CN108315298B - 一种γδT细胞的培养方法 - Google Patents

一种γδT细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)从外周血中获得单个核细胞，用额外添加有抗体的无血清培养基重悬后，调整单个核细胞密度，培养箱培养；(2)第4天和第8天，分别补加不添加抗体的无血清培养基；第12天，扩增培养结束；(3)对T细胞筛选，将分选后的γδT细胞转移至细胞培养瓶，补加γδT细胞培养基；(4)第4天和第8天，分别补加γδT细胞培养基；第12天，扩增培养结束；(5)收集γδT细胞。本发明的优点为：提供了一种专门针对γδT细胞的细胞培养方法，扩增γδT细胞12天，扩增倍数达到60倍，培养出的γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性在25:1时达到90％以上。

Description

一种γδT细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种γδT细胞的培养方法。
背景技术
近年来，随着细胞分子生物学和基因工程改造等技术的飞速发展，细胞免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗三大常规治疗之后的第四种肿瘤治疗的新模式。通过大量的基础生物学研究和临床实验等安全性、有效性数据结果显示，基因修饰化免疫细胞治疗(CAR-T/TCR-T)方法明显优于T细胞过继免疫治疗和树突状细胞(DC细胞)免疫治疗。
CAR-T疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，嵌合抗原受体T细胞疗法，在治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤上有显著的效果。它的基本原理是通过分离获得病人自体的T细胞，通过基因工程改造编辑T细胞，使T细胞表达相关肿瘤抗原特异性的scFV抗体片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。通过与肿瘤细胞表面特异性的抗原受体结合，激活T细胞后释放大量细胞因子、肿瘤杀伤因子等清除肿瘤细胞。
按T细胞表面受体(TCR)的不同，T细胞可分为αβT细胞和γδT细胞，其中，αβT细胞占T细胞总数的95％以上，γδT细胞则至占T细胞总数的2-5％，且主要分布于黏膜相关淋巴组织中。在过去研究中，人们对γδT细胞的功能及认知有限，但随着生物技术的快速发展，γδT细胞的生理功能和作用机制却被不断发现。研究发现，γδT细胞所具备的非MHC限制杀伤肿瘤细胞的特征使之可以成为一种理想的细胞制剂原料，可以在无抗原呈递细胞(APC细胞)的作用下，直接启动对肿瘤细胞的杀伤，并且对有免疫逃逸倾向低表达MHC分子的肿瘤细胞，也具备良好的杀伤效果。
然而，目前却并没有一种专门针对γδT细胞而设的细胞培养方法，将具有普遍广泛性的T细胞培养方法用于γδT细胞的培养明显不具备针对性，且十分不利于γδT细胞的扩增以及对肿瘤细胞的杀伤活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种专门针对γδT细胞而设的γδT细胞的培养方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从150-250mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3 antibody与anti-CD28 antibody的无血清培养基充分重悬后，调整单个核细胞密度为(2-3)x106细胞/mL，再将装有上述培养液的细胞培养瓶于培养箱中培养3天；
(2)T细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mL不添加抗体的无血清培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mL不添加抗体的无血清培养基；
第12天，T细胞扩增培养结束；
(3)γδT细胞的筛选
使用γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有5-15mg/L转铁蛋白、5-15％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、100-200mMβ-巯基乙醇、5-15mg/L胰岛素、50-200U/mL IL-2、50-200U/mL IL-4、2-5mM丙酮酸钠和100-200uM异戊烯焦磷酸的RPMI-1640培养基；
(4)γδT细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mLγδT细胞培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mLγδT细胞培养基；
第12天，γδT细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδT细胞
离心收集γδT细胞，同时使用流式抗体鉴定γδT细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(3)中于36-38℃、4％-6％CO2培养箱中培养。
作为本发明的优选方式之一，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中无血清培养基具体为KBM581无血清培养基。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中添加有anti-CD3antibody与anti-CD28 antibody的无血清培养基的配方为：50-200U/mL IL-2、2ug/mL anti-CD3 antibody、4ug/mL anti-CD28 antibody、100-200mMβ-巯基乙醇、2-5mM丙酮酸钠、5-15mg/L转铁蛋白、5-15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中不添加抗体的无血清培养基的配方为：50-200U/mL IL-2、100-200mMβ-巯基乙醇、2-5mM丙酮酸钠、5-15mg/L转铁蛋白、5-15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中γδT细胞阳性筛选试剂盒具体为美天旎γδT细胞阳性筛选试剂盒。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中于500g x10min离心条件下离心收集γδT细胞。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述细胞培养瓶具体为T175细胞培养瓶。
作为本发明的优选方式之一，所述γδT细胞培养基的配制方法为：将其他组分加入基础培养基RPMI-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调pH值至7.2-7.4，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，0-4℃保存。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)提供了一种专门针对γδT细胞而设的细胞培养方法，扩增γδT细胞12天，其扩增倍数达到60倍，表型鉴定结果为γδT阳性细胞比例达到95％以上，并且，培养出的γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性在25:1时达到90％以上；
(2)外周血单个核细胞的制备、T细胞的扩增培养过程中均采用“无血清培养基”，克服了目前采用含血清培养基培养T细胞带来的最终质量缺陷(由于血清成分非常复杂、血清批次间差异大，并且可能含有病原性物质，对细胞制品质量造成严重影响)。
附图说明
图1是实施例1-3中γδT细胞的培养方法的流程图；
图2是实施例4中T细胞培养过程中的扩增曲线图；
图3是实施例4中γδT细胞培养过程中的扩增曲线图；
图4是实施例4中γδT细胞的表型鉴定结果图；
图5是实施例4中不同比例浓度下γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性表示曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从150mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3 antibody与anti-CD28 antibody的KBM581无血清培养基(50U/mL IL-2、2ug/mL anti-CD3 antibody、4ug/mLanti-CD28 antibody、100mMβ-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠、5mg/L转铁蛋白、5mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为2x106细胞/mL，再将装有上述培养液的T175细胞培养瓶于36℃、4％CO2培养箱中培养3天；
(2)T细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加50mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(50U/mLIL-2、100mMβ-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠、5mg/L转铁蛋白、5mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加100mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(50U/mL IL-2、100mMβ-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠、5mg/L转铁蛋白、5mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第12天，T细胞扩增培养结束；
(3)γδT细胞的筛选
使用美天旎γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的T175细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于36℃、4％CO2培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有5mg/L转铁蛋白、5％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、100mMβ-巯基乙醇、5mg/L胰岛素、50U/mL IL-2、50U/mL IL-4、2mM丙酮酸钠和100uM异戊烯焦磷酸的RPMI-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基RPMI-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调pH值至7.2，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，0℃保存；
(4)γδT细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加50mLγδT细胞培养基；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加100mLγδT细胞培养基；
第12天，γδT细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδT细胞
500g x10min离心条件下收集γδT细胞，同时使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从250mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3 antibody与anti-CD28 antibody的KBM581无血清培养基(200U/mL IL-2、2ug/mL anti-CD3 antibody、4ug/mL anti-CD28 antibody、200mMβ-巯基乙醇、5mM丙酮酸钠、15mg/L转铁蛋白、15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为3x106细胞/mL，再将装有上述培养液的T175细胞培养瓶于38℃、6％CO2培养箱中培养3天；
(2)T细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加100mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(200U/mL IL-2、200mMβ-巯基乙醇、5mM丙酮酸钠、15mg/L转铁蛋白、15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加200mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(200U/mL IL-2、200mMβ-巯基乙醇、5mM丙酮酸钠、15mg/L转铁蛋白、15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第12天，T细胞扩增培养结束；
(3)γδT细胞的筛选
使用美天旎γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的T175细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于38℃、6％CO2培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有15mg/L转铁蛋白、15％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、200mMβ-巯基乙醇、15mg/L胰岛素、200U/mL IL-2、200U/mL IL-4、5mM丙酮酸钠和200uM异戊烯焦磷酸的RPMI-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基RPMI-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调pH值至7.4，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，4℃保存；
(4)γδT细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加100mLγδT细胞培养基；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加200mLγδT细胞培养基；
第12天，γδT细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδT细胞
500g x10min离心条件下收集γδT细胞，同时使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从200mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3 antibody与anti-CD28 antibody的KBM581无血清培养基(120U/mL IL-2、2ug/mL anti-CD3 antibody、4ug/mL anti-CD28 antibody、150mMβ-巯基乙醇、3mM丙酮酸钠、10mg/L转铁蛋白、10mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为2.5x106细胞/mL，再将装有上述培养液的T175细胞培养瓶于37℃、5％CO2培养箱中培养3天；
(2)T细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加75mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(120U/mL IL-2、150mMβ-巯基乙醇、3mM丙酮酸钠、10mg/L转铁蛋白、10mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加150mL不添加抗体的KBM581无血清培养基(120U/mL IL-2、150mMβ-巯基乙醇、3mM丙酮酸钠、10mg/L转铁蛋白、10mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺)；
第12天，T细胞扩增培养结束；
(3)γδT细胞的筛选
使用美天旎γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的T175细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于37℃、5％CO2培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有10mg/L转铁蛋白、10％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、150mMβ-巯基乙醇、10mg/L胰岛素、120U/mL IL-2、120U/mL IL-4、3mM丙酮酸钠和150uM异戊烯焦磷酸的RPMI-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基RPMI-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调pH值至7.3，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，2℃保存；
(4)γδT细胞的扩增培养
第4天，向T175细胞培养瓶中补加75mLγδT细胞培养基；
第8天，向T175细胞培养瓶中补加150mLγδT细胞培养基；
第12天，γδT细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδT细胞
500g x10min离心条件下收集γδT细胞，同时使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型。
实施例4
本实施例用以说明上述实施例制备过程中T细胞、γδT细胞的扩增情况，γδT细胞的表型鉴定情况，以及γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性。
参见图2，图2为T细胞培养过程中的扩增曲线图，由图可知，扩增T细胞12天，其扩增倍数达到17倍；
参见图3，图3为γδT细胞培养过程中的扩增曲线图，由图可知，扩增γδT细胞12天，其扩增倍数达到60倍；
参见图4，图4为使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型的表型鉴定结果图，由图可知，γδT阳性细胞比例达到95％以上；
参见图5，图5为不同比例浓度下γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性表示曲线图，由图可知，培养出的γδT细胞对K562肿瘤细胞具有极高的杀伤活性，且在25:1(γδT细胞：K562肿瘤细胞)时达到90％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种γδT细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从150-250mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3antibody与anti-CD28antibody的无血清培养基充分重悬后，调整单个核细胞密度为(2-3)×106细胞/mL，再将装有上述培养液的细胞培养瓶于培养箱中培养3天；
(2)T细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mL不添加抗体的无血清培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mL不添加抗体的无血清培养基；
第12天，T细胞扩增培养结束；
(3)γδT细胞的筛选
使用γδT细胞阳性筛选试剂盒对上述T细胞进行筛选，将分选后的γδT细胞转移至新的细胞培养瓶中，并补加γδT细胞培养基，再于培养箱中培养3天；其中，γδT细胞培养基具体为添加有5-15mg/L转铁蛋白、5-15％人AB血清或自体血浆或胎牛血清FBS、100-200mMβ-巯基乙醇、5-15mg/L胰岛素、50-200U/mL IL-2、50-200U/mL IL-4、2-5mM丙酮酸钠和100-200uM异戊烯焦磷酸的RPMI-1640培养基；
(4)γδT细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mLγδT细胞培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mLγδT细胞培养基；
第12天，γδT细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδT细胞
离心收集γδT细胞，同时使用流式抗体鉴定γδT细胞表型；
所述步骤(1)和步骤(2)中无血清培养基具体为KBM581无血清培养基；
所述步骤(1)中添加有anti-CD3antibody与anti-CD28antibody的无血清培养基的配方为：50-200U/mL IL-2、2ug/mL anti-CD3antibody、4ug/mL anti-CD28antibody、100-200mMβ-巯基乙醇、2-5mM丙酮酸钠、5-15mg/L转铁蛋白、5-15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺；
所述步骤(2)中不添加抗体的无血清培养基的配方为：50-200U/mL IL-2、100-200mMβ-巯基乙醇、2-5mM丙酮酸钠、5-15mg/L转铁蛋白、5-15mg/L胰岛素、1mM维生素C、5mM谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3)中于36-38℃、4％-6％CO2培养箱中培养。
3.根据权利要求2所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO2。
4.根据权利要求1所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中γδT细胞阳性筛选试剂盒具体为美天旎γδT细胞阳性筛选试剂盒。
5.根据权利要求1所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中于500g×10min离心条件下离心收集γδT细胞。
6.根据权利要求1所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用FITC-anti-TCRγδ流式抗体鉴定γδT细胞表型。
7.根据权利要求1-6任一所述的γδT细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞培养瓶具体为T175细胞培养瓶。
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