CN110684731A

CN110684731A - 一种nk细胞的体外扩增培养方法

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Publication number: CN110684731A
Application number: CN201911037240.8A
Authority: CN
Inventors: 张志新; 卓越; 张勇; 杨飞
Original assignee: Chengdu Exab Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Exab Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明公开了一种NK细胞体的外扩增培养方法。该方法包括以下步骤：(1)向处理后包含NK细胞的血液中加入刺激因子和终浓度为0.1～10nM的比例调节剂，培养3～4天；(2)调整细胞密度为0.5～1.5×10⁶个/mL后，再继续添加终比例调节剂和细胞因子，继续培养20～30天即可。本发明在培养NK细胞的过程中，无异体细胞，所涉及因子均为临床级别对人体无害的因子，安全性能强，培育得到的细胞表型和数量稳定，培育方法简便可行。

Description

一种NK细胞的体外扩增培养方法

技术领域

本发明属于细胞培育技术领域，具体涉及一种NK细胞的体外扩增培养方法。

背景技术

随着医学的进步，癌症患者的生存率得到明显改善，但目前仍然还是难治性疾病。癌的治疗的标准方法为外科疗法、化学疗法和放射线疗法，近年来，免疫疗法作为新的治疗法备受瞩目，到目前为止已经开发了各种方法。所谓免疫疗法，是指利用体内的免疫力来进行癌、病毒感染症等的治疗的方法。例如细胞因子疗法、细胞免疫疗法。

所谓细胞因子疗法，是指通过将具有使T细胞、NK细胞等淋巴细胞增殖或活化的作用的细胞因子直接给予生物体内，从而杀伤癌细胞、病毒感染细胞的治疗法。例如，有通过给予白细胞介素2(IL-2)、干扰素的治疗法等。然而，该治疗法在临床结果上并未得到预期那样的效果，还存在产生器官功能不全、体液潴留(给予IL-2的情况下)、感冒症状或精神障害(给予干扰素的情况下) 等严重副作用的问题。

细胞免疫疗法是通过将从患者采取的免疫细胞在体外进行活化、增殖等的处理后再次回输到该患者的体内，从而提高该患者的免疫力的治疗法。根据体外处理的免疫细胞的种类，细胞免疫疗法分为激活淋巴细胞疗法、树突状细胞疗法。其中，关于树突状细胞疗法，由于临床试验才刚刚开始，所以还未能得到足以判断有效性的结果。

激活淋巴细胞疗法进一步分为在体外对T细胞进行活性、增殖处理的狭义的激活淋巴细胞疗法(激活T淋巴细胞疗法、或狭义的过继免疫疗法)和对NK细胞进行活化、增殖处理的激活NK细胞疗法。

狭义的激活淋巴细胞疗法，例如有LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)疗法、 TIL(肿瘤组织浸润淋巴细胞)疗法、CTL(细胞毒性淋巴细胞)疗法等。

LAK疗法是培养从患者采取的淋巴细胞，使T细胞、NK细胞活化或增殖后回输到体内的方法。该方法为了维持给予体内的LAK活性，需要向体内给予大量的IL-2，因此，存在伴有与前述利用IL-2的细胞因子疗法同样的副作用、不能获得预期那样的效果的问题。

TIL疗法是采取浸润到肿瘤组织等的淋巴细胞，与LAK疗法同样地体外培养后回输到体内的方法。然而，该方法存在只能从手术摘出组织采取淋巴细胞、不能获得预期那样的效果的问题。

CTL疗法是将淋巴细胞与手术采取的癌细胞等一起培养，通过刺激来对该癌细胞等诱导特异性淋巴细胞的方法。也有有效案例的报告，但是存在必须通过手术采取癌细胞，因而侵袭性极高，适应症例有限，另外在不能采取并培养癌细胞的情况下治疗变得困难的问题，只对表达主要组织相容性抗原的癌有效等的问题。

另一方面，激活NK细胞疗法为将增殖和活化了的NK细胞移入体内的方法。 NK细胞是不需要被抗原致敏，就能够杀伤癌细胞、病毒感染细胞的淋巴细胞集团。在动物实验中，已知它能够抑制癌的浸润、转移，此外，长期大规模队列研究中也有外周血中的NK细胞活性高的人相比于低的人癌的发生率显著降低这样的报告。因此，如果在体外大量地增殖并活化患者的NK细胞，然后重新移入该患者体内，则能够治疗癌、病毒感染症等。然而，NK细胞通常在健常人的淋巴细胞中也只存在几～十几％左右，癌患者细胞中含量更低。此外，即使NK 细胞数相同，与健康人相比，癌患者的血中的NK细胞的癌细胞毒活性也多降低。因此，需要通过培养进行增殖和活化。以往生物体外的NK细胞增殖一直是困难的，但是通过近年来很多的研究，已有报告NK细胞增殖培养的成功案例。然而，那些方法为了强化NK细胞，利用培养的癌细胞、基因导入细胞，在临床应用时的安全性、实用性方面存在未解决的问题。此外，关于NK细胞增殖效率、细胞活性、纯度，也处于未达到充分满足的水平的状况。

如上，以往的免疫疗法的任何一种方法都存在不能得到充分的治疗效果、伴有严重的副作用、或者其他应该改善的问题。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种NK细胞体的外扩增培养方法，在培育NK细胞时，具有安全(无异体细胞，因子不直接给与患者体内)、稳定(细胞纯度高，收获数量多，细胞活率高)、制作简单方便(无需与其他组织、细胞共培养，操作难度低)等显著优势。在激活扩增NK细胞的同时控制T 细胞的活化生长，最终达到本产品NK细胞高纯度的特点。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种NK细胞体的外扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)向处理后包含NK细胞的血液中加入刺激因子和终浓度为0.1～10nM 的比例调节剂，于36.5～37.5℃、5～10％CO₂培养3～4天；

(2)在进行步骤(1)培养的同时调整细胞密度为0.5～1.5×10⁶个/mL，再继续添加终浓度为0.1～10nm的比例调节剂，然后于36.5～37.5℃、5～10％CO₂，添加终浓度为100～500U/mL的细胞因子继续培养20～30天即可。

进一步地，本发明中所谓血液，是指从生物体采取的包含有NK细胞的血液成分。例如有全血、脐带血、骨髓液或其成分的一部分、例如单核细胞等。可以使用任一种血液，但在NK细胞制剂的制造上，红细胞、粒细胞等血液成分可成为阻碍因素，因此优选单核细胞。其中，特别优选从外周血得到的外周血单个核细胞(PBMCs)。这是因为，如果是外周血，则不仅能够不选择时期地从生物体容易地采取，而且对供体的侵袭性低。

从生物体采取的意思是血液来自生物体。例如，除了像外周血、骨髓液那样将注射针等直接刺入生物体来采取的血液、像脐带血那样从分娩后的脐带直接采取的血液之外，还可以考虑从移植器官的回流液采取的血液。也可以是从向前述采取的血液中添加肝素等实施抗凝处理后或进一步分离单核细胞后、将它们暂且冷藏或冷冻保存后的保存血液等中采取的血液。

其中，对于外周血，注射外周部的静脉等进行采取即可；对于骨髓液，通过骨髓穿刺采取即可；对于脐带血，将针刺入分娩后胎盘的娩出前脐带进行采取即可。

进一步地，刺激因子为通过与NK细胞表面上的受体特异性结合，在该NK 细胞的细胞内传递增殖信号或活化信号的功能的因子；或与NK细胞以外的单核细胞的细胞表面的受体结合，诱导体液因子产生释放的因子。

进一步地，刺激因子包括抗CD16抗体、OK432和细胞因子。

进一步地，抗CD16抗体的终浓度为0.1～10μg/mL；OK432的终浓度为 0.008～0.015KE/mL；细胞因子的终浓度为50～100ng/mL。

其中，抗CD16抗体是针对CD16抗原的抗体。CD16抗原是NK细胞、粒细胞的标志物，作为休止期的大多数NK细胞的细胞表面上存在的Fc受体的结构蛋白质FcγRIII而为人所知。尽管抗CD16抗体的NK细胞增殖诱导机制尚不明确，但通过将抗CD16抗体与IL-18等的细胞因子一起添加，与单独添加细胞因子的情况相比，能够飞跃性地增大NK细胞的增殖诱导率。本抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体和它们的片段中的任一种。抗CD16抗体优选3G8那样的抗人CD16单克隆抗体。

OK432是以青霉素处理后的溶血性链球菌Su株为有效成分的抗肿瘤制剂，已知OK432作为免疫佐剂，能够与单核细胞等的细胞表面TLR结合，活化单核细胞，激活免疫反应。

是负责细胞间的信号转导的多种蛋白质类激素，在免疫系统中，如前所述具有强化T细胞、NK细胞等淋巴细胞的作用。例如，可举出白介素、TNF、 MCP等。适合作为本发明的NK细胞增殖刺激因子的细胞因子为IL-18或IL-2。

进一步地，抗CD16抗体通过固相化方式固定于支持体上。通过将抗CD16 抗体固相化，其与NK细胞在一定方向上的接触频率变高，能够比游离状态时更高效地给予NK细胞增殖刺激。这里所说的“支持体”，是指固定抗体的支架。支持体的材质只要是能够以稳定的状态固定抗体的材质，就不特别限定。例如，可以利用塑料等合成树脂、玻璃、金属等。对支持体的形状不特别限定，优选与培养液的接触表面积大到使得固相化于该支持体的抗体与NK细胞的接触频率更高的形状，可举出例如，球状珠、具有淋巴细胞大的孔的多孔质立方体等。

进一步地，将抗CD16抗体固相化于支持体的方法为：

如果支持体的材质为像塑料等这样与抗体亲和性高的物质，则只要使抗体溶液与支持体接触，并保持规定的温度和时间，就能够固定。例如，如果是固相化于内壁表面积150cm²的塑料瓶的情况，则使用1μg/mL的抗CD16抗体溶液15mL左右即可。此外，25cm²和75cm²的培养瓶的情况下，分别使用5mL 和10mL即可。其后，在4℃下孵育24小时，抗CD16抗体附着于支持体。

另外，将抗CD16抗体固相化于支持体后，期望根据需要，洗涤固相化了抗 CD16抗体的支持体，除去抗CD16抗体溶液。例如，用适量的PBS洗涤支持体 2～3次左右即可。这样在支持体上固相化了抗CD16抗体的培养容器通过在4℃ 保存，能够不使抗体活性减少或失活地使用约1个月。

进一步地，细胞比例调节剂为雷帕霉素。

进一步地，血液的具体处理过程如下：

(1)将从静脉采取的外周全血转移至无菌离心管中，以900～1200g离心10 分钟后，收集上清作为血浆；将血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在 900～1200g离心10分钟后，于4℃保存，得自体血浆；

(2)向血浆分离后的成分中添加为未分离前的外周全血2倍体积的无菌 PBS，制成血细胞溶液；

(3)将血细胞溶液重叠在淋巴细胞分离液上，使用密度梯度离心法除去红细胞、粒细胞，分离得到PBMCs；然后用PBS洗涤分离得到的PBMCs 2～3次；

(4)用X-VIVO 15培养基将PBMCs细胞重悬后接种到培养皿中，贴壁 30min后，将悬浮的细胞移入离心管中，并用添加有自体血浆的X-VIVO 15培养基调整PBMCs的细胞密度为1～3×10⁶个/mL即可；所述自体血浆的加入量为 X-VIVO 15培养基体积的5～10％。

进一步地，步骤(2)中进行培养时，每2～4天补加含有700U/mL的细胞因子的X-VIVO 15培养基一次，直至培养结束。

进一步地，步骤(2)是通过含有自体血浆的X-VIVO 15培养基来调整细胞密度的；自体血浆的加入量为X-VIVO 15培养基体积的5～10％。

本发明的有益效果为：

1、本发明在培养NK细胞的过程中，无异体细胞，所涉及因子均为临床级别对人体无害的因子，安全性能强，培育得到的细胞表型和数量稳定，培育方法简便可行。

2、本发明培育得到的NK细胞的增殖率及纯度均比以往常规方法有所提高。

附图说明

图1为实施例1的流式细胞检测结果图；

图2为实施例2的流式细胞检测结果图；

图3为NK细胞表型的流式细胞检测结果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

1.NK细胞的体外扩增培养方法

1-1.概要

本发明方式的特征在于，用增殖刺激因子来刺激从生物体采取的血液中的 NK细胞，然后在生理细胞温度下培养，期间通过使用雷帕霉素降低从生物体采取的血液中所含的T细胞的生长速度，从而改变培养体系的细胞比例。

1-2.构成

本方式的NK细胞制剂的制造方法包括刺激工序、细胞比例调整工序和培养工序。以下关于各工序的构成具体进行说明。另外，本方式中，前提是各操作原则上以使用经灭菌处理的试剂、培养基、器具等，培养在洁净室内的洁净工作台等无菌环境下进行。这是为了防止杂菌等的污染。

1-2-1.刺激工序

所谓“刺激工序”，是通过NK细胞增殖刺激因子来刺激从生物体采取的血液中所含的NK细胞的工序。

(1)血液

本发明中所谓“血液”，是指包含NK细胞的血液成分。例如有全血、脐带血、骨髓液或其成分的一部分、例如单个核细胞等。可以使用任一种血液，但在NK细胞制剂的制造上，红细胞、粒细胞等血液成分可为阻碍因素，因此优选单个核细胞。其中，特别优选从外周血得到的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells:以下称为“PBMCs”)。这是因为，如果是外周血，则不仅能够不选择时期地从生物体容易地采取，而且对供体的侵袭性低。

所谓“从生物体采取”，意思是来自生物体。例如，除了像外周血、骨髓液那样将注射针等直接刺入生物体来采取的血液、像脐带血那样从分娩后的脐带直接采取的血液之外，还可以考虑从移植器官的回流液采取的血液。也可以是从向前述采取的血液中添加肝素等实施抗凝处理后或进一步分离单个核细胞后、将它们暂且冷藏或冷冻保存后的保存血液等中采取的血液。

(2)血液的制备

本工序中使用的血液为从生物体直接采取的血液的情况下，其采取方法依照公知的采血方法即可。例如，对于外周血，注射外周部的静脉等进行采取即可；对于骨髓液，通过骨髓穿刺采取即可；对于脐带血，将针刺入分娩后胎盘的娩出前脐带进行采取即可。以下，关于外周血的采取，举出一例进行具体说明。

外周全血可以通过将注射针刺入生物体的外周部血管，例如，静脉或动脉，通过真空采血管、采血袋等公知的全血采取法进行采取。采取的容量根据必要的NK细胞血液制剂的量而变动，例如，制造对成人一人给予一次的前述血液制剂的情况下，通常有40mL～60mL即可。其中，像癌患者那样血中的PBMCs 数极其低下的情况下，也可以通过成分采血选择性地仅采取必要量的PBMCs。为了采取后血液不凝固，优选肝素无菌抗凝管等。此外，也可以从外周全血分离出血浆，只使用血细胞成分。血浆的分离例如可以如下实现：将外周全血转移至离心管，以800g～1000g离心10～20分钟，取其上清液，从而实现。分离的血浆可以通过56℃下加温30分钟左右进行灭活，以800g～1000g离心10～20分钟，除去血小板等沉淀物，从而作为细胞培养的营养源使用。

根据需要，也可以从外周全血进一步分离PBMCs。PBMCs可以使用密度梯度离心法，从外周全血或血浆分离后的血细胞成分中得到。这些比重液利用市售的分离液等是便利的。关于PBMCs的分离方法，依照试剂盒附带的说明书即可。

为了除去比重液，将分离后的PBMCs用PBS、培养细胞用的培养基洗涤数次。其中，作为培养细胞用的培养基，可以使用例如，不含血清的PBS或 X-VIVO15培养基或其他用于培养的无血清培养基等。优选用前述PBS或培养基洗涤后，用血细胞计数板计算回收的PBMCs数目。通常，健康成人的情况下，可以从40mL～60mL的外周全血回收4×10⁷个以上的PBMCs。

(3)NK细胞刺激因子

本发明中所谓“NK细胞增殖刺激因子”，是指直接地或间接地强化NK细胞的因子。直接强化的因子中，可举出例如，具有通过与NK细胞表面上的受体特异性结合，在该NK细胞的细胞内传递增殖信号或活化信号的功能的因子。此外，间接地诱导的因子中，可举出例如，与NK细胞以外的单个核细胞等的细胞表面的受体结合，诱导细胞因子等体液因子产生释放的因子。NK细胞被释放的体液因子间接地强化。

本发明的NK细胞增殖刺激因子包含抗CD16抗体、OK432和细胞因子作为必需的因子。

所谓“抗CD16抗体”，是针对CD16抗原的抗体。CD16抗原是NK细胞、粒细胞的标志物，作为休止期的大多数NK细胞的细胞表面上存在的Fc受体的结构蛋白质FcγRIII而为人所知。尽管抗CD16抗体的NK细胞增殖诱导机制尚不明确，但通过将抗CD16抗体与IL-18等的细胞因子一起添加能够飞跃性地增大NK细胞的增殖诱导率。本抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体和它们的片段中的任一种。抗CD16抗体优选3G8那样的抗人CD16单克隆抗体。

所谓“OK432”，是以青霉素处理后的溶血性链球菌Su株为有效成分的抗肿瘤制剂，已知OK432作为免疫佐剂，能够与单个核细胞等的细胞表面TLR结合，活化单个核细胞，激活免疫反应。

所谓“细胞因子”，是负责细胞间的信号转导的多种蛋白质类激素，在免疫系统中，如前所述具有强化T细胞、NK细胞等淋巴细胞的作用。例如，可举出白介素、TNF、MCP等。适合作为本发明的NK细胞增殖刺激因子的细胞因子为 IL-18。

(4)刺激方法

所谓“刺激”，是指通过使上述NK细胞增殖刺激因子接触NK细胞，从而强化该NK细胞。

作为具体的刺激方法，首先用培养基调制从生物体采取的血液、例如PBMCs 使得例如细胞密度为1×10⁶～2×10⁶个/mL。这里所用的培养基为X-VIVO15培养基。如前所述，自体血浆从血液采取工序后得到的血液来调制即可。例如，可以将采取的外周全血在室温(20℃～25℃：以下相同)下以1000g离心15分钟左右得到的上清作为自体血浆。

接着，向预先调制的包含PBMCs的培养液中添加NK细胞增殖刺激因子。

然后通过抗CD16抗体来刺激的情况下，可以向培养基中直接添加抗体或者以将该抗体固相化于支持体的状态添加，使得终浓度为0.1μg/mL～10μg/mL。优选为以固相化于支持体的状态添加。这是因为通过将抗CD16抗体固相化，其与 NK细胞在一定方向上的接触频率变高，能够比游离状态时更高效地给予NK细胞增殖刺激。这里所说的“支持体”，是指固定抗体的支架。支持体的材质只要是能够以稳定的状态固定抗体的材质，就不特别限定。例如，可以利用塑料等合成树脂、玻璃、金属等。对支持体的形状不特别限定，优选与培养液的接触表面积大到使得固相化于该支持体的抗体与NK细胞的接触频率更高的形状，可举出例如，球状珠、具有淋巴细胞大的孔的多孔质立方体等。

将抗CD16抗体固相化于支持体的方法，如果支持体的材质为像塑料等这样与抗体亲和性高的物质，则只要使抗体溶液与支持体接触，并保持规定的温度和时间，就能够固定。例如，如果是固相化于内壁表面积150cm²的塑料瓶的情况，则使用1μg/mL的抗CD16抗体溶液15mL左右即可。此外，25cm²和75cm²的培养瓶的情况下，分别使用5mL和10mL即可。其后，在4℃下孵育24小时，抗CD16抗体附着于支持体。

将抗CD16抗体固相化于支持体后，期望根据需要，洗涤固相化了抗CD16 抗体的支持体，除去抗CD16抗体溶液。例如，用适量的PBS洗涤支持体2～3 次左右即可。这样在支持体上固相化了抗CD16抗体的培养容器通过在4℃保存，能够不使抗体活性减少或失活地使用约1个月。

通过OK432来刺激的情况下，在包含PBMCs的培养液中以例如终浓度为 0.008KE/mL～0.015KE/mL、优选为0.01KE/mL添加OK432溶液即可。OK432 溶液可以用水(例如，注射用水)2mL溶解而调制。

通过细胞因子来刺激的情况下，既可以单独添加，也可以组合多种类型而添加。如果考虑成本方面等，优选单独添加IL-18。添加的量，例如，对于IL-18，优选终浓度为50ng/mL～100ng/mL的范围。

添加前述各NK细胞增殖刺激因子后，为了给予PBMCs充分的刺激，优选将该血液在后述的生理细胞温度保持1～3天。此期间可以与细胞比例调整工序同时进行。即，可以一边给予刺激一边调整细胞比例。

1-2-2.细胞比例调整工序

通过向接种的细胞悬液中加入细胞比例调节剂，从而使NK细胞特异性扩增的方法。例如，向细胞悬液中加入0.1nM～10nM的雷帕霉素。

1-2-3.培养工序

所谓“培养工序”，是在刺激工序、比例调整工序之后，将该血液在生理细胞温度下培养的工序。本工序的特征在于，一边维持NK细胞的强化，一边增加其细胞数。

所谓“生理细胞温度”，是指在培养细胞方面最适的温度。通常为提供使用的血液的哺乳动物的体温。因此，在前述哺乳动物为人的情况下，一般为37℃，在以该温度为中心小于0.5℃的范围内、即36.5～37.5℃即可。这是因为，培养箱内的温度有可能在前述温度范围内前后变化。

本工序可以将确保用初期刺激工序中给予的NK细胞增殖刺激因子充分刺激NK细胞的时期和这些细胞的培养同时进行。培养在处于生理细胞温度条件下的5％CO2培养箱内进行14天～20天。期望在培养期内以2～5天为间隔定期地添加新的培养基及细胞因子，该细胞因子为IL-2，优选终浓度为100～500U/ml。

培养中使用的培养基原则上可以使用细胞培养中使用的任一种一般的培养基。优选为X-VIVO15培养基。培养后确认培养液中无细菌、内毒素的污染。菌的有无可以通过菌落形成试验法来检验，另外内毒素的有无可以通过市售的 ELISA等的比色法、鲎试验等的混悬法来检验。

实施例1

一种NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)自体血浆的制备

用肝素抗凝采血管从供体的静脉采取10mL的外周全血。将采取的外周全血转移至无菌锥形离心管，以900g离心10分钟后，将上清作为血浆进行分离。向采取血浆后残余的血细胞成分中添加相对于血浆分离前的全血量为2倍量的无菌PBS，制成血细胞溶液，用于进行后续的PBMCs的分离。将血浆在56℃ 下处理30分钟进行灭活，进一步在900g下离心10分钟，除去血小板等。其后，将血浆保存于4℃。将该血浆作为添加到培养基的细胞培养用自体血浆，在每次配置培养基时使用必要量。

(2)PBMCs的分离

a、将血细胞溶液重叠在淋巴细胞分离液上，使用密度梯度离心法除去红细胞、粒细胞，分离PBMCs。分离液使用天津灏洋的人外周血淋巴细胞分离液，操作步骤依照附带的说明书进行。然后向分离得到的PBMCs中添加40mL的 PBS，洗涤2～3次。

b、用5mLX-VIVO15培养基将PBMCs细胞重悬后接种到一个60mm的培养皿中，贴壁30min。然后将悬浮的细胞移入离心管中，取出一部分样品，用血细胞计数板计算其数目。细胞数为6×10⁶个的PBMCs。用添加了5％(V/V)的自体血浆的X-VIVO15培养基调整PBMCs的细胞密度为1.5×10⁶个/mL即可。

(3)培养基处理

在12孔板一个孔中加入1mLX-VIVO15培养基、3μg固化于支持体上的抗 CD16抗体(Clone3G8)，于4℃静置一夜使抗CD16抗体溶液固相化于皿内面。然后除去X-VIVO15培养基溶液，并用无菌PBS洗涤1次。

(4)刺激及抑制工序

取2mL步骤(2)制备得到的PBMCs悬浊液，将其加入至步骤(3)处理后的孔板内，再继续加入终浓度依次为为0.01KE/mL、50ng/mL以及1nM的 OK432、IL-18和雷帕霉素，混匀，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养3～4天；

(5)培养工序

在第4天时，转瓶，用含5％(V/V)自体血浆的X-VIVO15培养基将细胞密度调整为0.8×10⁶个/mL，并添加终浓度为1nM的雷帕霉素；此后每2～4天补加含500U/mL的IL-2的X-VIVO15培养基，于37℃的5％CO₂培养箱培养20天即可。

(6)污染实验

细菌、霉菌的有无可通过在琼脂培养基上涂布一部分的培养液，通过菌落形成测定法来确认、内毒素可用鲎试剂法检测。

(7)NK细胞收集

将培养3周左右的培养液转移至离心管，以400g进行离心10分钟后，抛弃上清。添加50mLPBS来混悬沉淀，再次以400g离心10分钟后，弃上清，得目标细胞。

(8)NK细胞表型检测

培养液中的NK细胞的测定在第20天使用流式细胞仪分析法进行。具体地说，使用用荧光物质标记的单克隆抗体(FITC标记-抗CD3抗体、PE标记-抗 CD56抗体、PI标记细胞活性)的组合对血液制剂中的NK细胞进行免疫染色。免疫染色通过向细胞悬浮液中添加各抗体的附带说明书中推荐的抗体量，室温下遮光染色15分钟，然后离心，冲洗包含荧光抗体的上清来进行。接着，通过流式细胞仪(SonySH800)以上述抗体的组合测定NK细胞。流式细胞检测结果见图1，其中，图1左侧图谱为表型检测结果，右侧图谱为活性检测结果；细胞计数结果见表1。

表1细胞计数

培养天数	细胞量	活率	NK细胞比例
				0	3×10<sup>6</sup>	-----	-----
7	9×10<sup>6</sup>	-----	-----
				14	6×10<sup>7</sup>	-----	-----
20	8×10<sup>8</sup>	96％	81％

实施例2

一种NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)自体血浆的制备

用肝素抗凝采血管从供体的静脉采取20mL的外周全血。将采取的外周全血转移至无菌锥形离心管，以900g离心10分钟后，将上清作为血浆进行分离。向采取血浆后残余的血细胞成分中添加相对于血浆分离前的全血量为2倍量的无菌PBS，制成血细胞溶液，用于进行后续的PBMCs的分离。将血浆在56℃ 下处理30分钟进行灭活，然后进一步在900g下离心10分钟，再除去血小板等。其后，将血浆保存于4℃。将该血浆作为添加到培养基的细胞培养用自体血浆，在每次配置培养基时使用必要量。

(2)PBMCs的分离

b、用10mLX-VIVO15培养基将PBMCs细胞重悬后接种到一个100mm的培养皿中，贴壁30min。然后将悬浮的细胞移入离心管中，取出一部分样品，用血细胞计数板计算其数目。细胞数为1.8×10⁷个的PBMCs。用添加了5％(V/V) 的自体血浆的X-VIVO15培养基调整PBMCs的细胞密度为1.5×10⁶个/mL即可。

(3)培养基处理

在T25瓶中加入2mLX-VIVO15培养基、8μg固化于支持体上的抗CD16抗体(Clone3G8)，于4℃静置一夜使抗CD16抗体溶液固相化于瓶内面。然后除去 X-VIVO15培养基溶液，并用无菌PBS洗涤1次。

(4)刺激及抑制工序

取5mL步骤(2)制备得到的PBMCs悬浊液，将其加入至步骤(3)处理后的T25瓶内，再继续加入终浓度依次为为0.01KE/mL、50ng/mL以及1nM的 OK432、IL-18和雷帕霉素，混匀，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养3天；

(5)培养工序

在第4天时，用含5％(V/V)自体血浆的X-VIVO15培养基将细胞密度调整为0.8×10⁶个/mL，并添加终浓度为1nM的雷帕霉素；此后每2～4天补加含 500U/mL的IL-2的X-VIVO15培养基，于37℃的5％CO₂培养箱培养20天即可。

(6)污染实验

(7)NK细胞收集

(8)NK细胞表型检测

培养液中的NK细胞的测定在第20天使用流式细胞仪分析法进行。具体地说，使用用荧光物质标记的单克隆抗体(FITC标记-抗CD3抗体、PE标记-抗CD56 抗体、PI标记细胞活性)的组合对血液制剂中的NK细胞进行免疫染色。免疫染色通过向细胞悬浮液中添加各抗体的附带说明书中推荐的抗体量，室温下遮光染色15分钟，然后离心，冲洗包含荧光抗体的上清来进行。接着，通过流式细胞仪(SonySH800)以上述抗体的组合测定NK细胞。流式细胞检测结果见图2，其中，图2左侧图谱为表型检测结果，右侧图谱为活性检测结果；细胞计数结果见表2。

表2细胞计数

培养天数	细胞量	活率	NK细胞比例
				0	7.5×10<sup>6</sup>	-----	-----
7	3×10<sup>7</sup>	-----	-----
				14	2×10<sup>8</sup>	-----	-----
20	2×10<sup>9</sup>	96％	86％

由图1、图2、表1和表2的检测结果可知，本发明方法培养得到的NK细胞的存活率和纯度均高于常规培养方法，同时，本发明在培养NK细胞时，无异体细胞、所涉及因子均为临床级别对人体无害的因子，安全性能强，培育得到的细胞表型和数量稳定，培育方法简便可行。

对比例

展示一种来自其他公司的较好的NK培养试剂盒培养NK细胞的结果

(1)自体血浆的制备

首先，制备细胞培养用自体血浆。用肝素抗凝采血管从供体的静脉采取 20mL的外周全血。将采取的外周全血转移至无菌锥形离心管，以900g离心10 分钟后，将上清作为血浆进行分离。向采取血浆后残余的血细胞成分中添加相对于血浆分离前的全血量为2倍量的无菌PBS，制成“血细胞溶液”，用于以下的PBMCs的分离。将血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900g下离心 10分钟，除去血小板等。其后，将血浆保存于4℃。将该血浆作为添加到培养基的细胞培养用自体血浆，在每次配置培养基时使用必要量。

(2)PBMCs的分离

将血细胞溶液重叠在淋巴细胞分离液上，使用密度梯度离心法除去红细胞、粒细胞，分离PBMCs。分离液使用天津灏洋的人外周血淋巴细胞分离液，步骤依照附带的说明书。向回收的PBMCs中添加40mL的PBS，洗涤2～3次。

(3)培养工序

培养细胞用试剂盒中的NK扩增培养基。用添加了5％(V/V)的上述自体血浆的NK扩增培养基调整PBMCs使得细胞密度为1.5×10⁶个/mL。

在T75瓶中加入3mL PBS、1支因子A，在37℃下静置2小时。其后，抛弃前述溶液，用无菌PBS洗涤1次。

将前述调制的PBMCs的悬浊液10mL转移至前述瓶内。加入1支因子B和 1支因子C，混匀。将培养瓶转移至预先将内部设定为37℃的5％CO₂培养箱中，保持3-5天。

在第4天时，添加10mL NK扩增培养基，此后每3～4天补加含1000U/mL 的IL-2的NK扩增培养基，于37℃的5％CO₂培养箱培养20天。

(4)NK细胞收集

将培养3周左右的培养液转移至离心管，以400g进行离心10分钟后，抛弃上清。添加50mL PBS来混悬沉淀，再次以400g离心10分钟后，弃上清，得目标细胞。

(5)NK细胞表型检测

培养液中的NK细胞的测定在第20天使用流式细胞仪分析法进行。具体地说，使用用荧光物质标记的单克隆抗体(FITC标记-抗CD3抗体、PE标记-抗 CD56抗体)的组合对血液制剂中的NK细胞进行免疫染色。免疫染色通过向细胞悬浮液中添加各抗体的附带说明书中推荐的抗体量，室温下遮光染色15分钟，然后离心，冲洗包含荧光抗体的上清来进行。接着，通过流式细胞仪(SonySH800) 以上述抗体的组合测定NK细胞。检测结果分别见图3和表3。

表3细胞计数

培养天数	细胞量	活率	NK细胞比例
				0	1.5×10<sup>7</sup>	-----	-----
7	4×10<sup>7</sup>	-----	-----
				14	2.3×10<sup>8</sup>	-----	-----
20	1×10<sup>9</sup>	92％	65％

由表3和图3检测结果可看出，无论是表型、还是扩增能力，本发明方法均优于该市面上的试剂盒。

Claims

1.一种NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向处理后包含NK细胞的血液中加入刺激因子和终浓度为0.1～10nM的比例调节剂，于36.5～37.5℃、5～10％CO₂培养3～4天；

2.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述刺激因子为通过与NK细胞表面上的受体特异性结合，在该NK细胞的细胞内传递增殖信号或活化信号的功能的因子；或与NK细胞以外的单核细胞的细胞表面的受体结合，诱导体液因子产生释放的因子。

3.根据权利要求1或2所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述刺激因子包括抗CD16抗体、OK432和细胞因子。

4.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述抗CD16抗体的终浓度为0.1～10μg/mL；所述OK432的终浓度为0.008～0.015KE/mL；所述细胞因子的终浓度为50～100ng/mL。

5.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素、TNF或MCP中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述抗CD16抗体通过固相化方式固定于支持体上。

7.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述比例调节剂为雷帕霉素。

8.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述血液的具体处理过程如下：

(1)将从静脉采取的外周全血转移至无菌离心管中，以900～1200g离心10分钟后，收集上清作为血浆；将血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900～1200g离心10分钟后，于4℃保存，得自体血浆；

(2)向血浆分离后的成分中添加为未分离前的外周全血2倍体积的无菌PBS，制成血细胞溶液；

(4)用X-VIVO 15培养基将PBMCs细胞重悬后接种到培养皿中，贴壁30min后，将悬浮的细胞移入离心管中，并用添加有自体血浆的X-VIVO 15培养基调整PBMCs的细胞密度为1～3×10⁶个/mL即可；所述自体血浆的加入量为X-VIVO 15培养基体积的5～10％。

9.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)中进行培养时，每2～4天补加含有700U/mL的IL-2的X-VIVO 15培养基一次，直至培养结束。

10.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)是通过含有自体血浆的X-VIVO 15培养基来调整细胞密度的；所述自体血浆的加入量为X-VIVO 15培养基体积的5～10％。