK细胞(n＝8)(图12C)以及适应性NK细胞(n＝9)(图12D)中评价脱颗粒(n＝9)和IFN-γ产生(n＝8)。图12E：或者，通过抗TIGIT和抗DNAM-1(10μg/ml)(n＝6)将细胞共同阻断。汇集数据被示为n个平行测定的平均值±SEM，并且使用双因素方差分析和单因素方差分析进行统计分析。

图13(A-D)示出了活性氧簇(ROS)诱导MDSC上CD155的表达。从健康献血者PBMC中用IL-6(10ng/mL)和GM-CSF(10ng/mL)将MDSC诱导7天，珠粒耗尽HLA-DR，并且针对CD33富集。图13A：针对所示的抗原对MDSC和新鲜分离的单核白细胞进行染色。示出了来自10次独立实验的一个代表性实例。图13B：将诱导的MDSC针对CD155染色并且在用超氧化物歧化酶(SOD，200IU/mL)、精氨酸酶抑制剂(a-ARG，精氨酸酶抑制剂N(ω)-羟基-正L-精氨酸，500μM)、ROS清除剂(过氧化氢酶，每毫升200个国际单位(IU/mL))、针对TGF-β的阻断抗体(10μg/mL)、iNOS抑制剂(aiNOS，NG-单甲基-L-精氨酸，500微摩尔/升(μM))过夜处理或保持未处理之后通过流式细胞术分析。汇集(n＝4)数据被示为平均值±SEM，并且使用司图顿氏t检验进行统计分析。图13C：将未刺激的单核白细胞和MDSC针对总ROS染色并且通过流式细胞术分析。图13D：将未刺激的或H₂O₂(250μM)单核白细胞和未刺激的MDSC针对总ROS、CD112、以及CD155染色并且通过流式细胞术分析。示出了对于ROS和CD112或CD155呈双重阳性的细胞。示出了六个供体中的一个代表性供体。为了简单起见，对于所有组，示出了一个代表性同种型对照组，这是因为单个对照组在条件之间是相似的。

图14(A-C)示出了TIGIT接合抑制pZAP70/Syk和pERK1/2并且引起对NK细胞的细胞毒性的抑制。在IL-15(10ng/mL)存在下并且在存在或不存在针对TIGIT的阻断抗体(10μg/mL)、或过氧化氢酶(200IU/mL)的情况下将来自健康献血者的纯化的NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率共培养5天。然后将细胞洗涤，静置4小时，用抗CD16刺激10分钟和30分钟，并且分别针对pZAP/Syk或pERK1/2染色。来自3次独立实验的代表性数据(图14A)或累积数据(图14B)被示为平均值±SEM。使用司图顿氏t检验进行统计分析。图14C：将在存在或不存在抗TIGIT或过氧化氢酶的情况下来自单核白细胞和MDSC共培养物的NK细胞洗涤并且与⁵¹Cr标记的K562一起孵育4小时以评估NK细胞的细胞毒性。来自3次独立实验的代表性数据被示为平均值±SEM。

图15(A-F)示出了骨髓增生异常综合征(MDS)MDSC对常规NK细胞的TIGIT依赖性抑制。图15A：将来自MDS患者和健康供体(n＝6)的PBMC(n＝15)静置过夜，染色并且通过流式细胞术确定MDSC出现率。单核白细胞型MDSC(mMDSC)被定义为CD45⁺Lin^-CD11b⁺CD33⁺HLA-DR^-/低CD14⁺并且粒细胞型MDSC(gMDSC)被定义为CD45⁺Lin^-CD11b⁺CD33⁺CD15⁺。图15B：将MDS-PBMC针对CD155染色并且针对mMDSC和单核白细胞门控。示出了15个直方图的代表性直方图。图15C：将来自MDS患者的PBMC(n＝10)静置过夜并且通过流式细胞术评价TIGIT表达。图15D：将来自健康供体(HD，n＝6)或MDS患者(n＝13)的PBMC在IgG对照或抗TIGIT、和抗CD16(1μg/ml)存在下用IL-15(10ng/ml)刺激6小时并且评估NK细胞脱颗粒和IFN-γ产生。图15E：在IL-15(10ng/mL)存在下将来自健康献血者的纯化的NK细胞(n＝6)与自体单核白细胞或从MDS患者的血液富集的同种异体MDSC以2:1比率共培养5天。在用抗CD16刺激6小时之后，通过流式细胞术在常规NK细胞和适应性NK细胞中评价脱颗粒和IFN-γ产生。图15F：在IL-15(10ng/mL)存在下并且在存在或不存在抗TIGIT(10μg/mL)的情况下将来自健康献血者的纯化的NK细胞(n＝6)与从MDS患者的血液富集的同种异体MDSC以2:1比率共培养5天。在染色前6小时，用抗CD16刺激细胞并且通过流式细胞术在常规NK细胞和适应性NK细胞中评价脱颗粒和IFN-γ产生。代表性数据被示为平均值±SD，并且使用司图顿氏t检验((图15A)、(图15C)、(图15D))以及曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)((图15E)和(图15F))对汇集数据进行统计分析。

图16A：体外诱导的MDSC和新鲜分离的单核白细胞的代表性表型。图16B：在IL-15(10ng/ml)存在下将NK细胞培养5天并且示出了常规NK细胞或适应性NK细胞中CD16的表达的代表性直方图。示出了平均荧光强度(MFI)。图16C：在IL-15(10ng/mL)存在下将NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率一起培养5天。在染色前6小时，用抗CD16刺激细胞；通过流式细胞术分析细胞。代表性直方图被示为平均荧光强度(MFI)。图16D：在IL-15(10ng/mL)存在下将来自健康献血者的纯化的NK细胞(n＝6)与自体单核白细胞或从MDS患者的血液富集的同种异体MDSC以2:1比率共培养5天。在通过抗CD16刺激6小时之后，通过流式细胞术在常规NK细胞和适应性NK细胞中评价IFN-γ产生。来自8次实验的代表性数据和累积数据被示为平均值±SEM。使用司图顿氏t检验进行统计分析。

图17(A-B)示出了实施例7中所用的门控策略。图17A：用于健康献血者的适应性NK细胞和常规NK细胞的门控策略。图17B：用于MDS患者的适应性NK细胞和常规NK细胞的门控策略。图中所示的细胞百分比表示总NK细胞中常规NK细胞和适应性NK细胞的出现率。

图18(A-C)示出了在抗TIGIT存在下NK细胞功能不受影响。图18A：在抗TIGIT(10μg/ml)或激动性抗CD158b(10μg/ml)存在下通过⁵¹Cr释放测定(4小时)针对p815分析健康供体多克隆NK(n＝4)细胞的细胞毒性。累积数据被示为平均值±SD并且使用曼-惠特尼检验对汇集数据进行统计分析。图18B：在IL-15和IgG(10μg/ml)或针对TIGIT的阻断抗体(10μg/ml)存在下将NK细胞与单核白细胞或MDSC一起培养5天，或者，通过抗TIGIT和抗DNAM-1(10μg/ml)(n＝6)将细胞共同阻断。汇集数据被示为平均值±SEM，并且使用单因素方差分析进行统计分析。图18C：在IL-15(10ng/ml)存在下将来自健康献血者的纯化的NK细胞(n＝6)与自体单核白细胞或从MDS患者的血液富集的同种异体MDSC以2:1比率共培养5天。在通过抗CD16刺激6小时之后，通过流式细胞术在常规NK细胞和适应性NK细胞中评价TNFα产生。代表性数据被示为平均值±SD并且使用曼-惠特尼检验对汇集数据进行统计分析。

图19示出了用CMV肽池对成熟树突状细胞进行脉冲处理诱导了适应性NK细胞扩增。从来自健康CMV血清阳性供体的外周血液单核细胞中分离NK细胞、未分级的单核白细胞、未成熟的树突状细胞(imDC)、以及成熟树突状细胞(mDC)。然后将NK细胞用10ng/mL的IL-15培养或与所示的自体细胞类型和10ng/mL的IL-15共培养。将所选择的成熟树突状细胞培养物进一步补充以CMV pp65肽池或HIV PTE Gag肽池。在12天到14天之后收获细胞，并且使用FACS确定每一种培养条件下适应性NK细胞(被定义为CD3^-CD56⁺CD57⁺FcεR1γ^-)的出现率(左图)和活跃增殖的适应性NK细胞的百分比(右图)。示出了来自使用5个供体的一次实验的累积数据。

图20示出了当在自体单核白细胞和IL-15存在下培养时，来自CMV血清阳性供体的NK细胞偏向于CD45RA^-CD45RO⁺表型。将来自分型的健康CMV血清阴性供体和CMV血清阳性供体的耗尽CD3/CD19的外周血液单核细胞用10ng/mL的IL-15培养。在7天之后，收获细胞并且通过FACS分析。示出了在培养之前和之后来自一个CMV血清阳性供体和一个CMV血清阴性供体的代表性表型(顶部)。示出了显示在培养前和培养后来自五个CMV血清阴性供体和八个CMV血清阳性供体的CD3^-CD56⁺CD45RA^-CD45RO⁺NK细胞的百分比的累积数据(底部)。数据代表了两次独立实验。使用成对司图顿氏t检验确定组内的统计显著性，并且使用非成对司图顿氏t检验确定组(CMV血清阳性和CMV血清阴性)间的统计显著性。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。

图21(A-C)示出了适应性NK细胞对Treg介导的抑制具有抗性。将来自12个CMV血清阳性供体的CellTrace标记的CD56⁺NK细胞单独培养或与Treg以所示的比率共培养6天。图21A：使用FACS分析常规NK细胞子集(CD56⁺CD57⁺FcεRγ⁺NKG2C^-)和适应性NK细胞子集(CD56⁺CD57⁺FcεRγ^-NKG2C⁺)的增殖。示出了在每一种培养条件下表现出CellTrace染料稀释的NK细胞的百分比。图21B：在用抗CD16激动剂抗体、IL-12以及IL-18刺激之后，通过FACS对培养的NK细胞测量脱颗粒(如通过CD107a表达所测量)和IFN-γ产生。图21C：使用FACS确定培养的NK细胞上PD1和TIM-3的表达。结果来自两次独立实验。p值是由成对司图顿氏t检验产生的。

具体实施方式

本公开提供了一种表现出适应性表型的NK细胞；一种分离的适应性自然杀伤(NK)细胞的群体；一种包括适应性NK细胞的组合物；用于在体外和/或体内制备或产生适应性NK细胞、适应性NK细胞的群体、或包括适应性NK细胞的组合物的方法；以及使用适应性NK细胞、适应性NK细胞的群体、或包括适应性NK细胞的组合物的方法。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞可以用于治疗病毒感染、癌症、和/或肿瘤。

在一些实施方案中，适应性NK细胞的制备包括分离细胞或细胞的群体。在一些实施方案中，所述制备包括细胞的分化和/或扩增。

如本文所用的术语“NK细胞”指的是CD56⁺和CD3^-的细胞。自然杀伤(NK)细胞是在对抗病毒感染和肿瘤的免疫中具有必要作用的产生细胞因子的细胞毒性淋巴细胞。如本文所用的“典型NK细胞”也被称作“常规NK细胞”，指的是SYK⁺、EAT-2⁺、FcεRγ⁺、PLZF⁺的NK细胞。在一些实施方案中，常规的NK细胞是NKG2C^-。在一些实施方案中，常规的NK细胞是CD57^-。在一些实施方案中，适应性NK可以是表现出SYK、EAT-2、FcεRγ、以及PLZF中的一种或多种的表达降低或表达丧失的NK细胞。

与常规的NK细胞相比，适应性NK细胞具有功能上独特的能力。当与常规的NK细胞相比时，这些功能差异容许适应性NK细胞提供额外的抗肿瘤能力或抗病毒能力。适应性NK细胞可以属于与常规NK细胞不同的几个独特子集之一。如下文进一步所述，适应性NK细胞可以例如表达CD57，所述CD57是人类CD8⁺T细胞上的终末分化标志物；相对于由常规NK细胞表达的PLZF的水平，表现出编码转录因子早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)的基因的转录沉默；当由低亲和力Fc受体CD16触发时，表现出增强的功能；表现出编码SYK、EAT-2、以及FcεRγ的基因中的一种或多种的转录沉默；表达NKG2C⁺；表达CD45RO；表现出CD45RA的低表达或无表达；是长寿命的；表现出记忆细胞表型；与常规的NK细胞相比，表现出增强的抗肿瘤活性；和/或与常规的NK细胞相比，表现出增强的抗病毒活性。

在一些实施方案中，所述NK细胞和/或适应性NK细胞可以是CD56^亮NK细胞。从外周血液中分离的CD56^亮NK细胞在IL-2或IL-15刺激下快速增殖，响应于IL-12和IL-18刺激而产生高水平的干扰素(IFN)-γ，表达高水平的抑制性受体NKG2A，并且缺乏低亲和力Fc受体CD16和杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的表达。CD56^亮NK细胞具有有限的细胞毒性潜能，这是因为它们表达非常低水平的穿孔素和颗粒酶。虽然CD56^亮NK细胞占总外周血液NK细胞的一小部分，但是它们在次级淋巴组织中是显著富集的，其中它们被假定为分化成CD56^暗NK细胞。

在其它实施方案中，所述NK细胞和/或适应性NK细胞可以是CD56^暗NK细胞。典型CD56^暗NK细胞代表响应于受病毒感染的细胞、赘生性细胞以及自体激活的免疫细胞而表达非常高水平的穿孔素和颗粒酶并且容易脱颗粒的表型上不同的NK细胞子集。典型CD56^暗NK细胞由于CD16的高表达水平而是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的强介质并且可以容易地经由激活KIR而被刺激。典型CD56^暗NK细胞的脱颗粒是通过识别自身MHC I类分子的驯化性抑制性KIR的表达来增强的。因而，典型CD56^暗NK细胞可以有效地介导激活淋巴细胞的细胞毒性免疫调节和受感染或转化的细胞的早期免疫监视。与CD56^亮NK细胞相比，典型CD56^暗NK细胞响应于IL-12和IL-18而产生更少的IFN-γ。

CMV血清阳性和重新激活

巨细胞病毒(CMV)是一种β-疱疹病毒，它一般在生命早期被获得并且形成持久的、终生的感染。CMV血清阳性率在美国成人当中是约50％，并且感染一般是无症状的，这是因为它们在健康个体中被CD8⁺T细胞和NK细胞很好地控制。CMV血清阳性与健康成人中表达异二聚体激活受体CD94-NKG2C的NK细胞的比例增加以及NKG2C^高CD57⁺NK细胞增加有关(Lopez-Verges等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(36):14725-14732)。尚未暴露于CMV的个体是“未感染过”CMV的。

在原发感染之后，CMV通常不会被根除，但是会在它的宿主中形成终生感染。CMV在多个终末器官中分散并且处于休眠状态，但是随后可以被许多不同的刺激重新激活，包括例如免疫抑制和炎症。

如实施例1和图1中所示，CMV重新激活在用降低强度预处理(RIC)和造血干细胞移植(HCT)(已知会造成30％-40％的复发率的方案)治疗的患有血液恶性肿瘤的患者中与减少的白血病复发和改善的无病存活率有关。实施例1和图2建立了CMV重新激活与体内适应性NK细胞扩增之间的新的联系，特别是在接受RIC的患者中。

适应性NK细胞

如本文所用的“适应性NK细胞”包括单个适应性NK细胞、多于一个适应性NK细胞、和/或分离的包括适应性NK细胞的细胞的群体。

在一些实施方案中，适应性NK细胞是CD57⁺。平均来说，来自成人的40％的CD56^暗NK细胞表达CD57，在个体之间有显著差异，从5％到70％不等。绝大多数的表达穿孔素的NK细胞是CD57⁺。在功能上，CD56^暗CD57⁺NK细胞与CD56^暗CD57^-NK细胞相比响应于IL-2或IL-15增殖不良，并且对IL-12和IL-18的刺激不太有响应(Bjorkstrom等,Blood.2010；116(19):3853-3864)。然而，当经由CD16刺激时，CD56^暗CD57⁺NK细胞产生更多的IFN-γ并且显示出更强效的裂解活性(Lopez-Verges等,Blood.2010；116(19):3865-3874)。如本文所述，CD57可以是响应于经由激活受体触发而表现出稳健的细胞毒性和炎性细胞因子产生的终末分化的典型NK细胞的标志物。

在一些实施方案中，适应性NK细胞是NKG2C⁺。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD45RO⁺、CD45RA^-、和/或TIGIT^低。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是TIGIT^-。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少两种。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是长寿命的。举例来说，所述适应性NK细胞可以是CD57⁺和NKG2C⁺或CD56^暗和TIGIT^低或CD56^暗和NKG2C⁺。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少三种。举例来说，所述适应性NK细胞可以是SYK^-、FcεRγ^-、以及EAT-2^-或CD56^暗、NKG2C⁺、以及TIGIT^低。

在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子的表达降低。在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子的表达降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞不表达PLZF。在一些实施方案中，不表达标志物或蛋白质优选地被定义为具有不可使用FACS检测的标志物或蛋白质的表达水平，并且对于标志物或蛋白质呈阳性或表达标志物或蛋白质被定义为具有可使用FACS检测的标志物或蛋白质的表达水平。

在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，PD-1的表达降低。在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，PD-1的表达降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。在一些实施方案中，PD-1(抑制性受体)的水平降低允许适应性NK细胞抵抗PDL1，所述PDL1由许多肿瘤细胞表达。

在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，TIGIT的表达降低。在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，TIGIT的表达降低了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。

在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，PLZF、PD-1、以及TIGIT的表达降低。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施方案中，所述肿瘤是造血组织和/或淋巴组织的肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体肿瘤。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞表达细胞毒性受体2B4、低亲和力Fc受体CD16、和/或杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞缺乏抑制性受体NKG2A的表达。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞表达高水平的颗粒酶和/或穿孔素并且响应于受病毒感染的细胞、赘生性细胞和/或自体激活免疫细胞而表现出脱颗粒的能力。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞是长寿命的NK细胞和/或是记忆NK细胞。在一些实施方案中，长寿命的NK细胞在感染之后持续至少21天、至少30天、至少60天、至少80天、或至少100天。相比之下，典型NK细胞通常表现出较短的持续时间，通常少于7天至14天。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞与典型NK细胞相比具有增强的抗肿瘤免疫活性。在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，所述适应性NK细胞具有增强的克服MDSC诱导的对免疫应答的抑制的能力。在一些实施方案中，当在MDSC存在下，适应性NK细胞与在MDSC存在下的典型NK相比表现出增强的增殖时，所述适应性NK细胞表现出增强的克服MDSC诱导的抑制的能力。

在一些实施方案中，与典型NK细胞相比，所述适应性NK细胞具有增强的克服调节性T细胞(Treg)诱导的对免疫应答的抑制的能力。在一些实施方案中，当在Treg存在下，适应性NK细胞与在Treg存在下的典型NK相比表现出增强的脱颗粒(例如通过CD107a表达所测量)和/或IFN-γ产生时，所述适应性NK细胞表现出增强的克服Treg诱导的抑制的能力。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞可以被包括在细胞的群体中，包括例如分离的细胞群体和/或NK细胞的群体。在一些实施方案中，当细胞的群体包括至少10％的适应性NK细胞、至少20％的适应性NK细胞、至少30％的适应性NK细胞、至少40％的适应性NK细胞、至少50％的适应性NK细胞、至少60％的适应性NK细胞、至少70％的适应性NK细胞、至少80％的适应性NK细胞、至少90％的适应性NK细胞、或至少95％的适应性NK细胞时，所述细胞群体被认为是针对适应性NK细胞“富集的”。

适应性NK细胞的体外制备

在一些实施方案中，适应性NK细胞的产生和/或制备是在体外进行的。体外制备可以包括细胞分化、扩增、富集、和/或分离。

在一些实施方案中，适应性NK细胞可以从来自受试者的血液样品或从血液样品中分离的细胞群体制备。在一些实施方案中，用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法包括从受试者获得血液样品以及培养所述血液样品的NK细胞的群体。在一些实施方案中，在培养所述NK细胞的群体之前，从所述血液样品中分离所述NK细胞的群体。在一些实施方案中，可以将所述血液样品的NK细胞的群体培养在培养基中；与树突状细胞一起培养，包括例如成熟树突状细胞、CMV肽补充的成熟树突状细胞、或这两者；和/或与单核白细胞一起培养。

在一些实施方案中，适应性NK细胞可以从未感染过巨细胞病毒(CMV)的来源和/或CMV血清阴性来源制备。举例来说，适应性NK细胞可以从自CMV血清阴性供体的血液中分离的细胞制备。

在一些实施方案中，适应性NK细胞可以从CMV血清阳性来源制备。举例来说，适应性NK细胞可以从自CMV血清阳性供体的血液中分离的细胞或从CMV血清阳性供体的血液中分离的细胞群体制备。在一些实施方案中，包括从受试者获得血液样品的用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法还可以包括向所述受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

在一些实施方案中，适应性NK细胞可以从以下各项制备：多潜能干细胞、胚胎干细胞、从脐带血中分离的细胞、诱导多潜能干细胞(iPSC)、血源性内皮、造血干细胞或祖细胞、iPSC衍生的造血干细胞、经由转分化衍生的造血干细胞、典型NK细胞、和/或NK细胞祖细胞。

在一些实施方案中，用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法包括在培养基中培养细胞或细胞的群体，包括例如NK细胞的群体。在一些实施方案中，适应性NK细胞源自于在培养基中培养的细胞。

在一些实施方案中，所述培养基包括一种或多种细胞因子。所述培养基可以包括例如IL-15、IL-21、IL-18、IL-12、IL-2、IFN-α、或IFN-β、或其组合。在一些实施方案中，所述细胞因子可以是膜结合的，如例如Denman等,PLOS One.2012 7(1):e.30264中所述。在一些实施方案中，所述培养基可以包括Notch配体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包括雷帕霉素。在一些实施方案中，所述细胞培养基不含饲养细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养基包括CD16信号转导的激活剂，包括例如抗CD16抗体、Fc受体的配体、CD16的配体、双特异性杀伤细胞接合剂(BiKE)、和/或三特异性杀伤细胞接合剂(TriKE)。

在一些实施方案中，所述培养基可以包括TIGIT抑制剂、TIGIT阻断剂、TIGIT拮抗剂、TIGIT配体阻断剂、和/或TIGIT配体拮抗剂。在一些实施方案中，TIGIT抑制剂包括针对TIGIT的抗体。在一些实施方案中，TIGIT配体可以包括例如CD155或CD112。在一些实施方案中，所述阻断剂或拮抗剂可以包括例如阻断抗体。在一些实施方案中，所述培养基可以包括活性氧簇(ROS)产生抑制剂，包括例如过氧化氢酶。如实施例7中所示，阻断TIGIT或抑制ROS可以增加激活NK细胞的细胞毒性的信号转导级联。

在一些实施方案中，用于制备适应性NK细胞的方法包括使所述血液样品的NK细胞与TIGIT抑制剂、PLZF抑制剂、和/或PD-1抑制剂接触。在一些实施方案中，所述TIGIT抑制剂包括针对TIGIT的抗体。

在一些实施方案中，用于制备适应性NK细胞的方法包括抑制所述血液样品的NK细胞或适应性NK细胞中PLZF、TIGIT、和/或PD-1的表达。在一些实施方案中，可以通过编码PLZF、TIGIT、和/或PD-1的核酸的遗传基因敲低来抑制所述表达。在一些实施方案中，可以通过使用siRNA来抑制所述表达。

在一些实施方案中，包括例如在用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法包括从受试者获得血液样品以及培养所述血液样品的NK细胞的群体的情况下，所述适应性NK细胞与培养之前NK细胞的群体相比可以具有改变的特征或功能。举例来说，与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞可以具有增强的抗肿瘤免疫活性。所述增强的抗肿瘤免疫活性可以包括例如细胞毒性增加、细胞因子产生增加、以及对调节性T(Treg)细胞的抗性增加中的一种或多种。在一些实施方案中，与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞可以具有以下各项中的一种或多种：细胞毒性增加；细胞因子产生增加；体内和/或体外持续时间延长；以及对调节性T细胞的抗性增加。在一些实施方案中，与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞可以具有降低的PLZF、TIGIT、和/或PD-1的表达。

在一些实施方案中，与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞可以具有增强的克服MDSC诱导的对免疫应答的抑制的能力。在一些实施方案中，当在MDSC存在下，适应性NK细胞与在MDSC存在下的培养之前NK细胞的群体的NK细胞相比表现出增强的增殖时，所述适应性NK细胞表现出增强的克服MDSC诱导的抑制的能力。

在一些实施方案中，与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞具有增强的克服调节性T细胞(Treg)诱导的对免疫应答的抑制的能力。在一些实施方案中，当在Treg存在下，适应性NK细胞与在Treg存在下的培养之前NK细胞的群体的NK细胞相比表现出增强的脱颗粒(例如通过CD107a表达所测量)和/或IFN-γ产生时，所述适应性NK细胞表现出增强的克服Treg诱导的抑制的能力。

在一些实施方案中，包括例如在用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法包括从受试者获得血液样品以及培养所述血液样品的NK细胞的群体的情况下，所述方法可以包括细胞扩增。

在一些实施方案中，用于制备或产生适应性NK细胞的方法包括分离所述适应性NK细胞。在一些实施方案中，所述NK细胞可以利用它对一种或多种表面标志物的表达或缺乏一种或多种表面标志物的表达来分离。有用的表面标志物可以包括例如CD56、CD3、CD57、NKG2C、TIGIT、CD45RO、以及CD45RA。

在一些实施方案中，用于制备或产生适应性NK细胞的方法产生针对适应性NK细胞富集的NK细胞群体。在一些实施方案中，当NK细胞的群体包括至少10％的适应性NK细胞、至少20％的适应性NK细胞、至少30％的适应性NK细胞、至少40％的适应性NK细胞、至少50％的适应性NK细胞、至少60％的适应性NK细胞、至少70％的适应性NK细胞、至少80％的适应性NK细胞、至少90％的适应性NK细胞、或至少95％的适应性NK细胞时，所述NK细胞的群体被认为是针对适应性NK细胞“富集的”。在一些实施方案中，当在进行用于从NK细胞的群体制备或产生适应性NK细胞的方法之后所述NK细胞的群体包括比在进行所述方法之前发现的NK细胞的比例更大比例的适应性NK细胞时，所述方法产生针对适应性NK细胞“富集”的群体。在一些实施方案中，当在进行包括从受试者获得血液样品以及培养所述血液样品的NK细胞的群体的制备和/或产生适应性NK细胞的方法之后所述NK细胞的群体包括比在所述血液样品的NK细胞的群体中所发现的NK细胞的比例更大比例的适应性NK细胞时，所述方法产生针对适应性NK细胞“富集”的群体。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于与饲养细胞共培养的细胞。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于在不含饲养细胞的细胞培养基中培养的细胞。在一些实施方案中，所述饲养细胞是贴壁细胞。在一些实施方案中，所述饲养细胞是受过辐照的细胞。在一些实施方案中，所述饲养细胞是基质细胞。在一些实施方案中，所述基质细胞可以是OP9细胞。在一些实施方案中，所述饲养细胞可以表达刺激和/或分化适应性NK细胞的配体，包括例如Notch配体，包括例如δ样1(DL-1)；膜结合细胞因子；人类白细胞抗原(HLA)I类分子(例如典型或非典型HLA，如HLA-E)；或其组合。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于与单核白细胞共培养的细胞。在一些实施方案中，用于制备和/或产生适应性NK细胞的方法包括将细胞或细胞的群体(包括例如NK细胞的群体)与单核白细胞一起培养。在一些实施方案中，单核白细胞包括CD14⁺单核白细胞、巨噬细胞；树突状细胞，包括例如成熟树突状细胞；抗原提呈细胞；和/或另外的骨髓细胞。在一些实施方案中，所述单核白细胞可以提呈抗原，包括例如源自于CMV的抗原。在一些实施方案中，所述抗原优选地是CMV肽。在一些实施方案中，所述培养基可以包括刺激抗原提呈细胞和/或单核白细胞的细胞因子，包括例如炎性细胞因子或GM-CSF、或这两者。在一些实施方案中，所述培养基可以包括诱导单核白细胞成熟的细胞因子，包括例如IL-15。在一些实施方案中，所述单核白细胞可以是自体单核白细胞。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于在培养基中培养的细胞，所述培养基包含一种或多种激活受体的激动剂，所述受体包括但不限于CD16、NKG2C、DNAM-1、以及2B4。在一些实施方案中，激动剂可以是单一单克隆抗体或刺激一种或多种激活受体的单克隆抗体或多克隆抗体的组合。在一些实施方案中，激动剂可以是所述受体的天然配体。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于用激活受体的刺激因子培养的细胞，所述刺激因子包括例如HLA-E，即NKG2C受体的天然配体。在一些实施方案中，可以根据WO 2014/037422中所述的用于获得NKG2C⁺NK细胞的培养方法来培养所述适应性NK细胞。

如实施例2中所示，在OP9δ样1(DL1)基质细胞系上用高剂量的IL-15(10ng/mL)和IL-21(50ng/mL)体外培养脐带血来源的NK细胞促进了表达CD57的终末分化细胞的分化和扩增。此外，这些培养条件支持脐带血来源的CD56⁺SYK^-PLZF^-适应性NK细胞的扩增。因此，如本文所述的培养系统可以用于驱动NK细胞的高功能子集的离体成熟和扩增以用于过继转移到患有癌症和/或病毒感染的受试者体内。如实施例1中所示，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增与在降低强度HCT之后白血病复发减少有关，这支持了关于终末NK细胞成熟和适应性NK细胞扩增与体内抗肿瘤作用有关的想法。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞源自于因它的TIGIT下调或不能表达TIGIT而被选择的细胞。在一些实施方案中，包括适应性NK细胞的细胞群体可以进一步针对TIGIT^低和/或TIGIT^-细胞富集。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞可以源自于与树突状细胞一起培养的细胞。在一些实施方案中，所述树突状细胞可以是成熟树突状细胞。在一些实施方案中，可以用CMV肽培养所述树突状细胞。在一些实施方案中，CMV肽可以包括多种CMV肽和/或CMV肽池。举例来说，如实施例8中所示，适应性NK细胞扩增可以通过将CD3^-CD56⁺NK细胞和CD14⁺单核白细胞与CMV肽补充的成熟树突状细胞一起孵育来诱导。

在一些实施方案中，所述适应性NK细胞可以源自于与单核白细胞一起培养的细胞。在一些实施方案中，所述单核白细胞可以是自体单核白细胞。在一些实施方案中，所述适应性NK细胞可以源自于在IL-15存在下与单核白细胞一起培养的细胞。举例来说，如实施例9中所示，当在自体单核白细胞和IL-15存在下培养时，来自CMV血清阳性供体的NK细胞偏向于CD45RA-CD45RO+表型。

适应性NK细胞的体内制备

在一些实施方案中，适应性NK细胞的制备是在体内进行的。在体内制备的适应性NK细胞可以用于制备它的相同受试者或用于不同的受试者，包括适应性NK细胞制品的同种异体应用。在一些实施方案中，在体内制备的适应性NK细胞可以从受试者体内取出并且随后向所述受试者重新施用。

在一些实施方案中，所述制备可以包括向受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗，包括例如减毒CMV疫苗、重组CMV疫苗、和/或灭活CMV。在一些实施方案中，在施用所述疫苗和/或灭活CMV之前，所述受试者是CMV血清阳性的。

在一些实施方案中，所述制备包括向受试者施用细胞因子，包括例如IL-15、IL-21、IL-18、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β、以及GM-CSF中的一种或多种。在一些实施方案中，所述细胞因子可以是膜结合的。在一些实施方案中，所述制备包括向受试者施用Notch配体和/或诱导Notch配体在受试者中表达。在一些实施方案中，所述制备还包括施用雷帕霉素。

如实施例1中所示，与清髓性(MA)预处理接受者相比，CMV血清阳性降低强度预处理(RIC)接受者在病毒重新激活时具有适度更高的绝对单核白细胞计数(AMC)。此外，在病毒诊断时的AMC与后续的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增有关。其中单核白细胞可能促进适应性NK细胞分化和扩增的一种方式是经由产生IL-12。由单核白细胞衍生的树突状细胞产生的其它炎性细胞因子，如IL-18和I型IFN(IFN-α和IFN-β)可以增强NK细胞功能并且可以促进适应性NK细胞的分化或成熟。在一些实施方案中，单核白细胞包括CD14⁺单核白细胞、巨噬细胞；树突状细胞，包括例如成熟树突状细胞；抗原提呈细胞；和/或另外的骨髓细胞。

尽管CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的扩增与移植后的CMV感染或重新激活有关，但是所述细胞似乎对CMV抗原没有严格的特异性。实际上，体外实验证实，与其它NK细胞子集相比，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞响应于K562骨髓性白血病细胞而表现出显著升高的TNF和IFN-γ产生。类似于受病毒感染的细胞，癌细胞可以下调典型的I类HLA分子，而保留HLA-E的表达。从主要抑制性NKG2A到激活NKG2C的HLA-E识别的受体利用的转换可能是适应性NK细胞介导移植物抗白血病作用的机制。

在接受造血细胞移植(HCT)的白血病患者中，CMV重新激活与NKG2C^高CD57⁺NK细胞的扩增有关。这些细胞以高频率在移植后持续至少1年，是针对驯化性抑制性KIR的表达富集的，并且以高频率响应于K562骨髓性白血病细胞的刺激而产生干扰素(IFN)-γ(Foley等,Blood.2011；118(10):2784-2792；Foley等,J Immunol.2012；189(10):5082-5088)。

施用

在体外或体内制备的适应性NK细胞可以单独或在药物组合物中向受试者施用，所述药物组合物包括另外的活性剂和/或药学上可接受的载体。所述适应性NK细胞可以有效产生所期望的作用的量向患者施用，所述患者优选地是哺乳动物，并且更优选地是人类。所述适应性NK细胞可以经由多种途径施用，包括例如静脉内、肿瘤内、动脉内、透皮、经由导管或支架局部递送、经由用于肿瘤内注射的针或其它装置、皮下等。所述适应性NK细胞可以施用一次或多次。具有本领域普通技术的医师可以确定并且开立适应性NK细胞和任选的所需的药物组合物的有效量和剂量。

在一些实施方案中，可以向受试者施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物包括适应性NK细胞或包括分离的包括适应性NK细胞的NK细胞群体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物可以包括活性氧簇(ROS)产生抑制剂，包括例如过氧化氢酶；CD155抑制剂；和/或TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，ROS产生抑制剂和/或CD155抑制剂以足以降低体内和/或体外MDSC上CD155的表达的量存在。

治疗方法

在一个方面，适应性NK细胞可以用于在受试者中治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒。在另一个方面，可以在患有癌症、癌前病况、或病毒的受试者体内制备适应性NK细胞以治疗所述癌症、癌前病况、或病毒。

在一些实施方案中，髓源性抑制细胞(MDSC)可以存在于受试者体内，包括例如存在于受试者的血液中。在一些实施方案中，相对于没有癌症、癌前病况、或病毒的受试者的MDSC水平，MDSC的水平可能升高。在一些实施方案中，所述MDSC表达CD11b、CD33、以及低的HLA-DR或不表达HLA-DR。在一些实施方案中，所述MDSC是CD14+(单核白细胞型MDSC[mMDSC])或CD15+CD66b+(粒细胞型MDSC[gMDSC])(参见Marvel等,The Journal ofClinical Investigation.2015；125(9):3356-64)。

所述癌症可以包括例如骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌、造血系统癌症、和/或淋巴癌等。造血系统癌症和/或淋巴癌可以包括例如急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏病、和/或多发性骨髓瘤。所述癌症可以是转移性癌症。

所述病毒可以包括例如疱疹病毒，包括例如CMV、水痘带状疱疹病毒(VZV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)或卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)相关疱疹病毒(KSHV)；或慢病毒，包括例如人类免疫缺陷病毒(HIV)。

在另一个方面，适应性NK细胞可以向受试者施用或在受试者体内制备以抑制受试者的肿瘤的生长。在一些实施方案中，所述肿瘤可以包括实体肿瘤。

适应性NK细胞可以在其它治疗之前、期间、和/或之后向受试者施用或在受试者体内制备。这样的联合治疗可以涉及在使用治疗剂、抗癌剂和/或抗病毒剂之前、期间、和/或之后施用或制备适应性NK细胞。其它治疗剂、抗癌剂、以及抗病毒剂可以包括例如细胞因子；趋化因子；治疗性抗体，包括例如高亲和力抗CMV IgG抗体；NK细胞受体配体，包括例如BiKE或TRiKE；佐剂；抗氧化剂；化学治疗剂；和/或放射。所述施用或制备在时间上可以与其它抗癌剂和/或抗病毒剂的施用相隔数小时、数天、或甚至数周。除此之外或作为另外一种选择，所述施用或制备可以与其它生物活性剂或用药程式(诸如但不限于抗赘生物剂)和非药物治疗(诸如但不限于手术)组合。

在一些实施方案中，本公开提供了一种用于增强抗肿瘤免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括使用适应性NK细胞或包括适应性NK细胞的分离的细胞群体。在一些实施方案中，所述方法还可以包括改变包括例如TIGIT或PD-1的抑制性受体的控制。

在另一个方面，本公开提供了一种调节常规NK细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括阻断MDSC的抑制能力以挽救或逆转常规NK细胞的功能低反应性。在一些实施方案中，所述调节方法包括抑制TIGIT表达。在一些实施方案中，所述方法可以包括施用组合物，所述组合物包括活性氧簇(ROS)产生抑制剂，包括例如过氧化氢酶；CD155抑制剂；和/或TIGIT抑制剂。

在一些实施方案中，所述ROS产生抑制剂和/或所述CD155抑制剂以足以降低MDSC上CD155的表达的量存在。

示例性实施方案

实施方案1：一种组合物，所述组合物包含适应性NK细胞。

实施方案2：实施方案1的组合物，其中所述适应性NK细胞是CD3^-和CD56⁺。

实施方案3：实施方案1或实施方案2中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是CD57⁺。

实施方案4：实施方案1至实施方案3中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是NKG2C⁺。

实施方案5：实施方案1至实施方案4中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是SYK^-。

实施方案6：实施方案1至实施方案5中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是FcεRγ^-。

实施方案7：实施方案1至实施方案6中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是EAT-2^-。

实施方案8：实施方案1至实施方案7中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是CD56^暗。

实施方案9：实施方案1至实施方案8中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是TIGIT^低。

实施方案10：实施方案1至实施方案9中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是CD45RO⁺。

实施方案11：实施方案1至实施方案10中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是CD45RA^-。

实施方案12：实施方案1至实施方案11中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞是长寿命的。

实施方案13：实施方案1至实施方案12中的任一个的组合物，其中与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，PD-1的表达或早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子的表达降低。

实施方案14：实施方案13的组合物，其中PLZF表达降低了至少90％。

实施方案15：实施方案1至实施方案14中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞不表达转录因子早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)。

实施方案16：实施方案1至实施方案15中的任一个的组合物，其中所述适应性NK细胞显示出抗肿瘤活性。

实施方案17：实施方案16的组合物，其中所述肿瘤包括造血组织和/或淋巴组织的肿瘤。

实施方案18：实施方案16的组合物，其中所述肿瘤是实体肿瘤。

实施方案19：实施方案1至实施方案18中的任一个的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。

实施方案20：一种制备实施方案1至实施方案18中的任一个的适应性NK细胞的方法。

实施方案21：实施方案20的方法，其中在体外制备所述适应性NK细胞。

实施方案22：实施方案20或实施方案21中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于来自未感染过巨细胞病毒(CMV)的来源的细胞。

实施方案23：实施方案20至实施方案22中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于从血液中分离的细胞。

实施方案24：实施方案20至实施方案23中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于多潜能干细胞。

实施方案25：实施方案24的方法，其中所述多潜能干细胞是诱导多潜能干细胞。

实施方案26：实施方案20至实施方案25中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于胚胎干细胞。

实施方案27：实施方案20至实施方案26中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于从脐带血中分离的细胞。

实施方案28：实施方案20至实施方案27中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在培养基中培养的细胞，所述培养基包含IL-15、IL-21、IL-18、IL-12、IL-2、IFN-α、或IFN-β中的至少一种。

实施方案29：实施方案20至实施方案28中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在包含雷帕霉素的培养基中培养的细胞。

实施方案30：实施方案20至实施方案29中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在包含Notch配体的培养基中培养的细胞。

实施方案31：实施方案20至实施方案30中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在包含NKG2C受体激动剂的培养基中培养的细胞。

实施方案32：实施方案20至实施方案31中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于与抗原提呈细胞共培养的细胞。

实施方案33：实施方案32的方法，其中所述抗原提呈细胞包括树突状细胞。

实施方案34：实施方案20至实施方案33中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在包含CMV肽的培养基中培养的细胞或与抗原提呈细胞共培养的细胞，其中所述抗原提呈细胞是在含有CMV肽的培养基中培养的。

实施方案35：实施方案20的方法，其中在体内制备所述适应性NK细胞。

实施方案36：实施方案35的方法，其中所述方法包括向受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

实施方案37：实施方案35或实施方案36中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用灭活的巨细胞病毒(CMV)。

实施方案38：实施方案35至实施方案37中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用细胞因子。

实施方案39：实施方案38的方法，其中所述细胞因子包括IL-15、IL-21、IL-12、IL-18、以及GM-CSF中的至少一种。

实施方案40：实施方案35至实施方案39中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用Notch配体。

实施方案41：实施方案35至实施方案40中的任一个的方法，其中所述方法包括诱导Notch配体在受试者体内表达。

实施方案42：实施方案35至实施方案41中的任一个的方法，其中所述受试者是CMV血清阳性的。

实施方案43：一种用于在受试者中治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用实施方案1至实施方案18中的任一个的适应性NK细胞。

实施方案44：实施方案43的方法，其中所述癌症包括骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌、造血系统癌症、或淋巴癌。

实施方案45：实施方案43或实施方案44中的任一个的方法，其中所述癌症是转移性癌症。

实施方案46：一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含实施方案1至实施方案18中的任一个的适应性NK细胞的组合物。

实施方案47：实施方案46的方法，其中所述肿瘤包括实体肿瘤。

实施方案48：实施方案43的方法，其中所述病毒包括慢病毒或疱疹病毒。

实施方案49：一种用于在受试者中治疗或预防癌症或癌前病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方案35至实施方案42中的任一个的体内制品。

实施方案50：实施方案49的方法，其中所述癌症包括骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脊柱癌、胃癌、子宫癌、造血系统癌症、或淋巴癌。

实施方案51：实施方案49或实施方案50中的任一个的方法，其中所述癌症是转移性癌症。

实施方案52：一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括实施方案35至实施方案42的体内制备。

实施方案53：实施方案52的方法，其中所述肿瘤包括实体肿瘤。

实施方案54：实施方案43至实施方案53中的任一个的方法，所述方法还包括施用包含治疗剂的组合物。

实施方案55：实施方案54的方法，其中所述治疗剂包括细胞因子、趋化因子、治疗性抗体、佐剂、抗氧化剂、或化学治疗剂中的至少一种。

实施方案56：实施方案43至实施方案55中的任一个的方法，其中所述受试者包含髓源性抑制细胞(MDSC)。

实施方案57：实施方案43至实施方案56中的任一个的方法，其中所述受试者已经接受造血细胞移植。

实施方案58：一种用于在受试者中治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒的方法，所述方法包括在所述受试者体内制备适应性NK细胞。

实施方案59：实施方案58的方法，其中所述方法包括向受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

实施方案60：实施方案58或实施方案59中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用灭活的巨细胞病毒(CMV)。

实施方案61：实施方案58至实施方案60中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用细胞因子。

实施方案62：实施方案61的方法，其中所述细胞因子包括IL-15、IL-21、IL-12、IL-18、以及GM-CSF中的至少一种。

实施方案63：实施方案58至实施方案62中的任一个的方法，其中所述方法包括向受试者施用Notch配体。

实施方案64：实施方案58至实施方案63中的任一个的方法，其中所述方法包括诱导Notch配体在受试者体内表达。

实施方案65：实施方案58至实施方案64中的任一个的方法，其中所述受试者是CMV血清阳性的。

实施方案66：实施方案58至实施方案65中的任一个的方法，其中所述受试者已经接受造血细胞移植。

实施方案67：实施方案58至实施方案66中的任一个的方法，其中所述受试者已经被诊断为患有白血病。

实施方案68：实施方案58至实施方案67中的任一个的方法，其中所述受试者包含髓源性抑制细胞(MDSC)。

实施方案69：一种方法，所述方法包括：

(a)从受试者获得血液样品；以及

(b)在包含IL-15、IL-21、以及Notch配体中的一种或多种的培养基中培养所述血液样品的NK细胞的群体以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

实施方案70：实施方案69的方法，其中所述步骤(b)的培养基还包含雷帕霉素和CD16信号转导的激活剂中的至少一种。

实施方案71：一种方法，所述方法包括

(a)从受试者获得血液样品；以及

(b)将所述血液样品的NK细胞的群体与CMV肽补充的成熟树突状细胞一起培养以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

实施方案72：一种方法，所述方法包括

(a)从受试者获得血液样品，其中所述受试者是CMV血清阳性的；以及

(b)将所述血液样品的NK细胞的群体与自体单核白细胞和IL-15一起培养以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

实施方案73：实施方案69至实施方案72中的任一个的方法，其中步骤(b)还包括使所述血液样品的NK细胞与TIGIT抑制剂接触。

实施方案74：实施方案73的方法，其中所述TIGIT抑制剂包括针对TIGIT的抗体。

实施方案75：实施方案69至实施方案74中的任一个的方法，其中步骤(b)还包括使所述血液样品的NK细胞与PLZF、TIGIT、或PD-1中的至少一种的抑制剂接触。

实施方案76：实施方案69至实施方案75中的任一个的方法，所述方法还包括所述血液样品的NK细胞或所述适应性NK细胞或这两者中PLZF、TIGIT、或PD-1中的至少一种的遗传基因敲低。

实施方案77：实施方案69至实施方案76中的任一个的方法，其中所述适应性NK细胞是CD57⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少一种。

实施方案78：实施方案69至实施方案77中的任一个的方法，其中与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出降低的PLZF表达。

实施方案79：实施方案69至实施方案78中的任一个的方法，其中与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出增强的抗肿瘤免疫活性。

实施方案80：实施方案69至实施方案79中的任一个的方法，其中与培养之前NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出细胞毒性增加、细胞因子产生增加、持续时间延长、以及对调节性T细胞的抗性增加中的一种或多种。

实施方案81：实施方案69至实施方案80中的任一个的方法，所述方法还包括向所述受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

实施方案82：实施方案69至实施方案81中的任一个的方法，其中培养所述NK细胞的群体包括细胞扩增或细胞表型偏移或这两者。

实施方案83：实施方案69至实施方案82中的任一个的方法，所述方法还包括

(c)分离所述适应性NK细胞。

实施方案84：一种组合物，所述组合物包含通过实施方案69至实施方案83中的任一个的方法所获得的适应性NK细胞。

实施方案85：一种组合物，所述组合物包含NK细胞的群体，其中所述NK细胞的群体是针对通过实施方案69至实施方案83中的任一个的方法所获得的适应性NK细胞富集的。

实施方案86：一种分离的NK细胞群体，其中所述细胞是CD56^暗、以及NKG2C⁺、CD57⁺、和TIGIT^低中的一种或多种。

实施方案87：实施方案86的分离的NK细胞群体，其中与典型NK细胞相比，所述细胞表现出PLZF和PD-1中的至少一种的表达降低。

实施方案88：一种分离的NK细胞群体，其中所述分离的群体是针对CD56^暗和NKG2C⁺的NK细胞富集的。

实施方案89：实施方案88的分离的NK细胞群体，其中所述分离的群体是针对与典型NK细胞相比表现出PLZF、TIGIT、以及PD-1中的至少一种的表达降低的NK细胞富集的。

实施方案90：实施方案86至实施方案89中的任一个的分离的NK细胞群体，其中与典型NK细胞相比，所述NK细胞群体表现出增强的抗肿瘤免疫活性。

实施方案91：实施方案86至实施方案90中的任一个的分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞群体可以克服髓源性抑制细胞(MDSC)诱导的对免疫应答的抑制。

实施方案92：实施方案86至实施方案91中的任一个的分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞群体可以克服Treg诱导的对免疫应答的抑制。

实施方案93：一种组合物，所述组合物包含实施方案86至实施方案92中的任一个的分离的NK细胞群体。

实施方案94：实施方案93的组合物，所述组合物还包含CD155抑制剂、TIGIT抑制剂、以及活性氧簇(ROS)产生抑制剂中的至少一种。

实施方案95：实施方案94的组合物，其中所述ROS产生抑制剂包括过氧化氢酶。

实施方案96：实施方案94或实施方案95中的任一个的组合物，其中所述ROS产生抑制剂或所述CD155抑制剂以足以降低髓源性抑制细胞(MDSC)上CD155的表达的量存在。

通过以下实施例说明本发明。应当了解的是，具体的实例、材料、量、以及程序应当根据本文所述的本发明的范围和精神宽泛地解释。

实施例

实施例1

CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增与降低强度HCT之后白血病复发减少有关

引言

自然杀伤(NK)细胞是在造血细胞移植(HCT)之后早期重建的主要淋巴细胞群体并且具有影响HCT后结果的潜能。然而，NK细胞的移植物抗白血病(GvL)活性在HCT之后第一年期间受到延迟的NK细胞功能成熟的限制。重建的供体NK细胞的未成熟表型与离体响应于肿瘤细胞系和原发性急性骨髓性白血病(AML)胚细胞的NK细胞介导的细胞毒性和干扰素(IFN)-γ产生的显著受损有关。总体来说，在HCT之后早期重建的供体NK细胞的表型和功能的不成熟限制了它们的临床益处。

表达高水平的激活受体NKG2C的NK细胞在CMV重新激活之后在HCT接受者体内稳健地扩增，优先地获得成熟标志物CD57并且在HCT后持续至少1年。在许多方面，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞似乎代表了参与清除鼠类CMV(MCMV)感染的Ly49H⁺记忆NK细胞的人类类似物。因此，CMV重新激活在HCT接受者中具有强效的作用并且驱动具有提高的效应功能的NK细胞的成熟。CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞在本文被称为适应性的。

几项最近的研究已经报道了CMV重新激活与HCT之后复发风险降低之间的关联性，但是该观测结果的具体机制尚未被描述。具有增强的功能和长期的持续时间的CMV诱导的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞可以在移植接受者中促进癌症控制。本研究试图限定影响CMV重新激活防止复发的保护作用的相关移植相关变量以及确定CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞是否与HCT后的临床结果直接相关。

患者和方法

移植程序

清髓性(MA)预处理被用于患有恶性血液疾病的366名患者并且由环磷酰胺(cyclophosphamide)(60mg/kg×2)和全身辐照(13.2Gy、165cGy，每天两次×4天)组成。对于一些，该方案还包括氟达拉滨(fludarabine)(第-8天到第-6天，25毫克/平方米/天)和吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)(每12小时1g，从第-3天到第+30天)。所有患者还接受环孢素A(cyclosporine A)，从第-3天开始并且在HCT后持续180天。降低强度预处理(RIC)被用于308名患者中并且由环磷酰胺(50mg/kg)和氟达拉滨(200mg/m²)以及全身辐照(2Gy)组成。在预处理后，输注来自骨髓、外周血液或脐带血(单份或双份)的干细胞。表I描述了由接受者CMV状态(呈血清阴性、在没有重新激活的情况下呈血清阳性以及在重新激活的情况下呈血清阳性)分层的HCT患者人口统计学。

表I：通过CMV血清状态和重新激活的人口统计学

*治疗间比较的p值。通过一般威氏检验(Wilcoxon test)分析连续变量。通过卡方分析分类变量。

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CMV筛查和治疗

在预处理之前，通过血清学，使用酶联免疫吸附测定来评估所有接受者的CMV暴露：CMV IgG抗体水平大于(>)每毫升10.0个ELISA单位(EU/mL)被认为是血清阳性的。在移植之后，所有接受者均每周通过pp65抗原血症(在2006年之前)或定量实时聚合酶链反应(PCR)(在2006年之后)针对CMV重新激活接受筛查直到移植后第+100天为止。CMV预防包括高剂量的阿昔洛韦(acyclovir)(500mg/m²[10mg/kg-12mg/kg]，静脉内，每8小时一次或800mg[18mg/kg儿科]，口服，每天5次)直到第100天为止。CMV重新激活被定义为CMV抗原血症(≥2个pp65阳性细胞/50,000个)、DNA血症(≥500个拷贝，通过定量实时PCR)或来自血液、体液或组织的CMV的培养物，并且用更昔洛韦(ganciclovir)或膦甲酸(foscarnet)治疗。

数据收集

明尼苏达大学血液和骨髓移植计划(University of Minnesota Blood andMarrow Transplant program)前瞻性地收集了关于患者特征和结果的所有数据。明尼苏达大学(University of Minnesota)机构审查委员会批准了所有的方案，并且所有患者(和/或他们的法定监护人)根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)提供了知情同意书。

在HCT接受者中重建的NK细胞的表型分析

通过密度梯度离心从外周血液样品中分离来自HCT接受者的外周血液单核细胞(PBMC)并且使用LSR II(加利福尼亚州圣荷西的碧迪生物科技公司(BD Biosciences,SanJose,CA))，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析。在病毒诊断时、在抗病毒治疗后2周、4周、和8周时以及在移植后6个月和1年时采集来自重新激活CMV的接受者的PBMC。对于呈CMV血清阴性或在没有病毒重新激活的情况下呈CMV血清阳性的接受者，在移植后第100天、6个月以及1年时采集PBMC。使用以下荧光缀合的抗体进行表型分析：能量耦合染料(ECD)缀合的抗CD3(加利福尼亚州布雷亚的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)；IM2705U)、PECy7缀合的抗CD56(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司(BioLegend,SanDiego,CA)；318318)、Pacific Blue缀合的抗CD57(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；322316)以及PE缀合的NKG2C(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems,Minneapolis,MN)；FAB138P-025)。为了在RIC接受者与MA接受者之间对适应性NK细胞的百分比和绝对计数进行统计比较，使用利用GraphPad计算的非成对双侧t检验。误差棒表示SEM。使用GraphPad计算28个CMV血清阳性接受者的绝对单核白细胞和淋巴细胞计数与适应性NK细胞扩增之间的相关性的R²值和相关的p值。

HCT群组中临床关联性的统计分析

使用卡普兰-迈耶曲线估计在HCT后1年内无病存活率(DFS)的概率(Kaplan等,J.Am.Stat.Assoc.1958；53:457-481)，并且使用对数秩检验进行比较。基于分层的Cox模型计算调整后的存活率曲线(Chang等,J.Chronic Dis.1982；35:669-674)。使用Cox回归检查因素对DFS的独立影响，并且使用鞅残差(Martingale residual)检查比例风险。将非复发死亡率(NRM)视作竞争性风险来评估累积复发发生率。使用Fine和Gray比例风险模型(Fine等,J.Am.Stat.Assoc.1999；94:496-509)来确定CMV重新激活对复发的独立影响并且计算调整后的复发曲线。所关注的主要协变量是被视作时间相关协变量的HCT后的CMV重新激活、以及预处理方案强度。潜在的混杂因素包括供体类型、诊断、移植年份(<2008年或≥2008年)、移植物抗宿主病(GvHD)预防、性别、疾病风险以及先前自体移植。HCT时的疾病风险基于ASBMT RFI 2006风险评分方案(可在万维网上在asbmt.org上获得)被分为标准风险或高风险。方差在所比较的组之间是相似的。使用递归分区确定与复发相关的适应性CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的百分比和绝对数量的最佳分割点。使用SAS 9.3版(北卡罗来纳州卡雷的SAS软件研究所公司(SAS Institute,Cary,NC))进行所有临床分析。

NK细胞功能测定

从纪念血库(Memorial Blood Bank)(明尼苏达州的明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))获得从5个健康的CMV血清阳性供体采集的白细胞层。将外周血液单核细胞(PBMC)使用Ficoll-Paque(英国白金汉郡小查尔方特的通用电气医疗公司(GE Healthcare,LittleChalfont,Buckinghamshire,United Kingdom))通过密度梯度离心分离并且在补充有10％胎牛血清(Gibco，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司的生命科技公司(LifeTechnologies,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA))的RPMI培养基中与K562细胞以2:1(效应细胞:靶细胞)比率一起培养5小时。将GolgiStop和GolgiPlug蛋白质转运抑制剂(加利福尼亚州圣荷西的碧迪生物科技公司)添加到测定中，持续1小时。使用以下抗体对NK细胞子集进行功能分析：BV785缀合的抗CD3(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；318318)、PECy7缀合的抗CD56(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；359620)、PE-CF594缀合的抗CD57(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；359620)、PE缀合的NKG2C(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司；FAB138P-025)、PerCP-Cy5.5缀合的抗CD107a(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；328616)、以及BV605缀合的IFN-γ(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司；502536)。K562细胞系购自ATCC(弗吉尼亚州的马纳萨斯(Manassas,Virginia))并且每月筛查支原体污染。将实验进行独立的2次。使用GraphPad中的双侧成对t检验来确定显著性。误差棒表示SEM。

结果

在重新激活CMV的RIC接受者中HCT后复发风险更低。

在2001年至2013年在明尼苏达大学接受治疗的患有急性骨髓性白血病(AML)(n＝313)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(n＝187)、骨髓增生异常综合征(MDS)(n＝85)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)(n＝42)、慢性骨髓性白血病(CML)(n＝28)、霍奇金氏病(n＝14)、以及多发性骨髓瘤(n＝5)的674个同种异体HCT接受者中分析一年复发风险和DFS。516名患者被分类为标准风险，148名患者被分类为高风险并且36名患者先前接受过自体移植。37名患者接受骨髓，166名患者接受外周血液干细胞并且471名患者接受脐带血移植物。将整个群组通过接受者CMV血清状态(呈CMV血清阴性[n＝270]或在没有重新激活的情况下呈CMV血清阳性[n＝214]或在重新激活的情况下呈CMV血清阳性[n＝190])和预处理方案(降低强度[n＝308]或清髓性[n＝366])分层。疾病类型和治疗相关变量在通过CMV血清状态分层的组间是均衡的(表I)。

在RIC(n＝308)之后，与在没有重新激活的情况下的CMV血清阳性接受者(30％[20％-40％])或CMV血清阴性接受者(35％[27％-43％])相比，CMV重新激活与HCT后1年的复发风险更低有关(26％[17％-35％]，p＝0.05)(图1A)。类似地，在RIC移植中，与在没有重新激活的情况下的CMV血清阳性接受者(45％[35％-55％])或CMV血清阴性接受者(46％[38％-54％])相比，CMV重新激活与DFS改善有关(55％[45％-65％]，p＝0.04)(图1B)。在清髓性预处理(n＝366)之后，CMV血清状态或重新激活不影响HCT后的复发或DFS(图1C、图1D)。

在回归分析中，在RIC接受者中，CMV重新激活趋向于更低的复发风险(RR＝0.6[0.4-1.0]，p＝0.06)并且与显著更好的DFS有关(RR＝0.7[0.6-1.0]，p＝0.04)，但是在没有重新激活的情况下的血清阳性不是这样。在RIC组内的多变量模型中移植物抗宿主病(GvHD)和年龄对复发和非复发死亡率(NRM)没有统计显著性影响(表II)。相反，对于MA群组，II级-IV级急性GVHD和更低的年龄与复发保护和更高的NRM率这两者有关。虽然CMV重新激活或接受者血清阳性在MA群组中对复发没有影响，但是呈CMV阳性，但是没有重新激活的患者具有更低的无病存活率。还分别对骨髓性(AML和MDS)和其它诊断(ALL、CML、NHL、霍奇金氏病以及多发性骨髓瘤)进行回归分析。尽管随着这些数据的这样的进一步子集化，功效受损并且因此置信区间更宽，但是在所有疾病组中均观测到具有CMV重新激活的RIC接受者的复发风险更低的类似趋势(数据未示)。

CMV重新激活的主要有益作用在早期发生(在它最常被检测时)，这是因为保护作用对于晚期复发来说不太明显。在较早经历CMV重新激活的存活者中没有观测到防止晚期复发(在第100天之后发生)的保护作用(RR＝1.0[0.5-1.9]，p＝0.98)。类似地，在超过第100天的存活者中先前的CMV重新激活与DFS之间没有关联性。由于在HCT后的100天之后CMV重新激活是不常见的并且无症状重新激活由于它在常规监测窗口之外发生而不太常被检测到，因此没有足够的事件来充分评价晚期CMV重新激活与晚期复发之间的关联性。总之，这些结果显示，在HCT环境下CMV重新激活的有益作用在移植之后早期被观测到，并且仅在RIC HCT接受者中是明显的。

表II：移植后复发和NRM的多变量回归分析

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所测试的协变量包括供体类型(同胞或UCB)、诊断(AML或其它)、移植年份(<2008年或≥2008年)、预处理(MA或RIC)、GvHD预防(MTX或MMF或其它)、性别(男性或女性)、疾病风险(标准或高)、年龄(<21岁或≥21岁)、作为时间相关变量的II级-IV级aGvHD(否或是)以及先前自体移植(否或是)。

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在CMV重新激活之后，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞优先地在RIC HCT接受者体内扩增。

为了进一步评价在RIC HCT之后CMV重新激活、复发保护以及DFS改善之间的关联性，分析HCT后源自于供体的外周血液NK细胞的表型。在6个月和1年时观测到在CMV血清阳性接受者中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的出现率增加，但是在CMV血清阴性接受者中没有观测到(图2A，左图和中图)。重新激活CMV的接受者表现出最高比例的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞。进一步分析揭示，在重新激活后的4周(8.58％对比4.64％，p＝0.02)、8周(7.77％对比3.84％，p＝0.02)以及6个月(14.80％对比6.29％，p＝0.01)时，在RIC接受者中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的出现率与MA接受者相比显著更高(图2A，右图)。类似地，在6个月和1年时观测到相对于CMV血清阴性接受者，在CMV血清阳性接受者中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量更大的关联性(图2B，左图和中图)。在移植后6个月时CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量在重新激活CMV的CMV血清阳性接受者中是最高的并且在RIC接受者中与MA接受者相比也是显著更高的(22.2个细胞/微升对比10.44个细胞/微升，p＝0.04)。在1年时观测到绝对数量的类似趋势。在RIC接受者中CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增率更高不能通过在第100天时急性GvHD率的差异来解释，这是因为这些比率在RIC准备方案(43％[38％-43％])与MA准备方案(42％[36％-48％])之间没有显著差异(p＝0.46)。从第100天开始扩增的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞可能从供体来源的细胞分化，这是因为91％的存活者在第100天时具有≥90％的供体细胞嵌合率，并且在6个月时，93％的存活者具有≥90％的供体细胞嵌合率。因此，供体来源的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞响应于CMV重新激活的扩增与复发风险降低和较好的DFS有关，但是仅在RIC接受者当中有关。

在HCT后6个月时CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的扩增与更低的2年复发率直接相关。

在HCT后6个月时(n＝68)，独立于CMV血清状态或重新激活来分析接受者中的绝对CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞计数。在该时间点，几乎所有的患者都有大于(>)90％的供体细胞植入。为了确定CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对计数的最佳分割点，使用递归分区。基于CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞数(>2.5个细胞/微升，n＝54)的扩增组中的接受者与非扩增组(0.1个-2.5个细胞/微升，n＝14)相比趋向于更低的2年复发率(16％[6％-26％]，p＝0.06)，所述非扩增组具有更高的2年复发率(46％[10％-82％])(表III)。因此，这些数据表明在移植之后早期响应于CMV重新激活扩增的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞防止复发。

表III：通过在移植后6个月时的CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞绝对计数分层的复发率

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使用递归分区来确定与2年复发率相关的在移植后6个月时CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对计数(每微升血液的细胞数)的最佳分割点。

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在病毒诊断时更高的绝对单核白细胞计数与CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的后续扩增有关。

模拟CMV感染的体外研究已经证实了单核白细胞在促进表达NKG2C的NK细胞的扩增中起作用(Rolle等,J Clin Invest.2014；124:5305-5316)。因此，相对于MA接受者，RIC接受者在病毒诊断时可能具有更高的绝对单核白细胞计数(AMC)，这解释了CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的优先扩增(图2)。在HCT群组内，有28个经历CMV重新激活的接受者(16个RIC和12个MA)在病毒诊断时的AMC和绝对淋巴细胞计数(ALC)以及在6个月和/或1年时的NK细胞表型数据是可用的。在病毒诊断时，RIC接受者的平均AMC趋向于比MA接受者更高(0.71×10⁹个细胞/升对比0.54×10⁹个细胞/升，p＝0.08)。相反，平均ALC在RIC接受者与MA接受者之间是相似的(0.65×10⁹个细胞/升对比0.61×10⁹个细胞/升，p＝0.39)。为了确定在CMV重新激活时接受者的血液中存在的单核白细胞数与后续适应性NK细胞扩增之间是否存在关联性，绘制每一个接受者在病毒诊断时的AMC值与在6个月(如果没有1年表型可供使用的话)或1年时CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量和百分比的关系图。观测到在病毒诊断时的AMC与在6个月或1年时CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的绝对数量(图3A，p＝0.02)和相对百分比(图3B，p＝0.01)这两者之间的显著正相关。在病毒诊断时的ALC与CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞扩增之间没有观测到这样的相关性(图3C、图3D)。因此，在CMV重新激活时更大数量的单核白细胞可以解释在RIC接受者体内CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞的优先扩增。

CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞对K562骨髓性白血病细胞系具有高度的功能。

为了确定CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞是否相对于其它NK细胞子集介导提高的针对白血病靶标的效应功能，从健康的CMV血清阳性献血者分离外周血液单核细胞(PBMC)并且将其与K562骨髓性白血病细胞以2:1比率一起培养。在未成熟的CD56^亮NK细胞、早期成熟CD56^暗CD57^-NKG2C^-NK细胞、晚期成熟CD56^暗CD57⁺NKG2C^-NK细胞以及适应性CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞中分析肿瘤坏死因子(TNF)和IFN-γ的产生。相对于所分析的所有其它子集，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞响应于K562细胞表现出更高频率的TNF和IFN-γ产生(图4A、图4B)。对于NK细胞脱颗粒没有观测到显著性差异，如通过CD107a表面表达所测定(未示)。因此，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞可能直接经由在直接识别肿瘤靶标时增强的炎性细胞因子的产生来促进HCT后的复发保护。

在本研究之前，CMV重新激活与复发保护之间的关联性的潜在机制仍不明确。在此，证实了在CMV重新激活之后，在降低强度接受者中，CD56^暗CD57⁺NKG2C⁺NK细胞优先扩增，并且这些细胞的扩增与更低的白血病复发直接相关。

实施例2

方法

OP9天然细胞和OP9-DL1细胞

将用空MigR1逆转录病毒载体(OP9天然)或用含有δ样1基因的MigR1逆转录病毒载体(OP9-DL1)转导的OP9基质细胞(Schmitt等,Immunity.2002；17(6):749-756)以4×10⁵个细胞/孔的浓度在MEMα培养基+20％胎牛血清(FBS)中在24孔板中培养2天以允许细胞贴壁。然后将板以2,000cGy辐照以停止细胞增殖。

在OP9细胞上的脐带血来源的NK细胞培养

通过密度梯度离心从全脐带血中分离单核细胞。通过分别使用抗CD3微珠和抗CD19微珠进行阳性磁选来耗尽T细胞和B细胞。然后将耗尽CD3/CD19的细胞以5×10⁵个细胞/孔的浓度添加到经过辐照的OP9细胞中并且在存在或不存在50ng/mL IL-21的情况下在补充有1ng/mL IL-15或10ng/mL IL-15的RPMI培养基+10％FBS中培养14天。

在培养之前和之后对NK细胞进行表型分析

在培养之前以及在培养7天和14天之后，使用以下细胞外抗体和细胞内抗体，通过荧光激活细胞分选(FACS)来分析脐带血来源的NK细胞：BV785缀合的抗CD3(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司)、PE-Cy7缀合的抗CD56(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司)、BV605缀合的抗CD57(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司)、APC缀合的SYK(加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司)、以及PE缀合的抗PLZF(加利福尼亚州圣荷西的碧迪生物科技公司)。

结果

支持终末分化的典型CD56^暗CD57⁺NK细胞和适应性CD56^暗SYK^-NK细胞的扩增的体外培养系统的建立

Notch信号转导通路在效应CD8⁺T细胞分化中起必要的作用并且控制效应功能的获得(Backer等,Nat Immunol.2014；15(12):1143-1151)。为了确定Notch信号转导是否可以在驱动终末分化的和适应性NK细胞子集的分化和扩增中起作用，在低剂量(1ng/mL)IL-15或高剂量(10ng/mL)IL-15存在下，在存在或不存在IL-21(50ng/mL)的情况下，将来自脐带血的耗尽CD3/CD19的单核细胞在天然OP9基质细胞或用Notch配体DL1稳定转导的OP9基质细胞上培养。在第7天和第14天时收获细胞，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)分析CD56⁺NK细胞的CD57和SYK的表达。在培养之前，平均2.13％±0.44％的CD56⁺NK细胞表达CD57。在第7天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15(0.59％±0.19％)或高剂量IL-15(0.70％±0.23％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。类似地，在第14天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15(0.24％±0.11％)或高剂量IL-15(0.22％±0.10％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。在第7天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15(0.91％±0.34％)或高剂量IL-15(1.30％±0.31％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。类似地，在第14天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15(0.93％±0.40％)或高剂量IL-15(0.86％±0.44％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。在第7天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.71％±0.24％)或高剂量IL-15加上IL-21(1.05％±0.29％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。类似地，在第14天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.18％±0.06％)或高剂量IL-15加上IL-21(2.74％±1.90％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。在第7天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(2.06％±0.66％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。在第7天时，在OP9-DL1培养物中在高剂量IL-15加上IL-21(5.31％±2.10％)存在下观测到CD57⁺NK细胞的中度扩增。在第14天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(1.38％±0.56％)存在下没有观测到CD57⁺NK细胞的扩增。在第14天时，在OP9-DL1培养物中在高剂量IL-15加上IL-21(12.67％±5.11％)存在下观测到CD57⁺NK细胞的稳健扩增。

在培养之前，平均3.09％±0.91％的CD56⁺NK细胞缺乏SYK的表达。在第7天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15(0.18％±0.06％)或高剂量IL-15(0.21％±0.05％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。类似地，在第14天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15(0.07％±0.03％)或高剂量IL-15(0.43％±0.15％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。在第7天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15(0.25％±0.06％)或高剂量IL-15(0.34％±0.04％)存在下SYK^-NK细胞没有被维持。类似地，在第14天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15(0.17％±0.08％)或高剂量IL-15(0.43％±0.15％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。在第7天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.39％±0.08％)或高剂量IL-15加上IL-21(0.31％±0.06％)存在下，SYK^-NK细胞没有扩增。类似地，在第14天时，在OP9天然培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.16％±0.03％)或高剂量IL-15加上IL-21(0.60％±0.32％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。在第7天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.77％±0.25％)或高剂量IL-15(0.67％±0.10％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。在第14天时，在OP9-DL1培养物中在低剂量IL-15加上IL-21(0.39％±0.10％)存在下SYK^-NK细胞没有扩增。在第14天时，在OP9-DL1培养物中在高剂量IL-15加上IL-21(3.31％±1.32％)存在下观测到SYK^-NK细胞的扩增。总之，这些结果证实了高剂量IL-15以及IL-21和Notch配体是为CD56^暗CD57⁺和CD56^暗SYK^-NK细胞的体外扩增所需的(图5)。

源自于脐带血的CD56^暗SYK^-NK细胞响应于IL-21下调PLZF

转录因子早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)的转录沉默是响应于CMV感染而扩增的适应性NK细胞的标志(Schlums等,Immunity.2015；42(3):443-456)。在来自新鲜分离的单核细胞和在体外培养14天的细胞的NK细胞中进行PLZF的细胞内染色。来自脐带血的新鲜分离的CD56^暗SYK^-NK细胞主要是PLZF阳性的(99.3％±0.10％)。用高剂量IL-15培养引起CD56^暗CD57^-SYK⁺NK细胞(9.93％±0.75％)、CD56^暗CD57⁺SYK⁺NK细胞(11.47％±2.18％)、CD56^暗CD57^-SYK^-NK细胞(7.05％±1.31％)、以及CD56^暗CD57⁺SYK⁺NK细胞(6.67±1.05)中PLZF表达的适度降低。然而，添加IL-21引起CD56^暗CD57^-SYK^-NK细胞(35.82％±7.02％)和CD56^暗CD57⁺SYK^-NK细胞(66.0％±8.86％)中PLZF的表达与CD56^暗CD57^-SYK⁺NK细胞(14.92％±1.80％)和CD56^暗CD57⁺SYK⁺NK细胞(12.13％±2.43％)相比显著降低。因此，IL-21降低CD56^暗SYK^-NK细胞中PLZF的表达，从而使得这些细胞获得适应性特征(图6)。

实施例3

如实施例2中所述培养的脐带血来源的NK细胞有细胞毒性的能力，如通过细胞毒性受体2B4、低亲和力Fc受体CD16、以及杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的表达所指示。另外的数据(未示)表明这些细胞表达高水平的颗粒酶和穿孔素，这指示了响应于受病毒感染的细胞、赘生性细胞和/或自体激活免疫细胞而脱颗粒的能力。

实施例4

将雷帕霉素添加到体外培养的来自CMV血清阳性供体的NK细胞中加速了适应性NK细胞的分化程序(图7A、图7B)。在功能测定中，用雷帕霉素处理的NK细胞表现出增强的脱颗粒和肿瘤坏死因子(TNF)产生(图7C、图7D)。因此，将雷帕霉素添加到离体NK细胞扩增方法中提出了一种新的策略以在过继免疫治疗之前增强NK细胞分化，针对具有独特代谢特性的成熟NK细胞子集富集以及增强NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生。

实施例5

来自成人CMV血清阳性供体的外周血液的适应性NK细胞可以在体外用高剂量IL-15、IL-21、以及CD16刺激来扩增。将来自健康CMV血清阳性供体的耗尽CD3/CD19的PBMC用CellTrace染料标记并且用单独的高剂量IL-15(10ng/mL)、IL-15加上IL-21(50ng/mL)、或IL-15加上IL-21加上抗CD16抗体(1:1000)培养10天。图8A示出了来自代表性CMV血清阳性供体的CD57、NKG2C、SYK、以及CellTrace的表达。图8B示出了表达NKG2C的NK细胞的百分比的累积数据。图8C示出了来自4个CMV血清阳性供体的缺乏SYK的NK细胞的百分比。

实施例6

为了诱导NKG2C表达，将如实施例2中所述，用以下各项中的至少一种将NK细胞培养7天和14天：可溶性和/或膜结合炎性细胞因子，包括例如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、以及IFN-γ；膜结合HLA-E；以及提呈CMV肽的膜结合HLA-E。

实施例7

具有低TIGIT表达的适应性NK细胞对髓源性抑制细胞具有抗性

引言

自然杀伤细胞是先天免疫系统的淋巴细胞。不同于T细胞和B细胞，它们不以克隆方式表达生殖系重排的抗原特异性受体。尽管它们与细胞毒性T细胞共有类似的杀伤机制，但是NK细胞经由激活受体和抑制性受体的家族识别靶标。这些受体之间的平衡决定了NK细胞的最终功能。NK细胞如何区分健康细胞和转化或受感染的细胞的主要范例是通过“迷失自我(missing self)”假说来解释的。受损细胞上MHC I类的下调或杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的抑制性亚组与它们在自身细胞上对应的人类白细胞抗原(HLA)配体之间的错配将使得靶细胞对NK细胞杀伤敏感。NK细胞还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力而不需要先前的抗原暴露，这种特性促进了NK细胞作为癌症治疗的效应细胞的开发。然而，与T细胞一样，NK细胞抗肿瘤活性受到肿瘤微环境中存在的抑制因素的限制，这导致免疫功能受到阻抑和不佳的预后。新兴研究表明T细胞和NK细胞上的抑制性受体，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)以及T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)可以抑制抗肿瘤应答。

在本研究中，研究了适应性NK细胞与髓源性抑制细胞(MDSC)之间的相互作用。MDSC是骨髓祖细胞和未成熟骨髓细胞的异质群体。在人类中，MDSC通常表达CD11b、CD33、低的HLA-DR或不表达HLA-DR并且是CD14+(单核白细胞型MDSC[mMDSC])或CD15+CD66b+(粒细胞型MDSC[gMDSC])(Marvel等,The Journal of Clinical Investigation.2015；125(9):3356-64)。这些细胞是由肿瘤诱导的并且通过产生TGF-β、IL-10、活性氧簇(ROS)、以及精氨酸酶来促进对先天抗肿瘤免疫和适应性抗肿瘤免疫这两者的抑制(Ostrand-Rosenberg等,Journal of Immunology.2009；182(8):4499-506)。然而，可以使用本文所公开的方法和组合物分离和/或制备的NK细胞子集适应性NK细胞对源自于癌症患者的MDSC的功能抑制表现出抗性。与常规NK细胞相比，适应性NK细胞表达更低水平的TIGIT，所述TIGIT是已知直接调节效应T细胞应答的抑制性受体。

结果

MDSC抑制T细胞和NK细胞增殖以及NK细胞功能

为了研究MDSC与NK细胞子集之间的相互作用，通过用IL-6和GM-CSF将来自健康供体的外周血液单核细胞培养1周，继而富集CD33⁺细胞来产生MDSC(图16A)。使用新鲜单核白细胞作为这些实验的骨髓细胞对照。将纯化的T细胞和NK细胞与单核白细胞或MDSC以不同的比率共培养并且在培养3天-4天后评价增殖。虽然单核白细胞对增殖有很小的影响，但是MDSC诱导了2.7倍±1.6倍的T细胞增殖抑制(p＝0.005)，对NK细胞有类似的影响(1.5倍±0.27倍抑制，p＝0.006)(图9A)。类似地，CD16接合刺激了NK细胞脱颗粒和IFN-γ产生，相对于与新鲜单核白细胞一起培养的NK细胞，这被MDSC显著抑制(分别是2.4倍±1.4倍抑制，p＝0.0001；以及2.6倍±1.5倍抑制，p＝0.003)(图9B)。

适应性NK细胞能抵抗MDSC抑制

为了研究适应性NK细胞与常规NK细胞相比是否可以抵抗MDSC抑制，将纯化的多克隆NK细胞与单核白细胞或MDSC以2:1比率共培养5天并且在CD16刺激之后检查脱颗粒、增殖以及细胞因子产生。常规NK细胞和适应性NK细胞表达相似量的CD16(图16B)；适应性NK细胞被定义为来自CMV血清阳性供体的CD57⁺NKG2C⁺FcεRγ^-的NK细胞(Schlums等,Immunity.2015；42(3):443-56)。当在IL-15存在下单独培养或与单核白细胞共培养时观测到相似的NK细胞活性(脱颗粒：44％±14％对比49％±12％；IFNγ：28％±14.0％对比27％±9.0％)(图10A)。与单核白细胞对照相比，在常规NK细胞的群体内，MDSC介导了对CD107a(52.4％±2.4％对比33.5％±3.1％，p＝0.0007)、IFN-γ(31.3％±3.8％对比13.8％±3.0％，p＝0.009)、TNF(29.1％±2.1％对比13.6％±3.3％，p＝0.007)以及增殖(49.0％±2.9％对比23.0％±3.5％，p＝0.001)(通过Ki67所测量)的显著抑制。然而，适应性NK细胞对相同的MDSC群体具有抗性(图10A)。此外，当由嵌套小室隔开时，在MDSC存在下，常规NK细胞的脱颗粒和IFNγ完全恢复(图10B)。因此，CMV感染产生对MDSC抑制具有抗性的适应性NK细胞的群体。

适应性NK细胞对MDSC抑制的抗性与更低的TIGIT表达相关

在染色之前将来自健康献血者的纯化的NK细胞在不存在或存在单独的IL-15(10ng/mL)的情况下或在IL-12(10ng/mL)和IL-18(100ng/mL)或抗CD16(1μg/mL)的另外的刺激下培养过夜。TIGIT表达在没有刺激的情况下是低的并且在存在单独的IL-15的情况下轻微上调。抗CD16的另外的刺激进一步增加了TIGIT表达。然而，DNAM-1由于高的基线表达水平而不能进一步增加(图11A)。在这些多克隆激活NK细胞上TIGIT的染色模式显示出双峰表达(图11A)。为了进一步研究该现象，检查适应性NK细胞和常规NK细胞上TIGIT和其它抑制性受体的表达。在适应性NK细胞与常规NK细胞之间DNAM-1、CD96、NKp44、NKp46、PD-1、Tim3、或NKG2A没有表达差异(图11B、图16C)。相反，在适应性NK细胞上TIGIT表达与常规NK细胞相比显著更低，无论是与单核白细胞共培养(TIGIT MFI：1595±407对比2196±461，p＝0.008)还是与MDSC共培养(TIGIT MFI：1680±336对比2556±403，p＝0.008)(图11C)。尽管在与单核白细胞或MDSC共培养之前和之后，常规NK细胞和适应性NK细胞以相似的水平共表达TIGIT和DNAM-1(单独的NK：18％±10％对比14％±11.5％，NK+单核白细胞：86％±8％对比83％±9％，NK+MDSC：84％±9％对比82％±6％，图11D)，但是适应性NK细胞的TIGIT表达保持较低。

MDSC对常规NK细胞的TIGIT依赖性抑制

将单核白细胞、MDSC、以及NK细胞用CellTracker Blue标记并且在腔室载片中共培养过夜。将细胞用抗CD155(绿色)和抗TIGIT(红色)染色并且通过尺寸区分。如所预期，NK细胞上的TIGIT与MDSC上的CD155共定位(图12A)。为了评估TIGIT是否在对NK细胞的MDSC依赖性调节中起作用，在IL-15(10ng/mL)存在下将来自健康献血者的多克隆NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率共培养5天。在CD16刺激6小时之后，基于差异性高或低的TIGIT表达，在与MDSC共培养的常规NK细胞中评价IFN-γ产生。这些数据显示具有低TIGIT表达的NK细胞相对于具有高TIGIT表达的NK细胞产生显著更多的IFN-γ(36.2％对比19.9％，p＝0.0005，图16D)。随后，检查TIGIT的接合是否负责驱动MDSC对NK细胞的抑制。如先前所述(Warren等,Int Immunol.2001；13(8):1043-52)在P815测定中使用正常的NK细胞测试抗TIGIT抗体的功能。虽然抗CD158b对照的存在抑制NK细胞的细胞毒性，但是在抗TIGIT存在下，NK细胞功能不受影响(图18A)，这表明缺乏激动功能。

在存在或不存在针对TIGIT的阻断抗体的情况下将NK细胞与单核白细胞或MDSC共培养5天。通过阻断TIGIT完全消除了MDSC诱导的对多克隆NK细胞功能的抑制(图12C)。由于TIGIT阻断对适应性NK细胞有很小的影响，因此该作用完全基于大的常规NK细胞群体(图12C、图12D)。同时阻断TIGIT和DNAM-1在与MDSC共培养的常规NK细胞中逆转了TIGIT阻断的作用并且抑制适应性NK细胞的脱颗粒和IFN-γ(图12E、图18B)，这表明了对DNAM-1信号转导的TIGIT依赖性抑制。

ROS诱导MDSC表面上CD155的表达

进一步检查在单独的单核白细胞和MDSC中TIGIT配体CD155和CD112的表达。MDSC表达高水平的CD155，相比之下，CD155在单核白细胞中几乎没有表达(MFI：675±124对比107±23，p＝0.015)。此外，在MDSC中CD112表达与单核白细胞相比显著更高(MFI：1714±331对比865±196，p＝0.015)(图13A)。为了进一步研究MDSC诱导的常规NK细胞抑制的机制，在MDSC产生结束时将MDSC所利用的通路，包括超氧化物、精氨酸酶、ROS、TGF-β、以及iNOS阻断过夜。虽然在阻断超氧化物、精氨酸酶、TGF-β或iNOS时没有观测到CD155表达的显著差异，但是用过氧化氢酶抑制ROS产生使得MDSC上CD155的表达显著降低(降低55％±23％，p＝0.03)(图13B)。

几项研究已经证实，MDSC中ROS产生增加与对T细胞功能的抑制相关。此外，ROS产生由增强的NADPH氧化酶活性(NOX2)而增加(Corzo等,Journal of Immunology.2009；182(9):5693-701)。在此，将MDSC中的ROS产生水平与新鲜分离的单核白细胞的水平相比。单核白细胞几乎不表达ROS并且主要是CD155阴性的。相反，MDSC产生高的基础水平的ROS并且均一地呈CD155阳性(图13C)。此外，在单核白细胞中通过H₂O₂处理诱导ROS产生可以诱导ROS⁺单核白细胞中CD155的表达(图13D)。

TIGIT接合抑制pZAP70/Syk和pERK1/2并且引起对NK细胞的细胞毒性的抑制

鉴于TIGIT接合对常规NK细胞的功能和增殖有强烈的抑制作用，分析在与MDSC共培养的NK细胞中CD16诱导的信号转导与TIGIT的相互作用。与在与对照单核白细胞共培养时相比，与MDSC共培养的NK细胞表现出ERK1/2(MFI：1356±143对比696±202，p＝0.03)和ZAP70/Syk(MFI：159±14对比109±14，p＝0.03)的磷酸化减少。此外，阻断TIGIT或抑制ROS增加了ZAP70/Syk和ERK1/2的磷酸化(p＝0.03，图14A、图14B)。为了研究阻断TIGIT或ROS是否可以恢复与MDSC一起培养的NK细胞在细胞毒性测定中的功能，将NK细胞与单核白细胞或MDSC一起培养，用TIGIT阻断或过氧化氢酶预处理，洗涤，然后与⁵¹Cr标记的K562细胞一起孵育。相对于与单核白细胞共培养，在与MDSC共培养之后，NK细胞的细胞毒性显著降低(图14C)。抗TIGIT和过氧化氢酶对单独培养的NK细胞都没有任何影响，但是TIGIT阻断和ROS抑制这两者均完全逆转了由MDSC介导的抑制作用(图14C)。此外，在NK细胞和MDSC的共培养物中阻断TIGIT与过氧化氢酶处理的组合对pZAP70/Syk和pERK1/2或NK细胞的细胞毒性没有累加效应。

骨髓增生异常综合征(MDS)患者MDSC对常规NK细胞的TIGIT依赖性抑制

已经鉴定出细胞因子产生的MDSC的接触介导的抑制机制，研究该机制在体内生理环境下是否起作用。分析来自CMV血清阳性MDS患者和健康供体(HD)的PBMC中适应性NK细胞和MDSC的出现率。尽管在CMV+MDS患者的血液中适应性NK细胞的出现率较高(n＝10，17％±15％对比7％±5％)，但是总NK细胞出现率与HD相比显著更低(n＝8，1.3％±1.2％对比8％±7％)。单核白细胞型MDSC(mMDSC)被定义为CD45⁺Lin^-CD11b⁺CD33⁺HLA-DR^-/低CD14⁺并且粒细胞型MDSC(gMDSC)被定义为CD45⁺Lin^-CD11b⁺CD33⁺CD15⁺。与健康献血者相比，在MDS患者的血液中观测到mMDSC(1.6±0.2对比11.4±9.2，p＝0.02)和gMDSC(0.02±0.02对比1.84±1.6，p＝0.01)这两者的出现率显著增加(图15A)。此外，与MDS-单核白细胞相比，MDS-MDSC具有增加的CD155表达(图15B)。评价来自MDS患者的PBMC的常规NK细胞和适应性NK细胞上TIGIT的表达。在MDS患者中，在适应性NK细胞上TIGIT的表达显著低于常规NK细胞(MFI：347±189对比660±311，p＝0.002；图15C)。相对于MDS-常规NK细胞，MDS患者CMV诱导的适应性NK细胞在用IL-15和CD16刺激激活之后表现出显著更大的功能。此外，适应性NK细胞显示出与健康供体NK细胞中相似的脱颗粒和IFNγ产生(图15D)。在常规NK细胞中阻断TIGIT信号转导挽救了它们的功能低反应性，但是对具有低TIGIT表达水平的适应性NK细胞有很小的附加作用(图15D)。

评价MDS患者的血液中循环的MDSC对来自健康志愿者的同种异体NK细胞的抑制能力。在IL-15和CD16刺激存在下共培养5天之后，与相同样品中的适应性NK细胞的功能相比，观测到同种异体常规NK细胞功能的显著降低(图15E、图18C)。TIGIT阻断完全逆转了来自MDS患者的原代MDSC对常规NK细胞的抑制功能，而对在本质上对该抑制机制具有抗性的CMV诱导的适应性NK细胞没有观测到作用(图15F)。因此，这些数据明确证实，用来自正常供体的细胞因子产生的MDSC所观测到的MDSC抑制机制与来自MDS患者的原代MDSC的抑制机制是相同的。

讨论

描述NK细胞和T细胞免疫治疗在患有活动性癌症的患者中的潜在治疗益处的免疫治疗文献激增。这种激励是由使用针对T细胞PD-1/PD-L1和/或CTLA-4通路的检查点阻断所获得的出人意料强烈的临床结果所助长的。总的来说，癌症治疗的新方法正经历策略性改变，重点放在抗原特异性应答和检查点阻断。虽然NK细胞对靶标的应答是由经由激活受体和抑制性受体的信号的平衡决定的，但是类似的检查点阻断机制却不太了解。在本研究中，TIGIT/CD155被鉴定为构成MDSC诱导的对常规NK细胞的抑制的基础的关键轴。CMV诱导的适应性NK细胞表达低水平的TIGIT并且对MDSC抑制不敏感。通过细胞因子暴露从正常血液产生的MDSC的功能等同于癌症(MDS)患者中所诱导的MDSC的功能，这突出了这些发现的生理相关性和它们的潜在翻译作用。如由本公开所提供，并且不希望受理论所束缚，有至少两种方式来克服TIGIT诱导的对NK细胞的免疫抑制。第一是TIGIT阻断，这使常规NK细胞中的CD16信号转导恢复到正常水平。第二是在CMV暴露之后TIGIT抗性适应性NK细胞的扩增。在此，证实了在被分离或没有被分离的情况下，NK细胞的子集可以被扩增，并且任选地被调节以通过维持低的TIGIT表达水平来实现对肿瘤诱导的免疫抑制的抗性。

包括MDSC的免疫抑制细胞类型在肿瘤微环境中积聚并且对诸如CTL和NK细胞的效应细胞施加抑制压力，从而使得清除肿瘤的能力降低。细胞因子诱导的MDSC抑制多克隆NK细胞的增殖、脱颗粒以及IFN-γ产生。然而，出人意料地发现，有可能通过分离适应性NK细胞和常规NK细胞以获得适合于阻断MDSC抑制的NK细胞的亚群来使NK细胞实现对MDSC抑制的抗性。基于适应性NK细胞对MDSC抑制的抗性，研究与和正常单核白细胞共培养相比，当与MDSC共培养时，适应性NK细胞与常规NK细胞相比是否存在任何独特的表型变化。发现与常规NK细胞相比，在适应性NK细胞中TIGIT表达显著更低。

CD112和CD155受细胞应激调节并且分别以低亲和力和高亲和力结合TIGIT。这两种受体在转化的细胞上均高表达。如本文所示，单核白细胞向MDSC的转化与CD112增加和诱导CD155表达有关。CD155表达依赖于活性氧簇(ROS)产生，并且MDSC产生高水平的ROS。

与和CD155^-单核白细胞共培养的NK细胞相比，在与MDSC共培养之后NK细胞上TIGIT的接合引起显著更少的ZAP70/Syk和ERK1/2磷酸化。阻断TIGIT或抑制ROS产生逆转了近端信号转导中的这一缺陷。不希望受理论所束缚，本文中的发现揭示了TIGIT作为免疫检查点调节性MDSC介导的NK细胞信号转导抑制因子的作用。如本文所示，阻断TIGIT或抑制ROS引起NK细胞对K562的细胞毒性增强。值得注意的是，来自患有MDS的患者的血液循环MDSC在抗TIGIT存在下不能抑制常规NK细胞。这些结果证实由MDS诱导的表型MDSC在功能上是抑制性的，这一发现可能有助于该疾病的临床进展。

这些数据暗示阻断TIGIT以增强NK细胞在癌症免疫治疗中的抗肿瘤作用。或者，适应性NK细胞在癌症患者体内的克隆扩增可以改善肿瘤靶向而有最小的肿瘤微环境抑制。这样的扩增在受到免疫抑制的患者中CMV重新激活之后被观测到(Davis等,Biology ofBlood and Marrow Transplantation:Journal of the American Society for Bloodand Marrow Transplantation.2015；21(9):1653-62；Foley等,Journal ofImmunology.2012；189(10):5082-8)，并且可以通过输注适应性NK细胞或通过CMV疫苗来促进。用CMV包膜糖蛋白B治疗以及用树突状细胞CMV疫苗进行遗传免疫接种已经被证实是安全和可行的(Pass等,The New England Journal of Medicine.2009；360(12):1191-9；Garu等,Molecular Therapy.2015；doi:10.1038/mt.2015.215)。综上所述，这些新数据提供了关于MDSC对不同NK细胞子集的抑制的新视角。

材料和方法

患者和健康供体

从健康受试者获得正常外周血液。来自骨髓增生异常综合征患者(MDS，n＝15)的冷冻的外周血液单核细胞(PBMC)是从国家骨髓捐赠计划(National Marrow DonorProgram，NMDP)/国际血液和骨髓移植研究中心(Center for International Blood andMarrow Transplant Research)获得的。所有健康供体和MDS患者供体均是CMV血清阳性的。所有样品均被去标识并且使用是由明尼苏达大学和NMDP机构审查委员会根据赫尔辛基宣言批准的。

细胞分离

在Ficoll梯度离心(Ficoll-Paque Plus，英国小查尔方特的通用电气医疗公司)之后收集来自MDS患者和健康献血者的PBMC。之后，将细胞以2×10⁶个/毫升的密度在含有10％热灭活的FBS、IL-6(10ng/mL，密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))以及GM-CSF(10ng/mL，R&D系统公司)的RPMI培养基中接种1周并且在培养第3天时补充以产生MDSC(Koehn等,Blood.2015；126(13):1621-8)。随后，用抗人类HLA-DR微珠(德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Germany))分离HLA-DR⁺细胞，并且之后使用抗CD33微珠(德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物科技公司)从HLA-DR^-级分中纯化MDSC。在所有所示的实验中均使用单核白细胞型MDSC(≥85％CD14⁺HLA-DR^-)。通过阴性耗尽(EasySep人类NK细胞富集试剂盒，加拿大温哥华的干细胞技术公司(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada))或CD3微珠(德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物科技公司)从过夜静置的PBMC中分离NK细胞和T细胞。使用抗CD33微珠从过夜静置的PBMC中分离对照单核白细胞。

增殖测定

将纯化的单核白细胞或细胞因子诱导的MDSC与CellTrace紫色染料(5μM，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))标记的自体T细胞或NK细胞(1×10⁵个)以1:1-1:16比率于补充有10％FBS的RPMI培养基(明尼苏达州明尼阿波利斯的Gibco公司(Gibco,Minneapolis,MN))(在下文被称为培养基)中按一式两份接种到96孔U型底板中。将T细胞用抗CD3/CD28激活珠粒(40个珠粒/孔)和IL-15(1ng/mL)刺激或对于NK细胞用单独的IL-15(10ng/mL)刺激并且培养3天-5天。通过LSRII流式细胞仪(碧迪生物科技公司)获得细胞并且通过FlowJo(俄勒冈州阿什兰的Tree Star公司(Tree Star,Ashland,OR))分析数据。

流式细胞术分析

将在不同的刺激存在下与单核白细胞或MDSC一起培养不同时间点的纯化的NK细胞或MDS PBMC(图17)重悬在染色缓冲液(含有0.5％人类AB血清的PBS)中并且用荧光染料缀合的抗体(表IV)染色。使用Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒(加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司)，根据制造商的说明书对培养的NK细胞的CD107a、Ki67、IFN-γ、以及TNFα产生进行检测。在固定和细胞外染色之前，在37℃将NK细胞用布雷菲德菌素A(blefeldinA)和莫能菌素(monensin)(GolgiPlug和GolgiStop；新泽西州富兰克林湖的碧迪生物科技公司(BD Bioscience,Franklin Lake,NJ))处理6小时。在与NK细胞共培养之前，将MDSC用针对以下抗原的抗体染色以确定它们的纯度和表型：CD11b、HLA-DR、CD33、CD14、CD15、CD66b、CD56、CD3、CD19(lin-)、以及可固定的死细胞标志物(表IV)。在几个实验中，在染色之前，将MDSC单独在靶向MDSC的不同抑制机制的试剂存在下培养过夜，所述试剂包括10μg/mL的针对TGFβ的中和抗体(R&D系统公司)、200IU/mL的ROS清除剂过氧化氢酶(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)或超氧化物歧化酶(西格玛-奥德里奇公司)、500μmol/L的精氨酸酶抑制剂N(ω)-羟基-正-l-精氨酸(nor-NOHA；Calbiochem公司)或iNOS抑制剂NG-单甲基-l-精氨酸(L-NMMA；密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)，并且针对CD155(PVR)染色。通过LSRII获得所有细胞并且通过FlowJo分析。将适应性NK细胞和常规NK细胞根据图17中的门控策略门控和鉴定。

嵌套小室测定

将来自健康献血者的纯化的NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率在IL-15(10ng/mL)存在下共培养5天并且在接触下接种到24孔板中或用仅允许可溶性因子交换的嵌套小室插入物(0.4μm孔)(纽约州康宁的康宁公司(Corning,Corning,NY))隔开。在针对脱颗粒和IFNγ产生进行染色之前并且如上文所述，将细胞用抗CD16刺激6小时。

共聚焦显微镜术

将MDSC和单核白细胞用CellTracker Blue(14μM，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)预标记20分钟。然后将它们与IL-15(10ng/mL)过夜预激活的NK细胞共培养40分钟。将混合细胞加到聚赖氨酸预处理的盖玻片上，持续30分钟，用3％BSA封闭并且在37℃在2％多聚甲醛中固定30分钟。在固定之后，将细胞在室温下用抗TIGIT和抗PVR(CD155)染色2小时，然后用荧光标记的二抗染色1小时，之后进行共聚焦显微镜术。

表IV：不同实施例中所用的抗体和荧光染料。

磷酸化流式细胞术(Phosflow)

在IL-15(10ng/mL)存在下并且在存在或不存在针对TIGIT的阻断抗体(10μg/mL)、或过氧化氢酶(200IU/mL)的情况下将来自健康献血者的纯化的NK细胞与自体MDSC或新鲜分离的单核白细胞以2:1比率共培养5天。然后将细胞洗涤，静置4小时，并且用抗CD16激动剂抗体刺激10分钟和30分钟，之后分别分析Zap-70磷酸化和ERK1/2磷酸化。根据制造商的说明书(新泽西州富兰克林湖的碧迪生物科技公司)将细胞用BD固定缓冲液和透化缓冲液III固定和透化并且针对pZap-70(pY319)/Syk(pY352)和pERK1/2(pT202/pY204)染色。

铬释放测定

在存在或不存在针对TIGIT的阻断抗体(10μg/mL)或ROS清除剂过氧化氢酶(200IU/mL)的情况下与单核白细胞或MDSC共培养5天之后，通过铬(⁵¹Cr)释放测定(4小时)针对K562(弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC(ATCC,Manassas,VA))细胞以5:1-2.5:1效应细胞:靶细胞比率分析NK细胞的细胞毒性。通过γ闪烁计数器(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA))测量⁵¹Cr释放，并且确定特异性靶细胞裂解。

MDSC抑制的离体分析

将来自MDS患者和健康供体的PBMC静置过夜，并且如上文所述分离MDSC。如先前所述从过夜静置的健康PBMC中分离NK细胞和单核白细胞。在IL-15(10ng/mL)存在下将NK细胞与自体单核白细胞或同种异体MDS MDSC以2:1比率共培养5天。在用抗CD16刺激6小时之后，在存在或不存在针对TIGIT的阻断抗体的情况下评价NK细胞的脱颗粒、增殖以及IFN-γ和TNFα产生。

统计分析

将所有数据首先在上述软件中分析并且通过Prism 6版软件(加利福尼亚州拉霍亚的GraphPad软件公司(GraphPad Software,La Jolla,CA))汇总。首先针对正态分布对所有数据进行检验。之后，通过司图顿氏t检验或非参数曼-惠特尼U检验分析组间差异(如附图图例说明中所示)。体外测定的数据被示为平均值和SEM并且用来自MDS患者的细胞进行的实验的数据被示为平均值和SD。基于平均值选择代表性直方图或图像。

实施例8

用CMV肽池进行脉冲处理的成熟树突状细胞诱导适应性NK细胞扩增。

将单核白细胞(2×10⁶个/毫升)培养在补充有100ng/mL的GM-CSF和20ng/mL的IL-4的CellGro培养基(2.5％人类AB血清)中以诱导单核白细胞成熟为未成熟的树突状细胞。在培养5天之后，收获未成熟的树突状细胞，短暂离心，并且以1×10⁶个细胞/毫升在新鲜CellGro培养基(2.5％人类AB血清)中接种，所述培养基补充有GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(20ng/mL)(对于未成熟的树突状细胞)或GM-CSF(100ng/mL)、IL-4(20ng/mL)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(Poly I:C)(20μg/mL)、脂多糖(LPS)(10ng/mL)、以及IFN-γ(1000IU/mL)(对于成熟树突状细胞)。将所选择的成熟树突状细胞培养物进一步用以下各项或不用以下各项补充：CMV pp65肽池(10μg/mL)(目录号11549，马里兰州日耳曼敦的国家卫生研究院AIDS试剂项目(National Institutes of Health AIDS Reagent Program,Germantown,MD)；所述池中肽的清单可在万维网上在aidsreagent.org/pdfs/11549_TAB_002.pdf上获得)；或HIV PTEGag肽池(10μg/mL)(目录号12437，马里兰州日耳曼敦的国家卫生研究院AIDS试剂项目；所述池中肽的清单可在万维网上在aidsreagent.org/support_docs/11554_Lot21164_Solubility-MW-Purity.docx上获得)。将自体PBMC在第5天解冻并且在补充有10％FBS的RPMI中在37℃静置过夜。

在第6天，通过珠粒选择，从静置过夜的PBMC中分离CD3^-CD56⁺NK细胞和CD14⁺单核白细胞。然后在24孔板中，在IL-15(10ng/mL)存在下，用NK细胞和新鲜的单核白细胞、培养的未成熟的树突状细胞、培养的成熟树突状细胞、培养的CMV肽补充的成熟树突状细胞、或培养的HIV肽补充的成熟树突状细胞以1:1比率建立自体共培养物。还建立了使用单独的NK细胞的培养条件。然后将细胞培养12天-14天，之后进行FACS分析。

结果示于图19中，证实了用CMV肽池对成熟树突状细胞进行脉冲处理诱导了适应性NK细胞扩增。

实施例9

当在自体单核白细胞和IL-15存在下培养时，来自CMV血清阳性供体的NK细胞偏向于CD45RA-CD45RO+表型。

将来自分型的健康CMV血清阴性供体和CMV血清阳性供体的耗尽CD3/CD19的外周血液单核细胞用10ng/mL的IL-15培养。使用FACS测量在培养前和培养后来自CMV血清阴性供体和CMV血清阳性供体的CD3^-CD56⁺CD45RA^-CD45RO⁺NK细胞的百分比。

如图20中所示，当在自体单核白细胞和IL-15存在下培养时，来自CMV血清阳性供体的NK细胞偏向于CD45RA^-CD45RO⁺表型。

实施例10

适应性NK细胞对Treg介导的抑制具有抗性。

使用以下方法在体外产生调节性T细胞(Treg)：通过密度梯度离心从CMV血清阳性供体分离PBMC。然后通过磁性珠粒分离从总PBMC中分离CD4⁺T细胞。然后分选CD4⁺T细胞以分离CD4⁺CD25^hiCD127^低Treg群体。然后在培养物中将分选的Treg用经过辐照的K562-mbIL-21饲养细胞系、抗CD3/CD28珠粒、以及300U/ml IL-2扩增21天。然后在补充有50U/ml IL-2的培养基中将扩增的Treg与自体或同种异体NK细胞和HLA-DR⁺抗原提呈细胞以1:1、1:2、1:4、或1:8比率一起培养6天。对于功能实验，用1μg/ml的抗CD16激动剂抗体、5ng/ml的IL-12、以及50ng/ml的IL-18将NK细胞刺激5小时。

使用流式细胞术分析常规NK细胞子集(CD56⁺CD57⁺FcεRγ⁺NKG2C^-)和适应性NK细胞子集(CD56⁺CD57⁺FcεRγ^-NKG2C⁺)的增殖。如图21中所示，适应性NK细胞对Treg介导的抑制具有抗性。图21A示出了在每一种培养条件下表现出CellTrace染料稀释的NK细胞的百分比。图21B示出了在用抗CD16激动剂抗体、IL-12以及IL-18刺激之后，培养的NK细胞的脱颗粒(如通过CD107a表达所测量)和IFN-γ产生。图21C示出了培养的NK细胞上PD1和TIM-3的表达，如通过FACS使用抗PD1(克隆MIH4；颜色：APC；加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司)和抗TIM3(克隆：F382E2；颜色：BV650，加利福尼亚州圣地亚哥的Biolegend公司)所测量。结果来自两次独立实验。p值由成对司图顿氏t检验产生。

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除非另外指明，否则说明书和权利要求书中所用的表示组分的量、分子量等的所有数字均应当被理解成在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另有相反指示，否则在说明书和权利要求书中所阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据由本发明所试图获得的所期望的特性而变化。至少，而不是试图将等同原则限制在权利要求书的范围内，每一个数值参数都至少应当根据所报告的有效数字的数量和通过应用普通四舍五入技术来解释。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中所述的数值是尽可能精确地报告的。然而，所有的数值在本质上都含有由它们对应的测试测量中所存在的标准偏差必然产生的范围。

所有标题都是为了读者的方便起见并且不应当被用于限制标题后面的文字的含义，除非如此说明的话。

Claims (48)

1.一种方法，所述方法包括：

(a)从受试者获得血液样品；以及

(b)在包含IL-15、IL-21、以及Notch配体中的一种或多种的培养基中培养所述血液样品的NK细胞的群体以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)的培养基还包含雷帕霉素和CD16信号转导的激活剂中的至少一种。

3.一种方法，所述方法包括：

(a)从受试者获得血液样品；以及

(b)将所述血液样品的NK细胞的群体与CMV肽补充的成熟树突状细胞一起培养以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

4.一种方法，所述方法包括：

(a)从受试者获得血液样品，其中所述受试者是CMV血清阳性的；以及

(b)将所述血液样品的NK细胞的群体与自体单核白细胞和IL-15一起培养以获得适应性NK细胞；

其中所述适应性NK细胞是CD56^暗并且是NKG2C⁺和TIGIT^低中的一种或多种。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括使所述血液样品的NK细胞与TIGIT抑制剂接触。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述TIGIT抑制剂包括针对TIGIT的抗体。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括使所述血液样品的NK细胞与PLZF、TIGIT、或PD-1中的至少一种的抑制剂接触。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括所述血液样品的NK细胞或所述适应性NK细胞或这两者中PLZF、TIGIT、或PD-1中的至少一种的遗传基因敲低。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞是CD57⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少一种。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中与培养之前所述NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出降低的PLZF表达。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中与培养之前所述NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出增强的抗肿瘤免疫活性。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中与培养之前所述NK细胞的群体相比，所述适应性NK细胞表现出细胞毒性增加、细胞因子产生增加、持续时间延长、以及对调节性T细胞的抗性增加中的一种或多种。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中培养所述NK细胞的群体包括细胞扩增或细胞表型偏移或这两者。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，所述方法还包括

(c)分离所述适应性NK细胞。

16.一种组合物，所述组合物包含通过如权利要求1至15中任一项所述的方法所获得的适应性NK细胞。

17.一种组合物，所述组合物包含NK细胞的群体，其中所述NK细胞的群体是针对通过如权利要求1至15中任一项所述的方法所获得的适应性NK细胞富集的。

18.一种分离的NK细胞群体，其中所述细胞是CD56^暗、以及NKG2C⁺、CD57⁺、和TIGIT^低中的一种或多种。

19.如权利要求18所述的分离的NK细胞群体，其中与典型NK细胞相比，所述细胞表现出PLZF和PD-1中的至少一种的表达降低。

20.一种分离的NK细胞群体，其中所述分离的群体是针对CD56^暗和NKG2C⁺的NK细胞富集的。

21.如权利要求20所述的分离的NK细胞群体，其中所述分离的群体是针对与典型NK细胞相比表现出PLZF、TIGIT、以及PD-1中的至少一种的表达降低的NK细胞富集的。

22.如权利要求18至21中任一项所述的分离的NK细胞群体，其中与典型NK细胞相比，所述NK细胞群体表现出增强的抗肿瘤免疫活性。

23.如权利要求18至22中任一项所述的分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞群体能够克服髓源性抑制细胞(MDSC)诱导的对免疫应答的抑制。

24.如权利要求18至23中任一项所述的分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞群体能够克服Treg诱导的对免疫应答的抑制。

25.一种组合物，所述组合物包含如权利要求18至24中任一项所述的分离的NK细胞群体。

26.如权利要求25所述的组合物，所述组合物还包含CD155抑制剂、TIGIT抑制剂、以及活性氧簇(ROS)产生抑制剂中的至少一种。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述ROS产生抑制剂包括过氧化氢酶。

28.如权利要求26或27中任一项所述的组合物，其中所述ROS产生抑制剂或所述CD155抑制剂以足以降低髓源性抑制细胞(MDSC)上CD155的表达的量存在。

29.一种组合物，所述组合物包含适应性NK细胞，其中所述适应性NK细胞是CD3^-、CD56⁺并且是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少一种。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述适应性NK细胞是长寿命的。

31.如权利要求29或30中任一项所述的组合物，其中与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子或PD-1的表达降低。

32.如权利要求29至31中任一项所述的组合物，其中所述适应性NK细胞显示出抗肿瘤活性。

33.如权利要求29至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。

34.一种制备适应性NK细胞的方法，其中所述适应性NK细胞是CD3^-、CD56⁺并且是CD57⁺、NKG2C⁺、SYK^-、FcεRγ^-、EAT-2^-、CD56^暗、TIGIT^低、CD45RO⁺、以及CD45RA^-中的至少一种。

35.如权利要求34所述的方法，其中与典型NK细胞相比，在适应性NK细胞中，早幼粒细胞性白血病锌指(PLZF)转录因子的表达降低。

36.如权利要求34或35中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞显示出抗肿瘤活性。

37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中在体外制备所述适应性NK细胞。

38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞源自于来自未感染过巨细胞病毒(CMV)的来源的细胞。

39.如权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞源自于从血液中分离的细胞、多潜能干细胞、诱导多潜能干细胞、胚胎干细胞、或从脐带血中分离的细胞。

40.如权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在培养基中培养的细胞，所述培养基包含IL-15、IL-21、IL-18、IL-12、IL-2、IFN-α、以及IFN-β中的至少一种。

41.如权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述适应性NK细胞源自于在培养基中培养的细胞，所述培养基包含雷帕霉素、Notch配体、NKG2C受体激动剂、单核白细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、以及CMV肽中的至少一种。

42.如权利要求34至41中任一项所述的方法，其中在体内制备所述适应性NK细胞。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述方法包括向受试者施用巨细胞病毒(CMV)疫苗。

44.如权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤中的至少一个：向受试者施用灭活的CMV、向受试者施用细胞因子、向受试者施用Notch配体、以及诱导Notch配体在受试者体内表达。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-15、IL-21、IL-12、IL-18、以及GM-CSF中的至少一种。

46.如权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述受试者是CMV血清阳性的。

47.一种用于在受试者中治疗或预防癌症、癌前病况、或病毒的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用如权利要求29至33中任一项所述的组合物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述受试者包含髓源性抑制细胞(MDSC)。