CN106566806A - 体外培养富集cd8+t细胞的方法 - Google Patents

体外培养富集cd8+t细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集CD8+T细胞的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD8+T细胞的方法。本发明的技术方案获得的T细胞增殖数量多、活力好、CD8+T细胞与CD4+T细胞之比可由正常生理状态的约1：2提高至2～5：1，同时目的培养物中，基于总的细胞数目，中枢记忆性T细胞的含量超过30％。

Description

体外培养富集CD8+T细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集CD8+T细胞的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD8+T细胞的方法。
背景技术
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。
细胞免疫治疗目前已经广泛开展，在早期的LAK细胞治疗尝试，后来发展到CIK(Cytokine Induced Killer Cell)、DC-CIK细胞治疗等。CIK细胞由IFN-γ，IL-2及anti-CD3抗体(OKT3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000IU/ml的IFN-γ，24小时后加入50ng/ml OKT3和300IU/ml IL-2，中间间隔2天加入含IL-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到CIK细胞。CIK细胞主要包括三个亚群，CD3+/CD56+NKT细胞，CD3+/CD56-T细胞和CD3-/CD56+NK细胞。NK细胞通过非特异性表面受体(如FcγRIII，CD16)发挥ADCC效应识别并杀伤肿瘤细胞，经过体外培养的T细胞能够保持其TCR特异性识别特异性靶细胞发挥杀伤功能，而CD3+/CD56+CIK细胞是CIK细胞发挥肿瘤杀伤功能的主要细胞亚群，其通过细胞表面表达的NKG2D分子识别肿瘤细胞表面的MHC相关配体A/B(MIC A/B),实现对肿瘤细胞的非HLA限制性杀伤。CD3+/CD56+CIK细胞与终末分化的CD8+T细胞表型较为接近，被认为是从CD8+T细胞分化而来。目前研究认为CD3+/CD56+CIK细胞是CIK细胞中发挥肿瘤杀伤作用的主要细胞亚群，因此其比例也常作为CIK指控的重要参考指标。CIK的三类细胞亚群主要通过非特异性杀伤功能达到一定的肿瘤杀伤作用，作为早期肿瘤或肿瘤术后辅助治疗手段，在临床研究中对于提高病人的生存质量做出了一定的贡献。
肿瘤特异性CTL细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的TCR识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和HLA分子复合物，激活CTL细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性T细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性T细胞免疫反应，产生的T细胞表面TCR亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性T细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性T细胞进行体外扩增和活化。
在T细胞分化过程中，T细胞经历T细胞、效应性T细胞、效应性记忆性T细胞和中枢记忆性T细胞的不同时期，其分化增殖的能力各不相同，在免疫细胞治疗过程中，终末分化的T细胞由于其分化增殖能力相对较差，而中枢记忆性T细胞能够快速反应并且能够大量增殖，对于肿瘤等的治疗具有更加持久的作用时间，因此，T细胞培养过程中产生的中枢记忆性T细胞分群对于后期免疫细胞治疗效果具有重要意义。
T细胞分化过程中，其细胞表面标识发生逐渐变化，表现为CD45RA由阳性逐渐变为阴性，而CD62L逐渐由阴性变为阳性，双染色分析表现为：细胞表征为CD45RA+/CD62L+；效应性T细胞表征为CD45RA+/CD62L-；效应性记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L-；中枢记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L+。
CD8+T细胞通过T细胞表面表达的T细胞受体(TCR)特异性识别靶细胞表面呈递的MHC-I/表位多肽复合物分子，通过CD8分子结合靶细胞表面MHC-I分子，募集CD3分子并将信号传递至CD3胞内的ITAM活化基序，由此产生T细胞激活的第一信号。在此基础之上，辅助激活分子CD28与B7-1等分子相互作用，产生T细胞激活所需的第二信号，产生细胞毒性T细胞(CTL)反应。新鲜外周血中CD4+/CD8+T细胞比例约为CD4+:CD8+＝2:1。CD8+T细胞是发挥特异性杀伤功能的主要细胞亚群，而目前尚无成熟的体外高效定向扩增CD8+T细胞的方法，因此，体外高效CD8+T细胞定向增殖培养技术和试剂的开发对于提高以CTL为基础的肿瘤治疗具有重要意义，因此在临床上具有需求，特别是含有较高含量的中枢记忆性T细胞同时富集CD8+T细胞的培养方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明发明人提供了一种能够体外高效扩增CD8+T细胞的方法。
本发明的一个目的是提供一种培养富集人CD8+T细胞的细胞悬液的方法，包括以下步骤：
抽取人全血5～100ml并对其进行处理以获得分离的外周血单个核细胞(PBMCs)；
对所述的分离的PBMCs进行分选，获得CD4+T细胞和CD8+T细胞T细胞悬液；
将所述的T细胞悬液在细胞培养板中在37℃、5％CO2和100％湿度条件下以AIM-V无血清细胞培养基进行培养7～14天获得目的细胞悬液，其中所述的培养基中分别添加有终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为5～10μg/ml的CD3抗体以及终浓度为5～10μg/ml的CD28抗体；其特征在于所述的细胞培养板是预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板。
优选地，所述的T细胞悬液的接种密度为5×105/ml。
优选地，所述的预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板是通过下述方法实现的：将含有终浓度为5μg/ml的CD3抗体和终浓度为5μg/ml的CD28抗体的PBS缓冲液按照100μl/孔(96孔板)或500μl/孔(24孔板)加入到细胞培养板后4℃孵育过夜。
优选地，所述的处理为：先将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)稀释一倍，将稀释的血样以1：1～5的比例加入到淋巴细胞分离液中，在25℃用水平离心机于700g离心20分钟，吸出第二层淋巴细胞层至新的无菌离心管中，用等体积的磷酸盐缓冲液等体积稀释后于25℃以800g的离心力离心10分钟；弃掉上清，用无血清RPMI1640重悬，在25℃下500g离心5分钟，弃掉上清，重悬，加入含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基清洗，于25℃下500g离心5分钟，弃掉上清后用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬,取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基将细胞液调整至2.5×106细胞/ml的最终密度。
优选地，所述的PBS缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS溶液。
优选地，所述的分选是通过分选柱实现的。
优选地，所述的分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。
优选地，所述淋巴细胞分离液可购自天津灏洋生物技术有限公司。
本发明的技术方案获得细胞悬液中的T细胞增殖数量多、活力好、CD8+T细胞与CD4+T细胞之比可由正常生理状态的约1∶2提高至2∶1～5∶1，同时目的细胞悬液中，基于总的细胞数目，中枢记忆性T细胞的含量超过30％。
附图说明
图1描述了T细胞分选效果流式细胞分析。其中纵坐标显示FITC标记CD8抗体染色，横坐标显示perCP荧光标记CD4抗体染色。
图2描述了两个个体D1和D2血样经过A、B、C处理后培养第3天和第6天T细胞亚群分析。
图3描述了两个个体D1和D2血样经过A、B、C处理后培养第9天和第13天T细胞亚群分析。
图4描述了两个个体D1和D2血样经过A、B、C处理后培养第6、9、13天T细胞分化特征。
图5描述了刺激物优化及培养后第4天镜检分析。
具体实施方式
本发明通过具体实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料，本发明所使用的抗体均可由商业公司容易地获得。
首先进行T细胞体外扩增培养
实施例1、志愿者外周血淋巴细胞(PBMCs)分离：
本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医务人员对志愿者进行采血。最终本项目筛选了2例健康志愿者D1和D2，采血时使用含有EDTA-K2抗凝的9ml一次性真空采血管(VACUETTE，奥地利格雷纳公司)，每名志愿者采血约20-25ml，采血后将血样立即颠倒防止凝血。
1)、先将新鲜采集的外周血用冷却的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4，经121℃高压灭菌)稀释一倍，将稀释的血样以1：1～5的比例加入到事先准备好的15ml淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物技术有限公司)中，需缓慢加入以避免界面混乱；
2)、将上述含淋巴细胞分离液和血样的离心管在25℃条件下用水平离心机(SORVALL Stratos，美国Thermo公司)700g离心20分钟，停止时降速调至最慢；
离心后的样品分四层，将最上层血浆用巴斯德移液管吸出弃掉，之后小心吸出第二层淋巴细胞层至新的无菌离心管中，即为粗纯PBMCs细胞；
3)、用等体积的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)等体积稀释粗纯PBMCs细胞，之后在25℃条件下以800g的离心力离心10分钟；弃掉上清，用7ml无血清RPMI1640(美国GE公司Hyclone品牌)重悬，在25℃下500g离心5分钟。
弃掉上清，重悬，加7ml含10％胎牛血清(FBS,美国Thermo Fisher公司品牌澳洲来源)的RPMI-1640培养基(同上，如无特殊说明1640培养基即为美国GE公司Hyclone品牌培养基)清洗，在25℃下500g离心5分钟。
4)、弃掉上清后用3ml含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基将细胞液调整至2.5×106细胞/ml的最终密度，获得分离的PBMCs细胞备用。
实施例2、T细胞分选
通过免疫磁珠法对上述分离的PBMCs细胞中的T淋巴细胞进行分选富集，以获得高纯度的T细胞，用以进行后续培养。
1)首先将上述获得的分离的PBMCs细胞按照每1×107细胞与20μl的CD4抗体偶联磁珠和20μl的CD8抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司)进行混合，之后置4℃进行孵育15分钟，用含5％胎牛血清(FBS,美国Thermo Fisher公司品牌澳洲来源)和2mMEDTA-Na的PBS缓冲液(PBS-F缓冲液)清洗两遍，在25℃下500g离心5分钟。
2)用500μl PBS-F缓冲液重悬上述细胞，并通过200目一次性无菌滤网(购自德国美天旎生物技术有限公司)过滤，去除细胞悬液中的杂质，以使得细胞能够顺利通过分选柱(MS分选柱，购自德国美天旎生物技术有限公司)，获得CD4和CD8抗体磁珠结合的PBMCs细胞。
3)将购自德国美天旎生物技术有限公司的MS分选柱放置在强磁场(MiniMACSSeparator，购自德国美天旎生物技术有限公司)中，用0.5ml PBS-F缓冲液润洗2次，至最后一次润洗PBS-F缓冲液完全流出分选柱后，获得经处理的MS分选柱备用。
4)将上述步骤2)获得的CD4和CD8抗体磁珠结合的PBMCs细胞缓慢加入到步骤3)处理后的MS分选柱，此时结合了CD4抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞就会在磁场作用下滞留在MS分选柱中，而未结合磁珠的其他细胞则沿分选柱流出，即为流穿细胞。用1ml的PBS-F缓冲液分三次缓慢加入到分选柱，使分选柱内未结合磁珠的细胞完全洗脱出分选柱，以便获得更高纯度的结合了CD4抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞。
5)将含有结合了CD4抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞分选柱远离磁场，加入1ml的PBS-F缓冲液，用MS分选柱活塞推出分选柱内与磁珠结合的CD4/CD8T细胞，1500rpm/分钟离心5分钟，弃掉上清后用AIM-V无血清细胞培养基(Medium-CTS,下同)清洗两次，并以含10％人AB血清(v/v)(购自江苏恩莫阿赛生物技术有限公司)和300IU/ml白细胞介素-2(IL-2)(购自PeproTech公司)的AIM-V培养基(来源同上)重悬计数至浓度为5×105细胞/ml的细胞悬液,将细胞悬液加入到24孔细胞培养板内，在37℃、5％CO2和100％湿度条件下进行培养，获得以CD4+和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞，以备后续刺激处理。
6)在磁珠分选过程中，取上述步骤5)获得的浓度为1×105CD4+和CD8+T细胞悬液，分别进行CD4和CD8荧光抗体染色，之后用流式细胞分析(FACS)对分选效果进行评价(图1)。通过对两例健康个体D1和D2的T细胞分选和流式分析验证，发现分选后CD4+T细胞在D1和D2中分别占比57.5％和71.9％,CD8+T细胞占比分别为31.2％和19.4％。从D1和D2中分选出的CD4+和CD8+T细胞合计占总淋巴细胞比例分别为88.7％和91.3％。
实施例3、T细胞体外刺激扩增
1)将实施例2中步骤5)获得的以CD4+和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞分别进行以下A、B、C三种处理方式:
A.添加CD3和CD28抗体偶联的磁珠；
B.置于预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中；
C.添加溶液状态的CD3和CD28抗体；
以便在不同刺激组合形式及培养方式条件下比较T细胞增殖水平及扩增的T细胞亚群和分化水平。具体添加或培养条件如下：
A.CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养：将包被有CD3和CD28抗体的磁珠(购自LifeTechnology公司Human T-Activator CD3/CD28)按照磁珠：T细胞＝1：1的数量比例取出并加入1ml的AIM-V培养基，在强磁场(MiniMACS Separator，购自德国美天旎生物技术有限公司)条件下弃掉上清。之后重复本步骤1次，用50-100μl体积的AIM-V培养基重悬备用；将上述步骤5)中分选出的以CD4+和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞按照5×105/ml密度加入到含CD3和CD28抗体偶联磁珠的24孔细胞培养板中进行培养，即为CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞；
B.置于预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养中：在制备上述步骤5)获得的以CD4+和CD8+T细胞前一天，将CD3抗体(克隆号为OKT-3,功能性等级纯化(Functional GradePurified)，浓度为1mg/ml，购自eBioscience公司)和CD28抗体(克隆号为CD28.2，功能性等级纯化(Functional Grade Purified)，浓度为1mg/ml，购自eBioscience公司)，分别以终浓度5μg/ml稀释到一份PBS缓冲液中，并按照100μl/孔(96孔板)或500μl/孔(24孔板)加入后4℃孵育过夜；次日，弃掉孔内上清溶液，并将上述步骤5)中分选出的以CD4+和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞按照5×105/ml密度加入到预包被有CD3和CD28抗体的孔板中进行培养，即为预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞；
C.添加溶液状态CD3和CD28抗体培养：将上述步骤5)中分选出的以CD4+和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞按照5×105/ml密度加入24孔板，每孔1ml，加入终浓度分别为10μg/ml的CD3和CD28抗体进行培养，即为溶液状态CD3和CD28抗体培养T细胞。
对经过上述A、B和C分别处理的T细胞在37℃、5％CO2和100％湿度条件下进行培养14天。在分别进行A、B和C处理后的第3、6、9、13天，分别对所培养的T细胞进行计数，并根据细胞生长情况进行重新计数，按照5×105/ml的密度重新调整细胞密度，并用含同等浓度的A、B和C处理中提到的刺激物及其组合的培养基补充至1ml体积。每个刺激组取不少于1×105的细胞以备后续流式细胞分析检测，对刺激产生的T细胞数量、T细胞亚群和记忆分化特征等进行定性和定量检测。
实施例4、CD8+T细胞高效体外扩增培养
按照实施例3所提供的培养方法，在T细胞培养后第3、6、9和13天分别取样进行流式细胞检测，以评价培养后T细胞亚群及分化特征。
1)CD4/CD8T细胞亚群分析
取培养后T细胞1×105个，以1500rpm/分钟离心5分钟，弃掉上清后用1ml的PBS缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用50μl PBS重悬，加入PE-anti-CD4抗体(购自BDBiosciences)和FITC-anti-CD8抗体(购自BD Biosciences)各1个反应量，室温孵育15分钟，之后用1ml的PBS缓冲液离心清洗两次，1500rpm/分钟离心5分钟。
最后一次离心后用500μl PBS缓冲液进行重悬，加入流式管(购自BDBiosciences)中准备上机检测(BD FACSCalibur双激光流式细胞分析仪)，所得数据经FlowJo 7.6.1软件(FLOWJO，LLC公司)进行分析。
表1、个体D1和D2经过A处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
表2、个体D1和D2经过B处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
表3、个体D1和D2经过C处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
经过A、B和C处理培养后第三天时CD8:CD4T细胞比例仍然呈现CD4比例较高的情况，通过对D1和D2两例健康个体的检测，发现D1个体CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图2中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图2中CoatedCD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图2中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例分别为：25.0％/65.1％，21.5％/67.4％，18.2％/75.8％。在D2个体中CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图2中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图2中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图2中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：23％/63.5％，12.4％/84.2％，7.57％/87.5％。
2)在培养后第六天之后用CD3/CD28抗体磁珠的T细胞中CD4/CD8T细胞维持原始比例，而预包被CD3/CD28抗体和可溶CD3/CD28抗体培养的T细胞培养中CD4/CD8T细胞比例开始发生逆转。D1个体CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图2中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图2中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图2中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：20.9％/70.5％，62.4％/30.8％，56.1％/36.2％。在D2个体中CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图2中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图2中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图2中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：23.1％/70.5％，59.4％/19.4％，53.9％/33.6％。
3)在培养后第九天之后用CD3/CD28抗体磁珠的T细胞中CD4/CD8T细胞仍基本维持原始比例，而预包被CD3/CD28抗体和可溶CD3/CD28抗体培养的T细胞培养中CD4/CD8T细胞比例逆转持续。D1个体CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图3中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图3中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图3中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：19.1％/73.4％，58.8％/31％，51.9％/36.2％。在D2个体中CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图3中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图3中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图3中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：18％/75.3％,70.5％/13.9％,53.5％/28.2％。
在培养后第十三天之后用CD3/CD28抗体磁珠的T细胞中CD4/CD8T细胞仍基本维持原始比例，而预包被CD3/CD28抗体实现了CD8+T细胞比例的进一步提高，而可溶CD3/CD28抗体培养的T细胞培养中CD4/CD8T细胞比例逆转持续维持。D1个体CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图3中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图3中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图3中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：17.8％/77.6％，63.4％/30.7％，62.6％/30.4％。在D2个体中CD3和CD28抗体偶联的磁珠培养T细胞(图3中CD3/CD28beads组)、预包被CD3和CD28抗体的细胞培养板培养T细胞(图3中Coated CD3/CD28Ab组)和溶液状态CD3/CD28抗体培养T细胞(图3中Soluble CD3/CD28Ab组)中CD8+T细胞/CD4+T细胞比例分别为：15.4％/80％，83.4％/6.96％，52.3％/31.8％。
实施例5.效应性记忆T细胞体外高效培养：
1)T细胞分化特征分析
取A、B、C刺激培养后第3、6、9、13天的细胞经1×105，1500rpm/min离心5min，弃掉上清后用1ml的PBS缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用50μl PBS重悬，加入PerCP-anti-CD45RA抗体和APC-anti-CD62L抗体(均购自BD Bioscience公司)各1个反应量，室温孵育15分钟，之后用1ml PBS离心清洗两次，以1500rpm/分钟转速离心5分钟。
最后一次离心后用500μl PBS缓冲液进行重悬，获得记忆表型待检测细胞样本，并将其加入流式管中准备上机检测(BD FACSCalibur双激光流式细胞分析仪)。
2)结果分析
在本实施例中，对实施例2的三种不同处理并培养至第6、9和13天的T细胞分化亚群进行了检测。结果表明(图4)，中枢记忆性T细胞亚群比例在D1和D2两例健康人中随培养时间的延长呈增长的趋势。在D1样本中，预包被CD3/CD28抗体培养和可溶CD3/CD28抗体培养的中枢记忆性T细胞(第四象限)在第6、9和13天的比例分别达到了：10％、38.8％和51.4％(B组)；7.22％、42.3％和37.5％(C组)，而A组培养的中枢记忆性T细胞比例在第6、9和13天的比例分别达到1.23％、30％和58.8％。而另一方面，A组处理培养的T细胞的比例在培养后的第13天仍达到26.7％，而B组处理培养和C组处理培养的T细胞比例仅为2.19％和9.26％。
在D2样本中，B组处理培养和C组处理培养的中枢记忆性T细胞(第四象限)在第6、9和13天的比例分别达到了：10％、46.8％和38.9％(B组)；7.22％、56.8％和38.1％(C组)，而A组处理培养的中枢记忆性T细胞比例在第6、9和13天的比例分别达到1.23％、64.2％和63.8％。而另一方面，A组处理培养的T细胞的比例在培养后的第13天仍达到14.5％，而B组和C组处理培养的T细胞比例仅为1.26％和6.43％。
因此，通过本实施例发现，在三种不同培养刺激条件下产生的T细胞均呈现记忆型T细胞比例增加的现象。对三种不同刺激条件培养的T细胞分化亚群的分析发现，A组处理培养的T细胞在第13天能够分化出更多的中枢记忆性T细胞和更高比例的T细胞，而B组处理培养和C组处理培养的的T细胞具有更高比例的效应性T细胞和效应性记忆性T细胞。
实施例6.CD3和CD28抗体包被浓度及刺激物组合优化
通过实施例4可以发现预包被CD3/CD28抗体能够产生更高比例的CD8+T细胞以及中枢记忆性T细胞，本案进一步对刺激条件和刺激物组合进行了进一步优化。
本实施例在起始T细胞培养孔中分别加入：
A.培养基空白对照：AIM-V无血清细胞培养基；
B.IL-2(300U/ml)+AIM-V无血清细胞培养基；
C.IL-2(300U/ml)+anti-CD3(10ug/ml)+AIM-V无血清细胞培养基；
D.IL-2(300U/ml)+anti-CD28(10μg/ml)+AIM-V无血清细胞培养基；
E.IL-2(300U/ml)+anti-CD3(10μg/ml)+anti-CD28(10μg/ml)+AIM-V无血清细胞培养基；
F.IL-2(300U/ml)+anti-CD3(5μg/ml)+anti-CD28(5μg/ml)+AIM-V无血清细胞培养基.
在培养后第四天进行显微镜下观察，发现无任何刺激的培养孔T细胞呈分散，成团少，生长状态较差；添加IL-2的培养孔有成团T细胞出现，而包被CD3或CD28抗体的培养孔出现较多的T细胞团，同时包被CD3和CD28抗体的培养孔细胞团明显多于单包被一种抗体的培养孔，抽取细胞悬液计数发现细胞悬液计数可达到1×109个以上，而且5μg/ml和10μg/ml两个包被浓度之间没有显著差异。
由以上的描述可以看出，以5μg/ml包被CD3和CD28抗体培养T细胞能够获得所需高比例CD8+T细胞，可用于临床治疗。

Claims (6)

1.一种培养富集人CD8+T细胞的细胞悬液的方法，包括以下步骤：
1)抽取人全血5～100ml并对其进行处理以获得分离的外周血单个核细胞；
2)对所述的分离的PBMCs进行分选，获得CD4+T细胞∶CD8+T细胞比率为1：1～1：5的T细胞悬液；
3)将所述的T细胞悬液在细胞培养板中在37℃、5％CO2和100％湿度条件下以AIM-V无血清细胞培养基进行培养7～14天获得目的细胞悬液，其中所述的培养基中分别添加有终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为5～10μg/ml的CD3抗体以及终浓度为5～10μg/ml的CD28抗体；
其特征在于所述的细胞培养板是预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的T细胞悬液的接种密度为5×105/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板是通过下述方法实现的：将含有终浓度为5μg/ml的CD3抗体和终浓度为5μg/ml的CD28抗体的PBS缓冲液按照对于96孔板以100μl/孔或对于24孔板以500μl/孔的量加入到细胞培养板后4℃孵育过夜。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的处理为：先将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液稀释一倍，将稀释的血样以1：1～5的比例加入到淋巴细胞分离液中，在25℃用水平离心机于700g离心20分钟，吸出第二层淋巴细胞层至新的无菌离心管中，用等体积的磷酸盐缓冲液等体积稀释后于25℃以800g的离心力离心10分钟；弃掉上清，用无血清RPMI1640重悬，在25℃下500g离心5分钟，弃掉上清，重悬，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基清洗，于25℃下500g离心5分钟，弃掉上清后用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基将细胞液调整至2.5×106细胞/ml的最终密度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的分选是通过分选柱实现的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。
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