KR20230126745A - 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질 - Google Patents

망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질 Download PDF

Info

Publication number
KR20230126745A
KR20230126745A KR1020237028551A KR20237028551A KR20230126745A KR 20230126745 A KR20230126745 A KR 20230126745A KR 1020237028551 A KR1020237028551 A KR 1020237028551A KR 20237028551 A KR20237028551 A KR 20237028551A KR 20230126745 A KR20230126745 A KR 20230126745A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fibrin
plasminogen
rpe
implant
cells
Prior art date
Application number
KR1020237028551A
Other languages
English (en)
Inventor
앨런 디. 마르모르스타인
레이몬드 이이지
자렐 케이. 간디
호세 에스. 풀리도
Original Assignee
메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 filed Critical 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Publication of KR20230126745A publication Critical patent/KR20230126745A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/363—Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/484—Plasmin (3.4.21.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/225—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3808—Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

본원은 망막 색소 상피 이식을 수행하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들면, 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질이 제공된다.

Description

망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질{METHODS AND MATERIALS FOR USING FIBRIN SUPPORTS FOR RETINAL PIGMENT EPITHELIUM TRANSPLANTATION}
본원은 망막 색소 상피 이식에 관한 것이다. 예컨대, 본원은 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질에 관한 것이다.
황반 변성 질환은 다양한 질환 및 병인을 나타내지만, 일반적으로 망막 색소 상피(RPE) 기능이상에 기인한다. 베스트로피노패씨(bestrophinopathy)를 포함하는 유전적 황반 변성은 PRE 기능에 관련된 단백질 돌연변이에 기인하여 발생한다. 베스트로피노패씨(예컨대, 베스트 질환(Best's disease))는, 종국적으로 광수용체 죽음을 이끄는 RPE 기능이상을 일으키는 Best1 유전자의 돌연변이로부터 발생한다. 유병률은 이전에 16,000명 내지 21,500명 중 1명인 것으로 보고되었다(Dalvin et al., Ophthalmic Genet., Epub:1-5 (2016)). 유전적으로 발병되는 황반 변성은 드문 반면, 노인성 황반 변성(AMD)은 제1 세계에서 선두적인 실명 원인이다. 그것은 2050년에 미국에서 5백만 건을 차지할 것으로 추정된다. AMD는 RPE 기능에 직접적으로 영향을 끼치는 면역 및 혈관 기능의 복잡한 질환이다.
황반 변성에 대한 치료로서의 RPE 대체가 최근에 대중적인 관심이 되었다. 줄기 세포 기술의 현대적 발전은 배아 줄기(ES) 세포 및 유도된 만능 줄기(induced pluripotent stem: IPS) 세포를 이식의 매력적인 후보로 만들었다. 다수의 보고서에는 두가지 줄기 세포 공급원을 RPE 계통으로 분화시키는 능력이 제시되어 있다(Sonoda et al., Nat. Protoc., 4:662-673 (2009); Johnson et al., Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015); Brandl et al., NeuroMolecular Med., 16:551-564 (2014); Idelson et al., Cell Stem Cell., 5:396-408 (2009); Carr et al., Mol. Vis., 15:283-295 (2009)). ES-RPE 및 IPS-RPE는 세포 마커, 식작용 및 색소화를 포함한 정상적인 RPE 기능을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Singh et al., Ophthalmol. Vis. Sci., 54:6767-6778 (2013)).
본원은 RPE 이식에 관한 것이다. RPE 이식이 시험관내에서 성공하였지만, 임상적 적용으로의 이식에서 많은 어려움이 발생하였다. 최초 시험에서는 건성 AMD 환자에서 망막하 공간에 RPE 단일 세포 현탁액을 전달하는 것을 시도하였다(Peyman et al., Ophthalmic Surg., 22:102-108 (1991); 및 Schwartz et al., The Lancet., 379:713-720 (2012)). 이들 연구는, 어떠한 역반응도 보고되지 않았으므로, 안전 효능을 나타내었다(Schwartz et al., The Lancet., 379:713-720 (2012); Schwartz et al., The Lancet., 385:509-516 (2015); 및 Schwartz et al., Ophthalmol. Vis. Sci., 57:ORSFc1-9 (2016)). 그러나, 이식은 낮은 백분율의 RPE 부착 및 생존을 특징으로 하였다. 예상된 바와 같이, 시력에서 큰 개선이 발견되지 않았다(Schwartz et al., The Lancet., 385:509-516 (2015)).
상피로서, 세포-세포 접촉은 RPE 생존 및 기능에 관여한다. 후속적인 시험에서는 이식을 위한 RPE 단층의 성장에 초점을 맞추었다. 최근 연구에서는 RPE의 콜라겐 겔 배양, 및 이식 전에 단일 유닛으로서 단층을 분리하는 콜라게나제의 용도를 이용하였다(Kamao et al., Stem Cell Rep., 2:205-218 (2014); 및 Sun et al., Stem Cells, 33:1543-1553 (2015)). 이러한 모델을 사용하여 비지지된 RPE 단층을 이식하는 동물 연구는 이식 후 부착된 세포 생존능에서 개선을 나타내었다. 그러나, 외과적 수술 동안 편평하고 주름이 없는 단층을 유지할 수 없다는 우려가 제기되었다. 사실, 세포 부착은 표적을 벗어나 클럼핑 표현형을 지닌 것으로 보인다. 이러한 전략을 이용한 최초 인간 시험이 수행되었으며(Mandai et al., N Eng J Med., 376:1038-1046 (2017)) 임상 시험이 진행 중에 있다.
단층 유지를 극복하기 위해, 일반적인 조직 공학 전략은 분화 과정 및 후속 이식 동안 RPE에 대한 기저 지지체로서 합성 중합체 기재를 사용하는 것이었다. 현재 임상 시험 중인 2가지 물질은 파릴렌(Hu et al., Ophthalmic Res., 48:186-191 (2012); 및 Diniz et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54:5087-5096 (2013)) 및 폴리에스테르(Stanzel et al., Stem Cell Rep., 2:64-77 (2014))를 포함한다. 이들 물질은 미세공을 만들고 세포 부착을 개선하도록 변형될 수 있다(Lu et al., Biomed. Microdevices, 14:659-667 (2012); McHugh et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 55:1754-1762 (2014); 및 Lai et al., PLoS ONE. 8:e54058 (2013)). 이들 물질은 또한 서서히 분해되어 긴 RPE 분화 프로토콜을 통해 세포 배양을 가능하게 한다. 이러한 느린 분해 때문에, 상기 물질은 이식 후 수개월 내지 수년 동안 RPE와 맥락막 사이에 남아 만성 염증 및 섬유증, 저투과성 및 잠정적으로 저하된 RPE 생존의 우려를 일으킬 수 있다. 또한, 재료의 강성 때문에, 이전의 동물 연구에서 나타난 바와 같이(Diniz et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 54:5087-5096 (2013)), 기저의 맥락막에 대한 손상의 우려가 있다.
본원은 RPE 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질을 제공한다. 피브린은 전구체를 이의 자가 중합 모노머로 활성화시킨 후 자발적으로 형성되는 가교 결합 피브릴 네트워크일 수 있다. 피브린은 전형적으로 상처 치유 동안 생리학적으로 형성되는 응괴를 구성하며, 널리 특성화된 활성화, 형성, 분해 및 제거의 다단계를 갖는다(Undas et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 31:e88-e99 (2011)). 예컨대, 피브린 겔은, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)와 같은 효소에 의해 활성화되는 과정인, 플라스미노겐의 플라스민으로의 활성화를 통해 신속히 분해될 수 있다. 종종 피브린 아교로 불리는 피브린은 연조직의 외과적 절개 동안 천연 실란트로서 임상에서 사용되며, 시판된다. 본원에서 사용되는 피브린은 고도의 접착성을 가질 수 있고, 생체역학적 강성을 가질 수 있으며, 생체적합할 수 있고, 분해될 수 있다.
RPE 이식을 위한 기재로서의 피브린의 적합성을 확인하기 위해, 시간 척도로 분해에 대해 규정된 파라미터를 사용하여 박층의 단단한 히드로겔을 형성하도록 피브린 히드로겔의 특성을 변화시켰다. 이어서, 최적화된 조건을 iPSC-RPE 단층에 적용하였다. 피브린-RPE(FRPE) 이식물을 분리시키는 능력을 조사하였다. 이식에 대한 세포의 잠재적 효능을 보장하기 위해, 히드로겔 분해를 포함하여 시험관내 세포 생존능 및 표현형을 각각의 단계 후에 평가하였다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 피브린 히드로겔은 RPE 이식을 위해 일시적인 정단 병치(apically-apposed) 또는 기저 지지 기재로서 사용될 수 있다. 예컨대, RPE 이식은 본원에서 제공되는 RPE 단층/피브린 이식물을 사용하여 수행될 수 있다. 피브린 스캐폴드는 개선된 RPE 부착을 위해 RPE 단층의 정단면 또는 기저면 상에 존재할 수 있다. 경우에 따라, RPE는 피브린 지지체 상에서 성장되어 기저 지지체를 갖는 단층을 발생시킬 수 있다. 이들 배양물은 절단되어 이식을 위한 개별 유닛을 발생시킬 수 있다. 다른 예시에서, 피브린 스캐폴드는 개선된 RPE 부착을 위해 REP 단층의 정단면 상에 존재할 수 있다. 경우에 따라, 다수(예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 RPE 단층/피브린 이식물의 모듈식 타일링이 넓은 면적 적용범위(coverage)를 제공할 수 있고, 레이저 태킹(tacking)을 이용하여 전달 위치의 정밀도를 가능하게 할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 스캐폴드는, 예컨대 tPA를 통해 수술 동안 제어된 조건 하에 분해될 수 있다.
일반적으로, 본원의 하나의 측면은 (a) 정단(apical) 표면 및 기저(basal) 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층, 및 (b) 단층의 정단 및/또는 기저 표면에 부착된 피브린 히드로겔 층을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 망막 이식물을 특징으로 한다. 피브린 히드로겔 층은 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께일 수 있다. 이식물은 플라스미노겐을 포함할 수 있다. 이식물은 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 이식물은 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 히드로겔 층은 자가 유래로 수득될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 망막 또는 망막 아래 이식물을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층을 수득하는 단계, 및 (b) 단층의 정단 표면 상에 피브리노겐 및 트롬빈의 코팅물을 침착시키는 단계를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다. 코팅물은 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께일 수 있다. 본 방법의 코팅물은 약 20 mg의 피브리노겐/mL 내지 약 80 mg의 피브리노겐/mL을 포함할 수 있다. 본 방법의 코팅물은 약 2 U의 트롬빈/mL 내지 약 1500 U의 트롬빈/mL을 포함할 수 있다. 본 방법은 단층의 정단 표면 상에 플라스미노겐을 침착시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 단층의 정단 표면으로 피브린 히드로겔 내의 플라스미노겐을 침착시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법의 코팅물은 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 이식물은 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 망막 또는 망막 아래 이식물을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 피브린 기저 지지 기재 상의 망막 상피 세포를, 프로테아제 억제제 또는 항피브린용해제(예컨대, 소분자 프로테아제 억제제)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다. 배지는 프로테아제 억제제를 포함할 수 있고, 프로테아제 억제제는 아프로티닌일 수 있다. 배지는 약 5 U의 아프로티닌/mL 내지 약 500 U의 아프로티닌/mL을 포함할 수 있다. 배지는 플라스미노겐을 더 포함할 수 있다. 배지는 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL(예컨대, 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 30 U의 플라스미노겐/mL)을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 이식물은 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 플라스미노겐은 이식 직전에 배지에 첨가될 수 있다. 피브린 기저 지지 기재는 내피 세포를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 내피 세포는 iPSC-유도된 내피 세포, 혈액 외성장 내피 세포(BOEC), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 내피 전구 세포(EPC) 및 제대 정맥 내피 세포(UVEC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 수득된다. 피브린 기저 지지 기재는 RPE 아래 조직 세포 집단을 포함할 수 있다. RPE 아래 조직 세포 집단은 멜라닌세포, 주위세포 또는 섬유아세포를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 기저 지지 기재는 자가 유래로 수득될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 (a) 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층, 및 (b) 단층의 기저 표면에 부착된 피브린 히드로겔 층을 포함하는 망막 이식물을 특징으로 한다. 피브린 히드로겔 층은 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께일 수 있다. 이식물은 플라스미노겐을 포함할 수 있다. 이식물은 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 피브린 히드로겔 층은 코팅물을 포함할 수 있다. 코팅물은 기저 막 단백질, 마트리겔 또는 겔트렉스를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 히드로겔 단층은 자가 유래로 수득될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 망막 이식물을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (a) 피브린 히드로겔 층을 수득하는 단계, (b) 피브린 히드로겔 층의 표면을 제제로 코팅하는 단계, 및 (c) 코팅물 상에, 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층을 형성하는 단계로서, 기저 표면이 정단 표면보다 피브린 히드로겔 층에 더 가까운 것인 단계를 포함한다. 피브린 히드로겔 층은 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께일 수 있다. 피브린 히드로겔 층은 약 20 mg의 피브리노겐/mL 내지 약 80 mg의 피브리노겐/mL을 포함할 수 있다. 피브린 히드로겔 층은 약 2 U의 트롬빈/mL 내지 약 1500 U의 트롬빈/mL을 포함할 수 있다. 피브린 히드로겔 층은 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 히드로겔 단층은 자가 유래로 수득될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원은 망막 이식물을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 피브린 기저 지지 기재 상의 망막 상피 세포를 프로테아제 억제제 또는 항피브린용해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 배지는 프로테아제 억제제를 포함할 수 있고, 프로테아제 억제제는 아프로티닌일 수 있다. 배지는 약 5 U의 아프로티닌/mL 내지 약 500 U의 아프로티닌/mL을 포함할 수 있다. 배지는 항피브린용해제를 포함할 수 있고, 항피브린용해제는 트란스섹삼산 또는 아미노카프로산일 수 있다. 배지는 플라스미노겐을 더 포함할 수 있다. 배지는 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함할 수 있다. 피브린 기저 지지 기재는 내피 세포를 포함할 수 있다. 내피 세포는 iPSC-유도된 내피 세포, 혈액 외성장 내피 세포(BOEC), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 내피 전구 세포(EPC) 및 제대 정맥 내피 세포(UVEC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 피브린 기저 지지 기재는 코팅물을 포함할 수 있다. 코팅물은 기저 막 단백질, 마트리겔 또는 겔트렉스를 포함할 수 있다. 코팅물은 피브린 기저 지지 기재 상의 망막 상피 세포를 배양하기 전에 존재할 수 있다. 피브린 기저 지지 기재는 RPE 아래 조직 세포 집단을 포함할 수 있다. RPE 아래 조직 세포 집단은 멜라닌세포, 주위세포 또는 섬유아세포를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 기저 지지 기재는 자가 유래로 수득될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 본원에서 언급되는 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 참조로 전체가 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하는 본원의 명세서가 제어할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예시는 단지 설명을 위한 것으로서 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a는 정단 피브린을 갖는 RPE 단층을 제조하고 이를 수술 이식 장치에 로딩하는 방법의 개략도이다. 도 1b는 기저 피브린을 갖는 RPE 단층을 제조하고 이를 수술 이식 장치에 로딩하는 방법의 개략도이다.
도 2a는 황반 변성을 치료하기 위해 정단 피브린을 갖는 RPE 단층을 눈으로 이식하는 방법의 개략도이다. 도 2b는 황반 변성을 치료하기 위해 기저 피브린을 갖는 RPE 단층을 눈으로 이식하는 방법의 개략도이다.
도 3은 피브린용해 과정의 개략도이다.
도 4a는 박층 피브린 겔을 형성하기 위한 분무기 시스템의 사진이다. 도 4b는 분무기 시스템의 노즐의 확대된 사진이다.
도 5는 일부 실시양태에 따른 피브린 겔의 사진이다. 크기는 1.5 mm(W) x 5 mm(D) x 200 μm(H)이다.
도 6은 REP 단층에 부착된 정단 피브린의 사진이다.
도 7은 정단 피브린에 부착된 RPE 단층의 생/사(live/dead) 염색 사진이다. 부착된 세포는 2시간 후 생존한다.
도 8은 정단 피브린에 부착된 RPE 단층의 사진이다. 이미지는 피브린에 부착된 연속 단층을 도시한다.
도 9는 세포-세포 밀착 연접 단백질인 ZO-1(적색) 염색 및 세포 핵의 DAPI(청색) 염색 사진이다.
도 10은 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)로 2시간 동안 처리한 후 피브린의 생체물질 분해를 나타내는 사진을 포함한다. 피브린 분해 시간 범위는 1시간 내지 72시간일 수 있다.
도 11은 피브리노겐 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프를 포함한다. 플라스미노겐 및 tPA 농도는 고정되었다. 분해는 속도 상수에 독립적이었다. 피브리노겐 농도와 분해 시간 사이에는 선형 관계가 관측되었다.
도 12는 플라스미노겐 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프를 포함한다. 피브리노겐 및 tPA 농도는 고정되었다. 속도 상수는 플라스미노겐 농도에 의존적이었다. 플라스미노겐 농도와 분해 시간 사이에 비-선형 관계가 관측되었다.
도 13은 tPA 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프이다. 피브리노겐 및 플라스미노겐 농도는 고정되었다. 광범위한 분해 시간이 관측되었다.
도 14a 내지 14c는, 겔트렉스 코팅물의 존재(도 14b) 또는 부재(도 14c) 하에 플레이트 상에서, 아프로티닌을 포함하는 배지 중에 2주 동안 배양된, 피브린 겔 중에 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 망막 색소 상피(RPE)를 포함하는 플레이트의 이미지이다. 배지 중에 아프로티닌의 포함시키는 것은 피브린 겔 분해를 방지하는 것으로 나타났다.
도 15a 및 15b는, 플레이트로부터 겔을 분리한 후, 아프로티닌을 사용하여 기저 피브린 겔 상에서 배양된 iPSC-RPE 세포를 포함하는 플레이트의 이미지이다. 겔을 분리한 후 세포는 부착된 상태로 남아 있었으며(도 15a), 겔을 절단한 후 최소한의 세포 제거가 있었다(도 15b).
도 16a 및 16b은, 겔을 분리 및 절단한 후, 겔트렉스 코팅물의 존재(도 16a) 또는 부재(도 16b) 하에 플레이트 상에서, 아프로티닌을 포함하는 배지를 사용하여 피브린 겔 중에 배양된 iPSC-RPE 세포의 이미지이다. 세포를 칼세인-AM으로 염색하였으며, 세포는 분리 및 절단 후 생존가능한 것으로 유지되었으며, 겔트렉스는 생존을 위해서는 필요하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
도 17은 겔트렉스 코팅물 부재 하에 배양된 피브린 겔의 가장자리에 있는 iPSC-RPE 세포의 이미지이다. 겔을 플레이트로부터 분리 및 절단하고 세포를 칼세인-AM(생) 및 이티듐 호모다이머(사)로 염색하였다. 살아있는 세포는 녹색으로 보이며, 반면에 죽은 세포는 적색으로 보인다.
도 18a 및 18b는 피브린 겔에서 배양한 후, 60시간(도 18a) 또는 96시간(도 18b) 동안 0.1 U/ml 플라스미노겐 및 22 U/ml 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 사용한 소화에 의해 분해된 iPSC-RPE 세포를 포함하는 플레이트의 이미지이다. 세포는 플레이트로부터 단층으로서 분리되었다.
도 19는, 피브린 겔을 96시간 동안 플라스미노겐 및 tPA로 분해한 후의 단층의 iPSC-RPE 세포의 이미지이다. 세포를 칼세인-AM(생) 및 이티듐 호모다이머(사)로 염색하였으며; 살아있는 세포는 녹색으로 보이고 죽은 세포는 적색으로 보인다.
도 20은 병든 망막이 넓은 표면적에 영향을 끼치는 것을 보여주는 사진이다. 황반(동그라미 면적)은 직경이 5 mm이다(25 mm2). 망막은 1200 mm2이다. 본원에 기술된 방법 및 물질은 전체 황반 또는 망막의 다른 영역을 다루는데 사용될 수 있다.
도 21은 RPE 단층/피브린 이식물을 눈 내의 관심 영역으로 전달하기 위한 이식 장치의 사용을 나타내는 사진이다.
도 22는 이식물을 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지지 않도록 하기 위해 레이저 도구를 사용한 결과를 나타내는 사진이다.
도 23은 제2 RPE 단층/피브린 이식물을 눈 내의 관심 영역으로 전달하기 위한 이식 장치의 사용을 나타내는 사진이다. 제2 이식물은 제1 이식물에 인접하게, 바람직하게는 최초 절개를 통해 배치된다.
도 24는 제2 이식물을 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지지 않도록 하기 위해 레이저 도구를 사용한 결과를 나타내는 사진이다.
도 25는 제3 RPE 단층/피브린 이식물을 눈 내의 관심 영역으로 전달하기 위한 이식 장치의 사용을 나타내는 사진이다. 제3 이식물은 제2 이식물에 인접하게, 바람직하게는 최초 절개를 통해 배치된다.
도 26은 제3 이식물을 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지지 않도록 하기 위해 레이저 도구를 사용한 결과를 나타내는 사진이다.
도 27은 상이한 크기 및 모양으로 절단된 피브린 스캐폴드의 사진이다.
도 28은 RPE 단층/피브린 이식물을 눈으로 이식하기 위한 이식 장치의 일례의 개략도이다.
도 29는 RPE 단층/피브린 이식물을 눈으로 이식하기 위한 이식 장치의 하나의 프로토타입의 사진을 포함한다.
도 30은 도 29의 프로토타입을 통해 전달될 수 있는 이식물의 사진이다. 길이는 약 0.1 mm 내지 약 3 mm의 범위일 수 있고, 폭은 약 0.1 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다.
도 31은 RPE 단층/피브린 이식물을 눈으로 이식하기 위한 이식 장치의 또 다른 프로토타입의 사진을 포함한다.
도 32는 눈으로 다수의 도입을 제공하고 안구 허탈(eye collapse)을 방지하도록 안압을 유지하는 캐뉼라 포트의 사진을 포함한다.
도 33은 눈으로 다수의 도입을 제공하고 안구 허탈을 방지하도록 안압을 유지하는 캐뉼라 포트의 개략도이다. 길이는 약 0.1 mm 내지 약 4 mm의 범위일 수 있고; 폭은 약 0.1 mm 내지 약 3 mm의 범위일 수 있다.
도 34는 1.5 mm x 5 mm 기하구조로 형성된 피브린 겔의 기계적 강도 자료이다. 도 34a는 시험 설정의 예를 도시한다. 도 34b는 기울기(기계적 강도) 및 최대 힘 자료가 얻어지는 샘플 힘 대 변위 그래프를 도시한다. 도 34c는 20 mg/mL 내지 80 mg/mL의 피브린 히드로겔의 피브리노겐 농도 변화에 따른 기계적 강도 및 최대 힘을 도시한다. 도 34d는 100 μm 내지 300 μm의 히드로겔 두께 변화에 따른 기계적 강도 및 최대 힘을 도시한다.
도 35는 피브린 히드로겔 구조물의 이미지를 도시한다. 35a는 1.5 mm x 5 mm 기하구조로 절단한 후의 피브린 히드로겔의 육안 이미지를 도시한다. 도 35b는 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층촬영을 이용한 피브린 히드로겔의 단면도를 도시한다. 도 35c는 피브린 히드로겔 표면의 주사 전자 현미경 이미지를 도시한다. 도 35d는 SEM을 이용한 피브린 히드로겔 피브릴 구조물의 보다 높은 배율을 도시한다. 도 35e는, 피브린 히드로겔이 10 mg/mL와 같은 낮은 피브리노겐 농도에서는 감기지만 40 mg/mL의 피브리노겐 농도로 형성될 때는 그의 모양을 그대로 보유하기에 충분한 강도를 갖는다는 것을 도시한다.
도 36a는 시간 경과에 따른 조직 플라스미노겐 활성화제 + 플라스미노겐(tPA+P), 플라스미노겐 또는 tPA로 처리한 후의 피브린 분해를 나타내는 사진을 포함한다. 도 36b는 피브리노겐 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프를 포함한다. 플라스미노겐 및 tPA 농도는 고정되었다. 분해는 속도 상수에 독립적이었다. 플라스미노겐 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프에서는 선형 관계가 관측되었다. 피브리노겐 및 tPA 농도는 고정되었다. 속도 상수는 플라스미노겐 농도에 의존적이었다. 플라스미노겐 농도와 분해 시간 사이에는 비-선형 관계가 관측되었다. 도 36c는 tPA 농도를 변화시켰을 때의 분해 속도론을 플로팅한 그래프를 포함한다. 피브리노겐 및 플라스미노겐 농도는 고정되었다. tPA 농도와 분해 시간 사이에는 비-선형 관계가 관측되었다.
도 37은 프로테아제 억제제, 예컨대 아프로티닌을 포함시킬 필요성에 대한 자료를 도시한다. 도 37a는 아프로티닌 공급 하에 및 부재 하에 피브린 상에서 배양된 iPSC-RPE의 육안 관측을 도시한다. 아프로티닌 부재 하에서 피브린은 분해되며, 세포는 단층을 형성하도록 부착될 수 없다. 도 37b는 8,000 U/mL과 같이 높은 아프로티닌이 iPSC-RPE에 어떠한 독성도 보이지 않는다는 것을 도시한다. 도 37c는 아프로티닌 농도를 변화시키는 것이 iPSC-RPE 단층 형성에 어떻게 영향을 미치는 가를 도시한다. 예컨대, 1 U/mL 미만의 농도에서 단층 내에서 구멍(hole)의 발생이 증가한다. 도 37d는 다양한 아프로티닌 농도에서 총 iPSC-RPE 단층의 정량화를 도시한다.
도 38은 피브린 히드로겔 지지체 상에서 성장된 iPSC-RPE의 특성이다. 도 38a는 위상차 광학 현미경 하에서 볼 때 iPSC-RPE가 착색된 자갈 패턴의 단층으로 보인다는 것을 도시한다. 도 38b는 iPSC-RPE가 피브린 상에서 배양될 때 생존가능하다는 것을 나타내기 위해 생/사 어세이(live/dead array)를 이용한다. 도 38c는 iPSC-RPE에 의한 VEGF 및 PEDF 분비의 ELISA 정량화를 도시한다. 도 38d는, 기준 B-액틴과 함께, 주요 RPE 마커인 Best1, RPE65 및 CRALBP에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 38e는 Best1, 에즈린(Ezrin) 및 ZO-1에 대한 면역 형광 염색을 도시한다.
도 39a는 피브린 겔 상에서 배양한 후 0.1 U/mL의 플라스미노겐 및 22 U/mL의 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)로 분해된 iPSC-RPE 세포를 포함하는 플레이트의 시간 경과에 따른 이미지를 포함한다. 세포는 플레이트로부터 단층으로서 분리되었으며 주름을 형성하고 접혔다. 도 39b는 피브린 겔이 완전 분해된 후의 iPSC-RPE의 생/사 어세이를 도시한다. 도 39c는 피브린 분해 전후의 정량적 iPSC-RPE 생존능을 나타내는 그래프이다. 도 39d는 피브린이 완전 분해된 후 iPSC-RPE 단층에서의 ZO-1의 면역형광 염색이며, 단층의 보유를 나타낸다.
도 40은 PCR을 사용하여 피브린 겔 상에서 배양된 iPSC-RPE의 RNA 프로필을 나타내는 표이다
도 41은 래빗 눈의 망막하 공간으로 이식된 피브린 히드로겔의 사진이다. 48시간 후 눈에서 피브린 히드로겔에 대한 어떠한 증거도 관측되지 않았다.
도 42a는 피브린(F), 피브린 + 마트리겔 및 마트리겔 대조군으로부터의 VEGF 방출을 비교하는 그래프이며, 도 42b는 피브린(F), 피브린 + 마트리겔 및 마트리겔 대조군으로부터의 PEDF 방출을 비교하는 그래프이다. 두 성장 인자 모두의 분비가 3개의 모든 샘플 간에 유사하였다.
도 43은 피브린 또는 피브린 + 마트리겔(F+MG) 상에서 성장된 iPSC-RPE의 에즈린 및 Zo-1에 대한 면역형광 염색의 이미지를 포함한다. 2개 군 모두 양성이고 특징적인 염색 패턴을 나타내었다.
도 44는 피브린 또는 피브린 + 마트리겔(F+MG) 상에서 성장된 iPSC-RPE의 생/사 어세이의 이미지를 포함한다. 세포 생존능은 군들 간에 유사하였다.
도 45는 피브린(F) 또는 피브린 + 마트리겔(FMG) 상에서 성장된 iPSC-RPE의 Best1, RPE65, CRALBP 및 B-액틴에 대한 웨스턴 블롯 분석의 이미지를 포함한다. L은 크기 래더(size ladder)이다. Best1, RPE65 및 CRALBP는 RPE 마커이다.
도 46은 하나의 실시양태에 따른 피브린 히드로겔 지지체 장치의 측면도이다.
도 47은 하나의 실시양태에 따른 피브린 히드로겔 지지체 장치의 상면도이다.
도 48은 하나의 실시양태에 따른 피브린 히드로겔과 함께 하는 피브린 히드로겔 지지체 장치의 측면도이다.
본원은 망막 색소 상피 이식에 관한 것이다. 예컨대, 본원은 망막 색소 상피 이식을 위한 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질을 제공한다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 피브린 히드로겔은 RPE 이식을 위한 일시적 기재로서 사용될 수 있다. 피브린 히드로겔은 RPE를 위한 기저 지지 기재(도 1b) 또는 정단 병치된 기재(도 1a)일 수 있다. 경우에 따라, REP는 2개의 피브린 히드로겔; 하나는 기저 지지 기재와 하나는 정단 병치된 기재 사이에 샌드위치화될 수 있다.
본원에서 제공되는 RPE 단층/피브린 이식물은 RPE를 편평하고 주름이 없는 단층으로 유지할 수 있다. 경우에 따라, 피브린 배치는 이식 과정 동안 기계적 지지 및 보호를 제공할 수 있으며, 올바른 RPE 극성의 이식을 보장할 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 REP 단층/피브린 이식물은 RPE/브루쉬(Bruch's) 막 부착의 장애물인 잠재적인 만성 염증을 감소시킬 수 있고, 맥락막으로부터의 확산 투과성을 유지할 수 있다.
임의의 적합한 방법을 사용하여 RPE 단층을 위한 피브린 기재를 생성할 수 있다. 겔화 속도론은 트롬빈 농도와 직접적으로 관련될 수 있으며, 피브린 히드로겔의 기계적 특성은 초기 피브리노겐 농도와 직접적으로 관련될 수 있다. 경우에 따라, 보다 높은 피브리노겐 농도로 가교를 증가시키고 경직된 피브린 히드로겔을 생성할 수 있다. 일반적으로, 피브린 히드로겔은 얇은 시트로서 형성될 수 있다. 경우에 따라, 피브린 히드로겔의 압축으로 히드로겔을 더욱 경직되게 할 수 있다.
경우에 따라, 피브린 박막 침착은 분무 코팅 또는 샌드위치화 방법을 통해 달성될 수 있다. 하나의 예시에서, 피브리노겐과 트롬빈(및 임의로 플라스미노겐)의 혼합물을 RPE 단층의 정단면 상에 분무하고 정단 피브린 코팅을 달성하기 위해 완전 겔화시킬 수 있다. 하나의 예시에서, 피브리노겐과 트롬빈(및 임의로 플라스미노겐)의 액적 혼합물을 RPE 단층의 정단면 상에 배치할 수 있으며, 액적을 압축 또는 분무하고 정단 피브린 코팅이 달성되도록 완전 겔화시킬 수 있다.
경우에 따라, 피브린 박층의 분무 코팅을 사용하여 피브린 히드로겔을 형성할 수 있다. 일반 및 복강경(laproscopic) 수술에 사용되는 것과 같은 분무기 시스템을 용도변경하여 본원에서 기술되는 바와 같이 피브린 히드로겔을 생성할 수 있다. 또한 문헌[Chaurasia et al., Transl. Vis. Sci. Technol., 1:2 (2012)]을 참조할 수 있다. 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔의 두께는 약 10 μm 내지 약 400 μm(예컨대, 약 20 μm 내지 약 400 μm, 약 50 μm 내지 약 400 μm, 약 10 μm 내지 약 200 μm, 약 50 μm 내지 약 200 μm)이다.
본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 정확한 방향 및 위치를 위한 수술 도구로 쉽게 조작될 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 이의 최초 형태 및 표면 특성을 유지하면서도 유연할 수 있다. 경우에 따라, 부착 세포는 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔의 표면으로부터 분리되지 않는다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 약 0.01 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 피브리노겐(예컨대, 약 20 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 피브리노겐)을 포함하는 용액을 분무함으로써 생성될 수 있다. 경우에 따라, 30 mg/mL 초과의 피브리노겐(예컨대, 약 30 mg/mL 내지 약 80 mg/mL의 피브리노겐)을 사용하여 핀셋으로 조작될 수 있는 피브린 히드로겔을 생성할 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 약 40 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 피브리노겐을 포함하는 용액을 분무함으로써 생성될 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 본원에서 기술되는 바와 같은 피브리노겐 및 약 2 U/mL 내지 약 1000 U/mL의 트롬빈(예컨대, 약 10 U/mL 내지 약 200 U/mL의 트롬빈)을 사용하여 생성될 수 있다. 경우에 따라, 5 U/mL 초과의 트롬빈(예컨대, 약 10 U/mL 내지 약 100/mL의 트롬빈)을 사용하여 핀셋으로 조작될 수 있는 피브린 히드로겔을 생성할 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 약 40 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 피브리노겐 및 약 10 U/mL 내지 약 100 U/mL의 트롬빈을 포함하는 용액을 분무하여 생성될 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 불활성 플리스미노겐에 의해 예비-로딩될 수 있다. 예컨대, 불활성 플라스미노겐은 이를 온전한 피브린 히드로겔에 결합시킴으로써 피브린 히드로겔로 예비-로딩될 수 있다. 경우에 따라, 플라스미노겐을 포함시키는 것은, 이식을 위한 피브린 지지된 RPE의 눈으로의 전달 전에, 플라스미노겐의 인큐베이션 및 피브린 겔로의 확산을 통해 달성될 수 있다. 경우에 따라, 플라스미노겐을 포함하는 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물은, 이식물이 눈 내에 배치된 후, tPA에 노출될 수 있다. 이러한 경우에, tPA 노출은 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키고, 이어서 피브린 히드로겔을 분해한다. 플라스민 농도는 본원에서 기술되는 바와 같이 피브린 분해 속도론과 직접적으로 관련된다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 약 0.001 U/mL 내지 약 40 U/mL의 플라스미노겐(예컨대, 약 0.5 U/mL 내지 약 4 U/mL의 플라스미노겐, 약 0.1 U/mL 내지 약 30 U/mL의 플라스미노겐 또는 약 0.1 U/mL 내지 약 40 U/mL의 플라스미노겐)을 포함하도록 생성될 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물은 눈으로의 이식을 위해 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화제와 함께 용액 중의 현탁물로서 전달될 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물은 콜라겔 겔 상에 생성될 수 있다. 이러한 경우, RPE/피브린 히드로겔 이식물은 콜라게나제(예컨대, 약 200 U/mL 내지 약 1500 U/mL의 콜라게나제)를 사용하여 수거될 수 있다. 콜라게나제는 세포-세포 상호작용을 방해하지 않으며, RPE 단층이 콜라겐 겔로부터 분리되게 한다. RPE 단층은 또한 콜라게나제 처리 후 피브린 히드로겔에 부착되어 잔류한다. 경우에 따라, 콜라게나제에 추가하여 또는 콜라게나제 대신에 디스파제(예컨대, 약 0.5 U/mL 내지 약 10 U/mL의 디스파제)가 사용될 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물은, 배양 기간 전반에 걸쳐 피브린 스캐폴드를 보존하고 피브린 지지체의 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제인 아프로티닌(예컨대, 약 5 U/mL 내지 약 500 U/mL의 아프로티닌)와 같은 항피브린용해제의 존재 하에 생성될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같이 사용될 수 있는 다른 항피브린용해제는, 제한 없이, 프로테아제 억제제(예컨대, 마크로글로불린, 트롬빈, 트롬빈-활성화가능 피브린용해 억제제 및 카르복시펩티다제), 세린 프로테아제 억제제(세르핀) 패밀리의 구성원(예컨대, 안티트립신, 알파 2-안티플라스민 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 1 및 2), 메탈로프로테아제 억제제(예컨대, 메탈로프로테이나제 1-4의 조직 억제제, 바티마스타트(Batimastat), 시페마스타트(Cipemastat) 및 일로라스타트(Ilorastat)) 및 소분자(예컨대, 아미노카프로산(Amicar), 트라넥삼산(Lysteda), 헤파린, 알파-N-아세틸-L-리신 메틸 에스테르(NALME), 비타민 K 및 p-아미노메틸-벤조산)을 포함한다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물의 피브린 히드로겔은 RPE 단층을 전달하기 위한 단기(예컨대, 72시간 미만 또는 1주 미만)의 기계적 지지체일 수 있다. 예컨대, 피브린 히드로겔은 눈의 망막하 공간으로의 전달을 위해 RPE의 정단(상단)면에 부착될 수 있고, 생체적합할 수 있고, 본원에서 기술되는 바와 같이 tPA 를 사용하여 조절가능한 방식으로 신속히 분해될 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물은 효과적인 REP를 제공하기 위해 눈으로 이식될 수 있다)(도 2a 및 2b).
본원은 또한 고도 근시, 혈관모양줄무뉘 및 황반 변성과 같은 눈 병태를 치료하기 위해 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물을 사용하는 방법을 제공한다. 황반 변성으로서 분류되고 본원에서 기술되는 바와 같이 치료될 수 있는 일부 질환은, 제한 없이, 노인성 황반 변성(AMD), 중심 지도모양 위축, 베스트로피노패씨, 레베르 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis), 범맥락막위축, 회색 위축(Gyrate atrophy), 소르스비 황반 이상증(Sorsby's macular dystrophy), 미토콘드리아-유전 당뇨병 및 난청(MIDD), 클로로퀸-관련 망막병증, 말라티아 레벤티네스(malattia leventinese), 노스캐롤라이나 이상증(North Carolina dystrophy), 고오르니틴혈증, 중심 장액성 맥락망막병증, 성인 발병 중심와황반 이상증(adult-onset foveomacular dystrophy) 및 스타르가르트 질환(Stargardt's disease)을 포함한다. 예컨대, 포유동물(예컨대, 인간)이 눈 수술을 위해 준비될 수 있고, 손상된 RPE 영역은 노출시키기 위해 망막하 분리가 생성된다(도 20). 이때, RPE/피브린 히드로겔 이식물을 관심 영역에 전달하기 위해 도 28, 29 또는 31에 도시된 바와 같은 이식 장치를 사용할 수 있다(도 21). 경우에 따라, 눈에 접근하기 위해 캐뉼라(예컨대, 도 32 및 33 참조)가 사용될 수 있다. 경우에 따라, RPE/피브린 히드로겔 이식물을 제 위치에 넣기 위해 기상 기포가 사용될 수 있다. 이식물을 레이저 광응고를 통해 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지지 않도록 하기 위해 레이저 도구(예컨대, 당뇨 망막증에 사용되는 레이저 도구)를 사용할 수 있다. 이때, 제2 RPE 단층/피브린 이식물을 눈 내의 관심 영역에 전달하기 위해 이식 장치를 사용할 수 있다(도 23). 제2 이식물은 제1 이식물에 인접하게, 바람직하게는 최초의 절개 또는 캐뉼라를 통해 배치될 수 있다. 제2 이식물을 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지지 않도록 하기 위해 레이저 도구를 사용할 수 있다(도 24). 이식 장치는 제3 RPE 단층/피브린 이식물을 눈 내의 관심 영역으로 전달하는데 사용될 수 있다(도 25). 제3 이식물은 제2 이식물에 인접하게, 바람직하게는 최초 절개 또는 캐뉼라를 통해 배치될 수 있다. 제3 이식물을 아래로 태킹하여 그 이식물이 미끄러지 않도록 하기 위해 레이저 도구가 사용될 수 있다(도 26). 본 단락은 3개의 RPE 단층/피브린 이식물을 이식하는 것을 기술하나, 치료될 면적을 커버하도록 임의의 적합한 수의 이식물이 사용될 수 있다. 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 RPE 단층/피브린 이식물이 치료되는 단일 눈 내에 이식될 수 있다. 일반적으로, 이러한 모듈식 타일링 접근법은 임상의가 환자의 필요에 따라 이식물을 개별화할 수 있게 하고, 넓은 면적으로 확장가능하며, 망막의 어떠한 영역에도 적용가능하고, 필요한 절개의 수를 줄인다.
경우에 따라, 특정 모양 또는 크기를 갖는 RPE 단층/피브린 이식물을 디자인하기 위해 기계식 펀치를 사용할 수 있다(예컨대, 도 27 참조). 피브린 이식물을 성형하는 다른 방법은 맞춤형(custom) 몰드를 사용한 겔 캐스팅, 레이저 미세해부 현미경 및 3D 프린팅을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 RPE 단층/피브린 이식물을 눈으로 이식하기 위한 이식 장치는 방출의 기계적 제어를 구비한 플런저 스타일 장치일 수 있다. 경우에 따라, 이식 장치는 다양한 크기의 RPE 단층/피브린 이식물을 전달하고 다수의 이식물을 클립 스타일 팁을 사용하여 신속히 삽입하는 능력을 갖도록 디자인될 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 이식 장치는 세포 및 히드로겔의 수화를 유지하도록 액체 리저버를 가질 수 있다. 경우에 따라, 본원에서 제공되는 이식 장치는 한손 조작 및 사용을 위해 디자인될 수 있다.
피브린 기저 지지체의 사용을 수반하는 경우에, 예비-혈관화 전략이 맥락막 조직을 형성하기 위해 RPE 배양과 조합될 수 있다. 피브린은 마이크로유동 장치(Moya et al., Methods Mol. Biol., 1202:21-7 (2014)), 3D 프린팅(Pinnock et al., Methods, 99:20-7 (2016)) 및 매트릭스 내의 캡슐화된 내피 세포의 자발적 혈관화(Mishra et al., Biomaterials, 77:255-66 (2016))의 사용을 통하는 것을 포함하여 다양한 방법으로 혈관화될 수 있다. 이들 전략은 RPE-맥락막 복합체를 형성하기 위해 예비-혈관화된 피브린의 상단에서 RPE 단층 배양물과 조합될 수 있다. RPE-맥락막은 건조 AMD를 포함한 맥락막 및 RPE가 모두 기능이상인 황반 변성 질환의 치료제일 수 있다. 내피 세포(EC)는 iPSC-유도된 내피 세포, 혈액 외성장 내피 세포(BOEC), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 내피 전구 세포(EPC) 및 제대 정맥 내피 세포(UVEC)와 같은 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
피브린 기저 지지체의 사용을 수반하는 경우에, 이식 조직을 형성하기 위해 다수의 세포 집단이 RPE 배양물과 조합될 수 있다. 피브린 지지체는 멜라닌세포, 맥락막 주위세포 및 섬유아세포를 포함하는 RPE 아래 조직에서 발견되는 다른 세포 유형과 함께 로딩될 수 있다.
본원은 또한 세포 배양 배지에 현탁되는 피브린 히드로겔 상에서 세포를 성장시키는데 사용될 수 있는 피브린 히드로겔 지지체 장치를 제공한다. 경우에 따라, 이는 본원에서 제공되는 RPE/피브린 히드로겔 이식물이 고체 지지체로부터 스캐폴드를 분리할 필요성을 회피하고 세포가 성장하고 분화함에 따라 배양 배지가 세포의 기저 표면에 접근할 수 있게 하는 방식으로 형성되게 한다. 하나의 실시양태에서, 장치는 스캐폴드 물질을 현탁으로 유지하도록 서로 용이하게 부착될 수 있는 2개의 분리된 부분을 포함할 수 있다(도 46 내지 48). 상단 부분은 상단 부분과 하단 부분 사이에 샌드위치화된 피브린 히드로겔 층을 가압하여 고정하도록 하단의 베이스 부분으로 삽입될 수 있는 원통형 내부 튜브일 수 있다(도 48). 하단의 베이스 부분은 측벽 및 중앙 개구부를 갖는 고리형 하단을 포함할 수 있다. 상단의 원통형 내부 튜브는 하단의 베이스 부분에 의해 유지되고 지지될 수 있다. 2개의 부품은, 예컨대 사출 성형을 통해, 제한 없이, 테플론, 실리콘 또는 기타 플라스틱을 포함한 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 경우에 따라, 폴리스티렌이 사용될 수 있다. 각각의 부품의 크기는 도 46 내지 48에 도시된 바와 같다. 경우에 따라, 상단의 원통형 내부 튜브는 실, 스냅-피트 또는 클립핑 메카니즘을 통해 하단의 베이스 부분에 맞물릴 수 있다.
경우에 따라, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 세포를 적용하기 전에 코팅될 수 있다. 예컨대, 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔은 세포를 적용하기 전에 기저막 매트릭스 및/또는 기저막 단백질(예컨대, 마트리겔 또는 다른 제제)로 코팅될 수 있다. 본원에서 제공되는 피브린 히드로겔을 코팅하는데 사용될 수 있는 다른 제제의 예는, 제한 없이, 겔트렉스, 라미닌 511, 라미닌 521, 비트로넥틴, 콜라겐, 젤라틴 및 이들의 조합을 포함한다. 경우에 따라, 마트리겔 및 겔트렉스는, 모두 마우스 육종 세포로부터 유래된 기저막 매트릭스이므로, 이들은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 설명될 것이며, 하기 실시예는 청구범위에 기술되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - IPSC-RPE 이식을 위한 피브린 히드로겔의 사용
화학물질
피브리노겐은 3개의 공급원으로부터: 에티콘(Ethicon)으로부터의 에비셀(Evicel)(60 mg/mL)로서, 박스터(Baxter)로부터의 티씰(Tisseel)(95 mg/mL)로서 및 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터의 연구 등급 물질(57 mg/mL)로서 입수되었다. 트롬빈은 또한 3개의 공급원으로부터: 에티콘으로부터의 에비셀 부분, 박스터로부터의 티씰 일부 및 시그마-알드리히로부터의 연구 등급 물질로부터 입수되었다. 플라스미노겐은 시그마-알드리히로부터 연구 등급 물질로서 입수되었다. 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)는 시그마-알드리히로부터의 연구 등급 물질로서 입수되었다.
세포
iPSC-RPE 세포는 문헌(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))에 기술된 바와 같이 변형에 의해 생성되었다. 트랜스웰 또는 HA 막을 포함하는, 정단 및 기저 매질을 갖는 막 지지체를 이용하였다. 막 표면을 제조자의 프로토콜에 따라 콜라겐 겔로 코팅하고, 순차적으로 또는 대안적으로, 2시간 동안 37℃에서 0.1 mg/mL까지의 겔트렉스 또는 마트리겔 용액으로 코팅하였다. 이어서, 세포를 플레이팅하고, 1개월 이하 동안 단층을 형성하게 하였다. 본 연구를 위해, 건강한 대조군 환자로부터의 IPSC-RPE를 사용하였다. diff 단계 5 이후의 세포를 사용하였다. 트랜스 상피 저항은 100 ohms 이상으로 측정되었다. 색소화가 사용 전에 주목되었다.
박층 피브린 겔의 형성
피브리노겐 농도 및 트롬빈 농도를 변화시키면서 피브린 겔을 형성하였다. 초기에는 피브리노겐과 트롬빈 용액의 혼합물이 200 μm의 갭 두께를 갖는 플라스틱 몰드 내의 2개 층의 파라필름 사이에 샌드위치화되는 플레이트 샌드위치화 방법에 의해 박층 겔을 형성하였다. 용액을 가습의 37℃에서 1시간까지 겔화하였다. 파라필름을 제거하고, 겔을 수화하고, 사용 전에 PBS에서 세척하였다. 이러한 방법으로 형성된 겔은 평균 두께가 196 ± 90 μm이었다.
대안으로, 분무기 시스템을 사용하여 박층 피브린 겔을 형성하였다. 이중 마이크로주입기 시스템(WPI)을 컴퓨터에 연결된 펌프 제어기에 연결하였다. 각각 피브리노겐 및 트롬빈 용액을 갖는 2개의 1 mL 주사기를 마이크로주입기 장치에 장착하고, 2:1 믹서 컨넥터를 주사기에 부착하였다. 이어서, 혼합기를 분무화 노즐(The Lee Co)에 연결하였다. 또한, CO2 가스 조절기를 노즐에 부착시켜 분무화를 위한 공기 압력을 제공하였다. 도 4a 및 4b는 셋업을 도시한다.
얇은 피브린 겔 형성을 달성하기 위해, 액체 분산액의 공기 압력 및 양을 변화시켰다((0.3-1.5 bar). 맞춤형 MATLAB 스크립을 사용하여 분무기 시간 및 속도를 변화시켰다. 공기 압력은 조절기에서 변화되고 풋 페달에 의해 조절되었다. 분무 후, 용액을 1시간까지 가습의 37 ℃에서 겔화하였다. 겔을 수화하고, 사용 전에 PBS에서 세척하였다.
겔 두께 측정
분무기 시스템을 사용하여 겔을 형성 후, 겔을 0.01 mg/mL의 FITC 이소티오아네이트(isothioanate) 용액으로 1시간 동안 염색하고 흔들었다. 비표지화된 FITC를 PBS로의 후속 세척을 통해 제거하였다. 공초점 z-시리즈 이미지를 겔을 통해 취하고, FITC 염색된 슬라이스의 크기를 측정하여 두께를 얻었다.
역학
문헌(Uehara et al., J. Bone Joint Surg. Am., 97:1792-1798 (2015))에 기술된 바와 같은 압축 시험을 이용하여 겔 생체역학을 수득하였다. 다양한 피브리노겐 농도를 갖는 겔을 제조하고 두께를 측정하였다. 간단히, 겔을 맞춤형 스테인레스강 블럭에 올려 놓앗다. 편평한 원통형 알루미늄 압자를 사용하여 압축 시험을 수행하였다. 압자는 직경이 1.3 mm이었다. 보세 일렉트로포스 3200 액츄에이터(Bose Electroforce 3200 actuator)를 사용하여 시험을 수행하였다. 10 그램 허니웰 소형 로드 셀(Honeywell miniature load cell)을 사용하여 힘을 측정하였다. 보세 일렉트로포스 3200 내부 선형 가변 차동 변압기(Bose Electroforce 3200 internal linear variable differential transformer)를 사용하여 변위를 측정하였다. LabVIEW을 사용하여 자료를 수집하였다. 정적 변형 시험을 파단될 때까지 0.05 mm/s에서 수행하였다. 응력 및 변형률 곡선을 그래프로 나타내고 선형 영역에 피팅하여 영 계수 값을 수득하였다.
분해 속도론
피브리노겐 농도를 변화시키면서(40-60 mg/mL) 샌드위치화 방법을 이용하여 다양한 겔을 제조하였다. 트롬빈 농도는 강성도 또는 분해 속도론에 영향을 끼치는 것으로 보이지는 않았으며, 100 U/mL로 일정하게 유지되었다. 다양한 플라스미노겐 농도(0.8-4.0 U/mL)를 겔화 전에 피브리노겐 농도와 혼합하여 겔 내에 로딩하였다. 겔 형성 후, 겔을 맞춤형 크기의 소형 중공 펀치를 사용하여 펀칭하였다. 모양은 타원형이고, 높이는 1.5 mm이고, 폭은 5 mm이었다(도 5). 펀칭된 겔을 다양한 농도의 tPA 용액(0.1-1,000 U/mL)에서 인큐베이션하였다. 시간 경과에 따라, 현탁 용액의 샘플을 취하였다. 각각의 변수(즉, 피브리노겐, 플라스미노겐 및 tPA 농도)의 효과를 평가하기 위해서, 다른 2개는 일정하게 유지하면서 각각을 변화시켰다.
제조자의 프로토콜에 따라 660 nm 단백질 어세이를 이용하여 피브린 분해 산물(FDP)을 정량화하였다. 공지된 FDP 농도의 표준 곡선을 이용하여 흡광도 값으로부터 농도를 수득하였다. 농도 대 시간의 그래프를 활용함으로써 지수 피팅 모델을 이용하여 속도 상수를 얻었다.
피브린/RPE 이식물의 분리
세포의 분리는 피브린 겔 병치 전 및 후 모두에서 달성되었다. 막 지지체 상의 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 30분까지 DMEM(Stem Cell Tech) 중의 기본 750 U/mL의 정제된 콜라게나제(Worthington) 또는 1 U/mL의 디스파제에서 인큐베이션하였다. 트랜스웰을 제거하여 건조시키고, 막을 절단하고 파라필름의 상단에 배치하였다. 이어서, 피브린을 상단에 분무하고, 완전 겔화하였다. 대안으로, 샌드위치화 방법을 이용하여 정단 RPE 단층 상에 피브리노겐과 트롬빈의 혼합물을 가하고 완전히 겔화하였다. 수화 후, 겸자를 사용하여 피브린/RPE 시스템(FRPE)를 벗겨 내었다. 이어서, FRPE를 배양 배지에서 인큐베이션하였다.
대안으로, 막 지지체 상의 RPE를 PBS로 세척하였다. 일단 PBS가 제거되면, 피브린을 상단에 분무하고 완전히 겔화하였다. 수화 후, 세포를 30분까지 DMEM 중의 기본 750 U/mL의 정제된 콜라게나제 또는 1 U/mL 디스파제에서 인큐베이션하였다. 막을 조심스럽게 절단하고, 페트리 디쉬에 배치하고, PBS에 담갔다. 이어서, FRPE를 겸자를 사용하여 벗기거나 세포 스크래퍼를 사용하여 긁어내었다.
FRPE 염색 및 이미지화
단층 표현형 유지를 측정하기 위해서, FRPE를 상피 세포에서 발견되는 세포-세포 연접 단백질인 ZO-1에 대해 염색하였다. FRPE 샘플을 펀칭하고, 1시간 동안 10% 포르말린으로 고정하였다. 문헌(Johnson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619-4630 (2015))에 기술된 바와 같이 염색을 수행하였다. 고정된 세포를 NGS로 블록킹하고, 4 ℃에서 1차 항체에서 밤새 인큐베이션하고, 2차 항체에서 2시간 인큐베이션하였다. 샘플을 어쿠아먼트(aquamount)를 사용하여 유리 슬라이드에 올려 놓고, 니콘 형광 현미경 하에서 이미지화하였다.
TEM 이미즈를 얻어 피브린 및 RPE의 상호작용을 관측하였다. FRPR 샘플을 1시간 동안 2.5% 글루타르알데히드로 고정하였다. 고정된 샘플을 수지 매립을 위해 처리하고, 0.5 μm 섹션으로 절단하고 올려 놓았다. TEM 현미경 상에서 이미지화를 수행하였다.
생/사 어세이
명시야 현미경을 사용하여 시간 경과에 따라 펀칭된 FRPR 이식물을 모니터링하였다. 세포 생존능을 측정하기 위해, 생/사 키트를 제조자의 프로토콜에 따라 FRPE에 사용하였다. 살아있는 세포를 FITC 스펙트럼(흡광도: 495 nm; 방출: 520 nm) 하에 가시화하고, 죽은 세포를 TRITC 스펙트럼(흡광도: 543 nm; 방출: 560 nm) 하에 가시화하였다. 세포 생존능을 백분율(살아있는 염색된 세포를 가시화된 총 세포로 나눔)로 계산하였다.
PCR
배양 지지체로부터 분리 25시간 후 및 피브린 지지체 분해 24시간 후에 세포의 기능을 확인하기 위해 PCR을 세포에 수행하였다. 마커는 PEDF, RPE65, Best1 및 대조군을 포함하였다.
결과
도 5는 RPE의 정단 표면에 피브린을 부착하고 디스파제를 사용하여 배양 표면으로부터 분리하는 것에 대한 성공을 도시한 것이다. 기계적 펀칭 후, 세포는 여전히 피브린에 부착되어 있었다.
RPE 세포는 겔의 표면에 부착되었으며(도 6), 칼세인-AM 염색의 존재는 피브린에 부착된 세포가 여전히 살아있었다는 것을 제시하였다(도 7). 단층 및 색소화를 유지하는 커다란 영역을 지닌 RPE 단층의 정단 표면에 피브린의 성공적인 부착이 관측되었다(도 8). 스케일은 이 방법이 보다 큰 이식물을 생성하기 위해 얼마나 확정성이 있는지를 보였다. DAPI(청색) 및 ZO-1(적색)은 피브린에 정단 부착된 RPE 단층의 염색을 나타내었다(도 9). ZO-1의 존재는 세포-세포 연접을 통한 단층의 존재를 제시하였다. 플라스미노겐의 존재 하에서, tPA를 사용하여 피브린 겔을 용해하였다(도 10). tPA 부재 하에서, 플라스미노겐은 활성화되지 않았으며, 겔은 분해되지 않았다.
고정된 플라스미노겐 및 tPA 농도에서, 속도 상수가 피브리노겐 농도에 독립적이었으므로(p=0.35), 피브리노겐 농도는 겔의 분해 속도론에 영향이 없었다(도 11). 고정된 피브리노겐 및 tPA 농도에서, 플라스미노겐 농도가 증가함에 따라 속도 상수가 증가하였으므로(p=0.005), 플라스미노겐 농도는 겔의 분해 속도론에 영향을 끼쳤다(도 12). 따라서, 플라스미노겐 농도를 증가시킴으로써 총 분해 시간은 기하급수적으로 감소되었다. 고정된 피브리노겐 및 플라스노겐 농도에서, tPA 농도 증가는 분해 시간에서 기하급수적 감소와 연관되었다(도 13). 피브린 스캐폴드 상의 RPE 배양물이 아프로티닌 부재 하에서 관측되었으며(도 14a), RPE는 3-4일 내에 피브린 기재를 분해하여 많은 세포를 죽게 하였다. 매우 소수의 세포가 잔류하고, 단층 형성의 어떠한 표현형도 관측되지 않았다. 배양 배지에 아프로티닌을 포함시킴으로써, RPE 생존 및 단층 형성이 관측되었다(도 14b). 이러한 형성은 겔트렉스 코팅에 독립적인 것으로 보였으며, 이는 RPE가 피브린에 직접적으로 부착할 수 있다는 것을 제시한다(도 14c).
피브린 기저 지지체 RPE 배양물의 이동이 관측되었으며(도 15a), RPE는 기계적 펀칭 후 여전히 부착되어 있었다(도 15b).
피브린 기저 지지체에 부착된 RPE는 기계적 펀칭 후 여전히 생존가능하였다(도 16). 또한, 생존능 및 기재에의 부착은 겔트렉스 코팅물과는 독립적이었다.
펀칭된 피브린 기저 지지된-RPE의 생/사 이미지의 클로즈 업이 수득되었다(도 17). 가장 먼 가장자리는, 아마도 기계적 펀치 동안 지속되는 스트레스 때문일 수 있는, 증가된 세포 생존능 손실을 나타내었다. 이러한 영역에서의 세포 생존능은 83.1%였다.
피브린 기저 지지체의 시간 경과 분해가 수득되었다(도 18). 60시간 후, 겔의 가장자리가 분해되었으며, 단층이 자체적으로 감기는 것을 보였다. 96시간 후, 50% 초과의 겔이 분해되었으며, 남은 RPE 단층은 자체적으로 감기고 접혔다. 겔은 120시간 후 완전 분해되었다. 이러한 결과는 RPE의 편평하고 주름이 없는 표현형을 유지하기 위해 피브린으로부터의 기계적 지지의 필요성을 입증하였다.
겔이 완전 분해된 영역에서의 RPE 단층의 생/사 이미지의 클로즈 업이 수득되었다(도 19). 초점 영역으로부터 접힘이 보였다. 전반적으로, 세포 생존능이 높게 유지되었고, 분해 전 세포의 생존능과 유사하였다.
RPE/피브린 이식물을 전달하기 위한 수술 도구의 사용이 도시되었다(도 29). 도구는 장치의 안과 바깥으로 이식물을 유동시키기 위해 정수압을 사용하였다.
이들 결과는 40-60 mg/mL의 피브리노겐 농도를 사용하여 적합한 강성이 달성될 수 있으며 겔 두께가 약 50 μm 내지 약 300 μm(예컨대, 약 100 μm 내지 약 200 μm 또는 약 50 μm 내지 약 200 μm)일 수 있음을 입증하여 보여준다. 이들 결과는 또한 세포-세포 연접이 콜라게나제 및 플라스미노겐 처리 후 온전할 수 있다는 것을 입증하여 보여준다.
본원에서 제공되는 결과는 피브린 기재의 분해 속도론이 피브리노겐, 플라스미노겐 및 tPA 농도를 조절함으로써 약 1.5시간 내지 약 20시간으로 변화할 수 있음을 입증하여 보여준다.
실시예 2 - 피브린 부착 및 세포 생존능에 대한 아프로티닌의 효과
피브린 겔 부착 및 유지에 대한 아프로티닌의 효과 및 세포 생존능에 대한 아프로티닌의 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. iPSC-RPE 세포를 50 U/mL의 아프로티닌을 포함하는 배지 중에서 겔트렉스 코팅물의 존재(도 14a) 및 부재(도 14b) 하에 피브린 겔 상에서 2주 동안 배양하였다. 배지 중에 아프로티닌을 포함시키는 것은 피브린 겔 분해를 방지하는 것으로 나타났다. 또한, 이들 연구는 세포의 피브린 겔에의 부착이 겔트렉스의 존재와 무관하게 발생할 수 있음을 나타내었다. 세포는 겔이 플레이트로부터 방출된 후 여전히 부착되어 있었으며(도 15a), 겔 절단 후 최소의 세포 제거가 있었다(도 15b).
2주 동안 아프로티닌을 사용한 배양에 이어 분리 및 겔 절단 후 피브린 겔 내 iPSC-RPE 세포의 생존능을 평가하기 위해서, 세포를 칼세인-AM(생) 및 이티듐 호모다이머(사)로 염색하였다. 세포는 겔트렉스의 존재(도 16a) 또는 부재(도 16b) 하에서 분리 및 절단 후 생존가능성이 유지되었다. 아프로티닌의 존재 및 겔트렉스의 존재 또는 부재 하의 배양된 겔 가장자리에서의 세포를, 플레이트로부터 분리 및 절단 후, 면밀히 조사한 결과, 비록 겔 주변에 일부 죽은 세포가 보였지만, 대부분의 세포는 생존한 것으로 나타났다(도 17).
배양된 세포에 대한 겔 분해의 효과를 평가하기 위해서, iPSC-RPE 세포를 포함하는 피브린 겔을 0.1 U/mL의 플라스미노겐 및 22 U/mL의 tPA에 의한 소화로 분해하였다. 60시간(도 18a) 및 96시간(도 18b)에 이미지를 취했으며, 세포는 플레이트로부터 단층으로서 분리되는 것으로 나타났다. 96시간의 겔 분해 후 생존능을 평가하기 위해 단층의 세포를 칼세인-AM(생) 및 이티듐 호모다이머(사)로 염색하였으며, 대부분의 세포가 살아있는 상태로 유지되었다는 점을 보여준다(도 19).
실시예 3 - 정단 피브린을 갖는 망막 색소 상피 단층에 대한 프로토콜
1) 2.5 mg/mL의 콜라겐을 셀룰로스 에스테르 막 필터 삽입물상에서 겔화한다.
a. 1.0-5.0 mg/mL 콜라겐.
b. 셀룰로스 에스테르, 폴리카르보네이트, PTFE, TCPS 막 필터.
2) 콜라겐 표면을 1:5 희석의 마트리겔로 코팅한다.
a. 범위: 1:1-1:50 희석.
b. 마트리겔, 겔트렉스 또는 정제된 라미닌.
3) 세포를 0.5 x 106개 세포/cm2로 플레이팅한다.
a. 0.1-2.0 x 106 세포/cm2.
4) 약 2주 동안 배양한다.
a. 1-6주.
5) 세포를 PBS로 세척한다.
6) 세포 표면을 건조시킨다.
7) 50 mg/mL 피브리노겐, 2 U/mL 플라스미노겐 및 100 U/mL 트롬빈의 혼합물 80 μL를 10 cm의 높이에서 1초 동안 80 uL/sec의 총 유량으로 0.8 bar 하에 분무한다.
a. 30-200 μL의 혼합물 분무.
b. 30-70 mg/mL 피브리노겐.
c. 0.1-4.0 U/mL 플라스미노겐.
d. 10-600 U/mL 트롬빈.
e. 30-400 μL/sec 유량.
f. 0.6-1.2 bar.
g. 5-15 cm 높이.
8) 피브리노겐을 1시간 동안 37 ℃에서 겔화한다.
a. 30분-2시간 겔화.
9) PBS로 재수화한다.
10) 삽입물을 750 U/mL의 콜라게나제에 배치하여 단층을 분리한다.
a. 400-1500 U/mL 콜라게나제.
11) PBS로 가볍게 세척.
12) 피브린-RPE 이식물을 편평한 표면에 옮기고 다수의 이식물로 펀칭한다.
13) 이식물을 수술 장치에 로딩한다.
14) 수술을 위한 눈을 준비한다.
15) 망막하 공간으로 이식물을 플런징한다.
16) 레이저 태킹한다.
17) 망막하 공간 내에 다수의 이식물을 타일링한다.
18) 눈을 감는다.
19) 24시간 후, 4,000 U/mL 조직 플라스미노겐 활성화제 100 μL를 유리체내 주입한다.
a. 수술 후 3-72시간.
b. 50-200 μL 주입.
c. 100-35,000 U/mL.
이 프로토콜은 정단 피브린 히드로겔에 의해 지지된 RPE 단층을 생성한다.
실시예 4 - 기저 피브린 지지체를 갖는 망막 색소 상피 단층에 대한 프로토콜
1) 30 mg/mL의 피브리노겐 및 100 U/mL의 트롬빈의 혼합 용액을 겔로 플레이팅한다.
a. 20-80 mg/mL 피브리노겐.
b. 10-600 U/mL 트롬빈.
c. 일정한 퍼짐을 보장하기 위해 플레이트를 회전.
d. 몰드를 사용하여 겔을 원하는 두께로 압축.
e. 두께: 50 μm 내지 1 mm.
f. 혼합물을 TCPS, 폴리카르보네이트, 셀룰로스 에스테르로 플레이팅.
g. 대안으로, 편평한 피브린 겔 시트를 몰드를 사용하여 예비-성형하고 세포 배양 삽입물에 올림.
h. 혼합물을 표면에 분무.
2) 겔 표면을 1:5 희석의 마트리겔로 코팅한다.
a. 범위: 1:1-1:50 희석.
b. 마트리겔, 겔트렉스, 라미닌 521, 라미닌 511.
c. 코팅 단계가 필수적이지 않음.
3) 세포를 0.5 x 106개 세포/cm2로 플레이팅한다.
a. 0.1-2.0 x 106 세포/cm2.
4) 2주 동안 50U/mL의 아프로티닌을 갖는 배지를 사용하여 배양한다.
a. 범위: 20-150 U/mL
b. 1-10주.
5) 지지체로부터 피브린을 벗겨 피브린-RPE를 유동한다.
6) 옵션: 플라스미노겐을 기저 피브린 겔에 로딩한다.
a. 피브린-RPE를 플라스미노겐 용액에서 인큐베이션.
i. 0.001-40 U/mL(예컨대, 1-40 U/mL) 플라스미노겐.
ii. 2-6시간.
7) 옵션: 추가의 지지체를 위한 정단 겔.
a. 50 mg/mL 피브리노겐, 2 U/mL 플라스미노겐 및 100 U/mL 트롬빈의 혼합물 80 μL를 10 cm의 높이에서 1초 동안 80 uL/sec의 총 유량으로 0.8 bar 하에 분무한다.
i. 30-200 μL의 혼합물을 분무.
ii. 30-70 mg/mL 피브리노겐.
iii. 0.1-4.0 U/mL 플라스미노겐.
iv. 10-600 U/mL 트롬빈.
v. 30-400 μL/sec 유량.
vi. 0.6-1.2 bar.
vii. 5-15 cm 높이.
b. 피브리노겐을 1시간 동안 37 ℃에서 겔화.
i. 30분-2시간 겔화.
8) 피브린-RPE 이식물을 편평한 표면에 옮기고 다수의 이식물로 펀칭한다.
9) 이식물을 수술 장치에 로딩한다.
10) 수술을 위한 눈을 준비한다.
11) 망막하 공간으로 이식물을 플런징한다.
12) 레이저 태킹한다.
13) 망막하 공간 내에 다수의 이식물을 타일링한다.
14) 눈을 감는다.
15) 24시간 후, 4,000 U/mL 조직 플라스미노겐 활성화제 100 μL를 유리체내 주입한다.
a. 수술 후 3-72시간.
b. 50-200 μL 주입.
c. 100-35,000 U/mL.
이 프로토콜은 기저 피브린 지지체를 갖는 RPE 단층을 생성한다.
실시예 5 - 눈 치료 프로토콜
진료소는 환자 피부 생검을 얻어 하기 문헌에 기술되는 바와 같이 iPSC-RPE 세포를 생성하기 위해 GMP 시설로 보낸다(Sonoda et al., Nat. Protoc., 4:662-673 (2009); Johnson et al., Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015); Brandl et al., NeuroMolecular Med., 16:551-564 (2014); Idelson et al., Cell Stem Cell., 5:396-408 (2009); 및 Carr et al., Mol. Vis., 15:283-295 (2009)). 3개월 이하 동안 세포 배양 삽입물을 사용하여 iPSC-RPE를 피브린 히드로겔 상에서 배양한다. RPE/피브린 겔을 환자의 요구에 대한 명세사항에 따라 절단한다. 절단된 이식물을 이식 장치의 팁 부품에 로딩하고, 플라스미노겐의 존재 또는 부재 하에 배양 배지에서 저장하고, 진료소로 보낸다.
RPE/피브린 겔로 예비-로딩된 클립 부품을 이식 장치에 삽입한다. 환자는 수술을 위해 준비한다. 표준 3 포트 유리체절제술을 수행한 후, 미세 캐뉼라를 사용하여 블렙(bleb)을 형성하고, 이어서 망막 가위를 사용하여 망막절개술을 수행한다. 공막(또는 분리를 갖는 망막)을 절개한다(예컨대, 3 mm 또는 1.5 mm 절개). 이식 장치의 팁을 망막절개술 하에 눈의 제 위치에 삽입하고 이식물을 배치한다. 레이저를 사용하여 이식물을 제 위치에 태킹한다. 치료될 면적을 커버하도록 추가의 이식물로 이를 반복한다. 실리콘 오일 또는 퍼플루오로카본 액체 탐폰삽입법을 이용하여 망막 분리물을 닫는다. 공막 절개물을 봉합하여 닫는다. tPA를 유리체내로 주입한다. 환자를 회복 및 치유시킨다. 일단 치유되면, 치료를 확인하기 위해 시각 시험을 수행한다.
실시예 6 - RPE 단층의 이식을 위한 이종물-무함유의 신속 분해가능한 지지체로서의 피브린 히드로겔
RPE 이식을 위한 기재로서의 피브린의 적합성을 확인하기 위해 하기를 수행하였다. 시간 척도로 분해에 대해 소정의 파라미터를 갖는 얇고 단단한 히드로겔을 형성하기 위해 피브리노겐 및 트롬빈의 농도를 변화시킴으로써 다양한 피브린 히드로겔을 생성하였다. 이어서, 최적화된 조건을 활용하여 iPSC-RPE가 배양되어 잘-분화된 단층을 형성하는 피브린 겔을 생성하였다. 마지막으로, 피브린 지지체를 시험관내에서 분해시키고, RPE 단층에 대한 이러한 분해의 효과를 평가하였다. 여기서 제공된 결과는, 피브린 히드로겔이 줄기 세포로부터의 RPE의 분화를 위한 장기-생존 기재로서 사용될 수 있고, 이어서 망막하 공간에 전달된 후 조절된 환경 하에서 신속히 분해될 수 있다는 것을 입증한다.
화학물질
피브리노겐 및 트롬빈을 에티콘(Somerville, NJ)(아비셀, 60 mg/mL의 피브리노겐), 박스터(Deerfield, IL)(티씰, 95 mg/mL의 피브리노겐) 및 시그마-알드리히(St Louis, MO)(57 mg/mL의 피브리노겐)로부터 입수하였다. 플라스미노겐 및 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 시그마-알드리히로부터 구입하였다.
박층 피브린 겔의 형성
피브리노겐 농도 및 트롬빈 농도를 변화시켜 피브린 겔을 형성하였다. 초기 연구들은 트롬빈 농도에 대해 최소 변화를 나타내었으며, 모든 실험은 최종 농도 100 U/mL의 트롬빈을 활용하였다. 무세포 실험을 위해, 2개의 폴리카르보네이트 플레이트 및 0-200 μm 범위의 소정의 두께 스페이서를 갖는 2층의 파라필름으로 이루어진 맞춤형 두께 몰드를 사용하여 박층 겔을 형성하였다. 피브리노겐 및 트롬빈 용액의 혼합물을 혼합 직후 2개의 층 사이에 샌드위치화하였으며, 용액을 1-2시간 동안 가습 인큐베이터에서 37℃에서 겔화하였다. 상단 플레이트 및 파라필름을 제거한 후, 겔을 수화하고, PBS에서 세척하였다. 맞춤형 기계적 펀치를 사용하여 1.5 mm x 5 mm의 직사각형 모양의 유사한 크기의 겔을 절단하였다. 겔을 다루기 위해 겸자를 조심스럽게 사용하였다.
겔 두께 측정
두께를 측정하기 위해 OCT를 사용하여 펀칭된 겔을 이미지화하였다. AIM 테이블을 사용하여 Envisu R4110(Leica; Wetzlar, Germany)을 설치하였으며 카메라 및 부착된 텔레센트릭(telecentric) 렌즈를 겔 위에서 아래로 향하게 하였다. 이미지화하기 전에, 겔을 투명한 60 mm 페트리 디쉬 내의 PBS에 배치하였다. A 및 B 스캔을 겔에서 취하고, 겔당 두께를 4개의 임의의 위치에서 평균하였다.
전자 현미경
히타치 S-4700(Hitachi High Technologies; Schaumburg, IL) 및 히타치 SEM 소프트웨어(V3.6)를 사용하여 피브린 히드로겔에 대해 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 수득하였다. 겔을 2가 양이온을 갖는 pH 7의 0.1 M 포스페이트 버퍼 중의 2.5% 파라포름알데히드 및 1% 글루타르알데히드로 밤새 고정하였다. 이어서, 겔을 이산화탄소를 사용하여 임계점 건조시키고, 알루미늄 스터브에 올려 놓고, 금-팔라듐을 사용하여 60초 동안 스퍼터 코팅하였다.
역학
문헌(Uehara et al., J. Bone Joint Surg. Am., 97:1792-1798 (2015))에 기술된 셋업을 사용하는 팽창(bulge) 시험을 이용하여 겔 생체역학을 수득하였다. 다양한 피브리노겐 농도 및 두께로 제조된 겔을 측정하였다. 간단히, 겔은 그립을 증가시키기 위해 사포질된 2 mm의 내경을 갖는 링 겸자(WPI; Sarasota, FL)에 올려 놓았다. 겸자를 XY 스테이지(Klinger; Irvine, CA)에 올려 압자를 겔과 함께 정렬하였다(도 34a). 1.3 mm 외경을 갖는 맞춤형 편평-원통형 알루미늄 압자를 사용하여 시험을 수행하였다. 시험을 맞춤형 z-스테이지 드라이버 상에서 수행하였다. 10 g 소형 로드 셀(Honeywell; Morris Plains, NJ)을 사용하여 힘을 측정하고, LabVIEW V12.0(National Instruments; Austin, TX)를 사용하여 자료를 수집하였다. 정적 변형 시험을 파단될 때까지 1 mm/sec에서 수행하였다. 선형 영역이 기계적 스트레스 값을 제공하도록 힘 및 변위 곡선을 그래프화하고 피팅하였다(도 34b). 또한, 최대 로드를 곡선의 피크로서 수득하였다.
분해 속도론
피브리노겐, 플라스미노겐 또는 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)의 농도를 변화시키면서 겔 분해 속도론을 측정하였다. 트롬빈 농도는 강성 또는 분해 속도론에 영향을 끼치는 것으로 보이지 않았으며, 10 U/mL로 일정하게 유지하였다. 맞춤형 펀치를 사용하여 동일한 크기의 겔(1.5 mm x 5.0 mm 직사각형)을 생성하였다. 펀칭된 겔을 다양한 농도의 플라스미노겐(0.01-1 U/mL) 및 tPA 용액(0.1-1,000 U/mL)에서 인큐베이션하였다. 각각의 변수(피브리노겐, 플라스미노겐 및 tPA 농도)의 효과를 설명하기 위해, 하나는 변화시키고 다른 2개는 일정하게 유지하였다.
시간 경과에 따라 현탁 용액의 샘플을 취하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 피어스(Pierce) 660 nm 단백질 어세이(Life Technologies; Carlsbad, CA)를 이용하여 피브린 분해 산물(FDP)을 정량화하였다. 공지된 FDP 농도의 표준 곡선을 사용하여 흡광도 값으로부터 농도를 수득하였다. 농도 대 시간의 그래프를 활용함으로써 1차 속도론을 가정하는 지수적 피트 모델을 사용하여 속도 상수를 수득하였다.
세포
21살의 백인 여성 기증자로부터 유래하는 iPSC 라인 006-BIOTR-001를 사용하였다(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015)). iPSC-RPE 세포는 문헌(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))에 기술된 분화 과정을 이용하여 라겐 라보라토리즈(LAgen Laboratories)(Rochester, MN)에 의해 이 라인으로부터 생성하였다.
배양 표면(60 mm, 6 웰 플레이트, 12 웰 플레이트 또는 12 웰 트랜스웰)의 바닥에서 피브리노겐(최종: 30 mg/mL) 및 트롬빈(최종: 10 U/mL) 용액을 혼합함으로써 피브린 겔을 제조하고, 맞춤형 테플론 웨이트(custom Teflon weight)를 사용하여 겔 표면을 평탄하고 매끄럽게 하였다. 이어서, 겔을 5% CO2, 37 ℃의 가습 인큐베이터에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이팅하기 전에 겔을 PBS로 세척하였다.
RPE를 문헌(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))에 기술된 바와 같이 계대하였다. 현탁된 세포를 0.4-0.5 x106개 세포/mL의 밀도로 피브린 또는 마트리겔 코팅된 표면 상에 플레이팅하였다. RPE 분화 배지(RPEM(LAgen Laboratories), 2% (v/v) B27 및 1% (v/v) 항진균제/항생제(Life Technologies)를 가짐)을 피브린 겔을 보존하기 위해 다양한 농도의 아프로티닌으로 보충하였다. 배지를 2일마다 교환하였다. RPE를 사용하기 6-10주 동안 겔 상에서 배양하였다. 적절한 경우, 마트리겔 코팅된 조직 배양 폴리스티렌 상에서 배양된 RPE를 양성 대조군으로 사용하였다.
RPE 면역형광
iPSC-RPE의 단백질 발현을 가시화하기 위해 면역형광을 이용하였다. 샘플을 -20 ℃에서 10분 동안 100% 얼음-냉각된 메탄올로 고정하였다. 1:1000 희석의 1차 항체: 폴리클로날 래빗-항 Best1(pAB125); 폴리클로날 래빗-항 에즈린(Cell Signaling; Danvers, MA); 및 폴리클로날 래빗-항 ZO1(Life Technologies)를 사용하여 문헌(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015))에 기술된 바와 같이 염색을 수행하였다. 샘플을 플루오로마운트(Fluoromount)를 사용하여 유리 슬라이드에 올려 놓고 니콘 E600 형광 현미경(Nikon; Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지화하였다.
생/사 어세이
생/사 생존능/세포독성 키트(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit)(Life Technologies)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 생/사 어세이를 수행하였다. 살아있는 세포를 FITC 필터(흡광도: 495 nm/ 방출: 520 nm)를 사용하여 가시화하고, 죽은 세포를 TRITC 필터(흡광도: 543 nm/ 방출: 560 nm)를 사용하여 가시화하였다. 피브린 상에서 배양된 RPE 단층을 분해 전후에 사용하였다. 1 U/mL의 플라스미노겐을 100 U/mL의 tPA와 함께 사용하여 분해를 달성하였다. 세포 생존능을 살아있는 염색된 세포를 가시화된 총 세포로 나눈 백분율로서 계산하였다. 실험군에 대한 결과를 대조군에 대해 정규화하였다.
PCR
피브린 상에서 배양된 RPE를 1X DPBS로 긁어내고, 5분 동안 5,000g로 4 ℃에서 원심분리하였다. 세포를 트리졸(Trizol)에서 용해시키고, 총 RNA 분리 키트(Zymo; Irvine, CA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 RNase-비함유 DNAse I(Roche Bio; Basel, Switzerland)으로 처리하였다. 슈퍼스크립트(Superscript) III 역전사효소(Life Technologies)를 사용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 총 RNA를 올리고 dT(Life Technologies)로 프라이밍하였다. 프라이머-BLAST 소프트 웨어(Ye et al., BMC Bioinformatics, 13:134 (2012))를 사용하여 프라이머를 디자인하였다. 센다이 바이럴 프라이머(Sendai Viral Primer) 서열은 CytoTuneTM-iPS 2.0 센다이 리프로그래밍 키트로부터의 것이었다. 프라이머는 IDT(Coralville, IA)로부터 탈염되도록 주문되었다. 10-100 ng의 투입(input) cDNA 및 파워업 Sybr 그린 매스터 믹스(PowerUp Sybr Green Master Mix)((Applied Biosystems; Foster City, CA)를 사용하는 PCR의 40회 사이클을 어플라이드 바이오시스템스 퀀트스튜디오(Applied Biosystems QuantStudio) 5 qPCR 기기 상에서 수행하였다. PCR 반응은 프라이머 세트의 어닐링 온도에 따라 뱃칭하였다(batched). 유전자는 CT가 37 사이클 미만인 경우 존재하는 것으로 간주하였다.
ELISA
ELISA 어세이 키트(RND Systems; Minneapolis, MN)를 활용하여 제조자의 프로토콜에 따라 48시간 후 수집된 배지로부터 예비-코팅된 플레이트로 VEGF 및 PEDF 분비를 정량화하였다. 총 단백질을 표준 곡선을 사용하여 측정하였다.
웨스턴 블롯
1% Triton-X, 20 mM Tris, 150 mM NaCl 및 5 mM EDTA를 갖는 pH 8.0의 TPI 버퍼 중의 피브린으로부터 RPE를 긁어내었다. 세포를 1시간 동안 4℃에서 용해하였다. 샘플을 희석하고, 모세관 전기영동-기반 웨스턴 블롯 기기(Protein Simple Wes; San Jose, CA) 상에서 제조자의 솔루션 키트 및 프로토콜에 따라 재용해하였다. 1차 항체는 RPE65(401.8B11.3D9), Bestrophin 1(pAB125), CRALBP(B2) 및 β-액틴(AC-15)을 포함하였다.
통계학
JMP 10(SAS; Cary, NC)를 사용하여 자료를 분석하였다. 피브린 기계적 시험 및 분해 연구에 대해, 1-원 ANOVA 시험을 이용하였다. 아프로티닌 독성 연구에 대해, 2-웨이 ANOVA 시험을 이용하였다. ANOVA 분석 후, 터키(Tukey) HSD 시험을 이용하여 군 간의 유의수준을 시험하였다. 모든 세포 정량 자료에 대해, 개별 군을 비교하기 위해 스튜던트 t-시험을 이용하였다. 통계학적 유의수준은 p<0.05에 대해 고려되었다.
결과
겔 형성 기계적 특성
RPE 이식을 위해 본원에서 제공되는 물질은 수술 기구로 조작되는 동안 평탄도를 유지하기에 충분한 강도를 갖는 얇은 층상 시트이도록 디자인될 수 있다. 피브리노겐 및 트롬빈 농도를 변화시키면서 동일한 두께의 겔을 생성하기 위해 맞춤형 몰드(50 mm x 50 mm 사각형, 400 μm의 두께)를 사용하였다. 트롬빈 농도는 문헌(Rowe et al., Acta Biomater., 3:59-67 (2007))에 기술되어 있는 바와 같이 1 U*mL-1*mg-2 보다 피브리노겐 농도에서 제조된 피브린 히드로겔의 기계적 특성에 영향을 끼치지 않았다. 하기 작업은 고정된 트롬빈 농도(100 U/mL)로 수행되었다.
피브린은 불투명하고 매끄럽고 얇고 강성인 겔을 생성하였다(도 35a). 피브린 겔은 수화 후 어떠한 팽창도 보이지 않았다. 겔의 가장자리는 잘 경계를 지었다. OCT 이미지화는, 이러한 방법으로 형성된 겔이 몰드의 크기에 근거하여 예상되는 범위인 200 ± 30 μm의 평균 두께를 갖는다는 것을 입증하여 보여주었다(도 35b). 피브린 겔의 SEM 이미지는 피브린에 대해 문헌(Filov et al., J. Biomed. Mater. Res. A., 90A:55-69 (2009))에 대해 기술된 것과 섬유성 미세구조와 함께(도 35d) 매끄러운 표면을 나타내었다(도 35c).
맞춤형 몰드에 형성된 피브린의 대형 시트로부터 유사한 크기의 히드로겔을 생성하기 위해 1.5 mm x 5 mm 치수를 갖는 맞춤형 직사각형 모양의 펀치를 사용하였다. 이식을 수행하기 위한 작은 절개를 유지하면서 황반(5 mm 직경)의 표면적을 커버하기 위해 1.5 mm x 5 mm 치수를 선택하였다. 이러한 크기를 사용함으로써, 3 mm 미만을 절개하면서 황반의 표면적의 90% 초과를 커버하도록 3개의 이식물을 정렬할 수 있다. 이러한 기하구조로 펀칭된 피브린 겔은 피브리노겐 농도가 증가함에 따라 더욱 단단해지는 것으로 나타났다. 다양한 피브리노겐 농도의 겔을 겸자로 PBS로부터 들어올려서 이의 모양을 유지하고 이의 수화 중량을 지지하는 능력을 정성적으로 관측하였다(도 35e). 10 mg/mL 농도의 겔은 PBS로부터 꺼낼 때 즉시 감김을 나타내었고 자체적으로 접혔다. 20 및 30 mg/mL의 피브리노겐 농도로 제조된 겔은 감소된 감김을 나타내었고, 40 mg/mL 이상에서는 감김을 나타내지 않았다. 모든 겔은 PBS에 다시 놓은 후 편평한 모양으로 돌아가기에 충분한 가소성을 나타내었다. 40 mg/mL 이상의 피브리노겐 농도에서 제조된 겔은 유연하고 내구성이 있으며 다양한 수술 기구에 대한 조작이 용이한 것으로 나타났다. 매우 높은 농도의 피브리노겐 용액으로부터 겔을 수득하는 것은 용액의 높은 점도 때문에 어려울 수 있으며, 시험된 가장 높은 농도는 80 mg/mL이었다. 그러나, 40 mg/mL 및 80 mg/mL로 제조된 겔 사이에는 강성에 대한 관측가능한 차이는 없었다.
정량적으로, 기계적 강도는 300 μm의 고정된 두께에서 피브리노겐 농도가 증가함에 따라 증가하였다(도 34c). 20, 40, 60 및 80 mg/mL의 피브리노겐으로 제조된 겔에 대해, 기계적 강도는 각각 0.016 ± 0.012 N/mm, 0.039 ± 0.011 N/mm, 0.035 ± 0.013 N/mm 및 0.045 ± 0.012 N/mm(n=5, p=0.003)였다. 군들 내에서, 20 mg/mL 농도 군은 40 mg/mL(p=0.027) 및 80 mg/mL(p=0.006)과 통계학적으로 상이하였다. 또한, 최대 항복력(yield force)은 피브리노겐 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 20, 40, 60 및 80 mg/mL의 피브리노겐에 대한 최대 힘 값은 각각 0.036 ± 0.038 N, 0.081 ± 0.039 N, 0.086 ± 0.035 N 및 0.111 ± 0.033 N(n=5, p=0.030)이었다. 군들 내에서, 단지 20 mg/mL 농도 군만이 80 mg/mL(p=0.023)과 통계적으로 상이하였다.
다양한 두께의 스페이서를 갖는 맞춤형 몰드에서 겔을 캐스팅한 후, 피브린 겔을 펀칭하고 실제 두께를 정량화하기 위해 OCT로 이미지화하고, 기계적 시험을 위해 올려놓았다. 보다 얇은 겔의 적절한 취급을 보장하기 위해, 두께를 변화시키면서 피브리노겐 농도를 60 mg/mL로 고정하였다. OCT 사용으로, 100 μm 군은 91 ± 13 μm의 실제 두께를 갖고, 200 μm 군은 198 ± 10 μm의 실제 두께를 가지며, 300 μm 군은 298 ± 9 μm(n=5)의 실제 두께를 가졌다. 두께를 변화시키는 것은 기계적 강도 및 최대 힘 모두에 대해 직접적인 지수적 관계를 나타내었다(도 34d). 100 μm의 두께는 0.004 ± 0.003 N/mm의 기계적 강도 및 0.004 ± 0.003 N의 최대 힘을 나타내었고, 200 μm의 두께는 0.020 ± 0.013 N/mm의 기계적 강도 및 0.032 ± 0.028 N의 최대 힘을 나타내었다. 300 μm의 두께는 0.043 ± 0.019 N/mm의 기계적 강도 및 0.094 ± 0.031 N의 최대 힘을 가졌다. 두께는 기계적 강도에 대해 유의한 효과가 있었으며(n=3, p=0.034), 100 μm 군은 300 μm 군과 통계학적으로 상이하였다(p=0.029). 마찬가지로, 두께는 최대 힘에 대해 유의한 효과를 가졌으며(n=3, p=0.010), 300 μm 군은 100 μm(p=0.009) 및 200 μm(p=0.045) 군 모두와 유의하게 상이하였다. 정성적으로, 100 μm 겔은 쉽게 찢어졌으므로 200 μm 및 300 μm 겔 모두와 비교하여 수술 기구로 조작하기에 어려웠다. 200 μm의 두께는 수술 조작을 위해 충분한 기계적 강도를 갖는 가장 얇은 겔인 것으로 나타났다.
피브린 히드로겔의 분해 속도론
피브린 겔은 실온에서 PBS 중에 멸균 저장하는 경우 그 자체로는 주목할만한 분해를 수행하지 않았다. 현재까지, 피브린 겔은 9개월 초과 동안 실온에서 저장되었다. PBS 중의 피브린 겔은 tPA에 노출되는 경우 주목할 만한 분해를 수행하지 않았다(도 36a). 그러나, 플라스미노겐과 tPA의 조합물을 가하는 경우, 피브린 겔은 빠르게 분해하기 시작하였다. 분해는 일부 겔이 더 작은 단편으로 부서지면서 겔이 전반적으로 얇아지는 것으로서 진행되었다. 분해는 어떠한 잔류물도 남아 있지 않을 때 완료된 것으로 간주되었다.
분해 속도론 연구를 위해, 기계적 연구에 사용된 것과 동일한 치수를 갖는 200 μm 두께의 피브린 히드로겔((1.5 mm x 5 mm, 직사각형)을 사용하였다. 3개의 상이한 성분 농도(피브리노겐, 플라스미노겐 및 tPA)의 효과는 다른 2개를 고정하면서 연구하였다(도 36b). 일정한 플라스미노겐(0.1 U/mL) 및 tPA 농도(100 U/mL)에서, 다양한 피브리노겐 농도를 사용하여 생성된 겔의 분해에 대한 속도론의 속도 상수는 40 mg/mL에 대해 0.023 ± 0.002 min-1, 50 mg/mL에 대해 0.025 ± 0.001 min-1 및 55 mg/mL에 대해 0.025 ± 0.005 min-1이었다. 속도 상수에 대한 피브리노겐 농도의 효과는 없었으며(n=3, p=0.55), 이는 0차 속도론을 제시한다. 사실, 분해시간은 피브리노겐 농도에 대해 선형적으로 연관되었다: 40 mg/mL에 대해 100 ± 10분, 50 mg/mL에 대해 113 ± 13분 및 40 mg/mL에 대해 120 ± 10분. 40 mg/mL 보다 높은 겔의 기계적 강성에서 어떠한 차이도 검출되지 않았으므로, 40 mg/mL 농도가 빠르게 분해할 수 있는 단단한 겔을 위한 최적의 조건인 것으로 결정되었다.
고정된 피브리노겐(40 mg/mL) 및 tPA 농도(100 U/mL)에서, 플라스미노겐 농도 변화는 분해 속도 상수 및 총 분해 시간에 효과를 가졌다. 다양한 플라스미노겐 농도에서 분해 속도는 1 U/mL에서 0.363 ± 0.048 min-1, 0.5 U/mL에서 0.116 ± 0.008 min-1, 0.1 U/mL에서 0.025 ± 0.002 min-1, 0.05 U/mL에서 0.0083 ± 0.0055 min-1 및 0.01 U/mL에서 0.0048 ± 0.0013 min-1 이었다(n=3, p<0.001). 군 내에서, 1 U/mL 군(P<0.001) 및 0.5 U/mL 군(p<0.003)은 모든 다른 군과 상이하였다. 다양한 플라스미노겐 농도에서 총 분해 시간은 1 U/mL에서 7 ± 1분, 0.5 U/mL에서 24 ± 3분, 0.1 U/mL에서 34 ± 3분, 0.05 U/mL에서 81 ± 16분 및 0.01 U/mL에서 177 ± 32분이었다(n=3, p<0.001). 군들 내에서, 0.01 U/mL 군(p<0.001) 및 0.05 U/mL 군(p=0.03)은 모든 다른 군과 통계학적으로 상이하였다.
고정된 피브리노겐(40 mg/mL) 및 플라스미노겐 농도(0.1 U/mL)에서, 분해 속도 상수는 tPA 농도 농도에 대해 100 U/mL에서 정체기에 도달할 때까지 증가하였다. 다양한 tPA 농도에서 분해 속도 상수 값은 1 U/mL에서 0.011 ± 0.003 min-1, 10 U/mL에서 0.021 ± 0.003 min-1, 100 U/mL에서 0.039 ± 0.002 min-1 및 1,000 U/mL에서 0.042 ± 0.005 min-1이었다(n=3, p<0.001). 군들 내에서, 1 U/mL(p=0.036) 및 10 U/mL(p=0.036) 군은 모든 다른 군과 유의하게 상이하였다. 총 분해 시간도 마찬가지로 100 U/ml의 tPA 농도에서 정체기에 도달한다. 다양한 tPA 농도에서 총 분해 시간은 1 U/mL에서 170 ± 17분, 10 U/mL에서 113 ± 12분, 100 U/mL에서 65 ± 9분 및 1,000 U/mL에서 57 ± 6분이었다(n=3, p<0.001). 군들 내에서, 1 U/mL(p<0.001) 및 10 U/mL(p=0.004)은 모든 다른 군과 통계학적으로 상이하였다.
피브린 상에서의 RPE 배양은 아프로티닌을 필요로 한다.
RPE 배양을 위해, 메니스커스(meniscus)를 편평하게 하도록 맞춤형 테플론 웨이트를 사용하면서 다양한 세포 배양 포맷에 맞도록 피브린 겔을 형성하였다. 40 mg/mL의 피브리노겐 농도로 형성된 피브린 겔을 사용하여 모든 세포 배양을 수행하였다. 피브린 상에서 초기에 배양된 RPE는 처음 48시간 내에 기재를 분해하였다(도 37a). 이를 해결하기 위해, 프로테아제 억제제인 아프로티닌을 사용하였다. 아프로티닌은 인간에서 사용되도록 FDA 승인되었다.
유용할 수 있는 아프로티닌 농도의 범위를 측정하기 위해, 아프로티닌이 iPSC-RPE에 대해 임의의 독성을 나타내는지의 여부를 측정하였다. 이를 달성하기 위해, 생/사 어세이를 96-웰 플레이트에서 iPSC-RPE에 대해 이용하였다. 세포에 2일 간격으로 250 U/mL 내지 8,000 U/mL 농도 범위의 아프로티닌으로 보충된 배지를 공급하였다(도 37b). 살아있는 세포의 백분율을 0 U/mL의 대조군에서 존재하는 살아있는 세포의 백분율에 대해 정규화하였다. 시험된 모든 아프로티닌 농도에 대한 생존능은 대조군과 다르지 않았다(도 37b). 투-웨이 ANOVA를 이용시, 8주 실험 과정에 걸쳐 시험된 임의의 농도의 아프로티닌에서 어떠한 유의한 생존능 감소 효과도 관측되지 않았다(n=3, p>0.999).
피브린 지지체를 유지하는데 필요한 아프로티닌의 최적량을 측정하기 위해서, 아프로티닌을 0.5 U/mL 내지 50 U/mL의 다양한 농도로 RPE 배양 배지에 첨가하고, RPE 단층을 지지하는 피브린 히드로겔의 존속을 시간 경과에 따라 정성적으로 모니터링하였다. 1주 후, 8주의 과정에 걸쳐 다양한 군의 현미경사진을 찍었다(도 37c). 0 U/mL에서, 대부분의 겔은 분해되었고, 최소 세포 부착이 2일 내에 관측되었다. 표면에 부착된 세포는 단층을 형성하지 않았다. 0.5 U/mL 군에서, 배양 2일 후 대부분의 겔은 온전하게 잔류하였다. 이 농도에서, iPSC-RPE 세포는 피브린 겔이 남아있는 패치 상에서는 성장하였으나 겔이 분해된 영역에서는 성장하지 않았다(도 37c, 별표). 1-10U/mL를 받은 군에서, 아프로티닌 농도가 증가함에 따라 분해된 겔의 패치가 더 적게 관측되었다.
10 U/mL 내지 50 U/mL의 아프로티닌 농도에 노출된 겔은 온전하게 남아 플레이트의 전체 표면을 커버하였으며, iPSC-RPE의 단층에 의한 적용범위를 나타내었다. 1주 후 정량적으로, 세포 부착을 갖는 표면적의 백분율은 0 U/ml에서 20.0 ± 8.9%, 0.5 U/mL에서 93.6 ± 1.3%, 1 U/mL에서 98.1 ± 0.9%, 5 U/mL에서 99.7 ± 0.5% 및 10 U/mL에서 99.8 ± 0.2%였다(n=3, p<0.001; 도 37d). 군들 내에서, 0 U/mL의 대조군은 모든 다른 군과 유의하게 상이하였다(p<0.001). 전체적으로, 25 U/mL의 아프로티닌의 첨가는 8개월 초과 동안 피브린의 RPE 분해를 방지하였다.
피브린 상의 RPE의 표현형
피브린 상에서 배양된 iPSC-RPE는 착색되며 세포의 자갈형 단층을 형성한다(도 38a). 생/사 어세이에 의해 세포가 살아있음을 확인하였다(도 38b). RPE 표현형의 검증을 20개 주요 RPE 마커의 패널을 사용하여 qPCT에 의해 수행하였다(도 40). PCT의 37번째 사이클 전에 피크가 관측되면 마커가 존재하는 것으로 간주되었다. 마트리겔 코팅된 조직 배양 플라스틱에서 성장된 iPSC-RPE에 대해 관측되었던 것과 유사하게, 모든 RPE 마커(특히, RPE65, CRALBP 및 MITF)가 10주 동안 피브린 겔 상에서 성장된 iPSC-RPE에서 검출되었다. 만능 마커 LIN28A 및 센다이 바이러스 전달된 "야마나카(Yamanaka)" 인자에 대한 마커((KLF, KOS, c-myc))는 모든 군에서 음성이었다.
RPE 마커의 단백지 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 이용하였다(도 38d). RPE65, Best 1 및 CRALBP(α-액틴에 대해 정규화됨)에 대한 밴드가 피브린 겔 상에서 성장된 iPSC-RPE로부터의 용해물에서 관측되었다. 면역형광 염색을 Best 1, 에즈린 및 ZO-1에 대해 수행하였다(도 38e). 마트리겔 코팅된 트랜스웰 상에서 성장된 iPSC-RPE에서 Best1, 에즈린 및 ZO-1에 대해 이전에 보고된 염색이 참조로 사용되었다(Johnson et al., Investig. Ophthalmol. Vis. Sci., 56:4619 (2015)). Best1은 세포의 기저측(basolateral) 표면에 국소화되었다. 미세융모의 마커인 에즈린은 미세융모를 나타내는 세포의 정단 표면 상에 반점으로서 관측되었다. ZO-1은 연접 컴플렉스 및 단일 단층의 존재를 나타내는 모든 세포의 경계를 윤곽짓는 것으로 관측되었다.
VEGF 및 PEDF의 RPE 분비를 ELISA로 정량화하였다(도 38c). REP 배양 48시간 후, 피브린 군으로부터의 배지는 6.46 ± 0.23 ng/mL의 VEGF 농도를 가졌다. PEDF에 대해, 피브린 군은 6.41 ± 1.61 μg/mL의 농도를 가졌으며, 마트리겔 대조군은 6.10 ± 0.53 μg/mL를 가졌다(n=3, p=0.822). 따라서, 피브린 히드로겔 또는 조직 배양 플라스틱 상에서 성장된 RPE 사이에는 어떠한 차이도 나타나지 않았다.
마트리겔 코팅된 피브린 히드로겔 상에서 iPSC-RPE를 배양하는 것과 유사한 결과가 수득되었다. 예컨대, VEGF 및 PEDF의 ELISA 정량화는, 피브린 + 마트리겔 코팅물 상에서 배양된 iPSC-RPE의 방출이 피브린 히드로겔 단독 및 마트리겔 코팅된 TCPS 둘 다에 대한 것과 유사함을 나타내었다(도 42). 면역형광 염색은 피브린 또는 피브린 + 마트리겔 코팅물 상에서 배양된 iPSC-RPE 사이에서 유사한 에즈린 및 ZO-1 패턴을 나타내었다(도 43). 생/사 어세이는 피브린 또는 피브린+마트리겔 상에서 성장된 iPSC-RPE가 유사한 생존능을 나타내었다(도 44). 웨스턴 블롯 분석은 피브린 또는 피브린+마트리겔 상에서 성장된 iPSC-RPE로부터 Best1, RPE65 및 CRALBP의 발현을 나타내었다(도 45).
피브린 분해는 온전한 RPE 단층을 남긴다.
본 연구의 목적은 REP 단층의 성장 및 이식을 위한 빠르게 분해가능한 지지체를 생성하는 것이다. 빠르게 분해가능하고 적합한 크기 및 기계적 강도를 갖는 피브린 히드로겔을 생성하기 위한 파라미터를 확립한 후, iPSC-RPE 단층의 존재 및 아프로티닌에서의 성장이 겔의 분해 속도론을 변화시켰는지의 여부 및 분해가 시험관내에서 iPSC-RPE의 생존능을 변화시켰는지의 여부를 결정하기 위해 하기를 수행하였다. 겔 sans iPSC-RPE를 사용하여 축적된 자료에 근거하여, 0.5 U/mL의 플라스미노겐 및 100 U/mL의 tPA를 사용하여 분해 연구를 수행하였다. 도 39a에 도시된 바와 같이, 피브린이 분해하기 시작함에 따라 RPE 단층은 가장자리부터 자체적으로 감기기 시작하였다(도 39a). 피브린 지지체가 남아 있지 않는 영역에서는 주름이 나타났다. 피브린이 여전히 온전한 영역에서는 RPE가 편평하게 보였다. 일단 완전 분해되면, RPE는 많은 감김과 주름을 갖는 단층 시트로서 남고 수술 기구에 의한 취급이 어려워졌다. 그러나, RPE는 연속적인 착색된 조직으로서 보였다(도 39a).
피브린 지지체가 분해된 후의 RPE의 생존능을 확인하기 위해서, 피브린이 완전 분해된지 24시간 후 생/사 어세이를 수행하였다(도 39b 및 39c). 생존능을 분해 이전에 피브린 상에서 배양된 살아있는 REP의 백분율에 대해 정규화하였다. 분해 이전의 RPE에 대한 정규화된 생존능 값은 100.0 ± 3.9%였으며, 분해 이후는 101.1 ± 10.5%(n=3, p=0.877)였다.
마지막으로, 면역형광을 활용하여 피브린 분해 후 ZO-1 존재를 검출하였다(도 39d). 완전한 피브린 분해 24시간 후, 고정된 RPE 단층은 ZO-1에 대해 양성 염색을 나타내었다. 지지되지 않은 RPE 단층의 염색은 분해되지 않은 피브린 상의 단층의 염색과 구별되지 않았다.
본원에서 제공되는 특정 결과는 iPSC-유도된 RPE를 사용하여 수득되었지만, 본원에서 기술되는 피브린 히드로겔 물질이 ESC 및 성체 줄기 세포와 같은 다른 공급원으로부터 유도되는 RPE에 대해 사용될 수 없는 이유가 없다.
본원에서 제공되는 결과는 피브린이 REP 이식을 위한 물질로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. RPE 전달에 적합한 기계적 강성 및 분해 특성을 갖는 피브린이 다양한 모양 및 크기로 형성될 수 있다. 또한, 본원에서 제공되는 결과는 아프로티닌과 같은 프로테아제 억제제가 피브린을 분해하는 RPE의 능력을 지연시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하여 보여준다. 또한, iPSC-RPE를 아프로티닌과 같은 프로테아제 억제제의 존재 하에서 피브린 상에서 배양하는 경우, 세포는 RPE와 표현형적으로 유사하게 보일 수 있다. 피브린이 분해된 후, RPE는 여전히 생존가능한 단층으로서 남아 있을 수 있다.
실시예 7 - RPE 단층을 포함하는 피브린 히드로겔의 이식
피브린 히드로겔을 래빗 눈의 망막하 공간으로 이식하였다(도 41). 얇은 시트(200 μm)를 생성하도록 맞춤형 몰드에서 피브리노겐(최종: 40 mg/mL) 용액 및 트롬빈(최종: 100 U/mL) 용액을 혼합함으로써 피브린 히드로겔을 제조하였다. 이식 후 겔을 보다 쉽게 가시화하기 위해 적은 부피의 트리판 블루를 첨가하였다. 이식물을 1.5 mm x 5 mm 직사각형 기하구조로 펀칭하였다. 일단 준비된 후에, 이식물을 이식 장치에 로딩하였다. 외과적 이식을 수행하기 위해, 백색 암컷 뉴질랜드 래빗(3 kg)를 마취시키고 수술을 위해 준비하였다. 표준 3-포트 유리체절제술을 수행한 후, 미세 캐뉼라를 사용하여 블렙을 형성하고, 망막 가위를 사용하여 망막절개술을 수행하였다. 3.2 mm 슬릿 나이프를 사용하여 공막을 통한 절개를 만들었다. 이식 장치를 눈에 삽입하고, 망막절개술 하에 위치시켰다. 이식물을 제 위치에 배치하였다. 이식 장치를 제거한 후, 공막 절개를 봉합하여 닫았다. 동물이 깨어나기 전, 이식물은 편평한 망막 아래의 편평한 시트로서 보여질 수 있었다. 48시간 후 동물을 희생시키고, 눈을 수거하였다. 육안 해부 검사 결과, 피브린 히드로겔의 어떠한 잔류 증거도 발견되지 않았다.
기타 실시양태
본 발명은 그의 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 영역을 예시를 하기 위한 것이지 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형이 하기의 청구범위의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> Mayo Foundation for Medical Education and Research <120> METHODS AND MATERIALS FOR USING FIBRIN SUPPORTS FOR RETINAL PIGMENT EPITHELIUM TRANSPLANTATION <130> 07039-1619WO1 <150> 62/431,259 <151> 2016-12-07 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 aacttgggtt tggcaagagc 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleoti <400> 2 ccacactcag aactacacca tca 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 atttataggc tggccctcac ggaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 tgttctgccg gagtcataaa gcct 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 tgccagagat ccccgaaaat 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ggaatgtgct tcatccctgt t 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 actgcctgga tgaactgtat ga 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 gagctctcca gcaactgtgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 tggtctccaa caagcgtctc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 tcacaaaact tgtcggactg g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 ccttcctcac caagtacctg aaa 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 ctcttgctgg aaggctggat 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 aagctgcttg agagggtctt t 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 acggccttgc catcatactt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 ccagggttca ggtttggttc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 catctgtgga gggtcttggg 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 aatacaggaa cttgaaatgc aggc 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 atgctgaagg aggtcttggc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 cgggagatct ctgagaccga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 ggatgagagt gcccagttcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 cgcatcaagg agttgggaat 20 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 ctccaggcgg cgagagt 17 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 ctgctcatcg gctgttggta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 gagcattggg aaccacaggt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 tgcctgggat tcttctcaca g 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 tgcttcataa gtctgcgcct at 22 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 ttgacagtat ttttgagcag tggc 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 gacacagcaa gctcacaagc 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 tctgaaggtt ctgatgccag c 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 gctggtgatg agagcaaggt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 aagcaagtga agggatctgc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 tcacagaggt ttggcttccg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 cgctctaagg gttctgctct 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 tcctgggcag acaccttctt a 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 atcctgctta tccttgtgct ga 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 gggtcattgt cagccgcttt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 ggtggacacc atcgtgaaag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 gaagccattt catagcgggc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 aatgtcacct ggggcattca 20 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 aaaagcccat cctgtacatt acaaa 25 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 cttcaagggg cagtgggtaa c 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 ggacttggtg acttcgcctt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 tccgaaccaa gcttcgtatc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 tagcgaaagt gccaaagctg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 tggacacctc ctggctattg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 gggccaggat gaagtcgtag 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 ctgcagttcg aggtgctcat 20 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 aggcggccgg cagag 15 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 accactttta ggtcggctca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 tctggtccgg agattctgct 20 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 aactcttcct gaggcaggtg g 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 52 ggaatctacg gggtgggttt 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 gccagacgat catgcagcta 20 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 54 gcagtctaca tgctaaatca gagg 24 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 55 tcgagggtgc aggtatggtt 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 tctgaactca cttcccgagc 20 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 57 gatcaagatc attgctcctc ctg 23 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 58 ctgcgcaagt taggttttgt ca 22 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 59 ctctgctcct cctgttcgac 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 60 accaaatccg ttgactccga 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 61 agatcaaaag gagacaggtg ct 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 62 aatagccccc acccattgtg 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 63 actgacggag cccgagaag 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 64 ttgctcggtt ctcttcaccc 20 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 65 ttggcttaat gagactggga cc 22 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 66 acatcaccac accaacactg a 21 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 67 gtgacgcaga aggcctca 18 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 68 tgcaccaggt ctgagtgttc 20 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 69 ggatcactag gtgatatcga gc 22 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 70 accagacaag agtttaagag atatgtatc 29 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 71 ttcctgcatg ccagaggagc cc 22 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 72 aatgtatcga aggtgctcaa 20 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 73 atgcaccgct acgacgtgag cgc 23 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 74 accttgacaa tcctgatgtg g 21 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 75 taactgacta gcaggcttgt cg 22 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 76 tccacataca gtcctggatg atgatg 26

Claims (42)

  1. (a) 정단(apical) 표면 및 기저(basal) 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층, 및 (b) 상기 단층의 상기 정단 표면에 부착된 피브린 히드로겔 층을 포함하는 망막 이식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께인 이식물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이식물이 플라스미노겐을 포함하는 것인 이식물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이식물이 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 이식물.
  5. 망막 이식물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층을 수득하는 단계, 및
    (b) 상기 단층의 상기 정단 표면 상에 피브리노겐 및 트롬빈의 코팅물을 침착시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 코팅물이 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 코팅물이 약 20 mg의 피브리노겐/mL 내지 약 80 mg의 피브리노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅물이 약 2 U의 트롬빈/mL 내지 약 1500 U의 트롬빈/mL을 포함하는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 단층의 상기 정단 표면 상에 플라스미노겐을 침착시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코팅물이 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  11. 망막 이식물을 제조하는 방법으로서, 피브린 기저 지지 기재 상의 망막 상피 세포를, 프로테아제 억제제 또는 항피브린용해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배지가 상기 프로테아제 억제제를 포함하고, 상기 프로테아제 억제제가 아프로티닌인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배지가 약 5 U의 아프로티닌/mL 내지 약 500 U의 아프로티닌/mL을 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 배지가 상기 항피브린용해제를 포함하고, 상기 항피브린용해제가 트란스섹삼산 또는 아미노카프로산인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 배지가 플라스미노겐을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 배지가 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 피브린 기저 지지 기재가 내피 세포를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 내피 세포가 iPSC-유도된 내피 세포, 혈액 외성장 내피 세포(BOEC), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 내피 전구 세포(EPC) 및 제대 정맥 내피 세포(UVEC)로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 수득되는 것인 방법.
  19. (a) 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층, 및
    (b) 상기 단층의 상기 기저 표면에 부착된 피브린 히드로겔 층
    을 포함하는 망막 이식물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께인 이식물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이식물이 플라스미노겐을 포함하는 것인 이식물.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이식물이 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 이식물.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 코팅물을 포함하는 것인 이식물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 코팅물이 기저 막 단백질, 마트리겔 또는 겔트렉스를 포함하는 것인 이식물.
  25. 망막 이식물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 피브린 히드로겔 층을 수득하는 단계,
    (b) 상기 피브린 히드로겔 층의 표면을 제제로 코팅하는 단계, 및
    (c) 상기 코팅물 상에, 정단 표면 및 기저 표면을 갖는 망막 색소 상피 단층을 형성하는 단계로서, 상기 기저 표면이 상기 정단 표면보다 상기 피브린 히드로겔 층에 더 가까운 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 20 μm 내지 약 400 μm의 두께인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 20 mg의 피브리노겐/mL 내지 약 80 mg의 피브리노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 2 U의 트롬빈/mL 내지 약 1500 U의 트롬빈/mL을 포함하는 것인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브린 히드로겔 층이 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  30. 망막 이식물을 제조하는 방법으로서, 피브린 기저 지지 기재 상의 망막 상피 세포를, 프로테아제 억제제 또는 항피브린용해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 배지가 상기 프로테아제 억제제를 포함하고, 상기 프로테아제 억제제가 아프로티닌인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 배지가 약 5 U의 아프로티닌/mL 내지 약 500 U의 아프로티닌/mL을 포함하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 배지가 상기 항피브린용해제를 포함하고, 상기 항피브린용해제가 트란스섹삼산 또는 아미노카프로산인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 배지가 플라스미노겐을 더 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 배지가 약 0.1 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL 또는 약 0.001 U의 플라스미노겐/mL 내지 약 40 U의 플라스미노겐/mL을 포함하는 것인 방법.
  36. 제30항에 있어서, 상기 피브린 기저 지지 기재가 내피 세포를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 내피 세포가 iPSC-유도된 내피 세포, 혈액 외성장 내피 세포(BOEC), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 내피 전구 세포(EPC) 및 제대 정맥 내피 세포(UVEC)로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 수득되는 것인 방법.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브린 기저 지지 기재가 코팅물을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 코팅물이 기저 막 단백질, 마트리겔 또는 겔트렉스를 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 코팅물이 상기 피브린 기저 지지 기재 상의 상기 망막 상피 세포를 배양하기 전에 존재하는 것인 방법.
  41. 제11항 또는 제30항에 있어서, 상기 피브린 기저 지지 기재가 RPE 아래 조직 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 RPE 아래 조직 세포 집단이 멜라닌세포, 주위세포 또는 섬유아세포를 포함하는 것인 방법.
KR1020237028551A 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질 KR20230126745A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662431259P 2016-12-07 2016-12-07
US62/431,259 2016-12-07
PCT/US2017/061300 WO2018106414A1 (en) 2016-12-07 2017-11-13 Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
KR1020197017685A KR20190093199A (ko) 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197017685A Division KR20190093199A (ko) 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230126745A true KR20230126745A (ko) 2023-08-30

Family

ID=62492097

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237028551A KR20230126745A (ko) 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질
KR1020197017685A KR20190093199A (ko) 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197017685A KR20190093199A (ko) 2016-12-07 2017-11-13 망막 색소 상피 이식을 위해 피브린 지지체를 사용하는 방법 및 물질

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11679180B2 (ko)
EP (1) EP3551216A4 (ko)
JP (2) JP2020501543A (ko)
KR (2) KR20230126745A (ko)
CN (1) CN110225763B (ko)
AU (1) AU2017372468A1 (ko)
CA (2) CA3210578A1 (ko)
MX (1) MX2019006576A (ko)
SG (1) SG11202008441YA (ko)
WO (1) WO2018106414A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018106414A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
JP7311433B2 (ja) * 2017-06-05 2023-07-19 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 幹細胞を培養し、増殖させ、分化させるための方法及び材料
CN108823160B (zh) * 2018-07-25 2020-08-21 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法
CN108893442A (zh) * 2018-07-25 2018-11-27 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法
AU2020219382A1 (en) * 2019-02-08 2021-08-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Implantation device
US20230414826A1 (en) * 2020-11-13 2023-12-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Fibrin hydrogels

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5487739A (en) 1987-11-17 1996-01-30 Brown University Research Foundation Implantable therapy systems and methods
US6045791A (en) 1992-03-06 2000-04-04 Photogenesis, Inc. Retinal pigment epithelium transplantation
JP3490447B2 (ja) * 1993-04-30 2004-01-26 フォトジェネシス インコーポレイテッド 網膜色素上皮移植
CA2161659C (en) * 1993-04-30 2004-09-14 Yao Liu Retinal pigment epithelium transplantation
AU771994B2 (en) 1996-12-02 2004-04-08 Ipxmedical, Llc Compositions and methods for treating or preventing inflammatory diseases
US20110171185A1 (en) 1999-06-30 2011-07-14 Klimanskaya Irina V Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof
CA2383572C (en) 1999-10-21 2007-12-11 Alcon Universal Ltd. Sub-tenon drug delivery
US6607522B1 (en) * 2000-03-16 2003-08-19 General Hospital Corporation Methods for tissue welding using laser-activated protein solders
US7867186B2 (en) 2002-04-08 2011-01-11 Glaukos Corporation Devices and methods for treatment of ocular disorders
US7824671B2 (en) 2002-10-04 2010-11-02 Tissuetech, Inc. Retinal pigment epithelial cell cultures on amniotic membrane and transplantation
CA2541334A1 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Sealants for skin and other tissues
AU2003284159A1 (en) 2002-10-23 2004-05-13 The Research Foundation Of State University Of Newyork Fibrin-based tissue-engineered vasculature
US20040236343A1 (en) 2003-05-23 2004-11-25 Taylor Jon B. Insertion tool for ocular implant and method for using same
US20050186672A1 (en) 2004-01-27 2005-08-25 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Tissue system with undifferentiated stem cells derived from corneal limbus
WO2005090550A1 (ja) 2004-03-18 2005-09-29 Biomaster, Inc. 幹細胞の増殖法
WO2006088483A2 (en) 2004-06-16 2006-08-24 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for inhibiting the synthesis or expression of mmp-1
US20060047250A1 (en) 2004-08-30 2006-03-02 Hickingbotham Dyson W Fluid delivery device
ES2437865T3 (es) 2005-07-25 2014-01-14 Foundation For Biomedical Research And Innovation Composición en forma de lámina
US20070060887A1 (en) 2005-08-22 2007-03-15 Marsh David A Ophthalmic injector
ITTO20060282A1 (it) 2006-04-14 2007-10-15 Univ Degli Studi Torino Mezzo di coltura e composizione farmaceutica per la rigenerazione del tessuto cartilagineo relativo procedimento relativi usi e prodotti
WO2007150046A2 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Sirion Therapeutics, Inc Methods and compositions for treating ophthalmic conditions via modulation of megalin activity
US20080097335A1 (en) 2006-08-04 2008-04-24 Allergan, Inc. Ocular implant delivery assemblies
WO2008129554A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Stem cell-derived retinal pigment epithelial cells
WO2009046194A2 (en) 2007-10-05 2009-04-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fibrin sealant
US20120219737A1 (en) 2007-10-19 2012-08-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Production of extracellular matrix, conditioned media and uses thereof
US8425473B2 (en) 2009-01-23 2013-04-23 Iscience Interventional Corporation Subretinal access device
JP6166900B2 (ja) 2009-08-24 2017-07-19 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨンＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 実質的に純粋なヒト網膜前駆細胞培養物、前脳前駆細胞培養物、網膜色素上皮細胞培養物、及び、それらの製造方法
ES2677945T3 (es) 2009-08-25 2018-08-07 Servicio Andaluz De Salud Producción de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa
WO2011084550A2 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Eyevation, Llc Delivery and extraction devices
US9532902B2 (en) 2010-02-22 2017-01-03 Optistent, Inc. Minimally-invasive method and apparatus for restructuring the retina
WO2011109712A2 (en) 2010-03-04 2011-09-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Bioengineered human corneal stromal tissue
US9267099B2 (en) 2010-03-15 2016-02-23 Indiana University Research And Technology Corporation Engineered lumenized vascular networks and support matrix
ES2542226T3 (es) 2010-04-28 2015-08-03 Technische Universität Dresden Método para producir células progenitoras retinianas polarizadas a partir de células madre pluripotentes y su diferenciación para dar células del epitelio pigmentario retiniano
GB201011313D0 (en) 2010-07-05 2010-08-18 Ucl Business Plc Implantation devices, methods and implants
EP3520749A1 (en) 2010-10-15 2019-08-07 Clearside Biomedical, Inc. Device for ocular access
US9132152B2 (en) 2011-02-10 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for generating induced pluripotent stem cells
MX348269B (es) 2011-02-25 2017-06-05 Riken Metodo para producir lamina celular epitelial de pigmento retinal.
JP5816452B2 (ja) 2011-03-31 2015-11-18 株式会社セルシード 細胞シート移植治具及びその利用方法
US9107897B2 (en) * 2011-05-18 2015-08-18 The Regents Of The University Of California Methods for isolating mammalian retinal progenitor cells
WO2012177968A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 The Schepens Eye Research Institute, Inc. A scaffold for subretinal cell transplantation and drug delivery
CN103007355B (zh) 2011-09-20 2014-08-13 同济大学 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途
KR101389850B1 (ko) 2012-05-04 2014-04-29 이화여자대학교 산학협력단 심장전구세포의 배양방법 및 그 용도
BR112014030895B1 (pt) 2012-06-12 2021-11-09 Alcon Inc Aparelho injetor de gás portátil
DK2898053T3 (da) 2012-09-20 2021-11-22 Danisco Us Inc Mikrotiterplader til styret frigivelse af kulturbestanddele til cellekulturer
JP2016507279A (ja) 2012-12-31 2016-03-10 ファルス，ジョージ，デイヴィッド 大量出血に対する凍結乾燥したフィブリンシーラント
CA2899865C (en) 2013-02-01 2023-10-10 Kapil BHARTI Method for generating retinal pigment epithelium (rpe) cells from induced pluripotent stem cells (ipscs)
US9587221B2 (en) 2013-11-11 2017-03-07 Auburn University Encapsulation and cardiac differentiation of hiPSCs in 3D PEG-fibrinogen hydrogels
WO2015077498A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treating disorders of the eye
CN103656742B (zh) 2013-11-29 2015-04-15 温州医科大学 功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法
US20150159134A1 (en) 2013-12-11 2015-06-11 Pfizer Limited Method for producing retinal pigment epithelial cells
CA2933083A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Pfizer Limited Method for producing retinal pigment epithelial cells
JP6495603B2 (ja) 2014-09-03 2019-04-03 テルモ株式会社 シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体の製造方法
KR101613478B1 (ko) 2014-09-22 2016-04-19 (주)안트로젠 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법
EP3011981A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Histocell, S.L. A biomaterial scaffold for regenerating the oral mucosa
TWI711455B (zh) 2015-05-13 2020-12-01 臺北榮民總醫院 多層視網膜細胞移植物
WO2017044488A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Cellular Dynamics International, Inc. Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
CN114807035B (zh) 2015-09-08 2024-02-02 (由卫生与公众服务部部长代表的)美利坚合众国 临床级别视网膜色素上皮细胞的可再现的分化方法
US10307289B2 (en) 2016-08-19 2019-06-04 Drug Delivery Company, Llc Sub-cutaneous medicinal dosage delivery implant system
WO2018106414A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
WO2018146679A2 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Photoreceptor cells for the treatment of retinal diseases
JP7311433B2 (ja) 2017-06-05 2023-07-19 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 幹細胞を培養し、増殖させ、分化させるための方法及び材料
AU2020219382A1 (en) 2019-02-08 2021-08-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Implantation device

Also Published As

Publication number Publication date
EP3551216A1 (en) 2019-10-16
MX2019006576A (es) 2019-08-21
US11679180B2 (en) 2023-06-20
WO2018106414A1 (en) 2018-06-14
KR20190093199A (ko) 2019-08-08
SG11202008441YA (en) 2020-10-29
JP2020501543A (ja) 2020-01-23
CN110225763B (zh) 2024-01-30
CA3045464C (en) 2023-10-17
CA3210578A1 (en) 2018-06-14
US20230277728A1 (en) 2023-09-07
CA3045464A1 (en) 2018-06-14
JP2022068182A (ja) 2022-05-09
AU2017372468A1 (en) 2019-06-13
EP3551216A4 (en) 2020-08-19
US20200061246A1 (en) 2020-02-27
CN110225763A (zh) 2019-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230277728A1 (en) Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
Redenti et al. Engineering retinal progenitor cell and scrollable poly (glycerol-sebacate) composites for expansion and subretinal transplantation
JP4348528B2 (ja) 組織表面用羊膜カバーおよび膜の固定を容易にする装置
Jang et al. Tailoring mechanical properties of decellularized extracellular matrix bioink by vitamin B2-induced photo-crosslinking
San Choi et al. Bioengineering endothelialized neo-corneas using donor-derived corneal endothelial cells and decellularized corneal stroma
Hynes et al. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space
Gandhi et al. Fibrin hydrogels as a xenofree and rapidly degradable support for transplantation of retinal pigment epithelium monolayers
Catala et al. Approaches for corneal endothelium regenerative medicine
Parekh et al. Concise review: an update on the culture of human corneal endothelial cells for transplantation
Oelker et al. Synthesis and characterization of dendron cross-linked PEG hydrogels as corneal adhesives
US20090306772A1 (en) Ocular Scaffolds and Methods for Subretinal Repair of Bruch&#39;s Membrane
Wray et al. Slowly degradable porous silk microfabricated scaffolds for vascularized tissue formation
Galloway et al. Characterization of human iPSC-RPE on a prosthetic Bruch's membrane manufactured from silk fibroin
de la Mata et al. Poly-l/dl-lactic acid films functionalized with collagen IV as carrier substrata for corneal epithelial stem cells
Tian et al. Polarized, cobblestone, human retinal pigment epithelial cell maturation on a synthetic PEG matrix
US9061050B2 (en) Repairing Bruch&#39;s membrane with hydrogels
CN115003321A (zh) 胶原凝胶配制品
Tichotová et al. Advantages of nanofibrous membranes for culturing of primary RPE cells compared to commercial scaffolds
Shadforth et al. Biomaterial templates for the culture and transplantation of retinal pigment epithelial cells: a critical review
EP4289937A1 (en) Sheet-shaped cell culture for covering cut surface of pancreas
Kwan et al. Development of tissue-engineered membranes for the culture and transplantation of retinal pigment epithelial cells
JP2022528378A (ja) 組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物及びその製造方法
Zwingelberg et al. Advancements in Bioengineering for Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK)
KR20200115293A (ko) 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 및 이의 제조방법
CN117881437A (zh) 胶原iv生物墨水

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal