KR20180042437A - 임상 등급 망막 색소 상피 세포의 재현성 있는 분화 방법 - Google Patents

임상 등급 망막 색소 상피 세포의 재현성 있는 분화 방법 Download PDF

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루카스 체이즈
쉐주 펑
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Abstract

만능 줄기 세포(PSC)의 출발 세포 현탁액, 예를 들어 단일 세포 현탁액으로부터 RPE 세포 개체군을 제조하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 이러한 방법은 PSC의 출발 단일 세포 현탁액을 분화 배지에서 배양하여 인간 RPE 세포를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

임상 등급 망막 색소 상피 세포의 재현성 있는 분화 방법
본 발명은, 2015년 9월 8일 출원된 미국 가특허출원 제62/215,579호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 인용에 의해 본원에 포함된다.
공동 연구 협약의 당사자들
본 발명은, 본 발명이 이루어질 당시 유효한 공동 연구 협약의 범위 내에서 수행된 활동들의 결과이다. 상기 공동 연구 협약의 당사자는 미합중국 정부, 국립 보건원의 연구소인 국립 안과 연구소(National Eye Institute)로 대표되는 미국 보건복지부, 및 셀룰러 다이내믹스 인터네셔널, 인코포레이티드이다.
1. 배경기술
본 발명은, 일반적으로 줄기 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 세포 치료법으로서의 용도를 위한 줄기 세포 유도 망막 색소 상피 세포 개체군의 효율적인 제조방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 설명
망막은 눈의 내부 표면의 막을 형성하는(line) 조직의 광감성층이다. 망막 내의 막대형 또는 원추형 광수용체 세포는 광에 대하여 직접적으로 민감성이며, 화학적 광 신호를 신경 자극을 유발하는 전기적 결과로 변형시킨다. 망막 색소 상피(RPE)는 혈액 망막 장벽을 형성하는 색소 세포층이다. RPE 세포는 시각 기능의 유지에서 중요한 역할을 하며, 망막하 공간으로부터 혈액으로 이온, 물, 및 대사 최종 생성물을 전달한다(Strauss 등, 2005). 또한, RPE 세포는 면역억제 인자를 분비함으로써 눈의 면역 회피를 확립한다. RPE 세포에 대한 장애 또는 손상은 망막의 손상, 시각 기능의 손실, 및 실명을 유발할 수 있다. 급성 및 노화 관련 황반 변성, 및 베스트 질환을 포함하는 다수의 망막 장애는 RPE의 변성을 수반하며, 따라서, 세포 대체 치료법은 시각의 보존을 위한 가능한 치료적 옵션이다(Buchholz 등, 2009).
일반적으로, 줄기 세포는 일련의 성숙한 기능성 세포들을 야기할 수 있는 미분화된 세포이다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포는 임의의 상이한 유형의 말단 분화 혈액 세포들을 발생시킬 수 있다. 배아 줄기(ES) 세포는 배아로부터 유도되고, 만능이며, 따라서 RPE 세포를 포함하는 모든 기관 또는 조직 유형으로의 발현 가능성을 가진다.
성체 마우스로부터의 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 형성은, 줄기 세포 연구, 약물 개발, 질환 모델, 및 세포 치료에 대한 중요한 돌파구로 2006년에 제공되었다(Takahashi 등, 2006). 인간 iPSC는 특화된 세포 유형으로 분화되고. 재생 의학을 위한 환자-특이적 면역-일치된 세포에 대한 가능성을 가진다(Yu 등, 2007).
iPSC는 RPE 세포를 포함하여 안구 세포를 발생시킨다(Hirami 등, 2009). 하지만, 지금까지 공지된 iPSC 유도 또는 ESC 유도 RPE 세포를 생성하기 위한 모든 기술은, 사용하는 출발 개체군의 배아체(embryoid body)에 따른다. 치료, 선별 검정, 망막 질환 모델, 및 RPE 생물학적 연구를 위해 필요한 iPSC 유도 또는 ESC 유도 RPE 세포의 효율적인 대규모 제조 방법이 부족하다.
안타깝게도, 출발 개체군의 배아체로부터의, iPSC 또는 ESC와 같은 만능 세포로부터 일상적이고 재현가능성 있는 RPE로의 생산은 문제가 많은데, 이는 배아체의 생성 과정 그 자체가 재현성이 없고, 다양한 효율을 가지며, RPE의 상업적 규모로의 제조를 위해 필요한 정도로 확장가능하지 않다는 사실 때문이다. 배아체 사용에 대한 요구를 피하여, 배아체 대신 만능 줄기 세포의 세포 현탁액 개체군, 바람직하게는 단일 세포 현탁액을 사용하는 망막 색소 상피(RPE) 세포 개체군을 얻기 위한 방법이 개시된다. 특정 양태에서, 만능 줄기 세포의 출발 세포 개체군은, 예를 들어 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 만능 줄기 세포를 망막 색소 상피(RPE) 세포로 분화시키기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 일양태에서, 인간 RPE 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 필수적으로 단일 세포로 해리된 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)들을 포함하는 출발 개체군을 얻는 단계; (b) 상기 iPSC를 망막 유도 배지에서 배양하여, 상기 세포의 망막계통 세포(retinal lineage cell)로의 분화를 개시하는 단계; (c) 상기 망막계통 세포를 망막 분화 배지에서 추가로 배양하여, 상기 망막계통 세포를 추가로 분화시키는 단계; (d) 상기 세포를 망막 배지에서 배양하여, 분화 RPE 세포를 형성하는 단계; 및 (e) 상기 RPE 세포를 RPE 성숙 배지에서 배양하여, 인간 RPE 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 배아체의 형성을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, RPE 세포는 제조 후에 냉동보존된다.
특정 측면에서, iPSC는 매트릭스 상에서 배양된다. 일부 양태에서, 매트릭스는 하나 이상의 재조합 세포 부착 단백질, 예를 들어 라미닌, 비트로넥틴, 또는 피브로넥틴을 포함한다. 특히, 하나 이상의 세포 부착 단백질은 인간 단백질이다.
특정 측면에서, iPSC는 영양세포층(feeder layer) 없이 배양된다. 일부 측면에서, iPSC는 완전한정 배양 배지에서 배양된다. 다른 측면에서, iPSC는 제노-프리(xeno-free) 배양 배지에서 배양된다.
추가의 측면에서, 망막 유도 배지는 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, 및 인슐린 성장 인자 1(IGF1)을 포함한다. 일부 측면에서, WNT 경로 억제제는, N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰아미드 디하이드로클로라이드(CKI-7), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-3-(2-메톡시페닐)-4-옥소티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP4), 2-페녹시벤조산-[(5-메틸-2-푸라닐)메틸렌]하이드라지드(PNU 74654), 2,4-디아미노-퀴나졸린, 케르세틴, 3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온(XAV939), 2,5-디클로로-N-(2-메틸-4-니트로페닐)벤젠설폰아미드(FH 535), N-[4-[2-에틸-4-(3-메틸페닐)-5-티아졸릴]-2-피리디닐]벤즈아미드(TAK 715), Dickkopf-연관 단백질 1(DKK1), 및 Secreted frizzled-연관 단백질 1(SFRP1)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, WNT 경로 억제제는 CKI-7이다. 특정 측면에서, BMP 경로 억제제는 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 하이드로클로라이드(LDN193189), 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드(도르소모르핀), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린(DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(DMH-2), 또는 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(ML 347)이다. 예를 들어, BMP 경로 억제제는 LDN193189이다. 특정 측면에서, TGFβ 경로 억제제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린(SB525334), 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-이에리-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 수화물(SB505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 수화물, 좌우 결정 인자(Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드(A 83-01), 4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드(GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(R 268712), 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(RepSox)이다. 예를 들어, TGFβ 경로 억제제는 SB431542이다.
일부 측면에서, 망막 분화 배지는 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, MEK 억제제, 및 IGF1을 포함한다. 일부 측면에서, WNT 경로 억제제는 N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰아미드 디하이드로클로라이드(CKI-7), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-3-(2-메톡시페닐)-4-옥소티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP4), 2-페녹시벤조산-[(5-메틸-2-푸라닐)메틸렌]하이드라지드(PNU 74654), 2,4-디아미노-퀴나졸린, 케르세틴, 3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온(XAV939), 2,5-디클로로-N-(2-메틸-4-니트로페닐)벤젠설폰아미드(FH 535), N-[4-[2-에틸-4-(3-메틸페닐)-5-티아졸릴]-2-피리디닐]벤즈아미드(TAK 715), Dickkopf-연관 단백질 1(DKK1), 및 Secreted frizzled-연관 단백질 1(SFRP1)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, WNT 경로 억제제는 CKI-7이다. 특정 측면에서, BMP 경로 억제제는 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 하이드로클로라이드(LDN193189), 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드(도르소모르핀), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린(DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(DMH-2), 또는 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(ML 347)이다. 예를 들어, BMP 경로 억제제는 LDN193189이다. 특정 측면에서, TGFβ 경로 억제제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린(SB525334), 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-이에리-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 수화물(SB505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 수화물, 좌우 결정 인자(Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드(A 83-01), 4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드(GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(R 268712), 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(RepSox)이다. 예를 들어, TGFβ 경로 억제제는 SB431542이다. 일부 측면에서, MEK 억제제는 N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901), N-[3-[3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드(GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디하이드록시프로필)사이클로프로판-1-설폰아미드(RDEA119), 또는 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(AZD6244)이다. 예를 들어, MEK 억제제는 PD0325901이다. 특정 측면에서, 망막 분화 배지는 LDN193189, CKI-7, SB431542, 및 PD0325901을 포함한다.
추가의 양태에서, RPE 세포는 RPE 성숙 배지에서 배양된 후 해리된다. 추가의 측면에서, 해리된 RPE 세포는 RPE 성숙 배지에 씨딩되고 배양된다. 특정 측면에서, RPE 성숙 배지는 MEK 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, MEK 개시제는 N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901), N-[3-[3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드(GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드 (MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디하이드록시프로필)사이클로프로판-1-설폰아미드(RDEA119), 또는 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(AZD6244)이다. 일부 측면에서, MEK 억제제는 PD0325901이다.
다른 추가의 양태에서, RPE 세포는, RPE 배지에서 배양된 후에 해리되고, RPE 성숙 배지의 분해성 스캐폴드 상에 재씨딩되어 성숙 RPE 세포를 생성한다. 특정 측면에서, RPE 성숙 배지는 하나 이상의 1차 섬모 유도인자를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 하나 이상의 섬모 유도인자는 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 아피디콜린이다. 다른 측면에서, RPE 성숙 배지는 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2) 또는 4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드(endo-IWR1)를 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, iPSC의 출발 개체군은 단일 세포들로 분화된 융합전(pre-confluent) 세포이다. 다른 측면에서, iPSC는 5,000 내지 40,000cells/cm2의 초기 세포 밀도로 배양된다. 특정 측면에서, iPSC는 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 또는 40,000cells/cm2의 초기 세포 밀도로 배양된다.
다른 추가의 측면에서, iPSC의 출발 개체군은 이를 필요로 하는 대상체에 대해 MHC 일배체형 일치된다. 일부 측면에서, iPSC는 하나 이상의 HLA 대립유전자에 대해 동형접합이다. 일부 측면에서, iPSC는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-DR에서 동형접합이다. 일부 측면에서, iPSC는 HLA-A 및 HLA-B에서 동형접합이다.
또 다른 측면에서, 인간 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 완전한정 배지에서 필수적으로 단일 세포로 해리된 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)들을 포함하는 출발 개체군을 얻는 단계; (b) 상기 iPSC를 LDN193189, CKI-7, 및 SB431542를 포함하는 망막 유도 배지에서 배양하여, 상기 세포의 망막계통 세포로의 분화를 개시하는 단계; (c) 상기 망막계통 세포를 LDN193189, CKI-7, SB431542, 및 PD0325901을 포함하는 망막 분화 배지에서 추가로 배양하여, 상기 망막계통 세포를 추가로 분화시키는 단계; (d) 상기 세포를 니코틴아미드 및 액티빈 A를 포함하는 망막 배지에서 배양하여, 분화 RPE 세포를 형성하는 단계; 및 (e) 상기 RPE 세포를 RPE 성숙 배지에서 배양하여, 인간 RPE 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 배아체의 형성은 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 하지만, 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 이러한 상세한 설명 및 특정 실시예는 예시의 방식으로만 제공될 뿐이며, 이는 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변형 및 개질이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 숙련가에게 자명해질 것이기 때문임을 이해한다.
하기 도면들은 본 발명의 일부를 이루며, 본 발명의 특정 측면들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 제공되는 특정 양태의 보다 상세한 설명과 함께, 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d: a) 융합전 iPSC의 이미지. b) RPE 분화 25일의 실시예 이미지. c) RPE 분화 40일의 실시예 이미지. d) 100x 명시야에서의, RPE-MM에서 배양을 포함하여 40일의 재플레이팅(replate) 후 60일의 실시예 이미지.
도 2a 내지 도 2b: iPSC 유도 RPE 세포 개체군의 세포 분리 전, MAP2, NES, PAX6, MITF, PMEL17, TYRP1, CRALBP 및 BEST1을 포함하는 관련 마커들의 유동 세포측정 분석.
도 3a 내지 도 3c: CD24 양성 세포, CD24 양성 및 CD56 양성 세포, CD24 양성 및 CD90 양성 세포, 및 CD24 양성 세포, CD56 양성 세포, 및 CD90 양성 세포의 제거에 대한 iPSC 유도 RPE 세포 개체군의 세포 분리 후, MAP2, NES, PAX6, MITF, PMEL17, TYRP1, CRALBP 및 BEST1을 포함하는 관련 마커들의 유동 세포측정 분석.
도 4a 내지 도 4d: a) iPSC-RPE 비처리 세포 및 PGE2 처리된 iPSC-RPE 세포의 베타 카테닌 및 F-액틴 염색. 베타 카테닌 염색은 비처리된 세포의 세포질 및 처리된 세포의 막에서 발견된다. b) iPSC-RPE 비처리 세포 및 PGE2 처리된 iPSC-RPE 세포의 pERM(Ezrin) 및 ZO1 염색. ERM 염색은 비처리된 세포의 세포질에서 낮게 그리고 처리된 세포의 세포질에서 높게 나타나는 반면, ZO1 염색은 비처리된 세포와 처리된 세포 둘 다의 형질막의 밀착 연접에서 발견된다. c) iPSC-RPE 비처리 세포 및 PGE2 처리된 iPSC-RPE 세포의 RPE65 및 ZO1 염색 RPE 65 염색은 비처리된 세포의 세포질에서 낮게, 그리고 처리된 세포의 세포질에서 높게 나타난다. d) iPSC-RPE 비처리 세포 및 PGE2 처리된 iPSC-RPE 세포의 투과 전자 현미경 사진. PGE2 처리된 세포는 보다 광범위한 정단 돌기(apical process)를 가진다.
도 5a 내지 도 5d: a) IWP2+endo-IWR1, IWP2, 또는 LiCl로 처리된 세포의 베타 케타닌 염색. IWP2 또는 IWP2+endo-IWR1 처리된 세포는 세포막 상에 베타 카테닌을 가진다. LiCl 처리된 세포는 핵 내에 베타 카테닌을 가지며, 비처리된 세포는 세포질 내에 베타 카테닌을 가진다. b) IWP2+endo-IWR1, IWP2, 또는 LiCl로 처리된 세포의 p27 염색. IWP2 또는 IWP2+endo-IWR1로 처리된 세포는 핵 내에 보다 높은 p27 발현을 가지며, 이는 세포가 세포 주기를 벗어났음을 시사한다. LiCl로 처리된 세포 또는 비처리된 세포는 핵 내에 약한 p27 발현을 가진다. c) IWP2+IWR1, IWP2, 또는 LiCl로 처리된 세포의 RPE65 및 ZOl 밀착 연접. RPE65는 IWP2+IWR1 처리된 세포 및 IWP2 세포의 세포질에서 높게 나타나고, 비처리된 세포에서 낮게 나타났으며, LiCl 처리된 세포에서 염색이 확인되지 않는다. d) IWP2+IWR1, IWP2, 또는 LiCl로 처리된 세포의 기능성 밀착 연접의 전자 현미경 이미지.
도 6a 내지 도 6d: a) RPE 분화의 다중 작동유전자. 도시된 데이터는, RPE 마커인 레틴알데하이드 결합 단백질 1(Cralbp)에 대한 유동 세포측정에 의해 측정된, 다중 작동유전자를 포함하여 3개의 세포주를 가로지르는 최적화된 프로토콜을 사용하는 RPE 분화 셋업(set-up)을 도시한다. b) RPE 분화 프로토콜의 재현성이 3D1, AMD1B, BEST1L, BEST3A, BEST8A, AMD Donor3D, AMD Donor3C, 및 HLA Line A를 포함하는 상이한 출발 세포주 개체군들 중에서 도시된다. c 내지 d) RPE 분화 프로토콜의 재현성이 상이한 출발 세포주 개체군들에서 도시된다. 데이터는 13개의 공여자(donor)로부터 유도된 28개의 iPSC 세포주 상에서 5개의 작동유전자에 의해 실시된 109개의 분화를 도시한다. Cralbp-양성 세포의 퍼센티지가, 사전-정제 세포 개체군의 다양한 순도에 비해 90 내지 100%로 증가되었다.
도 7a 내지 도 7g: a) RPE 분화 프로토콜을 사용하여 생성된 RPE 세포 장벽 기능의 기능성이, 단층을 가로지르는 이온 구배의 상피 통과 전위(TEP) 측정에 의해 도시된다. b) IWP2 또는 IWP2+endo-IWR2로 처리된 RPE 세포의 기능성. c 내지 e) 비처리된 세포, PGE2 처리된 세포 및 IWP2+endo-IWR1 처리된 세포의 상피 통과 저항(TER) 및 TEP(보다 밝은 막대). f) iPSC 유도 분화 프로토콜의 54일부터 75일까지 RPE-MM + PGE2 배지에서 50μM vs. 100μM PGE2로 성숙된 세포로부터의 기능성 응답(TRE). 상기 유도 분화 프로토콜의 54일부터 75일까지 RPE-MM + PGE2 배지에서 50μM을 사용하여 배양된 iPSC 유도 RPE에 비하여 100μM을 사용하는 이들의 분화 과정 동안의 TER 측정에서 점진적인 증가가 존재했다. 이는 PGE2 농도의 증가가 성숙기 및 iPSC 유도 RPE 배양의 기능적 효율성을 촉진함을 입증한다. g) iPSC 유도 RPE 분화 프로토콜의 54일 내지 75일에 출발한 50μM vs. 100μM PGE2를 사용하는 배양에서, 75일에서의 성숙 RPE 마커의 퍼센트 발현에 의한 iPSC 유도 RPE 순도. 50μM PGE2를 사용하여 배양된 iPSC 유도 RPE와 비슷한 Pmel17, Tryp1 및 Cralbp(RPE-특이 마커)의 발현이 존재한다. 이는 PGE2가 다양한 농도의 iPSC 유도 RPE 분화를 촉진함을 보인다. Best 1 마커(후기 성숙기 RPE 마커)의 발현은 50μM PGE2로 처리된 세포에 비하여 100μM PGE2로 처리된 세포에서 보다 높았으며, 이는 PGE2 농도의 증가가 iPSC 유도 RPE의 순도 및 성숙기를 촉진함을 보인다.
본 발명의 특정 측면은, 만능 유도 세포의 출발 세포 현탁액, 바람직하게는 만능 유도 세포의 필수적으로 단일한 세포 현탁액으로부터 RPE 세포 개체군을 제조하는 방법을 제공함으로써, 최근 기술의 다수의 주된 문제점들을 해결한다. RPE 세포는 ES 세포 및 iPSC 세포와 같은 만능 유도 세포로부터 유도될 수 있지만, 최근의 방법들은 배아체의 출발 개체군에 따른다. 일부 양태에서, 본 발명은, 배아체를 사용하지 않고, 만능 줄기 세포(PSC)를 기능적이고 성숙한 RPE 세포로 고도로 효율적이고 재현성 있게 분화시키는 방법을 제공한다. 추가의 양태들 및 이점들이 하기에 개시된다.
I. 정의
용어 "정제된"은 절대 순도를 필요로 하지 않는 대신, 상대적인 용어일 것이 의도된다. 따라서, 세포의 정제된 개체군은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 순수한 것이거나, 또는 가장 바람직하게는 다른 세포 유형을 필수적으로 포함하지 않는다.
특정 성분에 관하여 본원에서 사용된 바와 같은 "필수적으로" 또는 "필수적으로 포함하지 않는"은, 상기 특정 성분 중 어떠한 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않고/제형화되지 않거나, 상기 특정 성분이 불순물로서 또는 미량만으로 존재함을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도하지 않은 불순물로부터 생성되는 특정 성분의 총량은 0.05% 이하, 바람직하게는 0.01% 이하이다. 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서의 용어 "또는"의 용도는, 본 발명이 대안 및 "및/또는"만을 나타내는 정의를 지지할지라도, 대안만을 명확하게 나타내지 않거나 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서를 통하며, 용어 "약"은 값이, 상기 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 및 방법에 대한 오차 변량, 또는 연구 대상들에 존재하는 변량을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "세포"는, 독립적으로 복제할 수 있고, 막으로 둘러싸여 있으며, 생분자 및 유전 물질을 함유하는 유기체의 구조적 및 기능적 단위를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 세포는 자연 발생 세포 또는 인공 개질 세포(예를 들어, 융합 세포, 유전적 개질 세포 등)일 수 있다.
용어 "세포 개체군"은 일반적으로는 일반 유형의 세포 그룹을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 세포 개체군은 일반적인 전구세포로부터 유도될 수 있거나, 하나 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다. "풍부" 세포 개체군은, 출발 개체군의 세포 유형의 퍼센티지보다 더 큰 퍼센티지의 특정 세포 유형을 함유하는 출발 세포 개체군(예를 들어, 비분할된 불균질 세포 개체군)으로부터 유도된 세포 개체군을 나타낸다. 세포 개체군은 하나 이상의 세포 유형에 대해 풍부할 수 있으며, 하나 이상의 세포 유형이 고갈될 수 있다.
용어 "줄기 세포"는 본원에서, 적합한 조건하에서 다양한 범위의 특정 세포 유형으로 분화될 수 있는 동시에, 다른 적합한 조건하에서 자기재생할 수 있으며 필수적으로 미분화된 만능 상태로 유지되는 세포를 나타낸다. 용어 "줄기 세포"는 만능 세포, 다능 세포, 전구체 세포, 및 전구세포도 포함한다. 예시적인 인간 줄기 세포는 골수 조직으로부터 얻어진 조혈 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 얻어진 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 얻어진 배아 종자 세포로부터 얻을 수 있다. 예시적인 만능 줄기 세포는, 만능성과 관련된 특정 전사 인자의 발현에 의해 이들을 만능 상태로 재프로그래밍하여 체세포로부터 생성할 수도 있으며, 이러한 세포는 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"로 불린다.
용어 "만능"은, 배아외 세포 또는 태반 세포를 제외한 유기체의 임의의 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포의 성질을 나타낸다. 만능 줄기 세포는, 지속적인 배양 후에도 3개의 모든 종자 층의 세포 유형(예를 들어, 외배엽, 중배엽, 또는 내배엽 세포 유형)으로 분화될 수 있다. 만능 줄기 세포는 주머니배의 내부 세포 괴로부터 유도된 배아 줄기 세포이다. 다른 양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그래밍하여 유도된 만능 줄기 세포로부터 유도된다.
용어 "분화"는, 이에 의해 비특화된 세포가 구조적 및/또는 기능적 성질들이 변화되어 보다 특화된 유형으로 되는 과정을 나타낸다. 성숙 세포는 일반적으로 세포 구조 및 조직 특이성 단백질을 바꾼다. 보다 구체적으로는, 본 방법과 관련하여 인간 줄기 세포가, 상기 RPE 세포가 성숙한 말단 분화된 세포임을 나타내는 특징을 갖는 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포 유형을 획득하는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "미분화된"은 배아 또는 성인 유래의 말단 분화된 세포와 확연히 구분되는 미분화된 세포의 특징적인 마커 및 구조적 특징을 나타내는 세포를 나타낸다.
"배아체(EB)"는 내배엽층, 중배엽층, 및 외배엽층의 세포로 분화될 수 있는 만능 줄기 세포의 응집체이다. 만능 줄기 세포가 응집되어 현탁액 중의 EB의 비접착 배양을 가능케 하는 경우에 구형 구조가 형성된다.
"단리된" 세포는 유기체 또는 배양의 다른 세포로부터 실질적으로 분리되거나 정제되었다. 단리된 세포는, 예를 들어 99% 이상, 98% 이상, 95% 이상, 또는 90% 이상 순수할 수 있다.
"배아"는 접합체 또는 인공 재프로그래밍된 핵을 갖는 활성 난자의 1회 이상의 분열에 의해 얻어지는 세포 괴를 나타낸다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 초기 단계의 배아로부터 얻어진 미분화된 만능 세포, 예를 들어 주머니배 단계에서의 내세포괴, 또는 인공적인 수단(예를 들어 핵 치환)에 의해 생성된 미분화된 만능 세포이며, 종자 세포(예를 들어 정자 및 난자)를 포함하여 배아 또는 성인의 임의의 분화된 세포 유형을 생성할 수 있다.
"유도 만능 줄기 세포(iPSC)"는 인자들의 조합(본원에서는 재프로그래밍 인자로 나타냄)을 발현시키거나 이의 발현을 유도하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성되는 세포이다. iPSC는 태아, 출생후, 신생아, 소아, 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해 사용할 수 있는 인자는, 예를 들어 Oct4(종종 Oct 3/4로도 나타냄), Sox2, c-Myc, 및 Klf4, Nanog, 및 Lin28을 포함한다. 일부 양태에서, 체세포는 둘 이상의 재프로그래밍 인자, 셋 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
"대립유전자"는 둘 이상의 유전자 형태들 중 하나를 나타낸다. 이배체 유기체, 예를 들어 인간은 각 염색체의 2개의 카피를 함유하며, 따라서 각각에 대해 하나의 "대립유전자"를 지닌다.
용어 "동종접합"은 특정 유전자자리에 2개의 동일한 대립유전자를 함유하는 것으로 정의된다. 용어 "이형접합"은 특정 유전자자리에 2개의 상이한 대립유전자를 함유함을 나타낸다.
"일배체형"은 동일한 염색체를 따라 다수의 유전자자리에서의 대립유전자의 조합을 나타낸다. 일배체형은 단일 염색체 상의 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)의 세트 및/또는 주 조직적합성 복합체의 대립유전자에 따를 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "일배체형-일치된"은 처리되는 세포 및 대상체가 하나 이상의 주 조직적합성 유전자자리 일배체형을 공유하는 것으로 정의된다. 대상체의 일배체형은 당해 기술 분야에 널리 공지된 검정을 사용하여 쉽게 확인할 수 있다. 일배체형-일치된 iPSC 세포는 자가형 또는 동종이형일 수 있다. 조직 배양물에서 성장하고 내재적으로 RPE 세포로 분화되는 자가 세포는 대상체에 대해 일배체형-일치된 것이다.
"실질적으로 동일한 HLA 유형"은, 공여자의 체세포로부터 유도된 iPSC의 분화를 유도하여 얻어진 이식된 세포가 상기 환자에게 이식되는 경우 생착될 수 있을 정도로 공여자의 HLA 유형이 환자의 HLA 유형과 일치함을 나타낸다.
"초공여자(super donor)"는 특정 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 동형접합인 개인으로 본원에서 나타낸다. 이러한 동형접합 개인들은, 초공여자, 및 이들의 세포를 포함하는 조직 및 다른 물질을 포함하는 이들의 세포로서 역할을 할 수 있으며, 이러한 일배체에 대해 동형접합 또는 이형접합인 개인에게 이식될 수 있다. 초공여자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP, 또는 HLA-DQ 유전자자리/유전자자리 대립유전자 각각에 대해 동형접합일 수 있다.
"무영양세포(Feeder-free)" 또는 "영양세포 독립(feeder-independent)"은, 영양세포층에 대한 대체물로서의 시토카인 및 성장 인자(예를 들어, TGFβ, bFGF, LIF)로 보충된 배양물을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, "무영양세포" 또는 영양세포 독립 배양 시스템 및 배지를, 만능 세포를 미분화된 상태 및 증식 상태에서 배양하고 유지하기 위해 사용할 수 있다. 일부 경우에서, 무영양세포 배양은 동물 기반 매트릭스(예를 들어 MATRIGEL™)를 이용하거나, 피브로넥틴, 콜라겐, 또는 비트로넥틴과 같은 기질에서 성장된다. 이러한 접근법은 인간 줄기 세포가 마우스 섬유모세포를 필요로 하지 않고 필수적으로 미분화된 상태로 유지되게 한다.
"영양세포층"은 배양 접시의 바닥과 같은 세포의 코팅층으로 본원에서 정의된다. 영양세포는 배양 배지 내로 영양소를 분비할 수 있으며, 만능 줄기 세포와 같은 다른 세포가 부착할 수 있는 표면을 제공할 수 있다.
배지, 세포외 기질, 또는 배양 조건과 관련하여 사용하는 경우의 용어 "한정" 또는 "완전 한정"은, 대략적으로 모든 성분의 화학적 조성 및 양이 공지된 배지, 세포외 기질, 또는 배양 조건을 나타낸다. 예를 들어, 한정 배지는 비한정된 인자, 예를 들어 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민, 또는 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는다. 일반적으로, 한정 배지는 재조합 알부민, 화학적 한정 지질, 및 재조합 인슐린으로 보충된 기초 배지(예를 들어, 아미노산, 비타민, 무기 염, 완충제, 항산화제, 및 에너지원을 함유하는 Dulbecco' s Modified Eagle's Medium(DMEM), F12, 또는 Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI) 1640)를 포함한다. 예시적인 완전 한정 배지는 Essential 8™ 배지이다.
배지, 세포외 기질, 또는 배양 조건과 관련하여 사용하는 경우의 용어 "제노-프리(XF)"는, 불균질한 동물 유도 성분을 필수적으로 포함하지 않는 배지, 세포외 기질, 또는 배양 조건을 나타낸다. 인간 세포를 배양하기 위해, 마우스와 같은 비인간 동물의 임의의 단백질은 제노 성분이 없을 것이다. 특정 측면에서, 제노-프리 매트릭스는 임의의 비인간 동물 유도 성분을 필수적으로 불포함할 수도 있으며, 따라서, 마우스 영양세포 또는 MATRIGEL™을 제외한다. MATRIGEL™은, 라미닌(주성분), 콜라겐 IV, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 및 엔탁틴/니도겐을 포함하는 세포외 기질 단백질에서 풍부한 종양인 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 기저막 제제에 가용성이다.
"녹아웃™ 혈청 대체물"은 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 배지에서 성장시키고 유지하기에 최적화된 무혈청 제형을 본원에서 나타낸다.
"융합전"은, 세포로 덮인 배양물 표면의 일부가 약 60 내지 80%인 세포 배양물을 나타낸다. 일반적으로, 사전 융합은 약 70%의 배양물 표면이 세포로 덮인 배양물을 의미한다.
"망막"은 안구의 내부 표면을 형성하는 조직의 감광성층을 나타낸다.
"망막 색소 상피"는 혈관으로 채워진 층인 맥락막과 망막 사이의 색소 세포 단층을 나타낸다.
"망막계통 세포"는 RPE 세포를 생성하거나 RPE 세포로 분화시킬 수 있는 세포를 본원에서 나타낸다.
"망막 유도 배지(RIM: retinal induction medium)"는 본원에서, WNT 경로 억제제 및 BMP 경로 억제제를 포함하는 성장 배지를 나타내며, PSC의 망막계통 세포로의 분화를 야기할 수 있다. RIM은 TGFβ 경로 억제제도 포함할 수 있다.
"망막 분화 배지(RDM: retinal differentiation medium)"는 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, MEK 억제제를 포함하고 망막 세포를 분화시키는 배지를 본원에서 나타낸다. RDM은 TGFβ 경로 억제제도 포함한다.
"망막 배지(RM: retinal medium)"는 액티빈 A 및 니코틴아미드를 포함하는, 망막 세포의 배양을 위한 성장 배지로 정의된다.
"RPE-성숙 배지(RPE-MM)"은 타우린 및 하이드로코르티손을 포함하는 RPE 세포의 성숙을 위한 배지를 본원에서 나타낸다. RPE-MM은 트리요오도티로닌도 포함한다. RPE-MM은 PD0325901 또는 PGE2도 포함할 수 있다.
"성숙한" RPE 세포는 본원에서, Pax6과 같은 미성숙 RPE 마커의 하향조정된 발현 및 RPE65와 같은 성숙 RPE 마커의 상향조정된 발현을 갖는 RPE 세포를 나타낸다.
RPE 세포 "성숙"은 본원에서, RPE 발달 경로가 조절되어 성숙 RPE 세포를 생성하는 과정을 나타낸다. 예를 들어, 섬모 기능의 조절은 RPE 성숙을 야기할 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"은, 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 치료되는 경우, 이러한 치료에 효과를 나타내기에 충분한 화합물의 양을 나타낸다.
"유도인자"는 본원에서, 세포 내의 유전자 활성과 같은 유전자 발현을 조정하는 분자로 정의된다. 유도인자는 억제인자 또는 활성인자에 결합할 수 있다. 유도인자는 억제인자를 사용하지 않음으로써 기능한다.
II. 만능 줄기 세포
A. 배아 줄기 세포
ES 세포는 주머니배의 내부 세포괴로부터 유도되며, 고도의 시험관내 분화능을 가진다. ES 세포는 발달 중인 배아의 외부 외배엽층을 제거한 뒤, 내부 세포괴를 비성장 세포의 영양세포층 상에서 배양함으로써 단리할 수 있다. 재플레이팅된 세포는 계속해서 증식할 수 있으며, 제거, 해리, 다시 재플레이팅, 및 성장될 수 있는 ES 세포의 새로운 군체를 형성할 수 있다. 이러한 미분화된 ES 세포의 "계대배양" 과정은 미분화된 ES 세포를 함유하는 세포주를 생성할 때까지 수회 반복할 수 있다(미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호, 제7,029,913호). ES 세포는 이의 만능성을 유지하는 동시에 증식할 수 있는 잠재력을 가진다. 예를 들어, ES 세포는 세포 분화를 제어하는 세포 및 유전자에 대한 연구에서 유용하다. 유전 조작 및 선택과 결합된 ES 세포의 만능성은, 유전자삽입, 키메라, 및 녹아웃 마우스의 생성을 통한 생체내 유전자 분석 연구를 위해 사용될 수 있다.
마우스 ES 세포의 제조방법은 널리 공지되어 있다. 하나의 방법에서, 129개의 마우스 균주로부터의 착상전 주머니배는, 마우스 항혈청으로 처리되어 외배엽이 제거되며, 내부 세포괴는 소 태아 혈청을 함유하는 배지의 화학적으로 불활성화된 매우스 배아 섬유모세포의 영양세포층 상에서 배양된다. 발달되는 미분화된 ES 세포들의 군체는, ES 세포의 개체군을 생성하기 위해 소 태아 혈청의 존재하에 마우스 배아 섬유모세포 영양세포층 상에서 계대배양된다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는, 혈청-함유 배양 배지에 시토카인 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)를 첨가함으로써, 영양세포층의 부재하에 성장할 수 있다(Smith, 2000). 다른 방법에서, 마우스 ES 세포는 골 형성 단백질 및 LIF의 존재하에 혈청 불포함 배지에서 성장할 수 있다(Ying 등, 2003).
인간 ES 세포는, 정자 세포와 난자 세포의 융합, 핵 치환, 발병기전에 의해, 또는 상기 개시된 방법에 의해 배아 세포를 생성하기 위한 염색질의 재프로그래밍과 상기 재프로그래밍된 염색질의 형질막으로의 후속적인 통합에 의해 생성된, 접합체 또는 주머니배-기의(staged) 포유동물 배아로부터 생성되거나 유도될 수 있다(Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000). 하나의 방법에서, 인간 주머니배는 항-인간 혈청에 노출되며, 외배엽 세포는 마우스 배아 섬유모세포의 영양세포층 상에서 배양된 내부 세포괴로부터 용해되고(lysed) 제거된다. 또한, 내부 세포괴로부터 유도된 세포 응괴는 화학적으로 또는 기계적으로 해리되고, 재플레이팅되며, 미분화된 형태학을 갖는 군체가 마이크로피펫으로 선택되고, 해리되고, 재플레이팅 된다(미국 특허 제6,833,269호). 일부 방법에서, 인간 ES 세포는, 염기성 섬유모세포 성장 인자의 존재하에, 섬유모세포의 영양세포층에서 ES 세포를 배양함으로써 혈청 없이 성장할 수 있다(Amit 등, 2000). 다른 방법에서, 인간 ES 세포는 MATRIGEL™과 같은 단백질 매트릭스 상에서, 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자를 함유하는 "조건화" 배지의 존재하의 라미닌 상에서 세포를 배양함으로써, 영양세포층 없이 성장할 수 있다(Xu 등, 2001).
ES 세포는, 상기 개시된 방법에 의해 레서스(rhesus) 원숭이 및 마모셋을 포함하는 기타 유기체로부터(Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000), 그리고 확립된 마우스 및 인간 세포주로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 정립된 인간 ES 세포주는 MAOI, MA09, ACT-4, HI, H7, H9, H13, H14 및 ACT30을 포함한다. 추가의 예로서, 정립된 마우스 ES 세포주는 마우스 염색 129 배아의 내부 세포괴로부터 정립된 CGR8 세포주를 포함하며, CGR8 세포의 배양은 영양세포층 없이 LIF의 존재하에 성장될 수 있다.
ES 줄기 세포는 전사 인자 Oct4, 알칼리성 인산분해효소(AP), 단계 특이 배아 항원 SSEA-1, 단계 특히 배아 항원 SSEA-3, 단계 특이 배아 항원 SSEA-4, 전사 인자 NANOG, 종양 거부 항원 1-60(TRA-1-60), 종양 거부 항원(TRA-1-81), SOX2, 또는 REX1을 포함하는 단백질 마커에 의해 검출될 수 있다.
B. 유도 만능 줄기 세포
만능성의 유도는, 만능성과 연결된 전사 인자의 도입을 통한 체세포의 재프로그래밍에 의해, 본래 마우스 세포를 사용하여 2006년에(Yamanaka 등. 2006) 그리고 인간 세포를 사용하여 2007년에(Yu 등. 2007; Takahashi 등. 2007) 달성됐다. 만능 줄기 세포는 미분화된 상태로 유지될 수 있으며, 거의 모든 세포 유형으로 분화될 수 있다. iPSC는 ES 세포의 대규모의 임상적 사용과 관련된 대부분의 윤리적이고 실질적인 문제들을 피하며, iPSC 유도 자가 이식받은 환자들은 이식편 거부반응을 예방하기 위한 평생의 면역억제 치료를 필요로 하지 않을 수 있다.
종자 세포를 제외한 모든 세포는 iPSC를 위한 출발점이 될 수 있다. 예를 들어, 세포 유형은 각질 세포, 섬유모세포, 조혈 세포, 중간엽 세포, 간 세포, 또는 위 세포일 수 있다. T 세포는 재프로그래밍하기 위한 체세포의 공급원으로 사용할 수도 있다(미국 특허 제8,741,648호). 미분화된 전구 세포(체세포 줄기 세포를 포함함) 및 최종 분화된 성숙 세포가 상기 개시된 방법에서 체세포 공급원으로 사용될 수 있을지라도, 세포 분화 정도 또는 세포가 수집되는 동물의 연령에는 제한이 없다. 일양태에서, 체세포는 인간 RPE 세포와 같이 RPE 세포 그 자체이다. RPE 세포는 성인 또는 태아 RPE 세포일 수 있다. iPSC는, ES 세포를 특정 세포 유형으로 분화시키며 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81을 포함하는 인간 ES 세포 마커를 발현시키는 것으로 공지된 조건하에서 성장될 수 있다.
체세포는 재프로그래밍 되어, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성할 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련가는 유도 만능 줄기 세포를 쉽게 생성할 수 있으며, 예를 들어, 미국 공개 특허출원 제20090246875호, 미국 공개 특허출원 제2010/0210014호; 미국 공개 특허출원 제20120276636호; 미국 특허 제8,058,065호; 미국 특허 제8,129,187호; 미국 특허 제8,278,620호; PCT 출원 제WO 2007/069666 Al호, 및 미국 특허 제8,268,620호를 참조하며, 이들은 인용에 의해 본원에 포함된다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자가 체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28 중 셋 이상, 또는 넷 이상이 이용된다. 다른 양태에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 이용된다.
세포들은 핵 재프로그래밍 물질로 처리되며, 상기 물질은 일반적으로 체세포로부터 iPSC를 유도할 수 있는 하나 이상의 인자(들) 또는 이러한 물질들(벡터에 포함된 형태를 포함함)을 암호화하는 핵산이다. 핵 재프로그래밍 물질은 일반적으로 적어도 Oct3/4, Klf4 및 Sox2, 또는 이러한 분자들을 암호화하는 핵산을 포함한다. p53, L-myc 또는 L-myc를 암호화하는 핵산, 및 Lin28 또는 Lin28b 또는 Lin28 또는 Lin28b를 암호화하는 핵산은 추가적인 핵 재프로그래밍 물질로서 이용될 수 있다. Nanog도 핵을 재프로그래밍하기 위해 이용될 수 있다. 미국 공개 특허출원 제20120196360호에 개시된 바와 같이, iPSC를 생성하기 위한 예시적인 재프로그래밍 인자는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc(Sox2는 Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7 또는 Soxl8로 대체될 수 있으며; Klf4는 KM, Klf2 또는 Klf5로 대체될 수 있다); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 대형 T 항원(SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 인간 유두종 바이러스(HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7; (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmil; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc(Esrrb는 Esrrg로 대체가능하다); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HP VI 6 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2(Esrrb는 Esrrg로 대체가능하다)를 포함한다. 하나의 비제한적 예에서, Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc를 이용한다. 다른 양태에서, Oct4, Nanog, 및 Sox2를 이용하며, 예를 들어, 미국 특허 제7,682,828을 참조하며, 이는 인용에 의해 본원에 포함된다. 이러한 인자들은 Oct3/4, Klf4 및 Sox2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 상기 인자들은 Oct 3/4, K114 및 Myc를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 비제한적인 예에서, Oct3/4, K114, c-Myc, 및 Sox2를 이용한다. 다른 비제한적인 예에서, Oct3/4, K114, Sox2 및 Sal 4를 이용한다. Nanog, Lin28, K114, 또는 c-Myc와 같은 인자들은 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며, 다수의 상이한 발현 벡터들로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, EBV 요소 기반 시스템과 같은 통합 벡터를 사용할 수 있다(미국 특허 제8,546,140호). 추가의 측면에서, 재프로그래밍 단백질은, 단백질 형질도입에 의해 직접적으로 체세포로 도입될 수 있다. 재프로그래밍은 세포들을 글리코겐 신타아제 키나아제 3(GSK-3) 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MEK) 억제제, 전환 성장 인자(TGF-β) 수용체 억제제, 또는 신호 억제제, 백혈병 억제 인자(LIF), p53 억제제, NF-카파 B 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 신호 수용체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절인자들은 소형 분자, 억제 뉴클레오티드, 발현 카세트, 또는 단백질 인자를 포함할 수 있다. 사실상 모든 iPS 세포 또는 세포주를 사용할 수 있는 것으로 예상된다.
이러한 핵 재프로그래밍 물질들의 마우스 및 인간 cDNA 서열은 WO 2007/069666에 언급된 NCBI 수탁 번호를 참조할 수 있으며, 상기 문서는 인용에 의해 본원에 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질, 또는 이러한 재프로그래밍 물질들을 암호화하는 핵산을 도입하기 위한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 공개 특허출원 제2012/0196360호 및 미국 특허 제8,071,369호에 개시되어 있으며, 상기 문서 둘 다는 인용에 의해 본원에 포함된다.
iPSC는 일단 유도되면, 만능성을 유지하기에 충분한 배지에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 제7,442,548호 및 미국 특허출원 제2003/0211603호에 개시된 바와 같이, 다양한 배지, 및 만능 줄기 세포, 보다 특히 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 기술들을 사용할 수 있다. 마우스 세포의 경우, 분화 억제 인자로서 백혈병 억제 인자(LIF)의 정상 배지로의 첨가를 포함하여 배양이 실시된다. 인간 세포의 경우, 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 LIF 대신 첨가하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지될 바와 같이, iPSC를 배양하고 유지하기 위한 다른 방법을 사용할 수 있다.
특정 양태에서, 비한정 조건이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 줄기 세포를 미분화된 상태로 유지하기 위해, 섬유모세포 영양세포 상에서 또는 섬유모세포 영양세포에 노출된 배지 상에서 만능 세포가 배양될 수 있다. 일부 양태에서, 영양 세포로서 방사선 또는 항생제로 처리된 마우스 배아 섬유모세포의 공존하에 배양되어 세포 분열을 종결시킨다. 다르게는, 만능 세포는 한정된 영양세포-독립 배양 시스템, 예를 들어 TESR™ 배지(Ludwig 등, 2006a; Ludwig등, 2006b) 또는 E8™ 배지(Chen 등, 2011)를 사용하여 필수적으로 미분화된 상태로 배양 또는 유지될 수 있다.
일부 양태에서, iPSC가 개질되어 외인 핵산을 발현할 수 있으며, 예를 들어 촉진자에 사용가능하게 연결된 티로시나제 증진인자 및 제1 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 티로시나제 유전자는, 예를 들어 2013년 1월 1일부터 접근가능한 GENBANK® 수탁 번호 22173에 개시되어 있다. 이러한 서열은 마우스주 C57BL/6 위치 5286971-5291691(역전 방향)의 염색체 7과 일치한다. A 4721 염기쌍 서열은 RPE 세포에서 발현되기에 충분하며, 문헌[Murisier et al., Dev. Biol. 303: 838-847, 2007]을 참조하며, 상기 문헌은 인용에 의해 본원에 포함된다. 이러한 구성은 망막 색소 상피 세포에서 발현된다. 다른 증진인자가 이용될 수 있다. 다른 RPE 특히 증진인자는 D-MITF, DCT, TYRP1, RPE65, VMD2, MERTK, MYRIP, 및 RAB27A를 포함한다. 적합한 촉진자는 티로시나제 촉진자를 포함하여 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 임의의 촉진자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 구성은 다른 요소, 예를 들어 번역 개시를 위한 리보솜 결합 자리(내부 리보솜 결합 서열), 및 전사/번역 종료자도 포함할 수 있다. 일반적으로, 세포를 이러한 구조로 형질감염(transfect)시키는 것이 유리하다. 안정한 형질감염을 위한 적합한 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 센다이 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
플라스미드는 다수의 목표, 예를 들어 조절된 높은 카피 수의 달성, 및 세균의 플라스미드 불안정성으로 인한 잠재력을 피하는 것, 및 인간 세포를 포함하여 포유 동물에서의 사용과 호환되는 플라스미드 선택을 위한 수단의 제공을 염두에 두고 고안되었다. 인간 세포에서 사용하기 위한 플라스미드의 이중 요구 사항에 대해 특별한 주의를 기울여왔다. 우선, 이들은 대장균에서의 유지 및 발효에 대해 적합하며, 따라서 대량의 DNA가 생성 및 정제될 수 있다. 두번째로, 이들은 인간 환자 및 동물에서의 사용에 대해 안전하며 적합하다. 첫번째 요구사항은 세균 발효 동안 비교적 쉽게 선택되고 안정적으로 유지될 수 있는 높은 카피 수의 플라스미드를 필요로 한다. 두번째 요구사항은 선택성 마커 및 다른 부호화 서열과 같은 요소에 대한 주의를 요한다. 일부 양태에서, 마커를 암호화하는 플라스미드는, (1) 높은 카피 수의 복제 기점, (2) 카나마이신으로 항생제 선택하기 위한 새로운(neo) 유전자와 같은 선택성 마커, (3) 티로시나제 증진인자를 포함하는 전사 종결 서열, (4) 다양한 핵산 카세트를 포함하기 위한 멀티클로닝 부위, 및 (5) 티로시나제 촉진자에 사용가능하게 연결된 마커를 암호화하는 핵산 서열로 구성된다. 단백질을 암호화하는 핵산을 유도하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 다수의 플라스미드 벡터가 존재한다. 이들은 미국 특허 제6,103,470호, 미국 특허 제7,598,364호, 미국 특허 제7,989,425호, 및 미국 특허 제6,416,998호에 개시된 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지는 않으며, 상기 문헌들은 인용에 의해 본원에 포함된다.
바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA 기반 또는 DNA 기반 바이러스 벡터일 수 있다. 에피솜 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus) 기반 에피솜 벡터, 효모 기반 벡터, 아데노바이러스 기반 벡터, 시미안 바이러스 40(SV40: simian virus 40) 기반 에피솜 벡터, 소 유두종 바이러스(BPV: 소 papilloma virus) 기반 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
마커는 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 적색 형관 단백질), 효소(예를 들어, 홍당무 과산화효소 또는 알칼리성 인산분해효소, 또는 반딧불이/레닐라(renilla) 루시퍼라아제 또는 nanoluc), 또는 다른 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 마커는 단백질(분비된 단백질, 세포 표면, 또는 내부 단백질을 포함하며, 이들 각각은 세포에 의해 합성되거나 흡수될 수 있음); 핵산(예를 들어 mRNA, 또는 효소 활성 핵산 분자), 또는 다당류일 수 있다. 항체, 렉틴, 탐색자(probe) 또는 관심있는 세포 유형의 마커에 대해 특이성인 핵산 증폭 반응에 의해 검출가능한 모든 세포 요소의 측정이 포함된다. 마커는 생화학적 검정 또는 효소 검정 또는 유전 생성물의 기능에 따르는 생물학적 반응에 의해 확인될 수도 있다. 이러한 마커들을 암호화하는 핵산 서열은 티로시나제 증진인자와 사용가능하게 연결될 수 있다. 또한, 다른 유전자는 예를 들어 줄기 세포의 RPE 분화, 또는 RPE 기능, 또는 생리학적 또는 병리학적 기능에 영향을 미칠 수 있는 유전자에 포함될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, MITF, PAX6, TFEC, OTX2, LHX2, VMD2, CFTR, RPE65, MFRP, CTRP5, CFH, C3, C2B, APOE, APOB, mTOR, FOXO, AMPK, SIRT1-6, HTRP1, ABCA4, TIMP3, VEGFA, CFI, TLR3, TLR4, APP, CD46, BACE1, ELOLV4, ADAM 10, CD55, CD59, 및 ARMS2 중 하나 이상을 암호화하는 핵산이 포함된다.
1. MHC 일배체형 일치
주 조직접합성 복합체는 동종이형 기관 이식의 면역 거부의 주된 원인이다. 세가지의 주요 MHC 클래스 I 일배체형(A, B, 및 C) 및 세가지의 주요 MHC 클래스 II 일배체형(DR, DP, 및 DQ)가 존재한다. HLA 유전자자리는 매우 다형태성이며, 염색체 6 상에 4Mb에 걸쳐 분산되어 있다. 상기 영역 내의 HLA 유전자를 일배체형으로 할 수 있는 가능성은 임상적으로 중요한데, 이러한 영역은 자가면역 및 감염 질환과 관련되며, 공여자와 수여자 사이의 HLA 일배체의 적합성은 이식의 임상적 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. MHC 클래스 I에 상응하는 HLA는 세포 내부로부터 펩타이드를 제공하며, MHC 클래스 II에 상응하는 HLA는 세포 외부로부터 T-림프구로 항원을 제공한다. 이식편과 숙주 사이의 MHC 일배체의 부적합성은 이식편에 대한 면역 반응을 촉발하며, 이의 거부를 야기한다. 따라서, 환자는 면역억제제로 치료되어 거부를 방지할 수 있다. HLA 일치된 줄기 세포주는 면역 거부의 위험요소를 극복할 수 있다.
이식에서의 HLA의 중요성으로 인해, HLA 유전자자리는 일반적으로 유리한 공여자-수여자 짝을 확인하기 위해 혈청학 및 PCR에 의해 유형화된다. HLA 클래스 I 및 II 항원의 혈청학적 검출은, 정제된 T 또는 B 림프구를 사용하는 보체 매개 림프구독성 시험을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 절차는 HLA-A와 HLA-B 유전자자리를 일치시키기 위해 우세하게 사용된다. 분자 기반 조직 유형화는 종종 혈청학적 시험보다 정확할 수 있다. PCR 생성물이 일련의 올리고뉴클레오티드 탐색자에 대해 시험되는 SSOP(서열 특이 올리고뉴클레오티드 탐색자)와 같은 저분해능 분자 방법은 HLA 항원을 확인하기 위해 사용할 수 있으며, 최근 이러한 방법은 클래스 II-HLA 유형화에 대해 사용하는 가장 일반적인 방법이다. PCR 증폭에 대한 대립유전자 특이 프라이머를 이용하는 SSP(서열 특이 프라이머) 방법과 같은 고분해능 기술은 특정 MHC 대립유전자를 확인할 수 있다.
공여자 세포가 HLA 동형접합인 경우, 즉, 각각의 항원 제공 단백질에 대해 동일한 대립유전자를 함유하는 경우, 공여자와 수여자 사이의 MHC 적합성이 상당히 증가한다. 대부분의 개인들은 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형접합이지만, 특정 개인들은 이러한 유전자에 대해 동형접합이다. 이러한 동형접합 개인들은 초공여자의 역할을 할 수 있으며, 이들의 세포로부터 생성된 이식편은 개인의 일배체형에 대해 동형접합이거나 이형접합인 모든 개인에 이식될 수 있다. 게다가, 동형접합 공여자 세포가 개체군에서 고빈도로 발견되는 일배체를 갖는 경우, 이러한 세포들은 다수의 개인에 대한 이식 치료법에 적용될 수 있다.
따라서, iPSC는 치료되는 대상체, 또는 환자의 체세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 또 다른 대상체의 체세포로부터 생성될 수 있다. 하나의 경우, 공여자의 주요 HLA(예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 세개의 주요 유전자자리)는 수여자의 주요 HLA와 동일하다. 일부 경우, 체세포 공여자는 초공여자일 수 있으며, 따라서, MHC 동형접합 초공여자로부터 유도된 iPSC를 RPE 세포를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 초공여자로부터 유도된 iPSC는 이의 일배체형에 대해 동형접합이거나 이형접합인 대상체에 이식될 수 있다. 예를 들어, iPSC는 2개의 HLA 유전자 자리, 예를 들어 HLA-A 및 HLA-B에서 동형접합일 수 있다. 이와 같이, 초공여자로부터 생성된 iPSC는 본원에 개시된 방법에서 사용되어 다수의 잠재적인 공여자에게 잠재적으로 "일치"될 수 있는 RPE 세포를 생성할 수 있다.
2. 에피솜 벡터
특정 측면에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 외인 에피솜 유전 요소에 포함된 발현 카세트로부터 발현된다(미국 특허출원 제2010/0003757호 참조, 상기 문헌은 인용에 의해 본원에 포함됨). 따라서, iPSC는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 요소와 같은 외인 유전 요소를 필수적으로 불포함할 수 있다. 이러한 iPSC는 염색체외 복제 벡터(즉, 에피솜 벡터)를 사용함으로써 제조될 수 있으며, 상기 벡터는 외인 벡터 또는 바이러스 요소를 필수적으로 불포함하는 iPSC를 이루기 위해 에피솜 복제할 수 있는 벡터이다(미국 특허 제8,546,140호 참조, 상기 문헌은 인용에 의해 본원에 포함됨, Yu 등, 2009). 다수의 DNA 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 시미안 공포성 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스(BPV), 또는 발아 효모 ARS(자율 복제 서열) 함유 플라스미드는 포유 동물 세포에서 염색체외 복제 또는 에피솜 복제한다. 이러한 에피솜 플라스미드는 벡터 통합과 관련된 모든 단점들(Bode 등, 2001)로부터 내재적으로 자유롭다. 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 림프친화 헤르페스 바이러스계 포함 또는 엡스타인 바 바이러스(EBV) 염색체외 복제할 수 있으며, 재프로그래밍 유전자를 체세포에 전달하는 것을 도울 수 있다. 유용한 EBV 요소는 OriP 및 EBNA-1, 또는 이들의 변형 또는 기능적인 동등물이다. 에피솜 벡터의 추가적인 이점은 외인 요소들이 세포 내로 도입된 후 시간에 따라 손실되어, 이러한 요소들을 필수적으로 불포함하는 자립(self-sustained) iPSC를 야기할 것이라는 점이다.
다른 염색체외 벡터는 다른 림프친화 헤르페스 바이러스 기반 벡터를 포함한다. 림프친화 헤르페스 바이러스는, 림프모세포(예를 들어, 인간 B 림프모세포)로 복제되며 이의 자연 생애주기의 일부 동안 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus)는 "림프친화" 헤르페스 바이러스가 아니다. 예시적인 림프친화 헤르페스 바이러스는 EBV, 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV: Kaposi's sarcoma herpes virus); 헤르페스 바이러스 사이미리(HS), 및 마렉 질환 바이러스(MDV: Marek's disease virus)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 에피솜 기반 벡터의 다른 공급원, 예를 들어 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40, 또는 BPV 또한 고려된다.
C. 체세포 핵 치환
만능 줄기 세포는 체세포 핵 치환 방법을 통해 제조될 수 있다. 체세포 핵 치환은 방추체 불포함 난자의 공여자 핵으로의 치환을 수반한다. 일 방법에서, 레서스 짧은꼬리 원숭이의 피부 섬유모세포로부터의 공여자 섬유모세포 핵을, 전기융합에 의해 방추체 불포함 성숙 중기 II 레서스 짧은꼬리 원숭이 난자의 세포질로 도입한다(Byrne 등, 2007). 융합된 난자는 이오노마이신에 노출 후, 주머니배 단계까지 항온배양함으로써 활성화된다. 이후, 선택된 주머니배의 내부 세포괴가 배양되어 배아 줄기 세포주를 생성한다. 배아 줄기 세포주는 정상 ES 세포 형태를 나타내며, 다양한 ES 세포 마커를 발현하며, 시험관내 및 생체내 둘 다의 다수의 세포 유형으로 분화된다.
III. 망막 색소 상피 세포
RPE 세포는 본원에 개시된 방법으로 생성된다. 광을 직접적으로 감지하는 망막의 세포는 광수용체 세포이다. 광수용체는 망막 외부의 광감성 뉴런이며, 막대형 또는 원추형일 수 있다. 광전도 과정에서, 광수용체 세포는, 수정체에 의해 입사광 에너지를 전기적 신호로 전환시킨 뒤, 시신경을 통해 뇌로 전송한다. 척추동물은 원추형 및 막대형의 두가지 유형의 광수용체 세포를 가진다. 원추형은 세밀하고 상세한 중심 시력 및 색각을 검출하고 밝은 광에서도 양호하게 기능하기에 적합하다. 막대형은 말초 시력 및 어두운 광 시력을 담당한다. 막대형 및 원추형으로부터의 신경 신호는 망막의 다른 신경들에 의해 처리된다.
망막 색소 상피는 혈류와 망막 사이의 장벽으로 작용하며, 시각 기능의 유지에서 광수용체와 상호작용한다. 망막 상피 세포는, 망막에 도달하는 광 에너지를 흡수하는 멜라닌 과립으로 밀도 높게 충전된 단일층의 육각 세포로 구성된다. 특화된 RPE 세포의 주요 기능은, 혈액으로부터 광수용체로 포도당, 레티놀, 및 지방산과 같은 영양소의 운반; 망막하 공간으로부터 혈액으로 물, 대사 말단 생성물, 및 이온의 운반; 광 흡수 및 광산화에 대한 보호; 모든 트랜스-레티놀의 11-시스-레티날로의 재이성화; 창고 광수용체(shed photoreceptor) 막의 포식작용; 및 망막의 구조적 통합성을 위한 다양한 필수 인자의 분비를 포함한다.
망막 색소 상피는 마커, 예를 들어 세포 레틴알데하이드 결합 단백질(CRALBP), RPE65, 베스트 난환상 황반 이상증 유전자(VMD2), 및 망막 색소 상피 유도 인자(PEDF)를 발현시킨다. 망막 색소 상피의 기능장애는 다수의 시각 변경 조건, 예를 들어 망막 색소 상피 박리, 형성이상, 위축, 망막병, 망막 색소변경, 황반 이상증, 또는 변성과 관련된다.
망막 색소 상피(RPE) 세포는 이들의 색소침착, 상피 형태, 및 첨단-기저 극성에 따라 특징될 수 있다. 분화된 RPE 세포는 이들의 조약돌 형태 및 색소의 초기 외관에 의해 시각적으로 구분될 수 있다. 또한, 분화된 RPE 세포는 단층을 가로지르고, 첨단으로부터 기저측으로 체액 및 CO2를 운반하고, 시토카인의 분극된 분비를 조절하는 상피 통과 저항/TER, 및 상피 통과 전위/TEP를 가진다(TER > 100ohms. cm2; TEP > 2mV).
RPE 세포는 면역세포화학, 웨스턴 블롯 분석, 유동 세포측정, 및 효소-연결 면역검정(ELISA)과 같은 방법론을 사용함으로써 검출용 마커로서의 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 예를 들어, RPE 특히 마커는 세포 레틴알데하이드 결합 단백질(CRALBP), 소안구증-연관 전사 인자(MITF), 티로시나제-연관 단백질 1(TYRP-1), 망막 색소 상피-특이성 65kDa 단백질(RPE65), 전멜라닌소체 단백질(PMEL17), 베스트로핀 1(BEST1), 및 c-mer 원종양 유전자 티로신 키나제(MERTK)를 포함할 수 있다. RPE 세포는 배아 줄기 세포인 Oct-4, nanog 또는 Rex-2를 (어떠한 검출가능한 수준으로도) 발현하지 않는다. 특히, 이러한 유전자들의 발현은, 정량 RT-PCR에 의해 평가되는 경우, ES 세포 또는 iPSC 세포에서에 비해 RPE 세포에서 약 100 내지 1000배 낮다.
RPE 세포 마커는, 예를 들어 역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯 분석, 또는 공개적으로 사용가능한 서열 데이터(GENBANK®)를 사용하는 표준 증폭 방법에서 서열 특이 프라이머를 사용하는 닷-블롯 부합화 분석에 의해 mRNA 수준으로 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출되는 조직 특이 마커의 발현은, 그 수준이 미분화된 만능 줄기 세포 또는 다른 비관련 세포 유형과 같은 대조군 세포의 적어도 또는 대략 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 또는 9배, 보다 특히, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상으로 높은 경우, 양성으로 간주한다.
RPE 세포의 기능장애, 손상, 및 손실은 노화 관련 황반 변성(AMD), 베스트 질환을 포함하는 유전 황반 변성, 및 망막 색소변성을 포함하는 다수의 안 질환 및 장애의 요인이다. 이러한 질환을 위한 잠재적인 치료는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상의 망막으로의 RPE 세포의 이식이다. RPE 세포의 이식에 의한 RPE 세포의 보충(Replanishment)이 지연될 수 있으며, 분해를 중단 또는 역전시킬 수 있으며, 망막 기능을 개선할 수 있으며, 이러한 병태들로부터 비롯된 시각상실을 방지할 수 있는 것이 추측된다. 하지만, 인간 공여자 및 배아로부터 직접적으로 RPE 세포를 얻는 것은 난제이다.
A. PSC 의 배아체로부터 RPE 세포의 유도
널리 공지된 재프로그래밍 인자를 사용하여 재프로그래밍된 iPSC는 RPE 세포를 포함하는 신경계 안구 세포를 발생시킬 수 있다(Hirami 등, 2009). 전문에 인용에 의해 본원에 포함되는 PCT 출원 제2014/121077호는, iPSC로부터 생성된 배아체(EB)가 현탁액 배양에서 Wnt 및 결절 길항제로 처리되어 망막 전구 세포의 마커의 발현을 유도하는 방법을 개시한다. 상기 출원은, RPE 세포에 대해 매우 풍부한 배양물로의 iPSC의 EB의 분화 과정을 통해 RPE 세포가 iPSC로부터 유도되는 방법을 개시한다. 예를 들어, 배아체는 rho 관련 권취 코일 키나아제(ROCK) 억제제의 첨가제에 의해 iPSC로부터 생성되며, 2개의 WNT 경로 억제제 및 Nodal 경로 억제제를 포함하는 제1 배지에서 배양된다. 추가로, EB는, 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 포함하지 않고, Nodal 경로 억제제를 포함하고, 약 20 내지 약 90ng의 Noggin을 포함하고, 약 1 내지 약 5%의 녹 아웃 혈청 대체물을 포함하는 제2 배지의 MATRIGEL™ 코팅된 조직 배양물 상에 플레이팅되어, 분화 RPE 세포를 형성한다. 분화 RPE 세포는 액티빈 및 WNT3a를 포함하는 제3 배지에서 배양된다. 이후, RPE 세포는 약 5%의 태아 혈청, 표준(canonical) WNT 억제제, 비표준 WNT 억제제, 및 Sonic Hedgehog 및 FGF 경로 억제제를 포함하는 RPE 배지에서 배양되어 인간 RPE 세포를 생성한다.
분화 세포 유형을 제조하기 위한 EB의 사용에는 다수의 단점이 존재한다. 예를 들어, EB의 제조는 효율이 다양하기 때문에 일관성이 없고 재현성이 없는 과정이다. iPSC 또는 ES 세포로부터 제조된 EB의 크기 및 형태는 균일하지 않으며, EBS의 제조는 속도 제한 원심분리 처리를 수반한다. 본원 명세서는 EB 독립적인 임상적인 연구 또는 치료학적 적용에 필요한 iPSC 유도 또는 ES 유도 세포의 대량 생산을 가능케하는 방법을 제공한다.
B. 필수적으로 단일한 세포 PSC 로부터의 RPE 세포의 유도
일부 양태에서, 인간 iPSC와 같은 만능 줄기 세포의 필수적으로 단일한 세포 현탁액으로부터 RPE 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, PSC가 융합전되게 배양되어 모든 세포 응집을 방지한다. 특정 측면에서, PSC는 예를 들어 TRYPSIN™ 또는 TRYPLE™로 예시되는 세포 해리 효소와 함께 항온배양되어 해리된다. PSC는 피펫팅에 의해 필수적으로 단일한 세포 현탁액으로 해리될 수도 있다. 또한, 블레비스타틴(예를 들어, 약 2.5μM)이 배지에 첨가되어, 단일 세포로의 해리 후의 PSC 생존율을 증가시킬 수 있는 동시에, 세포들은 배양 용기에 부착되지 않는다. 블레비스타틴 대신 ROCK 억제제를 사용하여 단일 세포로의 해리 후의 PSC 생존율을 다르게 증가시킬 수 있다.
단일 세포 PSC로부터 RPE 세포를 효율적으로 분화시키기 위해, 정확한 수의 투입 밀도가 RPE 분화 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, PSC의 단일 세포 현탁액은 일반적으로 tlELD 전에 계수된다. 예를 들어, PSC의 단일 세포 현탁액은 혈구계 또는 자동 세포 계수기, 예를 들어 VICELL® 또는 TC20로 계수된다. 세포는 약 10,000 내지 약 500,000cells/mL, 약 50,000 내지 약 200,000cells/mL, 또는 약 75,000 내지 약 150,000cells/mL의 세포 밀도로 희석될 수 있다. 비제한적인 예에서, PSC의 단일 세포 현탁액은 ESSENTIAL 8™(E8™) 배지와 같은 완전 한정 배양 배지에서 약 100,000cells/mL의 밀도로 희석된다.
PSC의 단일 세포 현탁액이 공지된 세포 농도로 얻어지면, 세포들은 일반적으로 적합한 배양 용기, 예를 들어 플라스크, 6웰, 24웰, 또는 96웰 플레이트와 같은 조직 배양 플레이트에 씨딩된다. 세포(들)을 배양하기 위해 사용되는 배양 용기는, 그 내부에서 줄기 세포를 배양할 수만 있으면, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 다중 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 다중 플레이트, 다중웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CELLSTACK® 챔버, 배양 주머니, 및 회전병을 포함할 수 있지만 이들로 특별히 제한되지는 않는다. 세포는, 배양 요구사항에 따라 적어도 또는 약 0.2ml, 0.5ml, 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml, 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml, 300ml, 350ml, 400ml, 450ml, 500ml, 550ml, 600ml, 800ml, 1000ml, 1500ml, 또는 이러한 범위 내부의 임의의 유도가능한 범위의 용적에서 배양될 수 있다. 특정 양태에서, 배양 용기는 생물학적으로 활성인 환경을 보조하여 세포들이 번식할 수 있는 임의의 생체외 장비 또는 시스템으로 나타낼 수 있는 생물 반응기일 수 있다. 생물 반응기는 적어도 또는 약 2L, 4L, 5L, 6L, 8L, 10L, 15L, 20L, 25L, 50L, 75L, 100L, 150L, 200L, 500L, 1m3, 2m3, 4m3, 6m3, 8m3, 10m3, 15m3, 또는 이러한 범위 내부의 임의의 유도가능한 범위의 용적을 가질 수 있다.
특정 측면에서, iPSC와 같은 PSC는 효율적인 분화를 위해 적당한 세포 밀도로 플레이팅된다. 일반적으로, 세포는 약 1,000 내지 약 75,000cells/cm2, 예를 들어, 약 5,000 내지 약 40,000cells/cm2의 세포 밀도로 플레이팅된다. 6웰 플레이트에서, 세포는 웰당 약 50,000 내지 400,000cells의 세포 밀도로 씨딩된다. 예시적인 방법에서, 세포는 웰당 약 100,000cells, 약 150,00cells, 약 200,000cells, 약 250,000cells, 약 300,000cells 또는 약 350,000cells, 예를 들어 웰당 약 200,00cells의 세포 밀도로 씨딩된다.
iPSC와 같은 PSC는 일반적으로 하나 이상의 세포 부착 단백질로 코팅된 배양 플레이트에서 배양되어, 세포 부착을 촉진하는 동시에 세포 생존력을 유지한다. 예를 들어, 바람직한 세포 부착 단백질은 세포외 기질 단백질, 예를 들어 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함하며, 이들은 만능 세포 성장을 위한 고형 지지체의 제공 수단으로서 배양 표면을 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "세포외 기질"은 당해 기술 분야에서 인식된다. 이의 성분은 다음 단백질들 중 하나 이상을 포함한다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 연결 단백질, 뼈 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 운둘린, 에필리그린, 및 칼리닌. 예시적인 방법에서, PSC는 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 배양 플레이트에서 성장된다. 일부 양태에서, 세포 부착 단백질은 인간 단백질이다.
세포외 기질(ECM) 단백질은 천연 유래의 것 및 인간 또는 동물 조직으로부터 정제된 것일 수 있거나, 다르게는 ECM 단백질은 유전적으로 조작된 재조합 단백질 또는 천연 합성 단백질일 수 있다. ECM 단백질은 자연 또는 조작된 전단백질 또는 펩타이드 분절 형태일 수 있다. 세포 배양을 위한 매트릭스에서 사용할 수 있는 ECM 단백질의 예는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 포함한다. 일부 양태에서, 매트릭스 조성물은 합성 생성된 피브로넥틴의 펩타이드 분절 또는 재조합 피브로넥틴을 포함한다. 일부 양태에서, 매트릭스 조성물은 제노-프리이다. 예를 들어, 인간 세포를 배양하기 위한 제노-프리 매트릭스에서, 인간 유래 매트릭스 성분이 사용될 수 있으며, 임의의 비인간 동물 성분들은 제외될 수 있다.
일부 측면에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1ng/mL 내지 약 1mg/mL일 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1 내지 약 300㎍/mL이다. 보다 바람직한 양태에서, 매트릭스 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 5 내지 약 200㎍/mL이다.
예를 들어 RPE 세포 또는 PSC와 같은 세포들은 각각의 특정 세포 개체군의 성장을 보조하기 위해 필요한 영양소로 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 탄소 공급원, 질소 공급원, 및 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 성장 배지에서 배양된다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 시토카인, 항산화물질, 피루브산, 완충제, 및 무기 염을 함유할 수도 있다. 예시적인 성장 배지는 최소 필수 배지, 예를 들어 비필수 아미노산 및 비타민과 같은 다양한 영양소로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™(E8™) 배지를 함유하여 줄기 세포 성장을 촉진한다. 최소 필수 배지의 예는 Minimal Essential Medium Eagle(MEM) 알파 배지, Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지, 및 F12 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 최소 필수 배지는 말, 소, 또는 소 태아 혈청과 같은 첨가제로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 혈청을 포함하지 않을 수 있다. 다른 경우, 성장 배지는 "녹아웃 혈청 대체물"을 함유할 수 있으며, 이는 본원에서 줄기 세포와 같은 미분화된 세포를 배지에서 성장시키고 유지하기에 최적화된 혈청 불포함 제형을 나타낸다. 녹아웃™ 혈청 대체물은 예를 들어 미국 특허 출원 제2002/0076747호에 개시되었으며, 상기 출원은 인용에 의해 본원에 포함된다. 바람직하게는, PSC는 완전 한정되고 영양세포를 포함하지 않는 배지에서 배양된다.
따라서, 단일 세포 PSC는 일반적으로 플레이팅 후에 완전 한정 배양 배지에서 배양된다. 특정 측면에서, 씨딩 후 약 18 내지 24시간에, 배지가 흡인되며, 예를 들어 E8™ 배지와 같은 새로운 배지가 배양물에 추가된다. 특정 측면에서, 단일 세포 PSC는 씨딩 후 약 1일, 2일, 또는 3일간 완전 제한 배양 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 단일 세포 PSC는 분화 과정으로 가공되기 전에 약 2일간 완전 한정 배양 배지에서 배양된다.
일부 양태에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대안을 함유할 수 있거나, 함유하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대안은 알부민(예를 들어, 지질-풍부 알부민, 알부민 치환체, 예를 들어 재조합 알부민, 식물 전분, 덱스트란, 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 기타 철 전달체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이들에 대한 동등물을 적당히 함유하는 물질들을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대안은 예를 들어 국체 출원 제WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 임의의 상업적으로 입수가능한 물질들이 보다 편리하게 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 물질은 녹아웃™ 혈청 대체물(KSR), 화학적으로 한정되고 지질 농축된(Gibco), 및 GLUTAMAX™(Gibco)를 포함한다.
기타 배양 조건은 적절히 한정될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어 적어도 또는 약 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃일 수 있지만, 이들로 특별히 한정되지는 않는다. 일양태에서, 세포는 37℃에서 배양된다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어 약 2 내지 5%, 또는 상기 범위 내의 임의의 유도가능한 범위일 수 있다.
a. 분화 배지
망막 유도 배지
단일 세포 PSC가 배양 플레이트에 부착된 후, 세포는 바람직하게는 망막 유도 배지에서 배양되어 망막계통 세포로의 분화 과정을 시작한다. 망막 유도 배지(RIM)는 WNT 경로 억제제를 포함하며, PSC의 망막계통 세포로의 분화를 야기할 수 있다. RIM은 TGFβ 경로 억제제 및 BMP 경로 억제제를 추가로 포함한다. 하나의 예시적인 RIM 배지는 표 3에 나타낸다.
RIM은 DMEM 및 F12를 약 1:1 비율로 포함할 수 있다. 예시적인 방법에서, RIM은 CKI-7과 같은 WNT 경로 억제제를 포함하며, LDN193189와 같은 BMP 경로 억제제를 포함하여, SB431542와 같은 TGFβ 경로 억제제를 포함한다. 예를 들어, RIM은 약 5 내지 약 50nM, 예를 들어 약 10nM의 LDN193189, 약 0.1 내지 약 5μM, 예를 들어 약 0.5μM의 CKI-7, 및 약 0.5 내지 약 10μM, 예를 들어 약 1μM의 SB431542를 포함한다. 또한, RIM은 녹아웃 혈청 대체물, 예를 들어 약 1 내지 약 5%의, MEM 비필수 아미노산(NEAA), 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 아스코르브산, 및 인슐린 성장 인자 1(IGF1)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, IGF1는 동물성분 불포함(animal free) IGF1(AF-IGF1)이며, 약 0.1 내지 약 10ng/mL, 예를 들어 약 1ng/mL로 RIM에 포함된다. 일반적으로 세포는 약 1 내지 약 5일간, 예를 들어 약 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일간, 예를 들어 약 2일간 RIM에서 배양되어 망막계통 세포를 생성한다.
망막 분화 배지
이후, 망막계통 세포는 추가의 분화를 위해 망막 분화 배지(RDM)에서 배양될 수 있다. RDM은 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, 및 MEK 억제제를 포함한다. 일양태에서, RDM은 CKI-7과 같은 WNT 경로 억제제, LDN193189와 같은 BMP 경로 억제제, SB431542와 같은 TGFβ 경로 억제제, 및 PD0325901과 같은 MEK 억제제를 포함한다. 다르게는, RDM은 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, 및 bFGF 억제제를 포함할 수 있다. 일반적으로, WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, 및 TGFβ 경로 억제제의 농도는 RIM에 비해 RDM에서 보다 더 높으며, 예를 들어, 약 9 내지 약 11배, 예를 들어 약 10배 더 높다. 예시적인 방법에서, RDM은 약 50 내지 약 200nM, 예를 들어 약 100nM의 LDN193189, 약 1 내지 약 10μM, 예를 들어 약 5μM의 CKI-7, 약 1 내지 약 50μM, 예를 들어 약 10μM의 SB431542, 및 약 0.1 내지 약 10μM, 예를 들어 약 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 또는 9μM의 PD0325901를 포함한다. 하나의 예시적인 RDM 배지는 표 3에 나타낸다.
일반적으로, RDM은 DMEM과 F12를 약 1:1 비율로, 그리고 녹아웃 혈청 대체물(예를 들어, 약 1 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%), MEM NEAA, 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 아스코르브산 및 IGF1(예를 들어, 약 1 내지 약 50ng/mL, 예를 들어 약 10ng/mL)을 포함한다. 특정 방법에서, 각각의 날에 전날로부터 배지의 흡인 후 RDM에 세포가 새롭게 제공된다. 일반적으로는, 세포는 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 또는 16일, 예를 들어 약 7일간 RDM에서 배양되어 분화된 망막 세포를 유도한다.
망막 배지
다음으로, 분화된 망막 세포는, 상기 세포를 망막 배지(RM)에서 배양함으로써 보다 추가로 분화될 수 있다. 망막 배지는 액티빈 A를 포함하며, 니코틴아미드를 추가로 포함할 수 있다. RM은 약 50 내지 약 200ng/mL, 예를 들어 약 100ng/mL의 액티빈 A, 및 약 1 내지 약 50mM, 예를 들어 약 10mM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 다르게는, RM은 GDF1과 같은 기타 TGFβ 경로 활성제 및/또는 WAY-316606, IQ1, QS11, SB-216763, BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심), 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘과 같은 WNT 경로 활성제를 포함할 수 있다. 다르게는, RM은 WNT3a를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 RM 배지는 표 3에 나타낸다.
RM은 DMEM 및 F12를 약 1:1 비율로, 그리고 녹아웃 혈청 대체물을 약 1 내지 약 5%, 예를 들어 약 1.5%, MEM 비필수 아미노산(NEAA), 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 및 아스코르브산을 포함할 수 있다. 배지는 실온 RM으로 매일 교체될 수 있다. 세포는 일반적으로 약 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일 또는 17일, 예를 들어 약 10일간 분화되어 분화 RPE 세포를 유도한다.
RPE -성숙 배지
RPE 세포를 추가로 분화하기 위해, 세포는 바람직하게는 RPE 성숙 배지(RPE-MM)에서 배양된다. 예시적인 RPE-MM 배지는 표 3에 나타낸다. RPE-성숙 배지는 약 100 내지 약 300μg/mL, 예를 들어 약 250㎍/mL의 타우린, 약 10 내지 약 30㎍/L, 예를 들어 약 20㎍/L의 하이드로코르티손, 및 약 0.001 내지 약 0.1㎍/L, 예를 들어 약 0.013 ㎍/L의 트리요오도티로닌을 포함할 수 있다. 또한, RPE-MM은 MEM 알파, N-2 보충, MEM 비필수 아미노산(NEAA), 및 나트륨 피루베이트, 및 소 태아 혈청(예를 들어, 약 0.5 내지 약 10%, 예를 들어 약 1 내지 약 5%)을 포함할 수 있다. 배지는 실온 RPE-MM으로 격일로 교체될 수 있다. 세포는 일반적으로 RPE-MM에서 약 5 내지 약 10일간, 예를 들어 약 5일간 배양된다. 이후, 세포는 RPE 세포로 추가 분화되기 위해 예를 들어 세포 해리 효소로 해리되고, 재씨딩되고, 약 5 내지 약 30일, 예를 들어 약 15 내지 20일의 추가 기간 동안 배양된다. 추가의 양태에서, RPE-MM은 WNT 경로 억제제를 포함하지 않으며, RPE 세포는 이 단계에서 냉동보존될 수 있다.
b. RPE 세포의 성숙
이후, RPE 세포는 성숙을 위해 연속된 시간 기간 동안 RPE-MM에서 배양될 수 있다. 일부 양태에서, RPE 세포는 6웰, 12웰, 24웰과 같은 웰에서, 또는 10cm 플레이트에서 성장된다. RPE 세포는 약 4 내지 약 10주간, 예를 들어 약 6 내지 8주간, 예를 들어 6주, 7주, 또는 8주간 RPE 배지에서 유지될 수 있다. RPE 세포의 연속된 성숙을 위한 예시적인 방법에서, 세포는 약 1 내지 2주간 PD0325901과 같은 MEK 억제제를 포함하는 RPE-MM에서, TRYPLE™과 같은 세포 해리 효소로 해리되고, 생물분해성 스캐폴드 어셈블리 상에, 예를 들어 특화 SNAPWELL™ 디자인에 재씨딩될 수 있다. 다르게는, RPE-MM은 MEK 억제제 대신 bFGF 억제제를 포함할 수 있다. 생물분해성 스캐폴드 상에서 RPE 세포를 배양하기 위한 방법은 PCT 출원 제WO 2014/121077호에 교시되고 개시되어 있으며, 상기 출원은 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다. 간략하게는, 이러한 방법의 주 요소는 CORNING® COSTAR® SNAPWELL™ 플레이트, 생물불활성 0-링, 및 생물분해성 스캐폴드이다. SNAPWELL™ 플레이트는 생물분해성 스캐폴드에 대한 구조 및 플랫폼을 제공한다. 첨단측 및 기저측을 생성하는 미세다공성막은, 지지체에 지지를 제공하기 위해서는 물론, 세포의 분극된 층의 뚜렷하게 구분되는 측을 단리하기 위해 이상적이다. SNAPWELL™ 인서트의 막의 박리능은 상기 인서트의 지지환이 지지체에 대한 고정물(anchor)로 사용되게 한다. 상기 생성된 분화되고 분극된 RPE 세포의 융합 단층은 이 단계에서 (예를 들어, 제노프리 CS 10 배지에서) 냉동보존될 수 있다.
일부 양태에서, 성숙 RPE 세포는, RPE 성숙을 촉진하는 추가의 화학물질 또는 소형 분자를 포함하는 RPE-MM에서 연속 배양함으로써, 완전한 RPE 조직으로서 거동하는 기능성 RPE 세포 단층으로 추가로 발달될 수 있다. 예를 들어, 이러한 소형 분자는 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 아피디콜린과 같은 1차 섬모 유도인자이다. PGE2는 약 25 내지 약 250μM, 예를 들어 약 50 내지 약 100μM의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 다르게는, RPE-MM은 표준 WNT 경로 억제제를 포함할 수 있다. 예시적인 표준 WNT 경로 억제제는 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2) 또는 4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드(endo-IWR1)이다. 세포는 추가 시간 기간 동안, 예를 들어 추가로 약 1 내지 약 5주간, 예를 들어 대략 또 다른 2 내지 4주간 이러한 배지에서 배양되어 성숙하고 기능성인 RPE 세포 단층을 얻을 수 있다. 따라서, 임상적 적용을 위해 대규모로 일관성 있게 재현할 수 있는 본원에 개시된 방법은 만능 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 성숙 RPE 세포를 제공한다.
c. RPE 세포의 냉동보존
본원에 개시된 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포는 냉동보존될 수 있으며, 예를 들어 PCT 출원 제2012/149484 A2호를 참조하며, 상기 출원은 인용에 의해 본원에 포함된다. 세포는 기질을 포함하여 또는 기질을 포함하지 않고 냉동보존될 수 있다. 다수의 양태에서, 저장 온도는 약 -50 내지 약 -60℃, 약 -60 내지 약 -70℃, 약 -70 내지 약 -80℃, 약 -80 내지 약 -90℃, 약 -90 내지 약 -100℃의 범위, 및 이들의 겹치는 범위이다. 일부 양태에서, 보다 낮은 온도가 냉동보존된 세포의 저장(예를 들어, 유지)에 사용된다. 다수의 양태에서, 액체 질소(또는 기타 유사한 액체 냉각제)가 세포를 저장하기 위해 사용된다. 추가의 양태에서, 약 6시간 이상 세포가 저장된다. 추가의 양태에서, 약 72시간 이상 세포가 저장된다. 다수의 양태에서, 48시간 내지 약 1주간 세포가 저장된다. 또 다른 양태에서, 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 또는 8주간 세포가 저장된다. 추가의 양태에서, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 67개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 동안 세포가 저장된다. 세포는 보다 더 긴 시간 동안 저장될 수도 있다. 세포는 개별적으로 또는 기질 상에서, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 기질 상에서 냉동보존될 수 있다.
일부 양태에서, 추가의 냉동보호제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 냉동보호제, 예를 들어 DM80, 혈청 알부민, 예를 들어 인간 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 냉동보존 용액에 냉동보존될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 용액은 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 용액은 약 1 내지 약 3%, 약 2 내지 약 4%, 약 3 내지 약 5%, 약 4 내지 약 6%, 약 5 내지 약 7%, 약 6 내지 약 8%, 약 7 내지 약 9%, 또는 약 8 내지 약 10%의 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
세포는 냉동보존 동안 예를 들어, 약 1℃분으로 냉각될 수 있다. 일부 양태에서, 냉동 보존 온도는 약 -80 내지 약 -180℃, 또는 약 -125 내지 약 -140℃이다. 일부 양태에서, 세포는 약 1℃/분의 냉각에 앞서 4℃로 냉각된다. 냉동보존된 세포는 사용하기 위한 해동에 앞서 기체상의 액체 질소로 전달될 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 세포가 약 -80℃에 도달하면, 이들은 액체 질소 저장 구역으로 전달된다. 냉동 보존은 속도제어 냉동기를 사용하여 완료될 수도 있다. 냉동보존된 세포는 예를 들어 약 25 내지 약 40℃의 온도에서, 일반적으로는 약 37℃의 온도에서 해동될 수 있다.
d. 억제제
WNT 경로 억제제
WNT는 세포-대-세포 상호작용을 조절하는 고도로 보존되고 분비된 신호 분자군이며, 초파리 체절 극성 유전자인 wingless와 관련된다. 인간에서, 유전자의 WNT군은 38 내지 43kDa의 시스테인 풍부 당단백질을 암호화한다. WNT 단백질은 소수성 신호 서열, 보존된 아스파라긴-연결된 올리고당 공통 서열(예를 들어, Shimizu 등 Cell Growth Differ 8: 1349-1358 (1997) 참조), 및 22개의 보존된 시스테인 잔기를 가진다. 이들의 세포질 베타-카테닌의 안정화의 촉진능으로 인해, WNT 단백질은 전사 활성제로서 작용할 수 있으며 세포자멸을 억제할 수 있다. 특정 WNT 단백질의 과발현은 특정 암과 관련된 것으로 나타났다.
WNT 억제제는 본원에서, 일반적인 WNT 억제제를 나타낸다. 따라서, WNT 억제제는 Wntl, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt4, Wnt5A, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt9A, WntlOa, Wnt11, 및 Wnt16을 포함하는 WNT군 단백질의 구성원의 임의의 억제제를 나타낸다. 본 발명의 방법의 특정 양태는 분화 배지에서의 WNT 억제제에 관련된다. 당해 기술 분야에 이미 공지된 적합한 WNT 억제제의 예는 N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰아미드 디하이드로클로라이드(CKI-7), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-3-(2-메톡시페닐)-4-옥소티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP4), 2-페녹시벤조산-[(5-메틸-2-푸라닐)메틸렌]하이드라지드(PNU 74654), 2,4-디아미노-퀴나졸린, 케르세틴, 3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온(XAV939), 2,5-디클로로-N-(2-메틸-4-니트로페닐)벤젠설폰아미드(FH 535), N-[4-[2-에틸-4-(3-메틸페닐)-5-티아졸릴]-2-피리디닐]벤즈아미드(TAK 715), Dickkopf-연관 단백질 1(DKK1), 및 Secreted frizzled-연관 단백질 1(SFRP1)을 포함한다. 또한, WNT의 억제제는 이의 우세한 음성 변종에 대한 항체, 및 WNT의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. WNT의 억제는 RNA 매개 간섭(RNAi)을 사용하여 달성될 수도 있다.
BMP 경로 억제제
골 형성 단백질(BMP)은 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 초군(superfamily)에 속하는 다기능성 성장 인자이다. BMP는 신체 전반의 구조를 조율하는 중심 형성 신호 그룹을 구성하는 것으로 간주된다. 생리학에서 BMP 신호의 중요한 기능은 병리학적 과정에서 조절곤란 BMP 신호를 위한 다수의 역할들로 강조된다.
BMP 경로 억제제는 일반적으로 BMP 신호의 억제제 또는 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10 또는 BMP15에 특이성인 억제제를 포함할 수 있다. 예시적인 BMP 억제제는 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 하이드로클로라이드(LDN193189), 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드(도르소모르핀), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린(DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(DMH-2), 및 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(ML 347)을 포함한다.
TGF β 경로 억제제
전환 성장 인자 베타(TGFβ)는 증식, 세포 분화, 및 대부분의 세포에서 기타 기능들을 제어하는 단백질을 분비한다. 이는 면역, 암, 기관지 천식, 폐 섬유증, 심장 질환, 당뇨병, 다발 경화증에서의 역할을 하는 유형의 시토카인이다. TGFβ는 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3으로 불리는 3가지 이상의 이소형으로 존재한다. TGFβ군은 전환 성장 인자 베타초군으로도 알려진 단백질 초군의 일부이며, 이는 인히빈, 액티빈, 항뮐러리안 호르몬, 골 형성 단백질, 데카펜타플렉 및 Vg-1을 포함한다.
TGFβ 경로 억제제는 일반적으로 임의의 TGFβ 신호 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 경로 억제제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린(SB525334), 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-이에리-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 수화물(SB- 505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 수화물, 좌우 결정 인자(Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드(A 83-01), 4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드(GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(R 268712) 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(RepSox)이다.
MEK 억제제
MEK 억제제는 미토겐 활성 단백질 키나제 효소 MEK1 또는 MEK2를 억제하는 화학물질 또는 약물이다. 이들은 MAPK/ERK 경로에 영향을 미치기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, MEK 억제제는 N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901), N-[3-[3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드(GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디하이드록시프로필)사이클로프로판-1-설폰아미드(RDEA119), 및 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(AZD6244)를 포함한다.
bFGF 억제제
염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF, FGF2 또는 FGF-β로도 알려짐)는 섬유모세포 성장 인자군의 구성원이다. bFGF는 기저막 및 혈관의 내피하 세포외 기질에 존재한다. 또한, bFGF는 인간 ESC 배양 배지의 일반적인 성분이며, 이는 세포를 미분화된 단계로 유지하기 위해 필수적이다.
bFGF 억제제는 본원에서 일반적인 bFGF 억제제를 나타낸다. 예를 들어, bFGF 억제제는 N-[2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아(PD173074), 2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온(PD 98059), 1-tert-부틸-3-[6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]우레아(PD161570), 6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-[2-(디에틸아미노)에톡시]페닐]아미노]-8-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 디하이드로클로라이드 수화물(PD166285), N-[2-아미노-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)-우레아(PD166866), 및 MK-2206을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
IV. 망막 색소 상피 세포의 사용
특정 측면은 다수의 중요한 연구, 개발, 및 상업적 목적용으로 사용할 수 있는 RPE 또는 RPE-풍부 세포 개체군을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 또는 약 90%(예를 들어, 적어도 또는 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 이들 내에서 유도가능한 임의의 범위)의 RPE 세포를 포함하는 적어도 또는 약 106, 107, 108, 5xl08, 109, 1010 (또는 이들 내에서 유도가능한 임의의 범위)cells의 세포 개체군을 생성한다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법을 위한 출발 세포는 적어도 또는 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013cells 또는 이들 내에서 유도가능한 임의의 범위의 용도를 포함할 수 있다. 출발 세포 개체군은 적어도 또는 약 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108cells/ml, 또는 이들 내에서 유도가능한 임의의 범위의 씨딩 밀도를 가질 수 있다.
본원에 개시된 방법으로 제조된 RPE 세포는, RPE 세포에 대해 당해 기술 분야에 현재 알려진 임의의 방법 또는 적용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포 상에서의 화합물의 약제학적 성질 또는 독성학적 성질을 평가하는 단계를 포함하는 화합물을 평가하는 방법이 제공될 수 있다. a) 본원에 제공된 RPE 세포를 화합물과 접촉시키는 단계, 및 b) RPE 세포에 대한 상기 화합물의 영향을 검정하는 단계를 포함하는, RPE 세포에 대한 효과에 대해 화합물을 평가하는 방법이 제공될 수도 있다.
A. 시험 화합물 선별
RPE 세포는, 이러한 세포 또는 이의 다양한 자손의 특성에 영향을 미치는 인자들(예를 들어 용매, 소형 분자 약물, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경적 조건(예를 들어 배양 조건 또는 조작)에 대해 선별하기 위해 상업적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 화학적 화합물, 소형 분자, 폴리펩티드, 성장 인자, 시토카인, 또는 기타 생물학적 제제일 수 있다.
일양태에서, 방법은 RPE 세포를 시험 제제와 접촉시키는 단계 및 상기 시험 제제가 개체군 내의 RPE 세포의 활성 또는 기능을 조정하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 적용에서, 선별 검정은 RPE 세포 증식을 조정하거나 RPE 세포 분화를 변화시키는 제제를 확인하기 위해 사용된다. 선별 검정은 시험관내 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 안구 제제 또는 RPE 제제를 선별하고 확인하는 방법은 고-처리 선별에 적합한 방법을 포함한다. 예를 들어, RPE 세포는 잠재적으로 치료학적인 분자를 확인하기 위한 배양 접시, 플라스크, 회전병, 또는 플레이트(예를 들어, 단일 다중웰 접시 또는 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536 다중웰 플레이트 또는 접시와 같은 접시) 상에, 임의로 한정된 장소에 위치되거나 배치될 수 있다. 선별될 수 있는 라이브러리는 예를 들어 소형 분자 라이브러리, siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터 라이브러리를 포함한다.
기타 선별 적용들은 망막 조직 유지 또는 복원에 대한 이들의 효과를 위한 약제학적 화합물의 시험과 관련된다. 화합물이 세포에 대한 약리학적 효과를 갖도록 설계되었거나, 또는 다르게 효과를 갖도록 설계된 화합물이 이러한 조직 유형의 세포 상에 의도하지 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에, 선별이 완료될 수 있다.
B. 치료법 및 이식
다른 양태는, 망막 변성 또는 상당한 손상을 포함하여 안구 조직 유지 및 복원을 필요로 하는 대상의 임의의 병태에 대해 안구 조직 유지 및 복원을 촉진하기 위한 RPE 세포의 용도도 제공할 수 있다.
치료학적 투여를 위한 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위해, 세포는 우선 적합한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 일 측면에서, RPE 세포는 이들의 생체내 표현형을 생존시키고 유지할 수 있는 능력에 대해 평가된다. 세포 조성물은 면역결핍 동물(예를 들어 누드 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선조사에 의해 면역결핍된 동물)에 투여된다. 성장 기간 후 조직이 수거되고, 만능 줄기 세포 유도 세포가 여전히 존재하는지에 대해 평가된다.
다수의 동물은 RPE 세포 조성물의 적합성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, Royal College of Surgeon's(RCS) 래트는 망막 이영양증의 널리 공지된 모델이다(Lund 등, 2006). 또한, RPE 세포 적합성 및 생존율은, NOG 마우스와 같은 면역결핍 동물의 매트리겔에 (예를 들어, 피하 또는 망막하) 이식함으로써 측정할 수 있다(Kanemura 등, 2014).
본원에 개시된 인간 RPE 세포는, 또는 이러한 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 병태의 치료를 필요로 하는 환자의 병태를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위해 사용할 수 있다. RPE 세포는 미리 냉동보존될 수 있다. 특정 측면에서, 개시된 RPE 세포는 iPSC로부터 유도되며, 따라서 안 질환을 가진 환자를 위한 "개인 맞춤 의학"을 제공하기 위해 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 환자로부터 얻은 체세포는 유전적으로 조작되어 돌연변이를 유발하는 질환을 교정할 수 있고, RPE로 분화될 수 있고, 조작되어 RPE 조직을 형성할 수 있다. 이러한 RPE 조직은 동일한 환자의 내부 변성된 RPE를 대체하기 위해 사용할 수 있다. 다르게는, 건강한 공여자 또는 HLA 동형접합 "초공여자"로부터 생성된 iPSC를 사용할 수 있다. RPE 세포는 특정 인자, 예를 들어 색소 상피 유도 인자(PEDF), 전환 성장 인자(TGF)-베타, 및/또는 레티노산으로 시험관내 처리되어 시험관내 항염증성 및 면역억제성 환경을 생성할 수 있다.
다양한 안 병태는 본원에 개시된 방법을 사용하여 얻어진 RPE 세포의 도입에 의해 치료되거나 방지될 수 있다. 상기 병태는 일반적으로 망막 기능이상 또는 변성, 망막 손상, 및/또는 망막 색소 상피 손실과 관련된 망막 질환 또는 장애를 포함한다. 치료될 수 있는 병태는 망막의 변성 질환, 예를 들어 스타가르트 황반 이양증, 망막 색소변성, 황반 변성(예를 들어, 노화 관련 황반 변성), 녹내장, 및 당뇨 망막병을 비제한적으로 포함한다. 추가적인 병태는 레베르 선천 흑암시, 유전 또는 후천성 황반 변성, 베스트 질환, 망막박리, 홍반 위축, 범맥락막위축, 무늬 이영양, RPE의 기타 이상증, 및 광 손상, 레이저 손상, 염증 손상, 감염 손상, 방사선 손상, 신생혈관 손상 또는 외상 손상 중 임의의 하나에 의해 유발된 RPE 및 망막 손상을 포함한다. 특정 양태에서, 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 RPE 세포를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 방지하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 하나 이상의 이러한 질병을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 병태를 치료하고/치료하거나 병태의 증상을 개선하기에 충분한 약제학적 유효량의 RPE 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. RPE 세포는 다양한 형식으로 이식될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 세포 현탁액 형태로 표적 부위로 도입될 수 있거나, 매트릭스, 세포외 기질, 또는 생물분해성 중합체와 같은 기질 상에 단층 또는 조합되어 부착될 수 있다. RPE 세포는 다른 망막 세포와 함께, 예를 들어 광수용체와 함께 이식될 수도 있다(공-이식). 일부 양태에서, RPE 세포는 치료될 환자로부터의 iPSC로부터 제조되며, 따라서 이들은 자기유래이다. 다른 양태에서, RPE 세포는 MHC 일치된 공여자로부터 제조된다.
일부 양태에서, RPE 세포는 재생성 의학을 수용하기에 적합한 대상체에 대해 자가 RPE 이식편으로 사용할 수 있다. RPE 세포는 다른 망막 세포와 함께, 예를 들어 광수용체와 함께 이식될 수 있다. 상기 개시된 방법에 의해 생성된 RPE 세포의 이식은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기술로 실시할 수 있다. 예를 들어, RPE 이식을 실시하기 위한 방법은 미국 특허 제5,962,027호 및 미국 특허 제6,045,791호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다. 일양태와 관련하여, 이식은 평면부 유리체 절제수술에 이어, 망막하 공간 내로의 소형 망막 개구를 통한 세포의 전달 또는 직접 주입을 통해 실시된다. RPE 세포는 세포 현탁액 형태로 표적 자리에 도입될 수 있거나, 세포외 기질과 같은 매트릭스 상에 부착될 수 있거나, 또는 생물분해성 중합체와 같은 기질 상에 제공될 수 있다. RPE 세포는 다른 세포와 함께, 예를 들어 광수용체를 포함하는 망막 세포와 함께 이식(공-이식)될 수도 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 얻어진 RPE 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 이러한 RPE 세포는 촉진자 및 마커를 암호화하는 핵산에 사용가능하게 연결된 티로시나제 증진인자를 포함한다. 다른 양태에서, RPE 세포는 제2 마커를 암호화하는 핵산에 사용가능하게 연결된 제2 기본구성 촉진자를 포함할 수도 있다.
RPE 세포의 약제학적 조성물이 본원에 개시된 방법에 의해 생성된다. 이러한 조성물은 적어도 약 1x103개의 RPE 세포, 약 1x104개의 RPE 세포, 약 1x105개의 RPE 세포, 약 1x106개의 RPE 세포, 약 1x107개의 RPE 세포, 약 1x108개의 RPE 세포, 또는 약 1x109개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 분화된 RPE 세포를 포함하는 (비-RPE 세포에 대해) 실질적으로 정제된 제제이다. 지지체, 예를 들어 중합체성 담체 및/또는 세포외 기질, 및 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 RPE 세포의 유효량을 포함하는 조성물도 제공된다. 예를 들어, 세포는 세포 단층으로 제공된다. 일반적으로 생리학적으로 허용되고 생체내 적용에 사용하기에 적합한 경우에는 매트릭스 물질이다. 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 물질은 흡수성 및/또는 비흡수성인 고형 매트릭스 물질, 예를 들어 소장 점막하층(SIS), 가교결합되거나 비가교결합된 알기네이트, 수성콜로이드, 포움, 콜라겐 겔, 콜라겐 스폰지, 폴리글리콜산(PGA) 메쉬, 플리스(fleece), 및 바이오 접착제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
적합한 중합체성 담체는 합성 또는 천연 중합체로 형성된 다공성 메쉬 또는 스폰지, 및 중합체 용액도 포함한다. 예를 들어, 매트릭스는 중합체성 메쉬 또는 스폰지, 또는 중합체성 하이드로겔이다. 사용할 수 있는 천연 중합체는 콜라겐, 알부민, 및 피브린과 같은 단백질, 알기네이트와 같은 다당류, 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체는 생물분해성 및 비생물분해성 중합체 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 생물분해성 중합체는 하이드록시 산, 예를 들어 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리락트산-글리콜산(PGLA), 폴리오르토에스테르, 폴리 무수물, 폴리포스파젠, 및 이들의 조합을 포함한다. 비생물분해성 중합체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트, 및 폴리비닐 알콜을 포함한다.
순응가능한(malleable) 이온 가교결합 또는 공유 가교결합된 하이드로겔을 형성할 수 있는 중합체를 사용할 수 있다. 하이드로겔은 (천연 또는 합성) 유기 중합체가 공유결합, 이온결합, 또는 수소결합을 통해 가교결합되어 3차원 개방 격자 구조를 생성하는 경우 형성되는 물질로서, 물 분자를 포획하여 겔을 형성한다. 하이드로겔을 형성하기 위해 사용할 수 있는 물질의 예는, 알기네이트와 같은 다당류, 포르포파진, 및 폴리아크릴레이트를 포함하며, 이들은 이온 가교결합되었거나 각각 온도 또는 H에 의해 가교결합된 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체인 PLURON1CS™ 또는 TETRON1CS™와 같은 블록 공중합체이다. 다른 물질은 피브린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐과 같은 중합체를 포함한다.
약제학적 조성물은, 예를 들어 망막 조직의 질환 또는 이상을 개선하기 위한 RPE 세포 기능의 재구성과 같은 원하는 목적을 위해 작성된 설명서와 함께 적합한 컨테이너에 임의로 패키징될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개시된 방법에 의해 제조된 RPE 세포는 조작되어 RPE를 형성할 수 있으며, 상기 RPE는 변성된 RPE의 대체를 필요로 하는 대상체의 변성된 RPE를 대체하기 위해 사용될 수 있다.
C. 상업적, 치료적, 및 연구 목적을 위한 분배
일부 양태에서, 제조, 분배, 또는 사용 동안의 임의의 때에 존재하는 RPE-풍부 세포 개체군을 포함하는 세포들의 세트 또는 조합을 포함하는 시약 시스템(reagent system)이 제공된다. 세포 세트는, 미분화된 만능 줄기 세포 또는 동일한 게놈을 공유하는 다른 미분화된 세포 유형과 조합된 본원에 개시된 세포 개체군의 임의의 조합을 포함한다. 각각의 세포 유형은, 동일한 시설에서 또는 상이한 장소에서, 동일하거나 상이한 시간에, 사업 관계를 공유하는 동일한 개체 또는 상이한 개체의 제어하에, 함께 패키징될 수 있거나 또는 개별 컨테이너에 패키징될 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들어 안구 조직의 질환 또는 이상을 개선하기 위한 RPE 세포 기능의 재구성과 같은 원하는 목적을 위해 작성된 설명서와 함께 적합한 컨테이너에 임의로 패키징될 수 있다.
V. 키트
일부 양태에서, 키트는 예를 들어, 제공되는 RPE 세포를 제조하기 위한 하나 이상의 배지 및 성분을 포함할 수 있다. 시약 시스템은 수성 매질에 또는 친액화 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 컨테이너 수단은 일반적으로, 성분이 배치될 수 있으며 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 하나 이상의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지, 또는 다른 컨테이너 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3, 또는 다른 추가적인 컨테이너를 함유할 수 있다. 하지만, 성분들의 다양한 조합은 바이알에 포함될 수 있다. 키트의 성분들은 건조 분말(들)로 제공될 수 있다. 제제들 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 상기 분말은 적합한 용매를 첨가함으로써 재구성될 수 있다. 용매가 또 다른 컨테이너 수단으로 제공될 수 있는 것으로 상정한다. 키트는 일반적으로 상업적 판매용으로 밀폐 구조물(confinement)에 키트 성분(들)을 함유하기 위한 수단도 포함할 것이다. 이러한 컨테이너는 그 안에 원하는 바이알을 보유하는 사출 성형 또는 취입 성형된 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다. 키트는 인쇄되거나 전자 형태로, 예를 들어 디지털 형태로 사용하기 위한 설명서도 포함할 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 양태들를 입증하기 위해 포함된다. 실시예에 개시된 기술들은, 본 발명의 실시에서의 양호한 기능을 위해 본 발명의 발명자들에 의해 발견된 하기 기술들을 소개하며, 따라서, 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당해 기술 분야의 숙련가들은 이해한다. 하지만, 본원 명세서를 고려하여, 개시되는 특정 양태들에서 다수의 변화가 이루어질 수 있으며, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 당해 기술 분야의 숙련가들은 이해한다.
실시예 1 - 출발 만능 줄기 세포 개체군의 제조
RPE 세포의 출발 개체군은 ES 세포 및 iPSC와 같은 만능 줄기 세포로부터 유도될 수 있다. 예시적인 방법에서, RPE 세포는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제8,546,140호, 미국 특허 제8,741,648호, 미국 특허 제 8,691,574호, 공개된 미국 특허 출원 제20090246875호, 공개된 미국 특허 제8,278,104호, 공개된 미국 특허 제9,005,967호, 미국 특허 제8,058,065호, 미국 특허 제8,129,187호, PCT 공개 제WO 2007/069666 Al호, 미국 특허 제8,183,038호, 및 미국 특허 제8,268,620호에 의해, 체세포로부터 재프로그래밍된 인간 iPSC 세포로부터 유도되었으며, 상기 문헌들은 인용에 의해 본원에 포함된다. 하나의 예시적인 방법에서, 체세포로부터 만능 줄기 세포를 제조하기 위해 핵 프로그래밍 인자인 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 사용되었다. 또 다른 예시적인 방법에서, 체세포로부터 만능 줄기 세포를 제조하기 위해 핵 프로그래밍 인자인 Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, L-Myc, 및 SV40 대형 T-항원이 사용되었다.
iPSC는 마우스 또는 인간 영양세포층 없이, 비트로넥틴 코팅된 플레이트 상의 완전 한정 배양 배지, 예를 들어 ESSENTIAL 8™(E8™) 배지에서 성장되었다. 비트로넥틴은 칼슘 또는 마그네슘을 불포함하는 DPBS에 1:200 희석되었으며, 배양 플레이트는 비트로넥틴으로 코팅되었으며, 실온에서 약 1시간 동안 항온배양됐다. iPSC는 이들이 융합전되는 경우 분할됐으며, 건강하지 않고/건강하지 않거나 미분화된 세포를 방지하기 위해 과성장되지 않게 하였다(도 1a).
RPE 세포를 유도하기 위해, iPSC를 단일 세포 현탁액에 해리하여 모든 응집 또는 배아체를 제거하였다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 세포들을 DPBS로 세척하고 TRYPLE™과 같은 세포 해리 효소에서 약 10분간 37℃로 항온배양했다. 이후, 상기 세포들은 혈청진단 피펫으로 피펫팅하여 박리되었으며, 세포 현탁액을 원추형 튜브에 수집했다. 세포가 부드러운 피펫팅으로 박리되지 않는 경우, 배양물을 보다 길게, 예를 들어 2 내지 3분의 추가 시간 동안 항온배양했다. 모든 세포를 수집하기 위해, 배양 용기를 실온 E8™ 배지로 세척한 뒤, 상기 배지를 세포 현탁액을 함유하는 튜브에 추가했다. 또한, 블레비스타틴(예를 들어, 2.5μM)을 E8™ 배지에 첨가하여 단일 세포로의 해리 후의 PSC 생존율을 증가시키는 동시에 세포들이 배양 용기에 부착되지 않게 했다. 세포들을 수집하기 위해, 이들은 약 5분간 400xg로 원심분리했으며, 상청액을 흡인하고, 세포를 적합한 용적의 E8™ 배지에 재현탁시켰다.
단일 세포 iPSC로부터 RPE 세포를 효율적으로 분화하기 위해, 단일 세포 iPSC의 유입 밀도를 VICELL™와 같은 자동화 세포 계수기로 정확하게 계수했으며, 실온 E8™ 배지에서 약 1x1O5cells/mL의 세포 현탁액에 희석했다. iPSC의 단일 세포 현탁액이 알려진 세포 밀도로 얻어지면, 비트로넥틴으로 코팅된 6웰 플레이트와 같은 적합한 배양 용기에 배치했다. 세포를 웰당 약 200,000cells의 세포 밀도로 씨딩하고, 약 37℃의 가습 항온배양기에 배치했다. 약 18 내지 24시간 후, 배지를 흡인하고 새로운 E8™ 배지를 상기 배양물에 추가했다. 플레이트에 적절하게 부착하기 위한 씨딩 후, 세포를 약 2일간 E8™ 배지에서 배양했다.
실시예 2 - iPSC 의 RPE 세포로의 분화
적당한 세포 밀도로 씨딩된 단일 세포 iPSC가 실시예 1에서와 같이 약 2일간 배양되면, 이들을 RPE 세포를 유도하기 위해 다양한 분화 배지에서 배양했다. 3일째에, E8™ 배지를 흡인하고, 실온의 망막 유도 배지(RIM)(예를 들어, 표 3)를 추가했다. 간단하게는, 상기 RIM은 DMEM과 F12를 약 1:1 비율로, 그리고 녹아웃 혈청 대체물, MEM 비필수 아미노산 (NEAA), 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 및 아스코르브산을 포함했다. 또한, 상기 RIM은 WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, 및 인슐린 성장 인자 1(IGF1)을 포함했다. 매일 배지를 흡인하고 상기 세포에 새로운 RIM을 추가했다. 세포들을 약 2 내지 4일간 RIM에서 배양했다.
다음으로 세포들을 약 7 내지 14일간 망막 분화 배지(RDM)에서 배양했다. 간단하게는, 상기 RDM(표 2)는 DMEM과 F12를 약 1:1 비율로, 그리고 녹아웃 혈청 대체물, MEM NEAA, 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 및 아스코르브산을 포함했다. 또한, 상기 RDM은 WNT 경로 억제제(예를 들어, CKI-7), BMP 경로 억제제(예를 들어, LDN193189), TGFβ 경로 억제제(예를 들어, SB431542), 및 MEK 억제제(예를 들어, PD325901)를 포함했다. WNT 경로 억제제, BMP 경로 억제제, 및 TGFβ 경로 억제제의 농도는 RIM에 비해 RDM에서 10배 높았다. 매일 배지를 흡인하고 실온의 RDM을 상기 세포에 추가하여 분화된 망막 세포를 제조했다.
RPE 세포를 유도하기 위해, 이후, 세포들을 망막 배지(RM)에서 7 내지 10일간 배양했다. 상기 RM은 DMEM과 F12를 약 1:1 비율로, 그리고 녹아웃 혈청 대체물, MEM NEAA, 나트륨 피루베이트, N-2 보충, B-27 보충, 및 아스코르브산을 포함했다. 또한, 상기 RM은 니코틴아미드 및 액티빈 A를 포함했다. 배지는 실온의 RM으로 매일 교체되어 RPE 세포를 생성했다.
RPE 세포의 성숙을 위해, 세포들을 RPE 성숙 배지(RPE-MM)에서 5 내지 10일간 배양했다. 상기 RPE-MM(표 2)은 MEM Alpha, 소 태아 혈청, N-2 보충, MEM NEAA, 및 나트륨 피루베이트를 포함했다. 또한, 상기 RPE-MM은 타우린, 하이드로코르티손, 및 3,3',5-트리요오도-1-티로닌을 함유했다(도 1c). 배지를 실온의 RPE-MM으로 격일로 교체했다. 이후, 세포를 세포 해리 효소에 해리시키고, 비트로넥틴 코팅된 플레이트에 재씨딩했다. 이 스테이지에서, 계속하여 RPE 성숙시키기 위해, 플레이팅된 세포를 또 다른 대략 15일간 배양했다.
실시예 3 - RPE 세포의 성숙
실시예 2에서 제조된 RPE 세포의 연속된 성숙을 위해, 세포를 TRYPLE™와 같은 세포 해리 효소에 해리시키고, PD325901과 같은 MEK 억제제를 포함하는 RPE-MM의 특화된 SNAPWELL™ 디자인의 분해성 스캐폴드 어셈블리 상에서 1 내지 2주간 재씨딩했다. 이는 분화되고 분극된 기능성 RPE 세포의 융합 단층을 생성했으며(도 1d), 이는 본 스테이지에서 제노프리 CS10 배지에 냉동보존될 수 있다.
성숙 RPE 세포를, PGE2 또는 아피디콜린과 같은 1차 섬모 유도인자와 같은 추가의 소형 분자를 포함하는 RPE-MM에서 계속 배양하여, 온전한 RPE 조직으로서 기능하는 기능성 RPE 세포 단층으로 추가로 발현시켰다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 1차 섬모 유도인자는 정상 WNT 경로를 억제하며, 세포상에 세포 주기 출구를 유도하며, RPE 단층의 첨단-기저 분극을 유도한다. RPE 성숙도는 다르게는, RPE 세포에 세포 주기 출구도 유도하여 RPE 성숙을 촉진하는 IWP2 및 endo-IWR1과 같은 정상 WNT 경로 억제제에 의해 유도될 수 있다. 세포를 이러한 배지에서 또 다른 2 내지 3주간 배양하여 성숙되고 기능성인 RPE 세포 단층을 얻었다. 따라서, 본원에 개시된 임상 적용을 위해 대규모로 일관성 있게 재현할 수 있는 방법은 만능 세포로부터 성숙 RPE 세포를 제공한다.
실시예 4 - RPE 세포의 냉동보존
실시예 2의 분화된 RPE 세포의 냉동보존을 위해, 배지를 흡인하고 세포를 Dulbecco 's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)으로 2회 세척했다. 이후, 세포를 세포 해리 효소와 함께 항온배양하고, 세포 현탁액을 원추형 튜브에 피펫팅했다. 세포를 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 실온의 RPE-MM에 재현탁했다. 이후, 세포 현탁액을 STERIFLIP® 세포 여과기를 통해 여과하고, 세포를 계수했다. 다음으로, 세포를 원심분리하고, 적당한 농도(예를 들어, 1x1O7cells/mL)로 차가운 CryoStor® CS10에 재현탁했다. 세포 현탁액을 사전 표지된 냉동바이알에 분취했으며, 이들을 냉동 컨테이너에 배치하고, 12 내지 24시간 동안 -80℃의 냉동기에 전달했다. 이후, 상기 바이알을 저장을 위해 액체 질소로 전달했다.
실시예 5 - CD24 , CD56 , 및/또는 CD90 고갈에 의한 오염 비 - RPE 세포의 MACS 고갈 및 RPE 세포의 출발 개체군의 풍부함
실시예 2 또는 실시예 3에서 얻어진 RPE 세포의 개체군은 잔류 오염 비-RPE 세포 및 미성숙 RPE 세포(포괄하여 "오염 세포"로 나타냄)를 가질 수 있으며, 이들 둘 다는 분리되고 제거되어 성숙 RPE-풍부 세포 개체군을 수득할 수 있다. 오염 세포는 다양한 방법론, 예를 들어 자기 활성 세포 분리(MACS®), 형광 활성 세포 분리(FACS), 또는 단일 세포 분리에 의해 배양물로부터 제거할 수 있다. 세포의 표면 항원에 따라 다양한 개체군을 분리할 수 있는 것으로 세포 당해 기술 분야에 공지된 MACS® 방법론을 사용하여 원하는 보다 성숙 RPE 세포로부터 오염 세포를 분리했다.
RPE 세포의 출발 개체군의 오염 세포는, 원하는 성숙 RPE 세포로부터 오염 세포를 분리하기 위해 사용할 수 있는 특이 세포 표면 마커를 가진다. 예를 들어, CD24, CD56, 및/또는 CD90은 만능 줄기 세포 및 기타 신경 세포 유형 상에 (비제한적으로) 발현되는 세포 표면 항원이다. CD24는 만능 줄기 세포, 일부 B 림프구, 및 분화 신경모세포의 표면에 발현되는 당단백질이다. CD56 또는 신경 세포 부탁 분자(NCAM)는 뉴런 및 천연 살해 세포의 표면에 발현되는 당단백질이다. CD90 또는 Thy-1은 다양한 줄기 세포 및 뉴런의 표면에 발현되는 마커이다. CD24, CD56 및/또는 CD90의 발현은, 줄기 세포의 분화 동안 RPE 세포를 포함하는 다수의 성숙 세포 유형에 대해 손실된다. 따라서, CD24, CD56, 및/또는 CD90에 대해 양성인 세포의 제거는 잔류 오염 세포의 고갈을 야기한다.
분리 기술을 실시하기 위해, RPE 세포의 출발 개체군의 분리(예를 들어, MACS)를 실시하기 위해 단일 세포 현탁액으로 해리하는 것이 바람직하다. 이전에 냉동보존된 세포에 대해, 세포를 해동하고 재플레이팅한다. 접착 배양에서 세포들로부터 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 세포들을 세척하고(예를 들어, DPBS), 세포 해리 효소(예를 들어, TRYPLE™)를 추가했다. 세포를 약 5분간 37℃에서 항온배양한 후, 용기를 부드럽게 두드려 뉴런 클러스터를 박리했다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 세포 해리 효소(예를 들어, TRYPLE™)를 추가했다. 세포를 약 30분간 37℃에서 항온배양한 후, 세포 현탁액을 RPE-MM 플레이팅 배지에 수집하고, 5분간 400xg로 원심분리했다. 세포 펠릿을 RPE-MM 플레이팅 배지에 재현탁하고, 상기 세포 현탁액을 세포 여과기(예를 들어, 20μM Steriflip 세포 여과기)를 통해 여과하여 모든 잔류 세포 클러스트를 해리했다. 세포 현탁액을 (예를 들어, ViCell 계수기를 사용하여) 생존가능한 세포를 계수하여 세포 농도를 얻었다. 계수된 세포 현탁액이 분리 또는 유동 세포측정 순도 검정을 위해 사용할 수 있는 단일 세포 현탁액을 제공했다.
RPE 세포의 출발 개체군으로부터 오염 세포를 제거하기 위해, MACS를 사용하여 CD24 양성 세포, CD56 양성 세포, 및/또는 CD90 양성 세포를 소모했다. RPE 세포의 출발 개체군으로부터의 세포들을 단일 세포 현탁액으로 해리한 후, 세포를 예를 들어 1x1O7cells/mL로 MACS 완충제에 재현탁했다. 예시적인 MACS 완충제는 표 3에 포함된다. 다음으로, 세포들을 항-CD24 항체, 항-CD56 항체, 및/또는 항-CD90 항체(각각 1:500으로 희석됨)로 염색하고, 20분 동안 4℃에서 항온배양하여 상기 항체를 세포의 항원에 결합되게 했다. 사용한 항체들은 2차 항체에 결합될 표지(예를 들어, FITC)로 태그했다. 항온배양 후, 20mLd의 MACS 완충제를 추가하고, 세포를 5분간 400xg로 원심분리했다. 세포 펠릿을 20mL MACS 완충제에 재현탁하고, 격렬하게 혼합하고, 5분간 400xg로 원심분리하여 모든 미부착된 항체를 제거했다. 세포 펠릿을 MACS 완충제(예를 들어, 1.11x108cells/mL로)에 재현탁하고, 희석된(1:10) 2차 항체(예를 들어, FITC)로 코팅된 마이크로비드를 추가하고, 세포를 20분간 4℃로 항온배양했다. 항온배양 후, 세포를 MACS 완충제로 세척하여 미부착된 마이크로비드를 제거하고, 최대 1.25x108개의 세포를 500μL의 MACS 완충제에 재현탁했다. 상기 세포 현탁액을 강한 자기장에 배치된 LD 컬럼으로 전달하고, 마이크로비드에 부착된 항원 CD24, CD56, 및/또는 CD90를 발현하는 세포는 컬럼에 유지됐다. LD 컬럼을 MACS 완충제로 2회 세척했다. 항원 CD24, CD56, 및/또는 CD90를 발현하지 않는 미표지된 세포를 유동되게 하고 수집했다. 추가의 특성확인 및 배양을 위해, 수집된 미표지된 세포 현탁액을 원심분리하고(5분간 400xg), RPE-MM 플레이팅 배지에 재플레이팅하고, 세포 현탁액의 분취량을 세포 유동측정 순도 검정에 사용했다. 따라서, MACS 세포 분리는 CD24, CD56, 및/또는 CD90에 대해 양성인 세포가 고갈된 RPE-풍부 세포 개체군을 생성했다. 이러한 방법의 사용은 실시예 2의 상세한 방법으로부터 생성된 출발 개체군에 대해서만 한정되지 않으며, 미국 출원 제12/523,444호 및 제14/405,730호에 개시된 방법과 같지만, 이로 제한되지 않는 다른 방법에 의해 생성되는 RPE 개체군으로부터 오염 세포를 제거하기 위해 사용할 수 있음을 주목한다.
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실시예 6 - RPE -풍부 세포 개체군을 확인하기 위한 유동 세포측정 순도 검정
MACS 분리를 실시하기 전 그리고 후에, BEST1, CRALBP, TYRP1, PMEL17, MAP2, NES, 및 MITF를 포함하는 관련 마커의 패널에 의해 RPE 세포의 확인을 실시했다(예를 들어, 분리전 및 분리후). 유동 세포측정 순도 검정을 실시하여, MACS에 의해 CD24 양성 세포, CD56 양성 세포, 및/또는 CD90 양성 세포의 제거 전 및 후, 각각의 마커에 대해 양성인 세포의 퍼센티지(표 1)의 측정을 얻었다(도 2 및 도 3).
유동 세포측정 순도 검정을 실시하여 본원 명세서의 분리 방법에 의해 얻어지는 RPE 세포의 퍼센티지를 측정했다. MACS 검정으로부터 수집된 세포 현탁액의 분취량(샘플당 5mL FACS 튜브 중 2xl06개의 세포)을 3분간 400xg로 원심분리했다. 세포 펠릿을 1mL의 염색제(예를 들어, Live-Dead 적색 염색제)에 재현탁하고, 15분간 실온에서 어둡게하여 항온배양했다. 항온배양 후, 2mL의 세척 완충제를 추가하고, 세포를 3분간 400xg로 원심분리하여 모든 미결합된 염색제를 제거했다. 세포 펠릿을 고정 완충제에 재현탁시키고, 15분간 실온에서 어둡게 하여 항온배양했다. 항온배양 후, 2mL의 세척 완충제를 추가하고, 세포를 3분간 400xg에서 완심분리하고, 상청액을 따라냈다. 세포 펠릿을 2mL의 세척 완충제에 재현탁하여 1x1O6cells/mL 현탁액이 되게 하고, 200μL의 세포 현탁액을 FACS 튜브로 전달했다. 각각의 튜브에, 2mL의 Perm 완충제를 추가하고, 세포를 3분간 400xg로 원심분리했다. RPE-특이 마커에 대한 1차 항체를 Perm 완충제에 희석시키고, 100μL의 희석된 항체 용액을 각각의 튜브에 추가했다. 4℃에서 어둡게 하여 밤새 항온배양한 후, 세포를 2mL Perm 완충제로 2회 세척했다. 2차 항체 용액을 각각의 튜브에 추가하고, 1 내지 2시간 동안 어둡게 하여 실온에서 항온배양했다. 항온배양 후, 세포를 Perm 완충제로 2회 세척하고, 원심분리하고(3분간 400xg), 유동 세포측정을 위하여 100μL의 세척 완충제에 재현탁했다. 당해 기술 분야, 예를 들어 미국 특허 제8,682,810호 및 문헌[Herzenberg 등, 2006] 에 공지된 방법에 의해 유동 세포측정을 실시하여 시험된 마커 각각에 대해 양성인 세포의 퍼센티지를 얻었으며(표 1), 상기 문헌들을 인용에 의해 본원에 포함된다. 유동 세포측정 순도 검정은 CD24, CD56, 및/또는 CD90에 대해 양성인 오염 세포를 소모시키기 위한 MACS 분리가, BEST1 마커에 의해 측정되는 바와 같이, 출발 세포 개체군(78.6%)에 비해 RPE 세포-풍부 개체군(95 내지 99%)을 생성했음을 보인다.
실시예 7 - RPE 세포를 분화시키기 위한 다른 방법
실시예 2 및 실시예 3에 개시된 방법에 관하여, MACS 배양 후를 포함하는 분화 과정의 종료 동안 iPSC 플레이팅후 2일째의 시작의 특정 윈도우에 대해, 배지로의 1μM 농도로의 PD0325901의 포함은, RPE 개체군의 순도(오염 세포의 감소를 의미함) 및 생성된 RPE 개체군의 성숙도 둘 다를 개선할 수 있다. 1μM 농도로의 PD0325901의 포함은, 본원에 개시된 RPE 방법의 RDM 및 RPE-MM에 포함되는 경우(대략 42 내지 50일), RPE 개체군의 순도 및 성숙도 둘 다를 개선하는 것으로 나타났다.
실시예 8 - RPE 세포를 분화시키기 위한 다른 방법
실시예 2 및 실시예 3에 개시된 방법에 관하여, RPE-MM 및 RPE-MM 플레이팅 배지에서의 5%에서 0.5 내지 1%로의 소 태아 혈청 퍼센티지의 감소는, RPE 개체군의 순도 및 생성되는 RPE 개체군의 성숟고 둘 다를 개선할 수 있다.
실시예 9 - 성숙 RPE 세포의 기능성
PGE2로의 처리로부터 생성된 성숙 RPE 세포를 분석하기 위해, ZO1 염색 및 iPSC-RPE 세포의 투과 전자 현미경 사진(도 4d)에 의해, RPE 단층의 면역염색을 실시하여, 밀착 연접의 육각형 구조를 확인했다(도 4a 내지 도 4c). 상기 염색은 PGE2 처리된 RPE 세포가 감소된 베타 카테닌 및 증가된 RPE5를 갖는 것을 보였다. 또한, IWP2+endo-IWR1 또는 IWP2로의 처리 결과는 감소된 베타 카테닌(도 5a) 및 증가된 RPE65(도 5c)를 생성했다. IWP2+endo-IWR1 조합은 IWP2 단독 또는 endo-IWR1 단독에 비해 보다 효과적인 것으로 확인했다. 따라서, PGE2, IWP2, 또는 IWP2+endo-IWR1로의 처리는 성숙 RPE 세포를 생성한다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 RPE 세포의 장벽 기능을 측정하기 위해, 상피 통과 전위(TEP)는 세포를 가로지르는 통로를 조절하는 에너지-유도된 이온 펌프에 의해, 생성된 단층을 가로지르는 이온 구배를 측정했으며, 상피 통과 저항(TER)은 밀착 연접 구조의 미세 구조를 주로 통과하는 세포주위 공간을 통과하는 물질의 저항을 측정한다(도 7a).
IWP2 또는 endo-IWR1로 처리된 성숙 RPE 세포의 기능성도 확인했다. 비처리된 RPE 세포 대 PGE2 또는 IWP2+endo-IWR1로 처리된 RPE 세포의 TEP 및 TER 측정은, 처리된 성숙 RPE 세포의 기능성이 증가되었음을 보인다(도 7c 내지 7e).
다음으로, RPE-MM+PGE2 매질의 PGE2의 50μM로부터 100μM로의 농도 증가가, RPE 개체군의 순도(즉, 오염 세포의 감소) 및 생성되는 RPE 새체군의 성숙도 둘 다를 개선시키는지 여부를 시험했다. 50μM 대 100μM PGE2 처리된 배양물의 성숙도 및 기능성을 확인하기 위해, 상피 통과 저항(TER)에 관한 장벽 기능을 측정하여(도 7f), 실시예 9에 설명된 바와 같은 세포주의 공간을 통과하는 물질의 저항과 비요했다. RPE-MM+PGE2 배지에서 iPSC 유도 RPE 배양물의 50μM 또는 100μM 로의 처리 후 얻어지는 순수 RPE 세포의 퍼센티지를 측정하기 위해, 실시예 6에 개시된 바와 같은 RPE-특이 마커들에 대해 유동 세포측정 순도 검정을 실시했다(도 7g). 결과는, 보다 높은 농도의 1차 섬모 유도인자 PGE2가, iPSC 유도 RPE 분화 과정에서 RPE 개체군의 순도 및 성숙도 둘 다를 촉진함을 보였다.
실시예 10 - RPE 분화 방법의 재현성
RPE 분화 과정의 재현성을 시험하기 위해, 다중 작동유전자에 의해 3개의 iPSC주를 RPE 세포로 분화시켰다(도 6a). 생성된 RPE 세포의 평균 순도를, 유동 세포측정에 의해 RPE 마커 레틴알데하이드 결합 단백질 1(Craplbp)을 측정하여 확인했다(표 2). 상이한 출발 세포 개체군들 사이에서 그리고 상이한 작동유전자들 사이에서 RPE 분화 과정이 매우 재현성이 있음을 확인했다. 또한, 3D1, AMD1B, BEST1L, BEST3A, BEST8A, AMD Donor3D 및 HLA Line A를 포함하는 상이한 출발 세포주들로부터의 RPE 분화에 의해 재현성을 확인했다(도 6b). HLA Line A(21525.102)는 미국 인구의 11.38%와 유리한 일치를 제공할 수 있는 HLA-A*01 및 HLA-B*08에 대한 공여자 동형접합으로부터 생성된 iPSC주이다. 게다가, RPE는, 미국 인구의 7.63%와 유리한 일치를 잠재적으로 제공할 수 있는 일명 HLA Line C (21526.101)인 HLA-A*03 및 HLA-B*07에 대한 공여자 동형접합으로부터 생성된 iPSC주를 사용하는 이러한 과정을 사용하여 성공적으로 생성된다. 상기 개시된 바와 같이 HLA-A 및 HLA-B에서 동형접합인 HLA Line A (21525.102) 및 HLA Line C (21526.101)는 세포 Dynamics International, Inc.의 소유물이다. 또한, 정제 전 및 후의 Cralbp 양성 세포의 퍼센티지를 측정함으로써, 13개의 공여자로부터 유도된 28개의 iPSC주에서 실시된 109개의 RPE 분화에서 재현성을 추가로 확인했다(도 6c 내지 도 6d). RPE 분화 후의 Cralbp 양성 세포의 퍼센티지가 다양해지는 반면, MACS 정제는 일관성 있게 95% 이상의 순도 및 대부분의 경우 거의 100%의 순도를 야기했다. 따라서, 본 발명의 RPE 분화 방법은 배아체로부터 RPE 세포를 생성하는 모든 방법들에 대해 뚜렷한 이점을 가지며, 이는 상이한 작동유전자들에 의해 실시되는 경우 공여자 유전자형들에 걸쳐 보다 일관되고 재현성 있는 결과를 제공하기 때문이다.
Figure pct00002
실시예 11 - 물질 및 방법
실시예 1 내지 실시예 10에서 사용한 물질을 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
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Figure pct00007
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유동 세포측정 세척 완충제는 20mL의 FBS를 1000mL의 DPBS에 추가하여 제조했다(즉, 칼슘 및 마그네슘을 불포함함). 상기 완충제는 필터 멸균되었으며, 최대 4주간 4℃로 저장할 수 있다.
유동 세포측정 Perm 완충제는 20mL의 FBS를 1000mL의 DPBS에 추가하여 제조했다(즉, 칼슘 및 마그네슘을 불포함함). 사포닌 1g을 추가하고 잘 혼합했다. 상기 완충제는 필터 멸균되었으며, 최대 4주간 4℃로 저장할 수 있다.
유동 세포측정 Live-Dead 적색 염색제는 Live-Dead 염색제 1:1000을 에ㅠㄴ에 희석시켜 제조했다(즉, 칼슘 및 마그네슘을 불포함함). 검정하는 1x1O6개의 세포당 1mL의 염색제를 제조했다. 상기 완충제는 사용 전에 새롭게 제조했다.
유동 세포측정 고정 완충제는 1mL의 36.5% 포름알데하이드을 내지 8.1mL의 DPBS에 첨가하여 제조했다(즉, 칼슘 및 마그네슘을 불포함함). 검정하는 1x1O6개의 세포당 1mL의 염색제를 제조했다. 상기 완충제는 사용 전에 새롭게 제조했다.
본 발명에 개시되고 청구되는 모든 방법은, 본원 명세서에 비추어 과도한 실험없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태에 관해 설명되었지만, 당해 기술 분야의 숙련가는, 본 발명의 개념, 정신, 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 개시된 방법 및 본 발명에 개시된 방법의 순서 또는 일련의 순서에 변형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 제제가, 본 발명에 개시된 제제를 대체할 수 있는 동시에 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 것이 자명할 것이다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은, 첨부된 청구 범위에 의해 한정되는 본 발명의 정신, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기 참조문헌은, 본원에 기재된 예시적인 절차 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도로 인용에 의해 본원에 특히 포함된다.
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Claims (28)

  1. 인간 망막 색소 상피(RPE: retinal pigment epithelial) 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 필수적으로 단일 세포로 해리된 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)들을 포함하는 출발 개체군을 얻는 단계;
    b) 상기 iPSC를 망막 유도 배지에서 배양하여, 상기 세포의 망막계통 세포(retinal lineage cell)로의 분화를 개시하는 단계;
    c) 상기 망막계통 세포를 망막 분화 배지에서 추가로 배양하여, 상기 망막계통 세포를 추가로 분화시키는 단계;
    d) 상기 세포를 망막 배지에서 배양하여, 분화 RPE 세포를 형성하는 단계; 및
    e) 상기 RPE 세포를 RPE 성숙 배지에서 배양하여, 인간 RPE 세포를 제조하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 방법은 배아체(embryoid body)의 형성은 포함하지 않는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 iPSC가 매트릭스에서 배양되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 매트릭스가 하나 이상의 재조합 세포 부착 단백질을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 부착 단백질이 라미닌, 비트로넥틴, 또는 피브로넥틴인, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 부착 단백질이 인간 단백질인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 유도 배지가 WNT 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, BMP 경로 억제제, 및 인슐린 성장 인자 1(IGF1)을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 분화 배지가 WNT 경로 억제제, TGFβ 경로 억제제, BMP 경로 억제제, MEK 억제제, 및 IGF1을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 이후에, 상기 RPE 세포를 해리하고, 상기 RPE 세포를 재씨딩(reseeding)하고, MEK 억제제를 포함하는 상기 RPE 성숙 배지에서 상기 RPE 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RPE 세포를 해리하고, 상기 REP 세포를 상기 RPE 성숙 배지의 분해성 스캐폴드 상에 재씨딩하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 상기 RPE 성숙 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 RPE 성숙 배지가 하나 이상의 1차 섬모 유도인자를 포함하여 성숙 RPE 세포가 생성되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 1차 섬모 유도인자가 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 아피디콜린인, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 상기 RPE 성숙 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 RPE 성숙 배지는 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2) 및/또는 4-(1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일)-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드(endo-IWR1)를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RPE 세포를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 iPSC의 출발 개체군이 단일 세포들로 해리된 융합전(pre-confluent) 세포들인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 iPSC가 약 5,000 내지 40,000cells/cm2의 초기 세포 밀도로 배양되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 영양세포층(feeder layer) 없이 배양되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 완전한정 배양 배지(fully-defined culture medium)에서 배양되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 제노-프리(xeno-free) 배양 배지에서 배양되는, 방법.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 WNT 경로 억제제가 N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰아미드 디하이드로클로라이드(CKI-7), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP2), N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-3-(2-메톡시페닐)-4-옥소티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP4), 2-페녹시벤조산-[(5-메틸-2-푸라닐)메틸렌]하이드라지드(PNU 74654), 2,4-디아미노-퀴나졸린, 케르세틴, 3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온(XAV939), 2,5-디클로로-N-(2-메틸-4-니트로페닐)벤젠설폰아미드(FH 535), N-[4-[2-에틸-4-(3-메틸페닐)-5-티아졸릴]-2-피리디닐]벤즈아미드(TAK 715), Dickkopf-연관 단백질 1(DKK1), 또는 Secreted frizzled-연관 단백질 1(SFRP1)인, 방법.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TGFβ 경로 억제제가 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린(SB525334), 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-이에리-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 수화물(SB505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 수화물, 좌우 결정 인자(Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드(A 83-01), 4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드(GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(R 268712), 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(RepSox)인, 방법.
  21. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901), N-[3-[3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드(GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디하이드록시프로필)사이클로프로판-1-설폰아미드(RDEA119), 또는 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복사미드(AZD6244)인, 방법.
  22. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 경로 억제제가 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 하이드로클로라이드(LDN193189), 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드(도르소모르핀), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린(DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(DMH-2), 또는 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(ML 347)인, 방법.
  23. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 경로 억제제가 상기 망막 유도 배지 중의 LDN193189인, 방법.
  24. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 경로 억제제가 LDN193189이고, 상기 MEK 억제제가 상기 망막 분화 배지 중의 PD0325901인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC의 출발 개체군이 이를 필요로 하는 대상체에 대해 MHC 일배체형 일치되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC의 출발 개체군이 하나 이상의 HLA 대립유전자에 대해 동형접합인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 HLA 대립유전자가 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-DR인, 방법.
  28. 인간 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 완전 한정 배지에서 필수적으로 단일 세포로 해리된 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)들을 포함하는 출발 개체군을 얻는 단계;
    b) 상기 iPSC를 LDN193189, CKI-7, 및 SB431542를 포함하는 망막 유도 배지에서 배양하여, 상기 세포의 망막계통 세포로의 분화를 개시하는 단계;
    c) 상기 망막계통 세포를 LDN193189, CKI-7, SB431542, 및 PD0325901을 포함하는 망막 분화 배지에서 추가로 배양하여, 상기 망막계통 세포를 추가로 분화시키는 단계;
    d) 상기 세포를 니코틴아미드 및 액티빈 A를 포함하는 망막 배지에서 배양하여, 분화 RPE 세포를 형성하는 단계; 및
    e) 상기 RPE 세포를 RPE 성숙 배지에서 배양하여, 인간 RPE 세포를 제조하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 방법은 배아체의 형성은 포함하지 않는, 방법.
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