CN115003321A - 胶原凝胶配制品 - Google Patents
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Abstract
本发明人使用未经修饰的I型胶原开发了可打印的胶原生物墨水，其具有便于以结构化形式应用于组织的机械和结构特性。特别地，本发明的组合物可用于使用二维或三维(挤出)生物打印技术将胶原凝胶施加到组织(例如眼睛)。
Description
通过交叉引用并入
本申请要求2019年11月18日提交的澳大利亚临时专利申请号2019904331的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及适于将药剂递送至诸如组织和细胞的生物靶标和/或能够为所述生物靶标提供保护的组合物，及其生产方法。
背景
当生物组织发生损害时，例如，由于意外的机械损伤、手术或疾病，首要任务是有效地封闭损伤部位。组织封闭剂具有广泛的应用，包括但不限于预防进一步损伤、预防感染和最小化失血。越来越多的组织封闭剂也被用于向受损组织递送药剂，这可能有助于愈合和/或帮助预防感染。当封闭剂由天然材料制成时，过敏反应等不良反应的可能性较小。
封闭剂的作用机制和使用难易程度差异很大。有效的封闭剂在施用期间自由流动，但在施用后具有保持形状/结构的能力。当修复中的生物组织的形状(例如角膜组织)对其功能至关重要时，后一种特性尤其重要。
角膜是眼睛保护层的透明组成部分。它允许光通过瞳孔并且是眼睛光学系统的主要折射元件。角膜由五层组成：外上皮、前弹力层、基质、后弹力膜和内皮。角膜基质占角膜总厚度的大约90％并且主要由胶原组成。
角膜盲是世界范围内失明的主要原因，就数量而言仅次于白内障。角膜盲的原因多种多样，包括沙眼、盘尾丝虫病、麻风病、新生儿眼炎和干眼症等疾病，以及眼外伤、角膜溃疡和使用传统眼药引起的并发症等其他过程。
角膜损伤是澳大利亚最常见的眼科急诊情况，大约75％的病例是由于角膜存在异物或擦伤。据估计，仅这些损伤每年就使澳大利亚人口花费超过1.55亿美元，如果得不到有效治疗，可能会导致感染和疤痕，从而导致视力永久性受损。
在轻微的情况下，受损的角膜能够经由正常的愈合途径再生。然而，在其他情况下，角膜的正常愈合机制不足，导致形成不可愈合的缺陷，这可能引起角膜融化、角膜新生血管、透明度丧失、感染、疤痕和视力下降直至失明。
目前对角膜损伤的医学治疗包括抗生素、眼垫、缝合和外科胶，这些可能有助于解决小问题。然而，它们并没有充分解决在更高级的情况下出现的问题，包括疼痛缓解、感染和/或疤痕组织的形成。感染是一种严重的并发症，通常需要住院治疗。疤痕在严重的角膜损伤中很常见，可导致永久性视力丧失。在这种情况下，角膜移植是视力康复的唯一选择，但全世界都存在供体角膜短缺的问题。
上述许多问题不仅限于角膜损伤，在其他身体组织损伤的情况下也很普遍。
需要用于封闭密封生物组织，和/或将药剂有效递送至诸如组织和细胞的生物靶标的改进的组合物和方法。
发明概述
本发明减轻了与用于封闭生物组织和将药剂递送至生物靶标的当前组合物和/或方法相关的至少一个问题。就角膜而言，目前的主要方法之一是用天然或合成材料重建角膜缺陷。胶原是使用的主要天然材料，是角膜中的主要蛋白质。胶原占角膜干重的60％-80％，并且I型胶原是角膜基质中的主要类型。然而，目前天然产生的胶原产品的强度和弹性是有限的。通常需要化学修饰或交联来提高I型胶原和其他类型的用于治疗用途而生成的胶原的坚固性。当前基于胶原的产品的生物力学特性仍然不足以持续使用，因为随着时间的推移通常会观察到不规则的角膜形状。
除了胶原植入物之外，还提出并且开发了胶原封闭剂和生物墨水。然而，此类生物墨水的应用受到复杂的印刷方法和所得产品缺乏透明度的限制。
取代使用胶原植入物作为基质等价物，本发明人已经开发了使用未修饰的I型胶原直接印刷到角膜上的可印刷胶原生物墨水。本发明的生物墨水也可以直接印刷到一系列其他生物靶标(例如组织、膜、细胞)上。经打印的胶原生物墨水可以固化以形成临时结构，其会安全降解并且允许周围角膜细胞迁移和基质重构。本发明的胶原生物墨水可以使用二维或三维(挤压)生物打印技术进行打印。此外，本发明的生物墨水能够进行光交联。本文所描述的生物墨水可以是透明的和有粘性的，并且可以支持细胞迁移和增殖。可以使用可生物降解的生物墨水来递送生物活性分子(例如生长因子)。
非限制性地，本文所述的组合物和方法通常可用于将药剂(例如药物和/或其他物质)递送至生物靶标(例如组织、膜、细胞)，并且可以应用于例如封闭组织，包括角膜组织。
本发明至少部分涉及以下实施方案：
实施方案1.一种组合物，包含：
-3-15mg/ml的I型胶原；
-0.135-0.5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；和
-一种或多种交联剂。
实施方案2.根据实施方案1所述的组合物，其中该组合物包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红。
实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的组合物，其中该一种或多种交联剂能够被光激活。
实施方案4.根据实施方案3所述的组合物，其中该光是UV光、蓝光、绿光或白光。
实施方案5.根据实施方案1所述的组合物，其中该组合物包含纤维蛋白原和/或凝血酶。
实施方案6.根据实施方案5所述的组合物，其中该组合物包含1.6-6mg/ml的纤维蛋白原。
实施方案7.根据实施方案5或实施方案6所述的组合物，其中该组合物包含1-5U/mL的凝血酶。
实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的组合物，其还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
实施方案9.根据实施方案8所述的组合物，其中该组合物包含含有离子和氨基酸的培养基。
实施方案10.根据实施方案8或实施方案9所述的组合物，其中：
(i)生长因子包含人表皮生长因子(hEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)；和/或
(ii)维生素包含抗坏血酸盐(维生素C)；和/或
(iii)基质蛋白包含IV型胶原；和/或
(iv)激素包含胰岛素；和/或
(v)糖蛋白包含转铁蛋白。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的组合物，其中离子是包括在组合物中的离子盐的组成部分。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的组合物，其中组合物还包含哺乳动物细胞。
实施方案13.根据实施方案12所述的组合物，其中哺乳动物细胞包含人细胞或由人细胞组成。
实施方案14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中I型胶原是中性的。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：
(i)3-15mg/ml的I型胶原、0.135-0.2M的钠离子和0.01-0.05M的钙离子；或者
(ii)4-12mg/ml的I型胶原、0.135-0.16M的钠离子和0.015-0.03M的钙离子；或者
(iii)5-11mg/ml的I型胶原、0.135-0.14M的钠离子和0.018-0.02M的钙离子。
实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：
(i)少于15mg/ml的I型胶原；
(ii)超过0.135M的钠离子；和
(iii)超过0.018M的钙离子。
实施方案17.一种制备组合物的方法，该方法包括：
(i)提供溶液，该溶液包含:
-3-15mg/ml的I型胶原；
-一种或多种交联剂；和
-0.135-0.5M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子；
(ii)将溶液施加至表面；和
(iii)向溶液施加能够激活一种或多种交联剂的光。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中将溶液施加至表面形成层，并且其中重复步骤(ii)和步骤(iii)多次，其中将每一层施加至前一层之上。
实施方案19.根据实施方案17或实施方案18所述的方法，其中该一种或多种交联剂包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红，并且其中光包括UV光、蓝光、绿灯或白灯。
实施方案20.根据实施方案17至19中任一项所述的方法，其中：
(a)将一种或多种交联剂与碱合并以形成A部分；
(b)将I型胶原与钠离子和/或钙离子合并以形成B部分；以及
(c)在步骤(iii)之前，将A部分和B部分混合以形成溶液。
实施方案21.一种制备组合物的方法，该方法包括：
(i)提供溶液，该溶液包含:
-3-15mg/ml的I型胶原；
-一种或多种交联剂；和
-0.135-0.5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；
(ii)将溶液施加至表面，其中在施加至表面之前将溶液分成至少两个组成部分。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其还包括以下步骤：
(iii)将纤维蛋白原添加到至少一个组成部分中以形成配制品(a)；
(iv)将凝血酶添加到至少一个组成部分中以形成配制品(b)；以及
(v)将配制品(a)和(b)合并以形成凝胶。
实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中：
-在步骤(iii)中将1.6-6mg/ml纤维蛋白原添加到至少一个组成部分中以形成配制品(a)；和/或
-在步骤(iv)中将1.5U/mL凝血酶添加到至少一个组成部分中以形成配制品(b)。
实施方案24.根据实施方案17至23中任一项所述的方法，其中该溶液还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中该溶液包含含有离子和氨基酸的培养基。
实施方案26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中：
(i)生长因子包含人表皮生长因子(hEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)；和/或
(ii)维生素包含抗坏血酸盐(维生素C)；和/或
(iii)基质蛋白包含IV型胶原；和/或
(iv)激素包含胰岛素；和/或
(v)糖蛋白包含转铁蛋白。
实施方案27.根据实施方案17至26中任一项所述的方法，其中该离子是包括在溶液中的离子盐的组成部分。
实施方案28.根据实施方案17至27中任一项所述的方法，其中该溶液进一步包含哺乳动物细胞。
实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中该哺乳动物细胞包含人细胞或由人细胞组成。
实施方案30.根据实施方案17至29中任一项所述的方法，其中I型胶原是中性的。
实施方案31.一种由根据实施方案17至30中任一项所述的方法获得或能够由根据实施方案17至30中任一项所述的方法获得的组合物。
实施方案32.一种封闭组织表面的方法，该方法包括将根据实施方案1至16或实施方案31中任一项的所述组合物施用于组织。
实施方案33.一种将药剂递送至组织的方法，该方法包括将根据实施方案1至16或实施方案31中任一项的所述组合物施用于组织。
实施方案34.根据实施方案1至16或实施方案31中任一项所述的组合物，用于封闭组织表面。
实施方案35.根据实施方案1至16或实施方案31中任一项所述的组合物，用于将药剂递送至组织。
实施方案36.包含I型胶原、钠离子、钙离子和一种或多种交联剂的试剂盒、包装或装置用于制备组合物的用途，该组合物包含：
-3-15mg/ml的I型胶原；
-0.135-0.5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；和
-一种或多种交联剂。
实施方案37.根据实施方案36所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该组合物包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红。
实施方案38.根据实施方案36或实施方案37所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该一种或多种交联剂能够被光激活。
实施方案39.根据实施方案38所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该光是UV光、蓝光、绿光或白光。
实施方案40.根据实施方案36所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该组合物包含纤维蛋白原和凝血酶，并且其中
-纤维蛋白原存在于第一隔室中；
-凝血酶存在于第二隔室中；并且其中
-该试剂盒、包装或装置被配置为允许在将纤维蛋白原和凝血酶装载到试剂盒、包装或装置中期间和之后分离第一隔室的纤维蛋白原和第二隔室的凝血酶，并且其中该试剂盒、包装或装置还包括促进第一隔室的纤维蛋白原与第二隔室的凝血酶混合的工具。
实施方案41.根据实施方案40所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该组合物包含：
-1.6-6mg/ml的纤维蛋白原；和/或
-1-5U/mL的凝血酶。
实施方案42.根据实施方案36至41中任一项所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中该组合物还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
实施方案43.根据实施方案36至42中任一项所述的试剂盒、包装或装置的用途，其中I型胶原、钠离子、钙离子和/或一种或多种交联剂中的任一种或多种与试剂盒内的其他一种或多种组分分离。
实施方案44.根据实施方案1至16或实施方案31中任一项所述的组合物，其中该组合物是透明的。
实施方案45.根据实施方案1至16或实施方案31中任一项所述的组合物，其中该组合物具有在打印后保持或基本保持形状/结构的能力。
定义
如本申请所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“组分”还包括多个组分。
如本文所用，术语“包含(comprising)”是指“包括(including)”。“包含(comprising)”一词的变体，诸如“包含(comprise和comprise)具有相应的各种含义。因此，例如，“包含(comprising)”组分“A”的组合物可以仅由组分“A”组成或可以包括一种或多种额外的组分(例如组分“B”和/或组分“C”)。
如本文所用，术语“受试者”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、羊、灵长类动物、鸟类和啮齿动物物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。
如本文所用，术语“组织”将被理解为涵盖作为组织成分的细胞和由组织形成的器官。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统包括允许将反应试剂(例如，在适当的容器中的标签、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于执行测定的书面说明等)储存、从一个位置运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个容纳相关反应试剂和/或支持材料的外壳(诸如盒子)。术语“试剂盒”包括分段试剂盒和组合试剂盒。“分段试剂盒”是指包含两个或更多个单独的容器的递送系统，每个容器含有全部试剂盒组分的子部分。容器可以一起或单独递送给预期的受试者。任何包含两个或多个独立容器的递送系统都包括在术语“分段试剂盒”的含义内，每个容器含有全部试剂盒组分的子部分。“组合试剂盒”是指在单个容器中含有反应测定的所有组分的递送系统(例如在容纳所需组分中的每一种的单个盒子中)。
如本文所用，术语“约”在用于提及所列举的数值时包括所列举的数值和在所列举的值的加或减10％内范围内的数值。
如本文所用，术语“多个”是指多于一个。在某些特定方面或实施方案中，多个可以表示2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多，以及可从其中推导出的任何数值，以及可从其中推导出的任何范围。
如本文所用，术语“在……之间”在用于提及数值范围时涵盖在该范围的每个端点处的数值。例如，浓度在0.135M和3M之间的钠离子包括浓度为0.135M的钠离子和浓度为3M的钠离子。
如本文所用，术语“大于”在用于提及数值时将被理解为表示“大于或等于”。例如，大于0.135M的钠离子涵盖0.135M的钠离子浓度和大于0.135M的所有钠离子浓度。
如本文所用，术语“小于”在用于提及数值时将被理解为表示“小于或等于”。例如，小于15mg/ml的I型胶原涵盖浓度为15mg/ml的I型胶原和小于15mg/ml的所有浓度的I型胶原。
如本文所用，术语“中性的”当用于描述I型胶原时将被理解为表示胶原溶液的pH在6.7和7.6之间。例如，“中性的”的I型胶原可能具有以下pH：在6.8和7.5之间、或在6.9和7.4之间、或在7.0和7.3之间或在6.9和7.2之间，等。
本文对现有技术文件的任何描述，或从这些文件衍生的或基于这些文件的陈述，并不承认这些文件或衍生陈述是相关技术的公知常识的一部分。
出于描述的目的，除非另有说明，否则本文提及的所有文件均通过引用整体并入本文。
附图说明
现在将参考附图仅通过示例的方式描述本发明的优选实施方案，其中：
图1示出了测试离子对中性的I型胶原溶液稳定性的影响的结果。对于生成的每种溶液，用2.7份5M NaOH中和90份胶原溶液，然后与7.3份各种盐溶液混合。测试的溶液包括1×磷酸盐缓冲盐水((PBS)，由NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4组成)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4和抗坏血酸钠(NaC6H7NO6)。在检查沉淀形成之前，将溶液在工作台上放置1小时、1天和1周。1xPBS(单位：mM)的组成为Na+：156.9、K+：109.8、Cl-：244.9、HPO4 2-：10、H2PO4-：1.8。图1示出了包括NaCl(最低浓度为68.4mM)或CaCl2(最低浓度为18mM)对于构成可溶性透明胶原凝胶是最优的。
图2核黄素粉末溶解在CaCl2/PBS中。图2a示出了离心前在CaCl2中的核黄素。左管：0.1％核黄素溶液；右管：0.2％核黄素溶液。图2b示出了离心后在CaCal2中的核黄素。左管：0.1％核黄素溶液保持透明。右管：0.2％核黄素在CaCl2溶液中沉淀，如箭头所示。
图3提供了在载玻片上的交联的胶原墨水的代表性图像。图3a示出了由组织培养罩UV灯交联的胶原墨水。图23示出了由3mw/cm2 365nm UV交联的胶原墨水。图3c示出了由470nm 10mw/cm2蓝光交联的胶原墨水。
图4提供了由3mw/cm2 365nm UV交联的在载玻片上的基于人胶原的胶原墨水的代表性图像。
图5提供了由玫瑰红-绿光交联的胶原生物墨水的代表性图像。
图6是展示胶原生物墨水样品的光流变特性的一系列曲线图。图6a至图6e示出了在对样品施加UV光后储能模量和损耗模量随时间的变化。图6a示出了含有PBS的12mg/ml胶原。图6b示出了含有钙离子的12mg/ml胶原。图6c示出了含有钙离子的6mg/ml胶原。图6d示出了含有钙离子的3mg/ml胶原。图6e示出了含有钙离子的12mg/ml胶原，储存在-30℃冰箱中。
图7提供了交联后刚制成的12mg/ml胶原生物墨水(图7a)和交联后-30℃储存的12mg/ml胶原生物墨水(图7b)。
图8是在y轴上绘制含有18mM Ca2+的6mg/ml添加了核黄素的胶原生物墨水的粘度与在x轴上绘制增加的剪切速率的曲线图。所显示的剪切修剪行为对于挤压3D打印是必需的。
图9是示出在UV处理后掺入抗坏血酸钠的胶原生物墨水和掺入氯化钠的胶原生物墨水的储能/损耗模量随时间变化的曲线图。两种生物墨水的胶原浓度相同。该图显示，由UV照射引发的光交联的强度随着抗坏血酸的添加而减半。
图10提供了折叠的胶原凝胶(图10a)和在水中展开的胶原凝胶(图10b)的代表性图像。
图11示出了胶原凝胶在400-700nm波长范围内的总透射率。
图12提供了由胶原生物墨水的线堆叠形成的结构的代表性图像。图12a提供了由6mg/ml胶原生物墨水形成的结构的图像，并用镊子操纵该结构。图12b示出了由12mg/ml胶原墨水的线堆叠形成的结构，并用镊子操纵该结构。
图13提供了在交联的胶原生物墨水顶部的HCET细胞的代表性图像(图13a)和胶原凝胶的一部分的DAPI染色结果(图13b)。
图14提供了在交联的胶原生物墨水上的HCSC的代表性图像(图14a)和在其上接种有HCSC的胶原凝胶的降解(图14b)。
图15提供了在第1天封装在交联的胶原生物墨水中的细胞(图15a)和在第5天封装在交联的胶原生物墨水中的细胞(图15b)的代表性图像。
图16提供了使用hCSC的细胞递送实验的结果。图像显示交联后1天(图16a)、3天(图16b)和7天(图16c)的胶原生物墨水和细胞。
图17示出了在96孔板中的HCET细胞的BrdU读数的比较，在胶原凝胶上的细胞(左)/在组织培养板上的细胞(右)(p＝0.04)。
图18示出了在96孔板中的hCSC细胞的BrdU读数的比较，在胶原凝胶上的细胞(左)/在组织培养板上的细胞(右)(p＝0.01)。
图19提供了在交联的掺入IV型胶原的6mg/ml胶原生物墨水上的永生化人角膜内皮细胞的代表性图像。细胞在7天内达到融合。
图20示出了在96孔板中的角膜基质细胞的BrdU读数的比较，在掺入FBS的胶原凝胶上的细胞(左)/在未掺入FBS的胶原凝胶(右)上的细胞(p＝0.04)。
图21示出了用本发明的组合物填充猪角膜。在图21a中，使用2mm环钻形成孔。在图21b中，冲洗后，用6mg/ml胶原生物墨水填充孔。
图22提供了填充在猪角膜中产生的间隙的图像(a)使用2mm环钻产生的间隙(b)用12mg/ml胶原墨水填充的间隙。
图23提供了填充在猪角膜中产生的间隙的图像(a)使用4mm环钻产生的间隙(b)用胶原墨水填充的间隙。
图24提供了具有UV固化装置的IOP模拟系统的非限制性实例。
图25提供了显示猪角膜封闭的图像。图25a示出了封闭角膜穿孔的6mg/ml胶原生物墨水。在图25b和25c中，12mg/ml胶原生物墨水未能粘附。
图26提供了显示猪角膜封闭的图像。(a)1.5mm直径的穿孔；(b)12mg/ml胶原生物墨水封闭间隙。
图27提供了显示猪角膜封闭的图像。(a)2mm直径的穿孔；(b)12mg/ml胶原生物墨水封闭间隙。
图28提供了显示在可交联胶原墨水中的A部分和B部分的体积关系的图表。
图29提供了生成的薄胶原膜的图像。
图30提供了冲洗前较厚的胶原结构的图像。
图31提供了显示3D打印的网状结构的孔隙的图像。
图32提供了显示打印后2周加载细胞的结构的钙黄绿素-AM染色。
发明详述
本发明人已经使用未修饰的I型胶原开发出可印刷的胶原生物墨水，其具有便于以结构化形式应用于组织的机械和结构特性。特别地，本发明的组合物可以用于使用二维或三维(挤出)生物打印技术将胶原凝胶施加到组织(例如眼睛)。该组合物提供了将药剂递送至生物靶标(例如器官、组织、细胞)的方式。虽然适合施用于角膜，但本文所述的组合物通过提供例如结构支持、活细胞和其他因素，为封闭组织和药剂递送领域中的许多应用提供了平台。
本领域需要用于诸如眼表和角膜基质的表面的有效的胶原衍生的封闭剂和粘合剂。本文所述的组合物基于天然I型胶原，其在角膜的情况下可以重构该组织中的主要蛋白质。本发明的组合物也是用于递送多种生长因子和其他药剂的理想试剂。本文所述的组合物可以利用模拟体内组织并充当细胞增殖的支架的生物材料，和/或通过对条件的操纵促进细胞自身再生其周围基质。在它们应用于眼组织的适用性的背景下，例如，本发明人已经解决了创建基质的困难，该基质可以体现正在治疗的组织(例如角膜)的结构完整性，同时保持透明度，并且仍然是多孔的和生物相容的足以允许角膜细胞和生长因子的浸润、迁移和/或增殖。
在提供受损组织的营养需求与满足受损组织(例如眼组织(诸如角膜))的结构、机械和物理要求之间的平衡是本发明出现时存在的问题。本发明提供了用于将药剂递送至多种生物靶标的改进的组合物和方法。不限于任何特定应用，该组合物可以用于封闭组织和将药剂递送至生物靶标。
用于递送生物药剂的组合物
本发明提供了适用于将药剂递送至诸如组织和细胞的生物靶标的组合物。该组合物还可以用作所述生物靶标的封闭剂和/或粘合剂。
该组合物利用基础支架材料在应用于生物靶标(例如组织、膜、细胞、器官)时提供结构支撑，以促进药剂向生物靶标的递送。
关于用于生成支架的一种或多种具体材料不存在特别限制。
例如，支架可以是胶原支架。这些可以经由例如，在组合物中使用I型胶原生成。与其天然存在的对应物相比，所使用的I型胶原可以是未修饰的。
本发明的组合物可以进一步任选地包含离子和/或一种或多种离子源。合适离子的非限制性实例包括钙离子和钠离子。合适的离子源的非限制性实例包括包含钙的化合物(例如氯化钙)和包含钠的化合物(例如氯化钠)。钙离子和钠离子可以一起或单独存在于本发明的组合物中。
本发明人已经确定了用于本发明的组合物的I型胶原、钠离子和/或钙离子的最佳相对浓度，其中一些描述于本申请的实例和权利要求中。应当理解，所公开的I型胶原、钠离子和/或钙离子的相对浓度仅是示例性的。
组合物可以包含1-20mg/ml的I型胶原、0.07-0.5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含1-20mg/ml的I型胶原、0.07-0.3M的钠离子和/或0.008-0.1M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含3-15mg/ml的I型胶原、0.135-0.3M的钠离子和/或0.008-0.1M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含3-15mg/ml的I型胶原、0.135-0.2M的钠离子和/或0.01-0.05M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含4-12mg/ml的I型胶原、0.135-0.16M的钠离子和/或0.015-0.03M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含5-10mg/ml的I型胶原、0.135-0.14M的钠离子和/或0.018-0.02M的钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含15mg/ml的I型胶原和多于0.135M的钠离子和/或多于0.018M的钙离子。
本发明的组合物可以进一步包含一种或多种交联剂。在本发明的一些实施方案中，交联剂是核黄素。核黄素可以以0.01-0.5％(w/v)的浓度存在。可以使用光，诸如UV光或蓝光来激活核黄素，使组合物交联。本领域技术人员将知道其他合适的光交联剂和光源，例如玫瑰红染料和绿光，这两者都已被批准用于角膜的多种应用。在一些实施方案中，玫瑰红用作光交联剂并被绿光激活。在一些实施方案中，玫瑰红用作光交联剂并被白光激活。在一些实施方案中，0.01-0.5％(w/v)玫瑰红用于光交联。在一些实施方案中，通过将胶原生物墨水与玫瑰红和合适的光源交联而提供的组合物将被着色。在一些实施方案中，颜色将是粉红色。这些有色组合物可以用于监测组织中的胶原代谢，或用于需要跟踪胶原活性的其他用途。
在本发明的一些实施方案中，交联剂是纤维蛋白原和/或凝血酶。所使用的浓度可以是1.6-6mg/ml纤维蛋白原和1-5U/mL凝血酶。所使用的浓度可以是0.1-20mg/ml纤维蛋白原和2-20U/mL凝血酶。本发明人已经确定了用于本申请的权利要求中描述的本发明组合物的纤维蛋白原和凝血酶的最优相对浓度。应当理解，所公开的纤维蛋白原和凝血酶的相对浓度仅是示例性的。
本发明的组合物可以包括血小板裂解物。血小板裂解物可以例如，是哺(例如，使用人、犬、猫科动物、牛科动物、猪、马、羊、山羊、鼠科动物、野兔、仓鼠(cricetine)或鼬鼠科动物血小板或其任意组合生成的)乳动物血小板裂解物。用于生成血小板裂解物的血小板来源通常取决于组合物待使用的具体目的。如本领域普通技术人员所知，血小板裂解物是通过分离血小板、裂解它们并去除细胞碎片而生成的。血小板裂解物的成分及其应用已得到很好的分析(参见例如,Burnouf等人,Biomaterials.2016年1月；76:371-87)。
在一些实施方案中，组合物不包含抗凝剂或基本上不含可能仅以痕量存在的抗凝剂。这种抗凝剂的非限制性实例包括肝素、维生素K拮抗剂(例如华法林、香豆素)、利伐沙班、依多沙班、阿哌沙班、达比加群等。在一些实施方案中，血小板裂解物包含少于：10％(v/v)、9％(v/v)、8％(v/v)、7％(v/v)、6％(v/v)、5％(v/v)、4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)、1％(v/v)、0.5％(v/v)的抗凝剂。
根据本发明的组合物可以包括细胞。细胞可以是例如哺乳动物细胞(例如人细胞、犬细胞、猫科动物细胞、牛科动物细胞、猪细胞、马细胞、羊细胞、山羊细胞、鼠科动物细胞、野兔细胞、仓鼠细胞、鼬鼠科动物细胞或其任意组合)。所使用的细胞类型通常取决于组合物待使用的具体目的。例如，细胞可以是与待施用组合物的组织类型相同的细胞(例如，眼表细胞，包括中央和/或外周角膜上皮细胞、球和/或睑结膜上皮细胞、睑结膜基质和/或睑缘细胞；皮肤细胞，包括但不限于角质细胞、生黑色素细胞、默克尔细胞和朗格汉斯细胞；和神经组织细胞，包括但不限于神经元和神经胶质细胞)。其他实例包括上皮细胞、角膜细胞、神经元细胞和内皮细胞。在一些实施方案中，细胞可以是造血干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞，或其任意组合。在一些实施方案中，细胞可以是神经元细胞。
组合物的血小板裂解物和/或细胞可以是自体同源的(即自身来源于预期接受组合物的给定受试者，或同种异体的(即供体来源的))。
本发明的组合物可以包含必需和/或非必需氨基酸。合适的必需氨基酸的非限制性实例包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸。
本发明的组合物可以包含额外的组分(例如一种或多种药剂)，包括但不限于纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、激素(例如胰岛素)、生长因子(例如人表皮生长因子(hEGF)、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮生长因子、转化生长因子[包括β]和结缔组织生长因子)、纤维蛋白稳定因子(例如因子XIII)、一种或多种基质蛋白(例如胶原蛋白[诸如IV型胶原蛋白]、层粘连蛋白、整合蛋白)、维生素(例如维生素C)、糖蛋白(例如转铁蛋白)、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物及其任意组合。在一些实施方案中，组合物包含含有离子和氨基酸的培养基。
本发明的组合物可以包括其他合适的成分，包括水和/或培养基(例如DMEM、DMEM/F-12、MEM、CnT-PR)。培养基可以包含例如以下的任意一种或多种：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水物、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐一水物,、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、维生素、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、i-肌醇、无机盐、氯化钙(CaCl2)(无水)、硫酸铜(CuSO4-5H2O)、硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O)、硫酸铁(FeSO4-7H2O)、氯化镁(无水)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-、硫酸锌(ZnSO4-7H2O)、其他组分、D-葡萄糖(右旋糖)、次黄嘌呤钠、亚油酸、硫辛酸、腐胺二盐酸盐、丙酮酸钠、胸苷或其任意组合。在一些实施方案中，离子作为包括在组合物中的离子盐的组分提供。
在本发明的一些实施方案中，组合物是透明的。另外或可替代地，组合物可以具有在打印后保持或基本保持形状/结构的能力。
组合物的非限制性性质包括以下中的一项或多项：
-非牛顿剪切稀化流体性质，由此组合物的粘度可以随着剪切速率的增加而降低。在一些实施方案中，组合物的粘度在室温下可以在0.01至1000Pa.s的范围内。
-不妨碍或基本不妨碍由光透射引起的视觉的光学清晰度，例如在400-700nm的视觉颜色范围内超过90％。
-对2D和/或3D打印(例如生物打印/挤压打印)的适合性，具有在打印后保持或基本保持形状/结构的能力。
-对印刷的适合性，同时在印刷过程中保持组合物内的细胞的活力。
-在包括或不包括活细胞的二维或三维结构中提供的能力。
-维持和/或促进细胞生长(例如维持和/或促进原代人类细胞诸如上皮细胞、角膜细胞、神经元细胞和内皮细胞的扩增生长)的能力。
-促进球状类器官形成的能力。
-细胞随时间(例如2-7天)降解的能力。
-随着时间的推移维持细胞活力(例如，在34℃下7天)。
-粘附于各种表面，包括组织、器官、膜(例如哺乳动物和人体组织、器官、膜)的能力。
组合物的制备
通常，本发明的组合物可以通过组合多种不同的制剂来制备。冻干的I型牛胶原可以用于制备组合物。另外或可替代地，可以使用人胶原。在添加离子和组合物的其他组分之前，可以中和I型胶原。在本发明的一些实施方案中，一种或多种交联剂与碱组合形成A部分，I型胶原与离子例如钠离子和/或钙离子组合形成B部分；将A部分和B部分混合以形成溶液，然后将溶液施加至表面。在一些实施方案中，A部分和B部分以(1-20):(200-300)的比率混合。在进一步的实施方案中，该比率是9:250。本领域技术人员将认识到可以使用各种方案来制备本发明的组合物并且可以使用各种缓冲溶液来将胶原保持在生理pH并维持溶解度。
在本发明的一些实施方案中，交联剂是纤维蛋白原和凝血酶。在一些实施方案中，包含凝血酶的I型胶原制剂可以与包含纤维蛋白原的I型胶原制剂分开保存，并且可以在施用组合物之前或期间将两种制剂组合。
在一些实施方案中，可以通过建立两种分离组分的单独流动流来提供I型胶原加纤维蛋白原和I型胶原加凝血酶制剂。这些流可以在合适的时间段内保持连续流动的状态，并定向为在给定点相互混合，从而提供沉积在生物靶标上的进一步的混合组分流。可替代地，可以将物流定向为在施用组合物的生物靶标的表面处或表面上相互混合。在不添加血小板裂解物的情况下，使用纤维蛋白原和凝血酶作为交联剂的本发明的组合物可能不透明。此类不透明的胶原生物墨水可以用于比眼科更广泛的应用。
本发明的组合物可以包含血小板裂解物(例如哺乳动物血小板裂解物、人血小板裂解物)。血小板裂解物可以通过任何合适的方法制备(例如，通过冷冻/解冻进行裂解；参见，例如，Chou和Burnouf,ISBT Science Series,第12卷,第1期,2017年2月,第168-175页)。向由纤维蛋白原和凝血酶交联的本发明组合物中添加血小板裂解物可能使组合物变得透明。
另外，本发明人已观察到，在制备血小板裂解物的过程中(例如在培养时)使用抗凝剂可以对血小板裂解物形成根据本发明的组合物的能力产生影响。因此，在本发明的一些实施方案中，在制备方法的一些或所有阶段，在没有抗凝剂(例如肝素)的情况下制备所使用的血小板裂解物。
在一些实施方案中，本发明提供了有助于分离形成本发明组合物所需的不同制剂直至使用的装置和/或试剂盒。在一些实施方案中，装置和试剂盒可以包含至少两个物理分离的隔室，第一隔室包含具有离子和凝血酶的胶原溶液制剂，并且第二隔室包含具有离子和纤维蛋白原的胶原溶液制剂。在一些实施方案中，任一或两个隔室可以包含用于生成组合物的额外组分(例如血小板裂解物、离子、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、维生素、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)。
装置和试剂盒可以进一步包含提供一种促进混合两种分隔的制剂的方法的组分，例如通过去除分离第一和第二隔室的一道或多道屏障，和/或通过刺穿其中任一个或两个隔室的封闭件或壁来促进混合。本领域技术人员将容易理解，为此目的可以进行各种布置。
另外地或替代地，装置和试剂盒可以以确保在从装置或试剂盒释放制剂期间或之后混合两种分隔的制剂的方式配置。
在一些实施方案中，装置和试剂盒可以包含额外的隔室，该隔室包含用于生成组合物的额外组分(例如血小板裂解物、离子、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)。装置或试剂盒可以以这样的方式配置：在装置或试剂盒的使用期间促进这些额外组分相互混合和/或与纤维蛋白原和/或凝血酶的一种或多种制剂混合。
装置和试剂盒可以在从装置或试剂盒中排出组分之前、期间或之后立即促进分离的组分混合。
在一些实施方案中，组合物是生物墨水并且装置是三维(3D)打印机(例如挤压打印机)。
在本发明的一些实施方案中，交联剂是核黄素。在一些实施方案中，核黄素可以被UV光或蓝光激活。可以将可能含有I型胶原和钠和/或钙离子的溶液挤出成一条线，并且可以施加UV光或蓝光。可以在第一条线的顶部施加额外的线以形成将通过交联剂和施加光而交联的结构。
在一些实施方案中，光交联发生在15分钟以内、14分钟以内、13分钟以内、12分钟以内、11分钟以内、10分钟以内、9分钟以内、8分钟以内、7分钟以内、6分钟以内、5分钟以内、4分钟以内、3分钟以内、2分钟以内或1分钟以内。使用的光源可以是3mW/cm2 365nm UV、10mW/cm2蓝光或组织培养罩UV灯。
在一些实施方案中，光交联剂玫瑰红。在一些实施方案中，玫瑰红被绿光激活。在一些实施方案中，玫瑰红被白光激活。在一些实施方案中，光交联发生在15分钟以内、14分钟以内、13分钟以内、12分钟以内、11分钟以内、10分钟以内、9分钟以内、8分钟以内、7分钟以内、6分钟以内、5分钟以内、4分钟以内、3分钟以内、2分钟以内或1分钟以内。使用的光源可以是100mw/cm2白光。本领域技术人员将认识到，光源和参数可以根据特定的应用而变化。
本发明的胶原凝胶可以根据应用具有不同的厚度，例如，凝胶的厚度可以为50μm至5mm。
组合物的应用
本发明人已经开发了一种用于将一种或多种药剂递送至靶组织和细胞的组合物，该组合物具有使其非常适合生物打印的特性。本发明的组合物可以用于需要递送试剂(例如天然生长因子、药物、纳米颗粒和/或细胞)和/或固定个体生物表面的应用中，和/或组织培养方法中。
在一些实施方案中，组合物可以用作组织封闭剂和/或用作生物结构的固定剂。它们可以为组织提供结构和/或营养支持。另外或可替代地，组合物可以促进一种或多种靶细胞类型的生长，包括可以作为组合物的组分提供的那些和/或存在于靶组织中的细胞。
在一些实施方案中，通过将胶原生物墨水与玫瑰红和合适的光源交联而提供的组合物将被着色。在一些实施方案中，胶原组合物可以是粉红色的。这些有色组合物可以用于监测组织中的胶原代谢，或用于需要跟踪胶原活性的其他用途。
尽管对于可以应用组合物的组织类型没有限制，但本发明人已经证明组合物在封闭眼组织方面是有效的。
例如，本文证明了该组合物在封闭角膜组织方面是有效的。在这些实施方案中，该组合物可以用于促进角膜上皮细胞的增殖和/或迁移。该组合物可以例如，支持角膜上皮细胞的多向生长和/或分层，一旦形成细胞单层，其可以部分或完全生物降解组合物。
本发明因此提供了用于封闭组织和将多种药剂递送至生物靶标的方法。例如，靶标可以位于眼组织中或周围，眼组织包括中央和/或外周角膜上皮、球和/或睑结膜上皮、睑结膜基质和/或睑缘的组织。
本领域技术人员将理解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
实施例
现在将参考具体实施例描述本发明，这些实施例不应该被解释为以任何方式进行限制。
实施例一：胶原生物墨水的制备与表征
材料和方法
1.1I型胶原(I型胶原)溶液的制备
根据制造商的方案制备I型胶原粉末(牛皮肤，Sigma-Aldrich)。在以800rpm的速度连续搅拌16小时的情况下，将粉末溶解在0.1M乙酸溶液(pH＝2.72)中。然后用肉眼观察混合物以确认胶原粉末完全溶解。然后将胶原溶液转移到1.5ml Eppendorf管中并储存在冰箱中。
1.2测试离子对中性I型胶原溶液稳定性的影响
对于生成的每种溶液，用2.7份5M NaOH中和90份胶原溶液，然后与7.3份各种盐溶液混合。测试的溶液包括1×磷酸盐缓冲盐水((PBS)，由NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4组成)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4和抗坏血酸钠(NaC6H7NO6)。每种测试的离子的浓度列于表1。在检查沉淀形成之前，将溶液在工作台上放置1小时、1天和1周。
表1：测试中使用的离子的浓度
1.3生成可光交联的胶原生物墨水
-将核黄素溶解在20mg/ml CaCl2溶液中
通过将0.5和1mg核黄素粉末分别加入500μL的2mg/ml CaCl2溶液中来制备0.1％(w/v)和0.2％(w/v)的核黄素溶液。将管涡旋2分钟，并通过在小型离心机中将管离心1分钟来检查沉淀。
将核黄素粉末(Sigma-Aldrich)以1mg/ml的终浓度添加到新制备的添加了离子的中性胶原溶液中。涡旋对于将核黄素粉末完全溶解在胶原生物墨水中是必要的。添加了核黄素的胶原生物墨水可以在铝箔包裹的Eppendorf管中在-30℃下冷冻。
添加了核黄素的胶原生物墨水通过各种光源进行光交联，包括3mw/cm2 365nmUV、10mW/cm2蓝光和组织培养罩UV灯。
1.4生成可光交联的基于人胶原的胶原生物墨水
通过涡旋10分钟将I型胶原粉末(人皮肤，Sigma-Aldrich)溶解在0.1M乙酸溶液中。然后用肉眼观察混合物以确认胶原粉末已经完全溶解。然后将胶原溶液转移到0.5mlEppendorf管中进行进一步处理。
用2.7份5M NaOH中和人胶原溶液(90份)，然后与7.3份各种盐溶液混合。然后加入核黄素粉末(Sigma-Aldrich)至终浓度为1mg/ml。然后通过3mw/cm2 365nm UV将添加了核黄素的人胶原溶液光交联2分钟。将玫瑰红粉末(Sigma-Aldrich)以1mg/ml的终浓度添加到刚制成的中性胶原溶液(与用于核黄素的相同)中。含有玫瑰红的胶原墨水通过发出100mw/cm2白光的白光LED进一步交联2分钟。
1.5使用玫瑰红和绿光生成可光交联的基于胶原的胶原生物墨水
将玫瑰红粉末(Sigma-Aldrich)以1mg/ml的终浓度添加到新制备的中性胶原溶液中。含有玫瑰红的胶原墨水通过发出100mw/cm2白光的白光LED交联2分钟。
结果
1.6I型胶原(I型胶原)溶液的制备
发现高达15mg的I型胶原粉末(牛皮肤，Sigma-Aldrich)可以完全溶解在1ml的0.1M乙酸中而不会产生沉淀。
1.7测试离子对中性I型胶原溶液稳定性的影响
结果表明，稳定中性胶原溶液的最低Na+浓度为136.9mM，不包括135mM NaOH中的Na+。Ca2+的最低浓度为18mM(图1)。与处于或超过最低浓度的Na+的组合离子结果也显示出I型胶原的稳定溶解度。结论是包括NaCl(以68.4mM的最低浓度)或CaCl2(最低浓度为18mM)对于组成可溶性胶原生物墨水是最优的。
1.8生成可光交联的胶原生物墨水
-将核黄素溶解在20mg/ml CaCl2溶液中
核黄素粉末很容易溶于2mg/ml CaCl2(0.1％w/v，0.5mg在500uL溶液中)形成透明的黄色溶液(图2a)，然而1.0mg核黄素没有完全溶解(0.2％w/v)产生不透明的溶液(图2b)。
如图3所示，按照1.1至1.3节中所述方法制备的胶原生物墨水可以在2分钟内通过3mw/cm2 365nm UV、10mw/cm2 470nm蓝光交联，形成粘附在载玻片上的胶原凝胶。组织培养罩杀菌UV(254nm UV)可以在15分钟内交联胶原生物墨水。
1.9生成可光交联的基于人胶原的胶原生物墨水
按照1.4节中所述制备的基于人胶原的生物墨水可以在2分钟内通过3mw/cm2365nm UV交联，形成粘附在载玻片上的胶原凝胶(图4)。
1.10使用玫瑰红和绿光生成可光交联的基于胶原的胶原生物墨水
加入玫瑰红作为光交联剂的I型胶原溶液可以在2分钟内通过100mw/cm2白光交联，形成粘附在载玻片上的粉红色的胶原凝胶(图5)。
与核黄素交联不同，冲洗后颜色不会褪色，因为玫瑰红分子与I型胶原蛋白结合。通过这种方法交联的胶原生物墨水仍然具有粘性，并且可以用于监测组织中的胶原代谢，或用于需要跟踪胶原活性的其他用途。
上述非限制性实施例展示了高达15mg/ml的天然I型胶原在透明胶原生物墨水制备中的用途，其可在短短两分钟内交联以形成透明胶原凝胶。该实施例还展示了人胶原在生物墨水制备中的用途。
上述实施例还表明，使用其他离子代替钙不太可能取得很好的效果。为了中和目的，必须存在钠。钙的添加提高了墨水的储能模量。其他离子(诸如钾)必须以远远超过生理范围的量添加以稳定胶原溶液，因此不适用于本发明的胶原生物墨水。
实施例二：胶原生物墨水的机械测试
材料和方法
2.1胶原生物墨水的光流变性
通过光流变学测试检验了刚制成的胶原生物墨水和冷冻胶原生物墨水的流变特性。对于刚制成的胶原生物墨水，测试了具有不同胶原浓度的PBS和CaCl2(表2，样品1-4)。根据1.3节中所述方法，将核黄素粉末(Sigma-Aldrich)与胶原溶液混合。交联状态(由储能模量表示)由TA仪器AR-G2流变仪与具有固定365nm波长的Omnicure 1000UV灯耦合评估。由12mg/ml胶原溶液、18mM Ca2+和1mg/mL核黄素制成的胶原生物墨水在-30℃下储存1周，然后在光折变测试前解冻(表2，样品5)。
表2：用于光流变测试的胶原生物墨水样品
| 样品编号 | I型胶原浓度 | 缓冲液 |
| 1 | 12mg/ml | 1×PBS |
| 2 | 12mg/ml | 18mM CaCl<sub>2</sub> |
| 3 | 6mg/ml | 18mM CaCl<sub>2</sub> |
| 4 | 3mg/ml | 18mM CaCl<sub>2</sub> |
| 5 | 12mg/ml | 18mM CaCl<sub>2</sub>(冷冻) |
使用20mm平板(几何间隙＝300μm)几何结构。将胶原生物墨水(120μL)加载到板上。在室温下进行测试。将UV强度调整为3.2mw/cm2。在34℃下以0.2Hz频率和1％应变将胶原生物墨水振荡10分钟。在2分钟时间点将UV施加于胶原生物墨水。
记录胶原生物墨水的储能模量和损耗模量随时间的变化。肉眼观察交联后的胶原生物墨水。
2.2胶原生物墨水的旋转测试
对于旋转测试，60μL含有18mM Ca2+的6mg/ml胶原生物墨水在34℃下从几何结构接受剪切率从0.1％至20％增加的剪切力。监测胶原生物墨水的粘度。
2.3掺入抗坏血酸盐的胶原生物墨水的储能模量测量
使用具有15mm直径锥板(corn-and-plate)几何结构(几何间隙＝55μm)的TA仪器AR-G2流变仪测量掺入抗坏血酸盐的胶原生物墨水(含有68.4mM抗坏血酸钠的6mg/ml胶原生物墨水)和对照(含有68.4mM NaCl的6mg/ml胶原生物墨水)的储能模量。在测量储能模量之前，用3mw/cm2365nm UV处理胶原生物墨水16秒。对于储能模量测量，将60μL胶原生物墨水以0.2Hz频率和1％应变振荡10分钟。记录胶原生物墨水的储能模量和损耗模量。
2.4通过交联胶原生物墨水制备薄膜
将少量添加了核黄素的胶原生物墨水转移到载玻片表面。进一步展开载玻片上的胶原生物墨水以覆盖尽可能多的区域，而不会在扩散区域内留下间隙。这是通过使用移液器尖端小心地涂抹生物墨水来完成的。然后通过3mw/cm2 365nm UV固化灯将胶原生物墨水交联2分钟，然后在PBS中洗涤多次以去除核黄素。测量交联的凝胶的厚度。通过使用镊子将其提起并浸入Milli-Q水中，观察交联的凝胶的柔韧性和强度。
2.5交联的胶原生物墨水的分光光度法测量
对通过使用1.3节中所述的方法交联胶原生物墨水而产生的薄膜的光学特性进行评估，该胶原生物墨水由含有18mM Ca2+和0.1％核黄素的6mg/ml胶原溶液组成。将分光光度计设置为测量可见光范围的总透射率，并使用圆形3d打印样品架读取背景。将胶原膜小心地转移到样品架上，然后将样品架装入分光光度计。得到总透射率曲线。
2.6使用线堆叠测试检查初步打印潜力
在工作台上设置打印台，其打印区域为100mm培养皿的直径2cm的中心区域。将3mw/cm2的UV处理持续施加于打印区域。经由20μL移液管通过移液缓慢挤出具有6mg/ml胶原溶液(含有18mM Ca2+和0.1％核黄素)成分的胶原生物墨水，以绘制10mm×1mm的线。在进一步的UV处理1分钟后，如前所述在前一条线的顶部绘制另一条线。总共进行了10次堆叠以形成3-D结构。通过将10条绘制的线逐一叠加起来制成了一个简单的3-D结构。通过用镊子操纵检查结构的形状和完整性。
结果
2.7胶原生物墨水的光流变特性
如图6a所示，在1×PBS中12mg/ml的胶原生物墨水的储能模量在UV照射1分钟后从1.7Pa达到10Pa，证明了光交联。所得凝胶是一种相对较弱的凝胶，储能模量为10Pa(图6a)。对于在18mM Ca2+中的相同浓度的胶原溶液，在UV照射1.5分钟后开始快速交联，并导致储能模量为70Pa的更强的凝胶(图6b)。
对于含有18mM Ca2+的6mg/ml胶原生物墨水，交联后的储能模量为40Pa，而含有18mM Ca2+的3mg/ml胶原生物墨水的储能模量为1.5Pa。快速交联所需的最短UV照射时间没有差异(图6c和图6d)。
储存在-30℃冷冻箱中并在测试前解冻的胶原样品(6mg/ml、添加了核黄素、含有18mM Ca2+的胶原生物墨水)能够在1.5分钟的交联时间内进行光交联。与刚制成的具有相同成分的样品相比，交联的胶原墨水的储能模量增加了5倍(图6d和图6e)。根据肉眼观察，与刚制成的具有相同成分的样品(图7a)相比，储存在-30℃冷冻箱中的胶原样品在交联后形成更坚固的凝胶(图7b)。
2.8胶原生物墨水的旋转测试
旋转测试的结果表明，6mg/ml、添加了核黄素、含有18mM Ca2+的胶原生物墨水具有剪切稀化行为，其粘度随剪切速率而降低(图8)。改特性对于挤压3D打印是需要的。
2.9掺入抗坏血酸盐的胶原生物墨水的储能模量测量
与具有相同胶原浓度但不含抗坏血酸盐的胶原生物墨水(储能模量为300kPa)相比，掺入抗坏血酸的胶原生物墨水在UV处理10分钟后显示几乎一半的储能模量(120kPa)(图9)。添加抗坏血酸后，由UV照射引发的光交联的强度减半。
2.10不同厚度胶原凝胶的制备
在100μm处测量生成的胶原凝胶的最小厚度。如肉眼观察到的，生成的胶原凝胶是透明的。它可以很容易地用镊子夹起，而不会以折叠的方式折断(图10a)。在没有额外力的情况下，凝胶在浸入Milli-Q水中的同时展开(图10b)。
2.11交联的胶原生物墨水的分光光度法测量
分光光度法结果表明，穿过交联的胶原生物墨水的光的亮度的降低小于10％(图11)。光谱表明，胶原凝胶在可见光范围内的总透射率超过90％(图11)。
2.12使用线堆叠测试检查初步打印潜力
使用2.6节中所述方法，可以堆叠10条6mg/ml胶原生物墨水线以形成结构，并且可以用镊子夹取而不分离层(图12a)。胶原浓度为12mg/ml的胶原生物墨水也可以堆叠成10层以形成类似的结构，也可以在没有结构损伤的情况下夹取该结构(图12b)。
上述非限制性实施例中的结果表明，本发明的胶原生物墨水能够凝胶化，因为储能模量大于损耗模量。生物墨水还展示出剪切稀化，这对于基于挤压的3D生物打印是理想的特性。
穿过交联的胶原生物墨水的光的亮度的降低小于10％，因此证明了不妨碍或基本上妨碍由光透射引起的视觉的光学清晰度。该实施例证明了胶原凝胶在400-700nm的视觉颜色范围内的总透射率超过90％。
实施例三：胶原生物墨水的体外生物相容性测试
材料和方法
3.1使用胶原凝胶培养人角膜上皮细胞系(HCET)和人角膜基质细胞(HCSCs)
在37℃ 5％CO2培养箱中，在HCET生长培养基中培养经转化的人角膜上皮细胞，该培养基由杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)(Thermo FisherScientific)、5％(v/v)胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)和10ng/ml人上皮生长因子(hEGF)(Thermo Fisher Scientific)组成。细胞在达到85％-90％的融合后即可传代进行实验。
通过在10％FBS细胞培养基中培养供体组织外植体来获得人角膜基质细胞，该培养基是在DMEM/F12中的10％FBS。细胞在达到80％-85％的融合后即可传代进行实验。
在本实验中，胶原生物墨水由6mg/ml的I型胶原和1％核黄素组成，并使用18mMCaCl2。将体积为2ml的胶原生物墨水转移到35mm培养皿中，通过组织培养罩UV交联1小时，并用PBS漂洗多次以去除由核黄素引起的淡黄色。
将HCET细胞以5×104个细胞/cm2的接种密度接种在胶原凝胶的顶部。培养皿保存在37℃ 5％CO2培养箱中。将HCSC也以5×104个细胞/cm2的接种密度接种在胶原凝胶上并保存在37℃ 5％CO2培养箱中。每两天更换一次细胞培养基。通过Olympus IX71倒置显微镜观察细胞生长情况。
当细胞在胶原凝胶表面达到融合时，使用直径为4mm的环钻去除部分胶原凝胶。将收获的胶原凝胶片固定并冷冻切片为20μm切片。使用DAPI对切片中的细胞核进行染色。
3.2使用HCET的细胞递送实验
由6mg/ml的I型胶原、1％核黄素和18mM CaCl2组成的胶原生物墨水用于本实验。胶原生物墨水与HCET细胞在其生长培养基中混合以获得1×106个HCET细胞/ml的密度。然后使用带有200μL移液器尖端的200μL移液器缓慢移取含有细胞的胶原生物墨水，以在35mm培养皿中绘制3条线。三条胶原仿生线然后接受2分钟的3mw/cm2 365nm UV处理。UV处理后，向培养皿中加入2ml细胞培养基。培养皿保存在具有5％CO2的37℃培养箱中。每两天更换一次细胞培养基。每天使用Olympus IX71倒置显微镜观察培养皿。
3.3使用hCSC的细胞递送实验
由6mg/ml的I型胶原、1％核黄素和18mM CaCl2组成的胶原生物墨水用于本实验。胶原生物墨水与人角膜基质细胞(hCSC)细胞在其生长培养基中混合以获得5×104个细胞/ml的密度。然后使用带有200μL移液器尖端的200μL移液器缓慢移取含有细胞的胶原生物墨水，以在35mm培养皿中绘制一条线。胶原生物墨水线然后接受1分钟的3mw/cm2 365nm UV处理。UV处理后，向培养皿中加入2ml细胞培养基。培养皿保存在具有5％CO2的37℃培养箱中。每两天更换一次细胞培养基。每天使用Olympus IX71倒置显微镜观察培养皿。
3.4使用溴脱氧尿苷/5-溴-2'-脱氧尿苷的细胞增殖试验
溴脱氧尿苷/5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)是一种可以在其合成过程中掺入DNA中的化学物质，因此可以用于测量细胞增殖。较高的BrdU读数表明合成的DNA量较高，这意味着更多的细胞增殖。
使用来自Abcam的BrdU细胞增殖ELISA试剂盒(化学发光)。根据制造商的说明，将HCET细胞(1000个细胞/孔)或人角膜基质细胞(hCSC)(3000个细胞/孔)接种到96孔板中。在两种条件下测试细胞：细胞接种在胶原凝胶顶部，具有BrdU染色(实验组1)、细胞接种在胶原凝胶顶部，没有BrdU染色(BrdU背景1)、细胞在没有胶原凝胶的情况下接种，但含有BrdU染色(实验组2)和细胞在没有胶原凝胶和BrdU染色的情况下接种(BrdU背景2)(表3)。
表3：用于HCET和人角膜基质细胞的BrdU细胞增殖ELISA试剂盒的实验组
本实验中用于形成胶原凝胶的胶原生物墨水由6mg/ml胶原、1％核黄素和18mMCa2+组成。
在含有5％FBS的DMEM/F12中培养HCET细胞。在培养结束前2小时将BrdU添加到设计的孔中。在无血清角膜细胞生长培养基中培养人角膜基质细胞，该培养基由杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)(Thermo Fisher Scientific)、1％(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)(Thermo Fisher Scientific)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(FGF-碱性)(Thermo Fisher Scientific)和1mM抗坏血酸组成。在培养结束前4小时将BrdU添加到指定的孔中。
结果
3.5使用胶原凝胶培养人角膜上皮细胞系(HCET)和人角膜基质细胞(HCSC)
相差显微镜观察显示HCET细胞可以在细胞培养的7天内在胶原凝胶表面达到融合(图13a)。接种了细胞的胶原凝胶横截面的DAPI染色(其染色细胞核)表明，一些细胞在细胞培养过程中迁移到胶原凝胶体中(图13b)。
HCSC也在7天内达到融合(图14a)。当细胞达到融合时，可以观察到胶原凝胶的降解(图14b)。
3.6使用HCET的细胞递送实验
图15a示出了在第1天包封在交联的胶原中的细胞。在第5天可以观察到细胞迁移和增殖，而交联的胶原生物墨水的结构在细胞迁移后仍然完好无损(图15b)。
3.7使用hCSC的细胞递送实验
图16中的图像示出了在第3天观察到了胶原凝胶体内的细胞迁移和增殖，并且在第7天细胞开始迁移出胶原凝胶。在此过程中没有观察到胶原凝胶的降解。
3.8使用溴脱氧尿苷/5-溴-2'-脱氧尿苷的细胞增殖试验
与BrdU一起孵育2小时后，在胶原凝胶顶部的HCET细胞的BrdU读数显著高于(p＝0.04)在组织培养板上的细胞(图17)。与BrdU一起孵育4小时后，在胶原凝胶顶部的人角膜基质细胞也显示出比在组织培养板上的细胞显著更高的BrdU读数(p＝0.01)(图18)。
本实施例的结果表明，本发明的胶原生物墨水具有较高的细胞相容性。当接种在胶原凝胶顶部时，生物墨水支持人角膜上皮细胞和人角膜基质细胞的细胞增殖和迁移。结果还表明，UV光交联不影响包封细胞的存活。结果表明，本发明的胶原生物墨水可以用于细胞递送。
实施例四：生成不同版本的胶原生物墨水
材料和方法
4.1掺入IV型胶原的胶原生物墨水的制备
将IV型胶原粉末溶解在6mg/ml酸性胶原溶液中至浓度为0.2mg/ml。在添加18mM钙离子和0.1％核黄素之前，进一步中和掺入IV型胶原的胶原溶液以产生可光交联的掺入IV型胶原的胶原墨水。
4.1.1胶原凝胶表面培养的角膜内皮细胞系
在掺入IV型胶原的交联的胶原生物墨水的顶部培养人角膜内皮细胞系(HCEC-B4G12)，细胞密度为5x104个细胞/cm2。培养基是在营养混合物Ham′s F12和培养基199(F99培养基)的1:1混合物中的5％胎牛血清(FCS)、20μg/ml抗坏血酸、20μg/ml胰岛素和10ng/mlFGF-碱性。在37℃ 5％CO2培养箱中培养细胞，每两天更换一次细胞培养基。
4.2掺入FBS的胶原生物墨水的制备
使用由12mg/ml的I型胶原和18mM CaCl2组成的无菌胶原生物墨水。将九份胶原墨水与一份FBS混合，得到含有10％FBS的胶原墨水。然后将含有10％FBS的胶原墨水进行光交联以形成胶原凝胶。
4.2.1细胞增殖试验
按照3.4节中所描述的方法进行BrdU细胞增殖测定。在DMEM/F12培养基中培养人角膜成纤维细胞，接种密度为2000个细胞/孔。在培养结束前20小时将BrdU添加到指定的孔中。
结果
4.3掺入IV型胶原的胶原生物墨水
在交联的掺入IV型胶原的6mg/ml胶原墨水的顶部培养的人角膜内皮细胞系(HCEC-B4G12)在7天内达到融合(图19)。
4.4掺入FBS的胶原生物墨水
在掺入FBS的胶原凝胶表面培养的人角膜基质细胞显示出比接种在未掺入FBS的胶原凝胶的HCSC更高的BrdU读数(图20)，表明更高的细胞增殖。
该实施例中的结果表明，光交联的胶原凝胶可以很容易地用I型胶原生物墨水与IV型胶原混合制成。由于IV型胶原是角膜内皮细胞粘附的后弹力层的主要成分，该组合可以为角膜内皮细胞培养提供进一步的益处。
实施例五：离体填充/封闭猪角膜
材料和方法
5.1用胶原生物墨水填充角膜基质
在角膜上产生了两种类型的孔—基质孔和穿孔。将猪角膜安装到前房上，并使用直径为2或4mm的环钻去除多达0.5mm深的部分前角膜，导致对基质的非穿透性损伤。在3mw/cm2 365nm UV或10mw/cm2蓝光固化下挤出如在6.1节中制备的具有6mg/ml和12mg/ml胶原、1％核黄素和18mM Ca2+的胶原墨水以填充孔。孔被填满后，施加额外的2分钟UV照射时间。通过在流水下冲洗角膜30秒然后用kimwipes干燥来检查胶原墨水的粘附性。
5.2用胶原生物墨水封闭穿孔
建立IOP模拟系统以测量胶原墨水封闭的角膜的爆裂压力。IOP模拟系统包括高度可调节的注射器，该注射器使用医用聚乙烯管连接到前房。通过向注射器中添加水来产生压力，并通过将水的高度转换为汞的高度(mmHg)来量化。针对正常人IOP和极高IOP测试了22mmHg和50mmHg的两个压力点。
使用0.8mm直径的针、1.5mm直径的针或2mm直径的环钻形成穿孔以穿透固定在前房上的猪角膜。将水连续添加到注射器中以保持压力。然后如上文5.1节中所述，在UV照射或蓝光固化下封闭穿孔下施加6mg/ml和12mg/ml胶原生物墨水以封闭穿孔。然后将Milli-Q水泵入前房以恢复压力。肉眼检查交联的胶原生物墨水和渗漏的情况。
结果
5.3用胶原生物墨水填充角膜基质
在猪角膜中形成的非穿透孔示于图21a(圆圈)。间隙的阶段和在用流水冲洗30s后施加于孔的6mg/ml交联的胶原生物墨水示于图21b(圆圈)。12mg/ml胶原墨水产生了相同的结果(图22a和图22b)。胶原生物墨水还可以在蓝光固化下填充更大的孔(直径4mm)(图23)。
5.4用胶原生物墨水封闭穿孔
本实例中使用的IOP模拟系统示于图24。胶原浓度为6mg/ml的胶原生物墨水能够封闭0.8mm直径的穿孔并在22mmHg和50mm Hg IOP下阻止穿孔泄漏(图25a)。胶原浓度为12mg/ml的胶原生物墨水在22mmHg IOP下未能粘附至穿孔区域(图25b)。
12mg/ml胶原墨水可以封闭1.5mm直径的穿孔并阻止高达50mmHg IOP的泄漏，而6mg/ml胶原墨水无法封闭穿孔(图26a、图26b)。
12mg/ml胶原墨水可以在22mm Hg下封闭2mm直径的穿孔，但无法在较高IOP下防止泄漏(图27a、图27b)。
本实施例的结果表明，6mg/ml胶原生物墨水可以以足够的粘附性直接施加在角膜，因此可以用作角膜组织的封闭剂。对于封闭角膜组织，具有18mM钙离子的6mg/ml胶原浓度的胶原生物墨水似乎是最优组合物。5.3节和5.4节中的结果表明，如果穿孔没有泄漏，12mg/ml胶原墨水可以封闭更大的穿孔。例如，在使用其他手术工具或膜/薄膜堵住渗漏后，12mg/ml胶原墨水将能够封闭直径大于4mm的穿孔。
实施例六：一种生成可交联的胶原墨水的精细方法
材料和方法
6.1制备A部分和B部分
将核黄素粉末(Sigma-Aldrich)以30mg/ml的浓度加入到5M NaOH中，形成胶原生物墨水的A部分。将离子以表4中所列的浓度加入到12mg/ml乙酸胶原溶液中，形成胶原生物墨水的B部分。制备后，将A部分和B部分在Eppendorf管中以9:250的比率混合，以获得含有核黄素的中性胶原生物墨水，其可以被交联。
6.2胶原生物墨水的储存
如上文6.1节所述制备酸性胶原溶液/含有核黄素的中性胶原溶液(胶原生物墨水)，并储存在冰箱(4℃)和冷冻箱(-20℃)中。酸性胶原溶液储存在1.5ml Eppendorf管中，而胶原生物墨水储存在铝箔包裹的Eppendorf管中。在1周/1个月/半年和一年后通过在365nm 3mw/cm2UV下中和和交联或在UV下直接交联来检查两种溶液。
6.3通过交联胶原生物墨水制备胶原膜
将少量添加了核黄素的胶原生物墨水转移到石蜡包裹的载玻片表面。将每片厚度为0.1mm的两个0号盖玻片添加到载玻片的两侧，与胶原滴的距离至少为1cm。然后将1mm厚的石蜡包裹的聚丙烯板放在载玻片顶部，这将胶原滴压平至0.1mm厚。然后通过3mw/cm2 UV固化灯或10mw/cm2蓝光固化灯将胶原墨水交联3分钟。交联后将膜从载玻片上取下并在PBS中洗涤。通过滚动和自膨胀试验观察膜的柔韧性和强度。
6.4 3D打印测试
对开发的胶原墨水进行3D打印测试。使用3D打印机(TRICEP，University ofWollongong)。将胶原墨水装入铝箔包裹的带有25号打印头的5mm直径注射器中。使用10mw/cm2 470nm蓝光协助打印和交联胶原生物墨水。对于网状打印测试，挤出速率设置为0.5mm/min，并且打印速度设置为150mm/min。
6.5细胞打印测试以打印装有细胞的角膜状结构
上文6.4节中使用的打印机设置在经过20分钟UV消毒的无菌生物打印罩中。胶原墨水是通过上文6.1节中所述方法制备的，B部分也接受20分钟的UV消毒。将A部分和B部分混合后，将胶原生物墨水与10％FBS DMEM/F12细胞培养基以9:1的比例进一步混合，该培养基含有的细胞数为200万个细胞/毫升，然后在无菌罩中装入与上文6.4节中使用的相同的注射器中。将打印的结构在组织培养基中培养。在打印后2周进行钙黄绿素-AM染色，对活细胞进行染色，以检查细胞活力。
结果
6.6可交联的胶原生物墨水的A部分和B部分的滴定
将50、100、150、200和250μL的胶原墨水B部分(含有钙离子的酸性胶原墨水)与特定体积的胶原墨水A部分混合，以使生物墨水达到中性pH并且是可交联的。每体积B部分所需的A部分的量示于表4中。A部分和B部分的体积关系是线性的(图28)，表明A部分和B部分具有0.036的固定比率，并且可以根据该比例容易地制备。
表4：每体积B部分所需的A部分的量
| A部分 | B部分 |
| 1.8μL | 50μL |
| 3.6μL | 100μL |
| 5.4μL | 150μL |
| 7.2μL | 200μL |
| 9.0μL | 250μL |
6.6胶原生物墨水的储存
储存测试的结果提供于表5中。
表5：储存在不同条件下的胶原墨水的特性
6.8制备不同厚度的胶原凝胶
可以通过蓝光固化生成胶原膜。在100μm处测量生成的胶原凝胶的最小厚度。通过肉眼观察判断生成的胶原凝胶是透明的。凝胶可以很容易地用镊子夹起，而不会以折叠的方式折断(图29a)。在没有额外力的情况下，凝胶在浸入Milli-Q水中的同时展开(图10b)。通过这种方法生成的交联的胶原结构可以厚达4mm(图30)。
6.9使用3D挤压打印机的打印测试
使用打印机按照上文6.4中所述的方法打印双层10cm×10cm网(图31)。打印后网的线条没有连接，这表明胶原墨水适用于3-D打印，并且与具有UV/蓝光固化附件的挤压3-D打印机兼容。
6.10细胞打印测试以打印装有细胞的角膜状结构
使用6.5节中所述方法打印装载细胞的结构。打印后将打印的结构转移到细胞培养基中。钙黄绿素-AM染色显示细胞在2周后仍有活力(图32)。
Claims (43)
1.一种组合物，包含：
-3-15mg/ml的I型胶原；
-0.135-0.5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；和
-一种或多种交联剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述一种或多种交联剂能够被光激活。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述光是UV光、蓝光、绿光或白光。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含纤维蛋白原和/或凝血酶。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含1.6-6mg/ml的纤维蛋白原。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的组合物，其中所述组合物包含1-5U/mL的凝血酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包含含有所述离子和氨基酸的培养基。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的组合物，其中：
(i)所述生长因子包含人表皮生长因子(hEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)；和/或
(ii)所述维生素包含抗坏血酸盐(维生素C)；和/或
(iii)所述基质蛋白包含IV型胶原；和/或
(iv)所述激素包含胰岛素；和/或
(v)所述糖蛋白包含转铁蛋白。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述离子是包括在所述组合物中的离子盐的组成部分。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含哺乳动物细胞。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞包含人细胞或由人细胞组成。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述I型胶原是中性的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：
(i)3-15mg/ml的I型胶原、0.135-0.2M的钠离子和0.01-0.05M的钙离子；或者
(ii)4-12mg/ml的I型胶原、0.135-0.16M的钠离子和0.015-0.03M的钙离子；或者
(iii)5-11mg/ml的I型胶原、0.135-0.14M的钠离子和0.018-0.02M的钙离子。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：
(i)少于15mg/ml的I型胶原；
(ii)超过0.135M的钠离子；和
(iii)超过0.018M的钙离子。
17.一种制备组合物的方法，所述方法包括：
(i)提供溶液，所述溶液包含:
-3-15mg/ml的I型胶原；
-一种或多种交联剂；和
-0.135-5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；
(ii)将所述溶液施加至表面；和
(iii)向所述溶液施加能够激活所述一种或多种交联剂的光。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述溶液施加至表面形成层，并且其中重复步骤(ii)和步骤(iii)多次，其中将每一层施加至前一层之上。
19.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中所述一种或多种交联剂包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红，并且其中所述光包括UV光、蓝光、绿光或白光。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中：
(a)将所述一种或多种交联剂与碱合并以形成A部分；
(b)所述I型胶原与所述钠离子和/或钙离子合并以形成B部分；以及
(c)在步骤(iii)之前，将A部分和B部分混合以形成溶液。
21.一种制备组合物的方法，所述方法包括：
(i)提供溶液，所述溶液包含:
-3-15mg/ml的I型胶原；
-一种或多种交联剂；和
-0.135-5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；以及
(ii)将所述溶液施加至表面，其中在施加至所述表面之前将所述溶液分成至少两个组成部分。
22.根据权利要求21所述的方法，其还包括以下步骤：
(iii)将纤维蛋白原添加到至少一个组成部分中以形成配制品(a)；
(iv)将凝血酶添加到至少一个组成部分中以形成配制品(b)；以及
(v)将配制品(a)和(b)合并以形成凝胶。
23.根据权利要求22所述的方法，其中：
-在步骤(iii)中将1.6-6mg/ml的纤维蛋白原添加到至少一个组成部分中以形成配制品(a)；和/或
-在步骤(iv)中将1.5U/mL的凝血酶添加到至少一个组成部分中以形成配制品(b)。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述溶液包含含有所述离子和氨基酸的培养基。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中：
(i)所述生长因子包含人表皮生长因子(hEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)；和/或
(ii)所述维生素包含抗坏血酸盐(维生素C)；和/或
(iii)所述基质蛋白包含IV型胶原；和/或
(iv)所述激素包含胰岛素；和/或
(v)所述糖蛋白包含转铁蛋白。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述离子是包括在混合物中的离子盐的组成部分。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含哺乳动物细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含人细胞或由人细胞组成。
30.根据权利要求17至29中任一项所述的方法，其中所述I型胶原是中性的。
31.一种由根据权利要求17至30中任一项所述的方法获得或能够由根据权利要求17至30中任一项所述的方法获得的组合物。
32.一种封闭组织表面的方法，所述方法包括将根据权利要求1至16或权利要求31中任一项所述的组合物施用于所述组织。
33.一种将药剂递送至组织的方法，所述方法包括将根据权利要求1至16或权利要求31中任一项所述的组合物施用于所述组织。
34.根据权利要求1至16或权利要求31中任一项所述的组合物，用于封闭组织表面。
35.根据权利要求1至16或权利要求31中任一项所述的组合物，用于将药剂递送至组织。
36.包含I型胶原、钠离子、钙离子和一种或多种交联剂的试剂盒、包装或装置用于制备组合物的用途，所述组合物包含：
-3-15mg/ml的I型胶原；
-0.135-5M的钠离子和/或0.008-0.4M的钙离子；和
-所述一种或多种交联剂。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述组合物包含0.01-0.5％(w/v)的核黄素或0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的用途，其中所述一种或多种交联剂能够被光激活。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述光包括UV光、蓝光、绿光或白光。
40.根据权利要求36所述的用途，其中所述组合物包含纤维蛋白原和凝血酶，并且其中
-所述纤维蛋白原存在于第一隔室中；
-所述凝血酶存在于第二隔室中；并且其中
-所述试剂盒、包装或装置被配置为允许在将所述纤维蛋白原和凝血酶装载到所述试剂盒、包装或装置中期间和之后分离所述第一隔室的所述纤维蛋白原和所述第二隔室的所述凝血酶，并且其中所述试剂盒、包装或装置还包括促进所述第一隔室的所述纤维蛋白原与所述第二隔室的所述凝血酶混合的工具。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述组合物包含：
-1.6-6mg/ml的纤维蛋白原；和/或
-1-5U/mL的凝血酶。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含以下中的任一种或多种：培养基、生长因子、激素、基质蛋白、糖蛋白、维生素、除钠离子或钙离子之外的离子、离子源、纤连蛋白、氨基酸、抗生素、麻醉剂、因子XIII、胎牛血清(FBS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的用途，其中所述I型胶原、钠离子、钙离子和/或一种或多种交联剂中的任一种或多种与试剂盒内的其他一种或多种组分分离。
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