CN109666640A - 自然杀伤细胞体外纯培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其包括如下步骤：采集外周血，分离单个核细胞，采用结合有特异性抗体的磁珠去除非NK细胞，得NK细胞群；将NK细胞群置于多重抗体包被的培养瓶中采用包含IL‑2、IL‑7、IL‑15、anti‑CD16、OK432以及灭活的自体血清的完全培养基进行激活培养，得激活的NK细胞群；将激活的NK细胞群置于无抗体包被的培养瓶中继续进行扩增培养，即得。该方法不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，能够整体上取得较高的扩增效率，同时使扩增后的NK细胞纯度达90％以上，实现了体外高效纯培养，便于满足临床使用。

Description

自然杀伤细胞体外纯培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞领域，尤其涉及一种自然杀伤细胞体外纯培养的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natμral killer，NK)是人体免疫细胞的一种，来源于骨髓淋巴细胞。在人体中，NK细胞主要分布在外周血和脾脏，同时，也少量存在于淋巴结等其他组织中。NK细胞主要存在于外周血和脾脏中，但是在不同人群中分布的比例不同，大致占外周血淋巴细胞的5％～15％。

NK细胞一般通过其表面表达的蛋白分子进行鉴定和筛选。由于该细胞表达CD56而缺失CD3，所以通常用标志物组合CD3-CD56+来定义NK细胞。此外，NK细胞还具有CD-16、CD-2以及NKP46等表面分子标记(Hadad et al.,Front Immμnol.,2015,6:495)。

NK细胞相对于其它类型的淋巴细胞，具有其自身的独特性质。其最重要的特性是NK细胞不表达特异性抗原识别受体。因此，NK细胞在杀伤靶细胞的过程中，不需要通过特异性的机制识别靶细胞，是人体快速抵抗外源物质入侵的第一道防线，可以广谱地杀灭各种病原物。同时，NK细胞的杀伤作用不受主要组织相容性复合体的限制，可以对多种肿瘤细胞迅速杀伤和溶解(Zamai et al.,J Immμnol,2007,178(7):4010.5-5016)。

在人体的免疫体统中，NK细胞是一类重要的免疫调节细胞，对抗外源性感染和肿瘤癌变细胞的第一道防线。NK细胞的特点在于其无需通过抗原预先致敏，因而可以快捷迅速地直接杀伤靶细胞。NK细胞杀灭靶细胞的方式主要包括：(1)对靶细胞释放穿孔素和颗粒酶；(2)抗体依赖的细胞毒性作用；(3)通过配体激活靶细胞的死亡受体；(4)释放TNF等细胞因子引发靶细胞凋亡(Smyth MJ,et al.,Nat Rev Cancer，2002Nov,2(11):850-61)。因此，NK细胞具有较低的免疫源性，并且相对其它免疫细胞具有广谱性的特点，在临床上，特别是细胞治疗中，具有其独特的优势。

然而，由于外周血中的NK细胞数量有限，且体外培养体系不成熟，NK 细胞的临床应用尚未取得较大突破。

目前，常规的NK细胞培养利用PBMC单核细胞作为起始培养物，并通过在培养基中添加抗体等成分诱导NK细胞的生长。该方法由于起始的 PBMC细胞是NK细胞含量仅占5-15％的细胞混合物，因而后续培养过程中无法避免其它类型细胞的污染，一般最终培养物中NK细胞的含量仅为 30-70％。此外，还有利用滋养层细胞刺激NK细胞生长的方法，然而该方法中由于滋养层细胞一般为灭活的癌细胞，临床使用的安全性风险较大。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种可显著提高NK细胞纯度的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，该方法不使用传统NK细胞培养过程所需的血清成分和滋养层细胞，简化了培养过程，适用于临床应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种自然杀伤细胞体外纯培养的方法，包括如下步骤：

采集外周血，分离单个核细胞，采用结合有特异性抗体的磁珠去除非 NK细胞，得分选的NK细胞群；

将所述分选的NK细胞群置于多重抗体包被的培养瓶中采用培养液进行激活培养，所述培养液为包含IL-2、IL-7、IL-15、anti-CD16、OK432以及灭活的自体血清的完全培养基，得激活的NK细胞群；

将所述激活的NK细胞群置于无抗体包被的培养瓶中继续进行扩增培养，即得。

在其中一个实施例中，所述结合有特异性抗体的磁珠为至少结合有 anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8及anti-CD19的葡聚糖磁珠。

在其中一个实施例中，通过磁力分选柱洗脱法分选所述NK细胞群，洗脱液为磁珠专用缓冲液。

在其中一个实施例中，所述培养液为包含300-600IU/mL的IL-2、15-250 IU/mL的IL-7、15-250IU/mL的IL-15、40-200ng/mL的anti-CD16、0.5-5μg/mL 的OK432以及10％灭活的自体血清的X-VIVO 15培养基。

在其中一个实施例中，所述多重抗体包被的培养瓶的包被步骤如下：将含包被浓度均为4-8μg/mL的CD16单抗、CD2单抗以及NKP46单抗的 X-VIVO 15培养基置于培养瓶中并覆盖瓶底，于0-4℃条件下包被，包被时间为8-12小时。

在其中一个实施例中，在所述激活培养和所述扩增培养的过程中，通过稀释法使NK细胞的密度始终保持在(1-2)×10⁶个/mL。

在其中一个实施例中，激活培养的时间为5天，扩增培养的时间为10-12 天。

在其中一个实施例中，所述分离单个核细胞包括如下步骤：

将采集的外周血置于肝素钠抗凝采血管中，再转移至离心管中，580g 转速下离心，得下层细胞层；

采用PBS缓冲液重悬所述下层细胞层，得细胞混合液；

将所述细胞混合液置于淋巴分离液的上方，380g转速下进行密度梯度离心形成四层，吸取白膜层，重悬于PBS缓冲液中，380g转速下再离心，弃上清液，将下层细胞用磁珠专用缓冲液重悬。

一种药物组合物，包括上述任一项所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法扩增培养获得的NK细胞。

上述任一项所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法扩增培养获得的NK 细胞在制备具有杀伤肿瘤靶细胞功效的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的自然杀伤细胞体外纯培养的方法通过磁珠负向筛选法，去除PBMC中非NK细胞，从源头上增加NK细胞培养物的纯度，同时可减轻分选过程对NK细胞的伤害。

值得说明的是，申请人通过大量研究发现，为了提高NK细胞体外培养的纯度，可采用特异性抗体结合磁珠的方法对PBMC细胞进行的NK细胞的定向分选，分选可分为正向和负向分选二种。正向分选直接在磁珠上抓取 NK细胞，而负向分选通过磁珠抓取非NK细胞的成分，从而得到纯的NK 细胞群。采用负向筛选的方法对NK细胞没有吸附，能够最大程度地减轻分选过程对NK细胞的伤害。

(2)本发明的自然杀伤细胞体外纯培养的方法可不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，培养基成分明确，安全性高，适合临床使用。

(3)与常规培养方法相比，本发明的自然杀伤细胞体外纯培养的方法通过选用含特定种类(IL-2、IL-7、IL-15、anti-CD16、OK432以及灭活的自体血清)及配比的培养液，能够整体上取得较高的扩增倍数和扩增效率，同时使扩增后的NK细胞纯度达90％以上，实现了体外高效纯培养，便于满足临床使用中对细胞数量的要求。

附图说明

图1为实施例1的自然杀伤细胞体外纯培养的方法的工艺流程示意图；

图2为在实施例1的自然杀伤细胞体外纯培养的方法的过程中所监测的细胞形态图；

图3为在实施例1的自然杀伤细胞体外纯培养的方法过程中对富集的NK细胞(Selected NK)在纯培养不同生长阶段统计的扩增倍数(Amplification number)柱状图；该统计是通过血球板计数计算细胞的总数，并通过与培养第一天(day 1)对比，计算其相对于第一天的扩增倍数；NK细胞扩增倍数的计算从培养第一天开始(day 1)直至第19天(day19)；

图4为实施例2的培养基中不同浓度的IL-2和OK432组合对NK细胞扩增效率的影响的统计图；其中，IL-2的试验浓度分别为300IU和600IU 单位，OK432的试验浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL，扩增效率的对比采用血球板细胞计数方法；

图5为实施例1富集的NK细胞在培养结束阶段(day 15-17)的流式细胞分析图；

图6为对比例1培养的NK细胞在培养结束阶段的流式细胞分析图；

图7为使用实施例1扩增培养的NK细胞终产物对癌症靶细胞K562的杀伤试验统计图。

具体实施方式

以下是对本发明进行举例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

原料来源：

用于磁珠负向分选结合的anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8以及anti-CD19 等抗体(Cat.No.130-050-101，130-045-101，130-045-201，130-050-301)：购自德国Miltenyi公司。

磁力架及配套磁力分选柱：购自德国Miltenyi公司。

CD16单抗、CD-2单抗和NKP46单抗：购自美国ThermoFisher公司。

重组人白介素2(IL-2)、重组人白介素7(IL-7)、重组人白介素(IL-15)：购自近岸蛋白质科技有限公司。

OK432：购自沃卡威(北京)生物技术有限公司。

X-VIVO15造血细胞培养基：购自美国Lonza公司。

淋巴细胞分离液：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

细胞培养瓶：购自美国Corning公司。

实施例1

请结合图1，本实施例提供一种自然杀伤细胞体外纯培养的方法，包括如下步骤：

S1，采集外周血，分离PBMC：

从静脉血管中抽取50mL外周血，置于肝素钠抗凝采血管中。随后，将外周血转移至50mL离心管中，580g转速条件下离心30分钟，离心完毕，离心管内液体分为二层，上层为血浆，下层为细胞层。

小心吸取上层血浆，置于50mL离心管中，56℃干浴灭活30分钟，随后在800g转速条件下离心20分钟，去上清，分装保存于-20℃冰箱中。

用约25mL PBS缓冲液重悬下层细胞层，得混合均匀的细胞混合液。取二只新的50mL离心管，分别加入15mL淋巴分离液，然后将混合均匀的细胞混合液缓慢加入到淋巴分离液的上方，注意控制速度，不得使细胞混合液与淋巴分离液混合。随后在380g转速条件下离心30分钟，进行密度梯度离心，离心完成后，离心管内的液体分为四层，吸取白膜层(白膜层为从上往下计数的第二层)，加入到新的50mL离心管中，约提取有15-20mL液体；然后向离心管中加入PBS缓冲液至液体总体积约为50mL，混匀，再在380g 转速条件下离心5分钟，弃上清，然后用30mLMiltenyi磁珠专用缓冲液重悬浮下层沉淀的细胞，并计数，计算细胞数量后，再次在380g转速条件下离心5分钟，得PBMC。

S2，通过磁珠从PBMC中负向分选NK细胞群：

根据细胞计数结果，用Miltenyi磁珠专用缓冲液重悬PBMC，控制密度为每10⁷细胞/40μL缓冲液，加入Biotin标记的CD-3、CD-4、CD-8、CD-19 的抗体混合物，标准均为10μL抗体/每10⁷细胞，置于4℃冰箱中，孵育5 分钟后，再加入每10⁷细胞/30μL缓冲液，将细胞悬浮液体积增大。随后，加入Biotin标记的磁珠，其用量为每10⁷细胞/20μL磁珠悬液，混合均匀，置于4℃冰箱中，孵育10分钟，得细胞悬液。

用3mL磁珠专用缓冲液洗涤一次性磁力分选柱及Miltenyi磁力架。随后将上述细胞悬液加入分选柱中，此过程中非NK细胞的成分被吸附到磁力器上，而流出的溶液中为经过纯化的NK细胞。用无菌试管收集流出的液体，完成后，再加入3mL磁珠专用缓冲液洗涤将分选柱上未被吸附且未流出的 NK细胞冲出，收集。收集完毕，380g转速条件下离心5分钟，用约12mL 培养基将沉淀的细胞重悬。该用于重悬细胞的培养基选用后续步骤培养的培养基。

S3，将分选的NK细胞群进行体外大量扩增：

将步骤S2收集的NK细胞悬浮液置于多种抗体包被的培养瓶中采用培养液进行激活培养5天，再转入无抗体包被的培养瓶中继扩增续培养至15-17 天，收集细胞培养产物。体外纯培养期间，控制NK细胞浓度始终在(1-2) ×10⁶个/mL。若需要，通过补加培养基的方式进行稀释。

其中，多种抗体包被的培养瓶的包被方法为：用无血清X-VIVO 15培养基稀释抗人CD16单抗、CD2单抗和NKP46单抗，将其浓度均调整为4 μg/mL，继而将6mL含有的上述单抗的无血清培养基加入到培养瓶中，使液体均匀覆盖瓶底，置于4℃冰箱中，包被过夜，即得。

其中，培养液为添加有10％的灭活自体血清、500IU/mL的IL-2、20 ng/mL的IL-7、20ng/mL的IL-15、50ng/mL的anti-CD16以及4μg/mL的 OK432的X-VIVO 15培养基。

此后的培养过程，一直使用上述培养液，直至收集的自体血清用完。分别在第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天、第15天取样，进行细胞计数，结果见图3，并使用合适体积的培养液稀释NK细胞，使其细胞密度保持在(1-2)×10⁶个/mL。第15天，若细胞数量仍未达到要求，可继续培养至第17天，否则在第15天收获细胞。另外，在培养过程中，可根据培养物的体积选择相应的培养瓶，T75培养瓶中可容纳约50mL培养基，其后转入T175培养瓶中。在培养过程的后期，可相应增加T175培养瓶的数量，或转入细胞培养袋中继续培养。

由图3可以看出，采用本实施例的方法培养时，在NK细胞培养的第1 天至第5天，NK细胞处于适应环境和抗体激活的阶段，细胞处于激活期和休眠期，此阶段细胞增殖处于相对平静的时期，细胞数量的增加不显著，可简称为“激活培养”。从第6天至第15天(或第17天)，NK细胞处于快速增殖的阶段，此阶段细胞数量增长较快，尤其在第6天至第13天处于指数生长期，并于培养的第14天达到约150倍的扩增效率，最终在第17天达到峰值，扩增倍数达到约1008倍，可简称为“扩增培养”。

实施例2培养基组成对NK细胞扩增效率的影响

本实施例通过采用实施例1的自然杀伤细胞体外纯培养的方法探究培养液的组成对NK细胞扩增效率的影响。其中，对照培养液的组成如下表1所示：

表1对照培养液组成表

本实施例对不同培养条件的细胞进行计数，以“OK432的浓度为0μg/mL， IL-2的浓度为300IU”为增值速率统计基准，比较其增殖的速率，统计结果见图4。

由图4可见，在相同的OK432浓度条件下，较高浓度的IL-2对NK细胞增殖的影响明显。在培养液中含有0.5-2μg/mL OK432的条件下，添加600 IU单位的IL-2相比300IU单位促进细胞增殖1.43-1.97倍。更重要的是，在 300IU的IL-2的条件下，培养液中通过添加OK432可大幅提高NK细胞的增殖速率。另外，采用含5μg/mL OK432的培养液相对于含0.5μg/mL的OK432的培养液，可将NK细胞的增值速率提高约3倍。

对比例1

本对比例提供一种自然杀伤细胞体外培养的方法，其与实施例1的自然杀伤细胞体外纯培养的方法的区别在于：不预先采用磁珠负向筛选PBMC 细胞中的NK细胞。培养期间采用与磁珠负向筛选法同样的培养液，并根据需要使用合适体积的培养液稀释NK细胞，维持细胞密度在(1-2)×10⁶个/mL。在第15天时，取样进行流式细胞分析。

NK细胞纯度和产率的鉴定

从实施例1和对比例1中，从培养过程的第15天的细胞培养物中取出约5mL培养基，进行计数。计数采用血球板的方法或者全自动细胞计数仪，并通过整体细胞培养物的体积计算出NK细胞的产率。计数完毕后，将取出的培养物全部转入15mL的离心管，以380g转速条件下离心5分钟，并弃去上清。用新鲜的X-VIVO 15培养基(不含血清或其它添加物)约3mL重悬浮NK细胞，得NK细胞悬浮液，并使用CD-3抗体、CD-4抗体、CD-8 抗体、CD-19抗体、CD-16抗体、CD-56抗体进行流式细胞分析。

流式细胞分析的具体程序如下：在每个5mL流式细胞仪检测管中加入 3mLNK细胞悬浮液，380g转速条件下离心5分钟，弃去上清，然后用PBS 缓冲液洗涤细胞，然后再次用380g转速条件离心5分钟，弃上清。随后，在室温下用人源IgG对细胞样品孵育10分钟，进行背景封闭。继而，将适量的上述抗体加到细胞样品中，于4℃冰箱中孵育30分钟。最后，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，并以300μL PBS缓冲液重悬细胞样品，得待测试细胞样品。处理完成的待测试细胞样品在流式细胞仪上以标准程序分析，通过上述抗体的应用，可鉴定细胞群体中的NK细胞、诱导T细胞、细胞毒性T细胞、B细胞以及NKT细胞等，统计结果分别见图5、表2和表3。表2为对比例1的细胞群体鉴定结果，表3为实施例1的细胞群体鉴定结果。

表2对比例1的细胞群体鉴定结果统计表

CD3<sup>+</sup>(总T细胞)	65.4％
		CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>(辅助/诱导T细胞)	3.7％
CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>(抑制/细胞毒T细胞)	48.2％
		CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>/CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>	0.08％
CD3<sup>-</sup>CD19<sup>+</sup>(B细胞)	未见
		CD3<sup>-</sup>(CD16<sup>+</sup>/CD56<sup>+</sup>)(NK细胞/自然杀伤细胞)	31.1％
CD3<sup>+</sup>(CD16<sup>+</sup>/CD56<sup>+</sup>)	12.6％

表3实施例1的细胞群体鉴定统计表

CD3<sup>+</sup>(总T细胞)	未见
		CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>(辅助/诱导T细胞)	未见
CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>(抑制/细胞毒T细胞)	未见
		CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>/CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>	未见
CD3<sup>-</sup>CD19<sup>+</sup>(B细胞)	未见
		CD3<sup>-</sup>(CD16<sup>+</sup>/CD56<sup>+</sup>)(NK细胞/自然杀伤细胞)	97.3％
CD3<sup>+</sup>(CD16+/CD56<sup>+</sup>)	未见

由图5、图6以及上表2和表3可以看出，对比例1未筛选的培养方法获得的NK细胞的比例仅为31.1％，占据细胞培养物中65.4％的仍为T细胞；而在实施例1筛选扩增的NK细胞培养物中，NK细胞的比例高达97.3％，其余T细胞和B细胞等的比例总和为约2.7％。可见，实施例1采用磁珠负向筛选富集后扩增的NK细胞的培养物的纯度明显高于对比例1的常规未筛选方法的细胞培养物的纯度。

NK细胞肿瘤靶细胞杀伤能力检测

NK细胞对靶细胞的杀伤能力通过与人慢性髓系白血病细胞K562的共培养进行检测，具体为检测乳酸脱氢酶的释放(LDH release)，试剂盒购自北京碧云天生物技术公司。K562细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中悬浮培养，并使用处于对数生长期的细胞用于实验。

NK细胞对靶细胞的杀伤能力检测包括如下步骤：准备新鲜的NK细胞样品，并计数，用新鲜的不含血清的RPMI 1640培养基稀释为1×10⁷/mL的细胞悬液。同时，将K562细胞稀释为1×10⁵/mL的细胞悬液，并加入到圆底的96孔板中，每孔加入100μL。用无血清的RPMI1640培养基调节NK细胞的浓度，使得每100μL NK细胞与K562靶细胞的比例分别为5:1、10:1、 20:1(记为NK20/K562)、25:1、50:1(记为NK50/K562)、100:1(记为 NK100/K562)，然后取100μL加入到含有K562细胞的96孔板中，在培养箱中孵育约4小时。同时，还需设置相应的NK细胞自然释放对照、K562细胞释放对照和K562细胞最大释放组。在反应结束前40分钟，将20μL细胞裂解液加入到K562细胞最大释放组(记为K562Lysis)。孵育完成后，按照试剂盒说明书的要求，依次加入显色液，反应终止液，最后用酶标仪分别在 490nm和630nm测量每个孔的OD值，用630nm测得的数值作为测量的自然背景相应扣减。

NK细胞杀伤活力的计算公式为：

NK杀伤活性％＝(实验组OD值-NK细胞自然释放组OD值-K562细胞自然释放组OD值)/(K562细胞最大释放组OD值-K562细胞自然释放组OD 值)×100％。

经过约4小时的杀伤试验，NK细胞对靶细胞的杀伤能力的部分统计结果见图7。

从图7的结果可以看出，在不同的NK细胞和靶细胞比例条件下，比例越高，NK细胞对靶细胞的杀伤效率越高。通过计算可知，在NK细胞和靶细胞的比例为50:1时，杀伤效率约为45％；而NK细胞和靶细胞的比例为100:1时，杀伤效率最高，达到91.3％。

另外，经大量的试验探究，本发明的自然杀伤细胞体外纯培养的方法采用包含300-600IU/mL的IL-2、15-250IU/mL的IL-7、15-250IU/mL的IL-15、 40-200ng/mL的anti-CD16、0.5-5μg/mL的OK432以及10％灭活的自体血清的X-VIVO 15培养基均可以使最细胞产物中NK细胞的纯度大于95％。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采集外周血，分离单个核细胞，采用结合有特异性抗体的磁珠去除非NK细胞，得分选的NK细胞群；

将所述分选的NK细胞群置于多重抗体包被的培养瓶中采用培养液进行激活培养，所述培养液为包含IL-2、IL-7、IL-15、anti-CD16、OK432以及灭活的自体血清的完全培养基，得激活的NK细胞群；

将所述激活的NK细胞群置于无抗体包被的培养瓶中继续进行扩增培养，即得。

2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，所述结合有特异性抗体的磁珠为至少结合有anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8及anti-CD19的葡聚糖磁珠。

3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，通过磁力分选柱洗脱法分选所述NK细胞群，洗脱液为磁珠专用缓冲液。

4.根据权利要求1至3任一项所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，所述培养液为包含300-600IU/mL的IL-2、15-250IU/mL的IL-7、15-250IU/mL的IL-15、40-200ng/mL的anti-CD16、0.5-5μg/mL的OK432以及10％灭活的自体血清的X-VIVO 15培养基。

5.根据权利要求4所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，所述多重抗体包被的培养瓶的包被步骤如下：将含包被浓度均为4-8μg/mL的CD16单抗、CD2单抗以及NKP46单抗的X-VIVO 15培养基置于培养瓶中并覆盖瓶底，于0-4℃条件下包被，包被时间为8-12小时。

6.根据权利要求1至3任一项所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，在所述激活培养和所述扩增培养的过程中，通过稀释法使NK细胞的密度始终保持在(1-2)×10⁶个/mL。

7.根据权利要求5所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，激活培养的时间为5天，扩增培养的时间为10-12天。

8.根据权利要求1至3任一项述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法，其特征在于，所述分离单个核细胞包括如下步骤：

将采集的外周血置于肝素钠抗凝采血管中，再转移至离心管中，580g转速下离心，得下层细胞层；

采用PBS缓冲液重悬所述下层细胞层，得细胞混合液；

将所述细胞混合液置于淋巴分离液的上方，380g转速下进行密度梯度离心形成四层，吸取白膜层，重悬于PBS缓冲液中，380g转速下再离心，弃上清液，将下层细胞用磁珠专用缓冲液重悬。

9.权利要求1至8任一项所述的自然杀伤细胞体外纯培养的方法扩增培养获得的NK细胞在制备具有杀伤肿瘤靶细胞功效的药物中的应用。