CN1599792A - 在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基 - Google Patents
在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1599792A CN1599792A CNA02823992XA CN02823992A CN1599792A CN 1599792 A CN1599792 A CN 1599792A CN A02823992X A CNA02823992X A CN A02823992XA CN 02823992 A CN02823992 A CN 02823992A CN 1599792 A CN1599792 A CN 1599792A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nutrient medium
- liquid nutrient
- aseptic liquid
- brain
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 title claims description 113
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 title claims description 26
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 title abstract 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 123
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 15
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims abstract description 13
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 13
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims abstract description 13
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 13
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims abstract description 13
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 33
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 26
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 26
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 25
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 23
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 22
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 21
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 16
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 16
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-M glutaminate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 13
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 11
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 11
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 11
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims description 10
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 9
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 9
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 9
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 9
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 9
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 9
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- QGNJRVVDBSJHIZ-QHLGVNSISA-N retinyl acetate Chemical group CC(=O)OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C QGNJRVVDBSJHIZ-QHLGVNSISA-N 0.000 claims description 9
- 229940032362 superoxide dismutase Drugs 0.000 claims description 9
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 9
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 8
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 claims description 8
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 8
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 8
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 8
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 8
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 claims description 8
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 claims description 8
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 8
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 8
- 150000003544 thiamines Chemical class 0.000 claims description 8
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 8
- 235000001815 DL-alpha-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 7
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 7
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 7
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000003223 pyridoxals Chemical class 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011627 DL-alpha-tocopherol Substances 0.000 claims description 5
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims description 5
- -1 alpha-tocopherol acetates Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims description 5
- 150000008542 L-histidines Chemical class 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 4
- 150000008543 L-isoleucines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000008544 L-leucines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000008547 L-phenylalanines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000008550 L-serines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- 150000008552 L-tryptophanes Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims description 4
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims description 4
- 150000003772 α-tocopherols Chemical class 0.000 claims description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 3
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 3
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 3
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 3
- FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N Dehydroepiandrosterone Natural products C1C(O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 claims description 2
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002847 prasterone Drugs 0.000 claims description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 2
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 claims 2
- CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone sulfate Chemical compound C1[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 CZWCKYRVOZZJNM-USOAJAOKSA-N 0.000 claims 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 14
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract description 12
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 abstract description 7
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 abstract 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract 1
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 abstract 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 abstract 1
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(III) nitrate Inorganic materials [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 abstract 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 abstract 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 abstract 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 81
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 63
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 30
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 29
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 29
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 25
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 17
- 244000309466 calf Species 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 14
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 10
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 10
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 8
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 7
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 7
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 7
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 7
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 5
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 5
- 208000018389 neoplasm of cerebral hemisphere Diseases 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 5
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 4
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 3
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 210000001543 spongioblast Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 1H-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 2
- 210000004179 neuropil Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 210000003538 post-synaptic density Anatomy 0.000 description 2
- 108010092804 postsynaptic density proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003478 temporal lobe Anatomy 0.000 description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 2
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMZRPKIUHJCHRJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-hydroxypropane-2-sulfonic acid Chemical compound OCC(N)(C)S(O)(=O)=O HMZRPKIUHJCHRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 241000531116 Blitum bonus-henricus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 206010006542 Bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-O CDP-choline(1+) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-O 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 235000008645 Chenopodium bonus henricus Nutrition 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000370738 Chlorion Species 0.000 description 1
- 206010009346 Clonus Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910002554 Fe(NO3)3·9H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000001741 anti-phlogistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000002779 brain fornix Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000005257 cortical tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000003371 gabaergic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 108010091047 neurofilament protein H Proteins 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 208000021090 palsy Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 210000003446 pia mater Anatomy 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000005215 presynaptic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000002241 progressive bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-N sulfonic acid Chemical compound OS(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法。该方法包括对脑或脊髓组织施用含水的无菌液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0－约3000μM CaCl2、约0.1－约1.2μM Fe(NO3) 3、约2500－约10000μM KCl、0－约4000μM MgCl2、约30000－约150000μM NaCl、约100－约30000μM NaHCO3、约250－约4000μM NaH2PO4、约0.01－约0.4μM亚硒酸钠、约0.2－约2μM ZnSO4、约2500－约50000μM D－葡萄糖、约1－约50μM L－肉碱、约3－约80μM 乙醇胺、约15－约400μM D(+)－半乳糖、约40－约800μM腐胺、约20－约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
Description
相关申请
根据35 U.S.C.119(e)，本申请基于2001-10-2由Brewer提交的题为“在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基”的美国临时专利申请No.60/326,658，并要求享受该申请的优先权，在此将其全文并入以供参考。
发明领域
本发明涉及一种维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的经过改进的含水培养基。本发明还涉及维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的改进方法。本发明还涉及将这种改进的培养基用于人类患者神经外科的方法。
发明背景
研究受损中枢神经系统组织的主要问题是维持细胞生存力。无法在各种环境条件下使维持中枢神经系统组织的生存力在培养物中维持较长时间，这曾经阻止了治疗中枢神经系统疾病的有效治疗方案的发展。
最近开发了一种在高二氧化碳气氛(5％CO2)下维持中枢神经系统组织生存力的营养平衡盐溶液(培养基)。NeurobasalTM(Gibco/Invitrogen股份有限公司，Rockville，MD)是能使胚胎大鼠海马神经元在pH 7.3、5％ CO2下生长最优的碳酸氢盐缓冲培养基。该培养基是Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)的衍生物并可优化胚胎大鼠海马细胞的存活率。与DMEM相比，NeurobasalTM含较少NaCl和NaHCO3，这使其渗量降低并含有较少量的半胱氨酸和谷氨酰胺，从而导致神经胶质生长降低。此外，NeurobasalTM含有丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和维生素B12，而这些DMEM都不含有。
尽管神经元可在5％CO2气氛下保持在高碳酸氢盐培养基中，当添加B27(一种获自Invitrogen公司的激素和抗氧化剂添加物)时，当转移到环境CO2条件(约0.2％)时神经元迅速死亡。死亡与培养基pH迅速升高至约8.1有关。
制造和研究神经组织和细胞通常需要在培养箱外使用环境CO2水平。现有控制培养箱外细胞pH的方法包括使用弱缓冲液(如Dulbecco改进的Eagle培养基或L 15培养基中使用的缓冲液)并用5-10％CO2连续吹气以维持生理pH。然而，一个简单的试验显示，环境CO2会使培养箱外DMEM的pH迅速升高至约8.1。通常用HEPES缓冲的做法会减慢，但不能阻止这种实质性的碱化。对组织连续吹气的做法可保持高CO2水平和生理pH，但设备笨重且成本昂贵。
美国专利6,180,404(2001.1.30)，该专利属于本申请相同受让人并被并入以供参考，提供了在环境CO2条件下维持神经细胞的培养基。所述培养基含有少于约2000μM碳酸氢盐(pKa为约6.9-约7.7的缓冲液)、0-约3000μM CaCl2、约0.05-约0.8μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约74000-约103000μM NaCl、约400-约2000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖和约20-约500μM丙酮酸钠，且其中所述培养基基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。这种培养基的一种形式可以商品名HibernateTM购得。优选地，这种培养基添加有B27(一种含有效量激素的促进生长的添加物)、必需脂肪酸和抗氧化剂以使神经细胞生长。
该领域还需要一种改进的培养基，这种培养基可维持生理pH，并可在受损的脑和脊髓组织中提供高神经细胞生存力，在受损的脑和脊髓组织中，受到损伤的血液供应会减少CO2和其它营养物、激素和/或促进再生和/或防止或显著降低退化的生长因子。本发明提供了这种改进的培养基。
脑肿瘤是15岁以下儿童和34岁以上青年中的第二大致死肿瘤。脑肿瘤是65岁以上成年中第二大发展最快的致死肿瘤。与许多其它肿瘤不同，行为改变似乎不会显著降低诸如脑肿瘤的风险。尽管约40％或50％的脑癌是良性的，但良性脑癌也会导致显著损伤和死亡。美国每年约有100,000人被诊断患有原发性或转移性脑肿瘤。只要肿瘤部位许可，通常可用外科手术技术来除去脑肿瘤。手术部位(即蛛网膜下隙、脑薄壁组织和切除腔)通常用生理盐水冲洗，有时还要用浸在生理盐水中的物质包扎。因此，就需要有可用于神经外科以提高神经细胞生存力和/或促进神经细胞再生和/或促进神经细胞分化的改进培养基和方法。这种改进的培养基和方法可用来冲洗或浸泡手术位置和/或用来浸渍或浸透填料(例如，明胶-泡沫海绵)，所述填料在除去肿瘤或其它神经组织后仍留在腔内。本发明提供了这种改进的培养基和方法。
发明概述
一方面，本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，所述方法包括对脑或脊髓组织施用无菌含水液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μMFe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μMNaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及神经元生长有效量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。所述无菌液体培养基还可含有有效量的脱氢表雄酮-4-硫酸盐(DHEAS)以维持激素水平；通常，有效量的DHEAS是约2-约200μM，更优选约5-约100μM。所述无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)以协助支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选用于本发明的FGF2是获自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。更优选地，所述无菌液体培养基含有有效量的DHEAS和FGF2。这种优选的组合物通常含有约5-约50μM DHEAS和约1-约50ng/ml FGF2，更优选约10-约30μM DHEAS和约2-约20ng/ml FGF2。
另一方面，本发明提供了一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.01-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μMMgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM 亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM 乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM 腐胺、约20-约500μM 丙酮酸钠，和对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，其中所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。所述无菌液体培养基还可含有有效量的脱氢表雄酮-4-硫酸盐(DHEAS)以维持激素水平；通常，有效量的DHEAS是约2-约200μM，更优选约5-约100μM。所述无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)，以协助支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选的用于本发明的FGF2是获自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。更优选地，所述无菌液体培养基含有有效量的DHEAS和FGF2。这种优选的组合物通常含有约5-约50μM DHEAS和约1-约50ng/mlFGF2，更优选约10-约30μM DHEAS和约2-约20ng/ml FGF2。
再在另一方面，本发明提供了一种有效提高脑或脊髓损伤或手术后人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力，或有效提高欲输递至人的脑、脊髓或神经系统的神经系统细胞或组织的神经细胞生存力的含水组合物，所述含水组合物含有0-约3000μM CaCl2；约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3；约2500-约10,000μM KCl；0-约4000μMMgCl2；约30,000-约150,000μM NaCl；约100-约30,000μM NaHCO3；约250-约4000μM NaH2PO4；约0.01-约0.4μM 亚硒酸钠；约0.2-约2μM ZnSO4；约2500-约50,000μM D-葡萄糖；约1-约50μM L-肉碱；约3-约80μM乙醇胺；约15-约400μM D(+)-半乳糖；约5-约200μM人白蛋白；约40-约800μM腐胺；约20-约500μM丙酮酸钠；约0.01-约0.32μM运铁蛋白；0-约120μM L-丙氨酸；0-约2400μM L-精氨酸；0-约30μM L-天冬酰胺；0-约60μM L-半胱氨酸；0-约3000μM L-谷氨酰胺；0-约2400μM甘氨酸；0-约1200μM L-组氨酸；0-约5000μM L-异亮氨酸；0-约5000μM L-亮氨酸；0-约5000μM L赖氨酸；0-约1200μML-甲硫氨酸；0-约2400μM L-苯丙氨酸；0-约500μM L-脯氨酸；0-约2400μM L-丝氨酸；0-约5000μM L-苏氨酸；0-约500μM L-色氨酸；0-约2400μM L-酪氨酸；0-约5000μM L-缬氨酸；约0.5-约16μM谷胱甘肽(还原的)；约0.1-约10μMα-生育酚；约0.1-约10μMα-生育酚乙酸酯；约0.001-约0.1μM过氧化氢酶；约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶；约0.001-约0.1μM皮质醇；0-约200μM DHEAS；约0.001-约0.1μM孕酮；约0.02-约1μM醋酸视黄酯；约0.1-约5μM胰岛素；0-约0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；约0.05-约20μM亚油酸；约0.1-约10μM亚麻酸；0-约2.5μM生物素；0-约100μMD-泛酸钙；0-约200μM胆碱；0-约100μM叶酸；0-约240μMi-肌醇；0-约200μM烟酰胺；0-约120μM吡哆醛；0-约6μM核黄素；0-约100μM硫胺和0-约1.2μM钴胺素；其中，所述含水组合物的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
附图简述
图1显示了本发明的无菌液体培养基中DHEAS和FGF2使人神经元存活的协同作用。神经元在有(实心圆)或没有(空心圆)10μM DHEAS和0-约10ng/ml碱性人重组成纤维细胞生长因子(获自Introgen公司，Rockville，MD)的条件下培养6天。数值是来自67岁原发性脑淋巴瘤病例6块0.3mm2区域的平均值和S.E.(标准误差)。三个最低GFG2浓度的多因素ANOVA F(1，10)＝15.2。注意0浓度被人工置于对数x轴上。
图2基于实施例，显示明胶海绵中本发明无菌液体培养基在大鼠伞毛-穹隆(fimbria-fornix)损伤中可保持内隔膜(medial septum)中经过轴索显微外科术(axotomized)的神经元的神经元密度至少一个月。盐水(对照)和本发明无菌液体培养基组中未受损侧的细胞密度分别为每平方毫米61和62个细胞。同时进行第二种对照(伪受损即未受到损伤)。显示了每组6只大鼠的平均值+S.E.。概率是t-试验对比盐水的结果。
图3基于实施例3，显示明胶海绵中本发明的无菌液体培养基提高了吸引术损伤(aspiration lesion)周围大鼠皮层神经元1个月的存活。图A：用本发明的无菌液体培养基(实心圆)处理明显优于用盐水处理(实心三角)的动物，且几乎等于伪受损的脑(未受损的，空心圆)。图B：相对神经元密度，即占未受损侧密度的百分数。比较本发明的碱性无菌液体培养基(实心圆)和用碳酸氢盐缓冲的本发明的无菌液体培养基(方框)和盐水(空心圆)；通常碱性无菌液体培养基优于用碳酸氢盐缓冲的无菌液体培养基。图C：本发明的无菌液体培养基+FGF2(方框)优于DMEM+FGF2(菱形)和盐水(三角)。每个点都是6个动物测量值的平均值和S.E.，它是距损伤边缘的距离的函数。概率由比较本发明的无菌液体培养基和盐水或DMEM的两因素ANOVA确定。
图4同样基于实施例3，显示与盐水(方框)和伪受损(三角相比)，置于皮层吸引术损伤中的明胶海绵内的本发明的无菌液体培养基(圆圈)可消除神经胶质增生，该结果基于GFAP免疫染色。每个点都是20×400μm面积中象素强度的平均值和S.E.，每次处理有3只大鼠，距损伤边缘的距离每次增加20μm，损伤位于软脑膜下1200μm。
图5A基于实施例4，显示在Neurobasal A培养基中培养7天后脑膜瘤细胞的生长，该培养基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。这些细胞在基质上铺展开并增殖，平均细胞面积达到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12细胞)。
图5B基于实施例4，显示培养7天后生长在本发明的培养基上的脑膜瘤细胞未铺展开或增殖(平均面积＝936μm2)(t-试验，比较血清-生长细胞，p＝0.0001)。
本发明的培养基上几乎没有存活细胞。
图5C基于实施例4，显示在Neurobasal A培养基中培养7天后成胶质细胞瘤细胞的生长，该培养基中含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺。这些铺展在基质上并增殖。
图5D基于实施例4，显示培养7天后生长在本发明的培养基上的成胶质细胞瘤细胞未铺展开或增殖。
图6基于实施例4、表3，比较了脑膜瘤细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基(空心圆)和本发明的培养基(实心圆)中的生长。使脑膜瘤细胞生长10天。培养10天后，生长在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中的细胞产生融合生长。用胰蛋白酶处理收集这些细胞，并将其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基或本发明的培养基。细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中继续生长，但在本发明的培养基中生长受到抑制，并有细胞死亡。
图7基于实施例4、表4，比较了各种类型的肿瘤在含有胎牛血清(GIBCO)的Neurobasal A培养基(交叉线柱)和本发明的培养基(实心柱)中的生长。显示了第6或第7天细胞的增加，增加是用第6天或第7天的细胞数除以开始培养时的细胞数。对于这5种连续肿瘤状况，本发明的培养基导致生长停滞或抑制以及细胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培养基使所有原发性肿瘤的细胞增殖而使转移肿瘤的细胞生长停滞。
优选实施方案的描述
本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，所述方法包括对脑或脊髓组织施用无菌含水液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μML-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化剂。用于本发明的培养基提供最少必需的含水培养基以维持神经细胞或组织在含有环境CO2水平环境下的生存力，且通常含有少于约2000μM碳酸氢盐，其渗量为约200-约270mOsm，含有pKa约6.9-约7.7的缓冲液，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。出于本发明的目的，″基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐″是指所述组合物含有少于约0.4μM硫酸亚铁、少于约1μM谷氨酸盐和少于约1μM天冬氨酸盐；优选地，所述组合物不含添加的硫酸亚铁、谷氨酸盐或天冬氨酸盐；更优选地，这些组分的水平接近或就是0。
通常，渗量优选约200-约240mOsm。优选地，以最终浓度表示，所述无菌液体培养基含有500-约2500μM CaCl2、约0.05-约0.6μM Fe(NO3)3、约3000-约8000μM KCl、约300-约2000μM MgCl2、约40000-约103000μM NaCl、约200-约1800μM NaHCO3、约400-约2000μM NaH2PO4、约0.03-约0.2μM亚硒酸钠、约0.4-约1.5μM ZnSO4、约10000-约40000μM D-葡萄糖、约3-约25μM L-肉碱、约6-约40μM乙醇胺、约30-约200μMD(+)-半乳糖、约80-约400μM腐胺，以及约100-约400μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的必需脂肪酸、激素和抗氧化剂。较佳地，优选的脂肪酸脂肪酸、激素和抗氧化剂包括约0.001-约0.1μM皮质醇、约0.5-约16μM还原的谷胱甘肽、约0.05-约20μM亚油酸、约0.1-约10μM亚麻酸、约0.001-约0.1μM孕酮、约0.02-约1μM醋酸视黄酯，0-约0.6μM3，3&APOS；，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、约0.1-约10μMDL-α生育酚、约0.1-约10μM DL-α生育酚乙酸酯、约5-约200μM人白蛋白、约0.001-约0.1μM过氧化氢酶、约0.1-约5μM胰岛素、约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶和约0.01-约0.32μM运铁蛋白。
所述无菌含水液体培养基含有pKa约6.9-约7.7的氢离子缓冲液，当与神经组织接触时，其量足以维持pH在约6.9-约7.7的所需范围。通常，所述氢离子缓冲液的量是约5000-约25000μM。适合用于本发明的缓冲液包括3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸(MOPS)、碳酸氢钠、N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、N，N-二-(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、1，3-二氮杂-2，4-环戊二烯、2-三(羟甲基)氨基乙烷磺酸(TES)等，以及它们的混合物。基础组合物中优选的缓冲液是3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸(MOPS)。碳酸氢钠在本发明中有双重作用。在低水平时(即通常少于约2000μM)，碳酸氢钠与氯离子的转运有关。此外，如上所述，碳酸氢钠可作为缓冲液；当用作缓冲液时，碳酸氢钠当然必需是高水平的(高达约30,000μM)。
本发明的培养基还含有有效量的至少10种必需氨基酸。优选地，用最终浓度表示，所述无菌液体培养基含有：(1)L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸各约250-约2500μM；(2)约150-约1500μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸各约120-约1200μM；(4)L-组氨酸和L-甲硫氨酸各约60-约600μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各约25-约250μM；(6)约6-约60μM L-丙氨酸；(7)约3-约30μM L-半胱氨酸；(8)约1.5-约15μML-天冬酰胺；(9)约12-约120μM i-肌醇，(10)约10-约100μM烟酰胺；(11)约9-约90μM胆碱；(12)约6-约60μM吡哆醛；(13)硫胺、叶酸和D-泛酸钙各约2-约40μM；(14)约0.3-约3μM核黄素；(15)约0.1-1.2μM生物素；和(16)约0.05-约1μM维生素B12。
优选地，所述促进生长的脂肪酸、激素和抗氧化剂包括约0.002-约0.03μM皮质醇、约1-约8μM还原的谷胱甘肽、约1-约10μM亚油酸、约0.2-约5μM亚麻酸、约0.005-约0.06μM孕酮、约0.05-约0.6μM醋酸视黄酯、约0.0005-约0.2μM3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、DL-α生育酚和DL-α生育酚乙酸酯各约0.5-约5μM、约15-约90μM人白蛋白、约0.002-约0.04μM过氧化氢酶、约0.2-约2μM胰岛素、约0.02-约0.25μM超氧化物歧化酶和约0.02-约0.16μM运铁蛋白。
本发明组合物的推荐组分如下表1所示：
表1
| 组分 | 范围(μm) | 优选范围(μM) | 更优选的范围(μM) |
| 无机盐 | |||
| CaCl2 | 0-3000 | 500-2500 | 1200-2400 |
| Fe(NO3)3·9H2O | 0.1-1.2 | 0.05-0.6 | 0.1-0.3 |
| KCl | 2500-10000 | 3000-8000 | 4000-6000 |
| MgCl2 | 0-4000 | 300-2000 | 600-1000 |
| NaCl | 30000-150000 | 40000-103000 | 66000-86000 |
| NaHCO3 | 100-30000 | 200-1800 | 780-980 |
| NaH2PO4·H2O | 250-4000 | 400-2000 | 800-1000 |
| 亚硒酸钠 | 0.01-0.4 | 0.03-0.2 | 0.06-0.1 |
| ZnSO4·7H2O | 0.2-2 | 0.4-1.5 | 0.57-0.77 |
| 其它 | |||
| D-葡萄糖 | 2500-50000 | 10000-40000 | 15000-35000 |
| MOPS | 5000-25000 | 8000-12000 | 9000-11000 |
| L-肉碱 | 1-50 | 3-25 | 6-18 |
| 乙醇胺 | 3-80 | 6-40 | 12-20 |
| D(+)-半乳糖 | 15-400 | 30-200 | 60-100 |
| 人白蛋白 | 5-200 | 15-90 | 30-45 |
| 腐胺 | 40-800 | 80-400 | 160-200 |
| 丙酮酸钠 | 20-500 | 100-400 | 130-330 |
| 运铁蛋白 | 0.01-0.32 | 0.02-0.16 | 0.04-0.08 |
| 氨基酸 | |||
| L-丙氨酸 | 0-120 | 6-60 | 10-30 |
| L-精氨酸·HCl | 0-2400 | 120-1200 | 200-600 |
| L-天冬酰胺·H2O | 0-30 | 1.5-15 | 2.5-7.5 |
| L-半胱氨酸 | 0-60 | 3-30 | 5-15 |
| L-谷氨酰胺 | 0-3000 | 150-1500 | 300-700 |
| 甘氨酸 | 0-2400 | 120-1200 | 200-600 |
| L-组氨酸·HCl·H2O | 0-1200 | 60-600 | 100-300 |
| L-异亮氨酸 | 0-5000 | 250-2500 | 600-1000 |
| L-亮氨酸 | 0-5000 | 250-2500 | 600-1000 |
| L-赖氨酸·HCl | 0-5000 | 250-2500 | 600-1000 |
| L-甲硫氨酸 | 0-1200 | 60-600 | 100-300 |
| L-苯丙氨酸 | 0-2400 | 120-1200 | 200-600 |
| L-脯氨酸 | 0-500 | 25-250 | 60-80 |
| L-丝氨酸 | 0-2400 | 120-1200 | 200-600 |
| L-苏氨酸 | 0-5000 | 250-2500 | 600-1000 |
| L-色氨酸 | 0-500 | 25-250 | 40-160 |
| L-酪氨酸 | 0-2400 | 120-1200 | 200-600 |
| L-缬氨酸 | 0-5000 | 250-2500 | 600-1000 |
| 抗氧化剂 |
| 谷胱甘肽(还原的) | 0.5-16 | 1-8 | 2-4 |
| 维生素E(α-生育酚) | 0.1-10 | 0.5-5 | 1-3 |
| 维生素E乙酸酯(α-生育酚乙酸酯) | 0.1-10 | 0.5-5 | 1-3 |
| 过氧化氢酶 | 0.001-0.1 | 0.002-0.04 | 0.005-0.02 |
| 超氧化物歧化酶 | 0.01-0.5 | 0.02-0.25 | 0.04-0.12 |
| 激素 | |||
| 皮质醇 | 0.001-0.1 | 0.002-0.03 | 0.005-0.015 |
| DHEAS | 0-200 | 5-100 | 10-30 |
| 孕酮 | 0.001-0.1 | 0.005-0.06 | 0.01-0.03 |
| 醋酸视黄酯 | 0.02-1 | 0.05-0.6 | 0.1-0.3 |
| 胰岛素 | 0.1-5 | 0.2-2 | 0.4-0.8 |
| 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3) | 0.0-0.6 | 0.0005-0.2 | 0.02-0.08 |
| 必需脂肪酸 | |||
| 亚油酸 | 0.05-20 | 1-10 | 2.5-4.5 |
| 亚麻酸 | 0.1-10 | 0.2-5 | 0.5-2.0 |
| 维生素 | |||
| 生物素 | 0-2.5 | 0.1-1.2 | 0.2-0.6 |
| D-泛酸钙 | 0-100 | 2-40 | 6-24 |
| 胆碱 | 0-200 | 9-90 | 20-40 |
| 叶酸 | 0-100 | 2-40 | 4-14 |
| i-肌醇 | 0-240 | 12-120 | 20-60 |
| 烟酰胺 | 0-200 | 10-100 | 15-50 |
| 吡哆醛·HCl | 0-120 | 6-60 | 10-30 |
| 核黄素 | 0-6 | 0.3-3 | 0.5-1.5 |
| 硫胺·HCl | 0-100 | 2-40 | 5-20 |
| B12(钴胺素) | 0-1.2 | 0.05-1 | 0.1-0.5 |
本发明的无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)，以参与支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选用于本发明的FGF2是获自Introgen公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。
特别优选所有的组分都是药物等级或更高等级的。此外，对于所有人衍生组分，只要可能，通常优选使用合成组分或经过处理的组分以减低患者接触有害试剂(例如朊病毒、HIV等等)的风险。
添加B27添加物(美国专利6,180,404)的HibernateTM可将活的脑组织在冷冻条件下保持至少一个月，这样就可在实验室之间运送活的脑组织。这种用NeurobasalTM代替HibernateTM的无菌液体培养基也支持任何年龄的成人海马神经元在培养基中再生(Brewer，J.Neurosci.Meth，1997；71：143-155)。从大约3岁大的成年大鼠(相当于人75岁)的脑中可分离约50％活细胞。在培养基中，这些细胞再生出轴突和树突，这清楚证明，在分离过程中经过轴索显微外科术后，成人的神经元可在无菌液体培养基中再生。本发明的这种进步扩使这种培养基可用于修复或损伤受损的脑或脊髓。因此，本发明的这种无菌液体培养基适合在体内临床保存受损的脑或其它神经系统组织中的神经元。
本发明的无菌液体培养基促进成人神经元的存活和再生(Brewer等，J.Neurosci.Methods，2001；107：15)。已证明神经丝、MAP2和τ细胞骨架免疫反应性的神经元特征。培养物可在本发明的无菌液体培养基中保持数周，足够长来证明突触原件的出现。观察到突触结、突触囊泡和突触后密度。由于案例数较少，不能鉴别边缘组织来源程度以外的因子，这些来源可提高神经元而不是神经胶质的频率。将小的组织切片和本发明的无菌液体培养基结合可获得更大成功。早期电灼组织的方法无法制造或的神经元。这里所述的方法，包括用压力部分止血，获得组织，然后进行必需的电灼以切割表面，不会对神经外科造成负担。
对于培养基中有神经元再生的40％的组织样品。在冷却在转运培养基(HibernateTM/B27，如美国专利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)之前，脑组织经历了数分钟急性局部缺血。Viel等(J.Neurosci.Res.，2001；64：311)显示，甚至在室温下局部缺血2小时之后仍可获得活的大鼠脑神经元。然而，如果局部缺血的脑被冷却至4℃，可在长达24小时后获得活的皮层神经元。
已经证明当包含在本发明的无菌液体培养基时，DHEAS和FGF2协同促进了人皮层神经元的存活。FGF是经典的皮层神经元营养因子(Walicke等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；83：3012-3016；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986；83：7537-7541)。脑中的突触前神经元被认为依赖于适当刺激的突触后神经元释放的这些营养因子。在从数千脑突触提取神经元时，需要用外源营养支持代替这些神经元依赖的FGF是不奇怪的。FGF与神经元上的FGF受体结合(Walicke等，J.Biol.Chem.，1989；264：4120-4126)以活化酪氨酸激酶级联(Eckenstein，J.Neurobiol.，1994；25：1467-1480)。部分神经保护机制可抵御培养物内(Skaper等，Dev.Brain Res.，1993；71：1-8；Mattson等，J.Neurochem.，1995；65：1740-1751)和体内(Nakata等，Brain Res.，1993；605：354-356)的谷氨酸盐毒性，这种毒性与抗氧化剂保护的正调节有关(Mattson等，J.Neurochem.，1995；65：1740-1751)。因此，有许多FGF神经保护作用的先例。脑衍生神经营养因子(BDNF)可提供其它营养支持(Kirschenbaum等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1995；92：210-214；Goldman等，J.Neurobiol，1997；32：554-566)。
类固醇DHEAS在本发明的无菌液体培养基中的作用机制还不清楚。DHEAS提高分离的小鼠皮层神经元的存活率，并增强脑池内感染后的学习(learning)(Roberts等，Brain Res.，1987；406：357-362)。部分机制与通过提高神经保护转录因子NF-κB(Mao等，Neuro.Report，1998；9：759-763)，同时抑制糖皮质激素受体的核转录(Cardounel等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1999；222：145-149)，从而免遭谷氨酸盐毒性有关(Kimonides等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1998；95：1852-1857)。DHEAS抑制GABA介导的大鼠脑对氯的摄入(Imamura等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1998；243：771-775)，并迅速阻断分离的海马神经元中的电压门控钙流(Ffrench-Mullen等，Eur.J.PHARMACOL.，1991；202：269-272)。所有这些活性都有助于这里报道的DHEAS对人和大鼠神经元存活的有利作用，但他们认为DHEAS和FGF2通过活化单独的通路产生协同作用以促进神经保护。
根据发明者的知识，以前未报道高产量的成年人神经元。至少10年前就开始培养胚胎人神经元(Mattson等，Brain Res.，1990；522：204-214)，但由于缺乏这种组织和缺少组织供体同意的伦理问题，这种组织的应用并不常见。将成人脑组织作为外植块在含有血清的培养基中培养主要产生星形神经胶质(Gilden等，Comp.Neurol.，1975；161：295-306)，这可通过GFAP染色判断(Gilden等，J.Neurol.Sci.，1976；29：177-184)。Silant等(Appl.Neurophysiol.，1988；51：10-20)还报道了来自两名成人的含有血清的外植块培养物，但没有关于神经元的免疫细胞学证据。在其它含有血清的培养物中，MAP2阳性神经元的产量仅占平板细胞的约0.025％(Kirschenbaum等，Cereb.Cortex，1994；4：576-589)。通过对神经丝进行免疫染色证明，平铺在本发明的无菌液体培养基(含有FGF2和DHEAS)中的细胞产生约20％的神经元。这种占平板细胞20％的产量是不含FGF2和DHEAS的本发明的无菌液体培养基产量的约1000倍。平铺在本发明培养基上的大脑皮层细胞产生9,000个活细胞/mg，接近分离自大鼠前皮层的10,000细胞/mg(Viel等，J.Neurosci.Res.，2001；64：311-321)。
获自癫痫症状并经本发明的组合物处理的组织有助于解答一些与疾病有关的基础性问题：在培养物上培养组织连接是否可产生阵挛或紧张现象的自发爆发活性？兴奋突触/抑制突触的高重建比例或谷氨酸能细胞与分离的γ-氨基丁酸能细胞的比例是否会随癫痫原性病变变化？或者，新环境下轴突和树突的再生是否会导致更加正常的网络活性？成人神经元似乎与胚胎神经元有不同特性(Brewer，Neurobiol.Aging，1998；19：561-568；Evans等，J.Neurosci.Meth.，1998；79：37-46；Collings等，Brain Res.Bull.，1999；48：73-78)。这些成人神经元可用于研究高级人神经药理学、毒理学以及为脑抑制开发改进的方法。
如上所述，本发明提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法。该方法包括按上面的描述对有关脑或脊髓组织或需要治疗的脑或脊髓组织周围应用或施用所述无菌液体培养基。所谓需要治疗的脑或脊髓组织是与脑或脊髓损伤和/或外伤有关的组织。在适当的情况下，所述无菌液体培养基可以预防用药的方式(如在脑手术之前)应用于或施用于脑或脊髓组织。出于本发明的目的，″脑或脊髓组织″当然包括与脑和脊髓关联的组织，但同时包括全身的神经结缔组织。因此，本发明的无菌液体培养基可用来增强神经再生和/或神经生存力，例如在外科连接四肢或其它身体部分，或涉及神经损伤的受损四肢或其它身体部分的重建中。
各种输递系统是已知的并可用来应用或施用本发明的无菌液体培养基。所述无菌液体培养基可以任何常规途径应用或施用，例如包括灌输或快速输注，并可和其它生物活性剂(例如抗生素、生长因子、细胞因子、消炎剂、神经递质、受体激动剂、拮抗剂等)一起施用。通常，优选的施用方法取决于被治疗的组织和患者的特定状况。在特定的实施方案中，可在需要治疗的区域局部施用本发明的无菌液体组合物。例如，这可通过手术时局部灌输、局部敷贴(如创口贴)、注射、导管或植入(如由多孔性材料、非多孔性材料或胶状材料形成的植入物、外科包扎物或填充物，包括膜，比如硅酮基膜或纤维)等实现，但不限于此。在一个实施方案中，可在要治疗的组织部位(或成型部位)直接注射施用。
本发明的无菌液体培养基特别适合用于脑外科治疗，无论是由于如脑肿瘤、动脉瘤、增生、中风或脑损伤。所述无菌液体培养基一般可用来冲洗或浸泡手术部位和/或用来浸渍或浸透外科包扎物或填充物(如由多孔性材料、非多孔性材料或胶状材料形成的植入物，包括膜，比如硅酮基膜或纤维等)，这些包扎物或填充物在除去肿瘤或其它神经组织后将留在腔内。一种优选的手术包扎材料是Gel-FoamTM海绵。
如果有需要，所述无菌液体培养基可在一段时间内用控制释放系统输递。因此，例如可使用与含有所述无菌液体培养基的贮槽连接的泵。或者可使用浸透所述无菌液体培养基的聚合填充材料或其它填充材料，所述无菌液体培养基可从中以受控方式释放。当然，可根据需要将这种控制释放系统设计成可补充所述无菌液体培养基的样子；或者采用这种系统，所述无菌液体培养基可在一段时间内被修饰以满足患者症状和/或所达到的愈合速度的变化。
如上所述，本发明还提供了一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.01-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4suM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，其中所述含水的无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。在将细胞输递至人的脑、脊髓或神经系统之前或期间用本发明的含水的无菌液体培养基处理的细胞(包括干细胞、神经系统细胞或神经系统组织)通常有增强的生存力，并更易于在脑、脊髓或神经系统中存活和/或繁殖。更优选地，本发明的含水的无菌液体培养基可用作植入这种细胞的输递系统或载体。
以下实施例描述并例证了本发明的方法和组合物。这些实施例仅仅是为了例证本发明，而不是要限制其范围和精神。除非另有说明，所有的比例都以重量表示。那些精通此领域的技术人员将容易理解，也可采用这些实施例中所述材料、条件和过程的变化。其中引用的所有参考资料在此并入以供参考。
常规方法。按照人类对象研究Springfield委员会(Springfield Committeefor Research on Human Subjects)和UC Irvine IRB许可的方案，脑组织于手术前在伦理学上获自被告知的患者。未除去其它组织且样本与对病理学标本的需求不矛盾。与其采用吸引术来除去所有组织，不如从皮层入口(access port)或损伤边缘组织获得1-3mm厚的组织切片。电灼术的使用被限制到最小程度以减少氧化自由基和其它神经元损伤。将手术室内获得的组织(198±80mg，平均值±S.D.，n＝8)转移到20ml冰冷的无菌转移培养基，该培养基置于无菌的50ml聚苯乙烯试管(Corning)。转移培养基是Hibernate A(Brewer等，NeuroReport，1996；7：1509-1512)，其中加有2％B27培养基添加物(Introgen公司，Rockville，MD)(Brewer等，J.Neurosci.Res.，1993；35：567-576)和0.5mM谷氨酰胺。Hibernate A含有D-葡萄糖、丙酮酸盐、平衡盐、氨基酸和维生素。B27含有5种抗氧化剂和15种其它组分。尽管在8℃转移培养基可保持胚胎大鼠脑组织50％的生存力4周，但在4℃这里所用组织大多数不能存放超过4周。从冰上转移到培养物实验室内的层流无菌被覆物后，在35mm平皿中用解剖刀和镊子除去组织的脑膜和白质，平皿中含有2ml转移培养基。将组织切成0.5mm的切片，用木瓜蛋白酶消化，并分离成单细胞悬液(见Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。在Optiprep密度梯度(Invitrogen)上通过离心富集细胞悬液。Optiprep首先用0.8％NaCl 50.5：49.5(V/V，Optiprep：盐水)稀释以使22℃的密度为1.15。以后的试验显示，用10mM MOPS，pH7.4缓冲的盐水效果最好。稀释的Optiprep进一步用转移培养基(v/v)稀释以在15ml离心管中制成4个1ml的梯度：底部(0.35∶0.65)、0.25∶0.75、0.2∶0.8、顶部(0.15∶0.85)。将最多6ml细胞悬液置于Optiprep分级梯度上部。尽管神经元和神经胶质在所有梯度中都存在，收集小丸(pellet)和碎片(debris)致密带之间的组分，以最大富集神经元(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。以320/mm2的密度将细胞铺到上述涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片上。细胞培养在Neurobasal A培养基(Invitrogen)中，培养基中含有2％B27、5ng/ml FGF2(碱性人重组成纤维细胞生长因子，Introgen)和0.5mM谷氨酰胺，并置于含有9％O2和5％CO2的湿润大气下(Forma，Marietta，OH)。在大多数试验中，还含有10μg/ml的DHEAS(脱氢表雄酮3-硫酸盐，Sigma)。DHEAS用10％的牛血清白蛋白稀释1mg/ml的贮液并无菌过滤得到。按照说明，用1％BSA/PBS将贮液稀释500倍，加入EGF(20ng/ml；鼠，Introgen)和NT3(100ng/ml；重组，Regeneron)。每3-4天用新鲜培养基更换一半培养基。
为进行免疫细胞学研究，培养物用热的PBS清洗两次并在PBS中4％的低聚甲醛中固定10分钟。用PBS清洗两次后，被GFAP染色的细胞再在乙酸/乙醇(1∶9，v/v)中固定20分钟，然后用PBS清洗两次。非特异性位点被封闭，并将细胞在5％正常羊血清和0.5％Triton X-100中渗透5分钟。在22℃，将细胞和第一抗体在5％羊血清和0.05％Triton中培养1小时，Triton中含有鼠抗-神经丝200(1∶40，Sigma)和兔抗-牛GFAP(1∶2000，Dako)，或鼠抗-MAP2(1∶250，Boeringer-Mannheim)和兔抗-τ(1∶2000)。用PBS清洗4次后，细胞在22℃和结合有若丹明的羊抗-兔IgG(重+轻链，1∶500，Tago)以及结合有cy2的羊抗-鼠IgG(重+轻链，1∶100，Jackson)一起培养1小时。用PBS清洗4次后，盖玻片用Aquamount固定并通过Nikon 60x/1.4目镜用Spot cooled CCD照相机(Diagnostic Instruments)照相。
为进行电子显微镜电子显微镜检测(Deitch等，J.Neurosci.，1993；13：4301-4315)，载玻片上的细胞在37℃用2.5％戊二醛固定1小时，直接稀释到培养基中形成25％的贮液。无需清洗，进一步固定细胞并在37℃用0.1％OsO4染色0.5小时。细胞用0.125M磷酸钠(pH7.4)清洗并用0.1％OsO4继续固定0.5小时。用3.6％NaCl和水清洗后，细胞用5％乙酸双氧铀水溶液染色1小时。用水清洗后，细胞用一系列乙醇脱水，继以环氧丙烷。将细胞倒入充满Spur树脂(Polysciences)的橡胶模具。在60℃聚合3小时以制成3mm厚的半透明盘，感兴趣的区域用20x物镜观察并用记号笔圈出。将圈出的区域移到划线树脂盘内侧。通过反复接触液氮和沸水除去玻璃盖玻片。用锯取下标记的区域并将其粘在金属轴(metal stub)上，以修剪和切片。将90nm金切片沉积在涂有聚醋酸甲基乙烯酯薄膜的狭缝载网上。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并用Hitachi H7显微镜在70kV观察。
实施例1.人皮层脑组织获自11例连续外科病例，包括7例肿瘤病例，3例癫痫病例和1例假性延髓麻痹(suprabulbar palsy)。患者年龄在41-70岁之间。表2总结了这11例病例的结果。
表2.培养在B27/Neurobasal A中的人皮层脑外科样本
| 手术样品 | 症状/诊断1 | 年龄，性别 | 组织重量 | 细胞产量(百万)3 | 添加物4 | ％，神经丝％GFAP(平均值±S.D.)5 |
| 1 | 胶质瘤，r.太阳穴 | 46，M | n.d. | 0.7 | 0 | 53±10，38±7 |
| DHEAS | 70±12，31±9 | |||||
| FGF2 | 67±7，30±7 | |||||
| 2 | 肿瘤，r.太阳穴 | 69，M | 150 | 1.5 | FGF2 | ＜10％，＞80％ |
| 3 | 神经胶质瘤，l.额 | 41，M | 205 | 5.7 | FGF2 | 84±8 |
| 61±10 | ||||||
| FGF2+DHEAS | 73±11 | |||||
| 4 | 癫痫，l.上太阳穴脑回 | 33，F | 266 | 3.6 | FGF2 | 16±5 |
| 15±2 | ||||||
| 17±4 | ||||||
| 5 | 脑膜瘤，r.太阳穴 | 70，M | 150 | 1.7 | FGF2 | 17±10 |
| DHEAS | 25±10 | |||||
| FGF2+DHEAS | 65±48 | |||||
| 6 | 癫痫，l.颞叶切除术 | 53，F | 73 | 0.12 | FGF2+DHEAS | 84±6，16±6 |
| +睾酮20nM | 85±4，15±4 | |||||
| +雌二醇18nM | 89±5，11±5 | |||||
| 7 | r.颞皮质 | 54，M | 323 | 1.2 | DHEAS，FGF2 | 所有神经胶质 |
| 8 | 癫痫 | 15，F | 253 | 0.9 | DHEAS，FGF2 | 所有神经胶质 |
| 9 | 原发性脑淋巴瘤 | 67，F | 167 | 0.7 | DHEAS，FGF2 | 26±3 |
| 10 | 脑膜瘤，l.颞叶 | 45，F | 349 | 1.9 | DHEAS，FGF2 | 所有神经胶质 |
| 11 | 假性延髓麻痹 | 53，F | 61 | 0.8 | DHEAS，FGF2 | 所有神经胶质 |
1.皮层组织的来源和/或患者诊断的诊断，l.脑左侧；r.脑右侧。
2.切割和粉碎前组织的重量；n.d.表示未称重。
3.梯度分离后通过除去锥虫蓝判断细胞产量。
4.培养基的添加物：见常规方法。
5. 6天后，按常规方法的描述固定培养物并进行免疫染色。4-6个0.304平方毫米的区域为神经丝免疫反应阳性。当有两组值时，第二个值表示对GFAP的免疫反应性。
分离的细胞的神经特征。将细胞骨架组分作为特异性标记来区别神经元和神经胶质。微管结合蛋白MAP2和τ通常分别与神经元的树突和轴突区域结合。神经丝200是仅限于神经元的常见中间丝，而GFAP仅限于星形神经胶质。所有制品都至少被这些标记之一免疫染色。对于分离自67岁原发性淋巴瘤病例额叶并培养6天的样品，这些细胞显示神经元样的形态并对神经元细胞骨架元件MAP2和τ免疫染色。较好地，在相图中看到了分支过程。MAP2染色清楚显示了树突生长锥。用τ染色并对τ进行核定位看到了一个轴突样的粗细均匀的纤维。如表2所示，6例神经胶质瘤中的3例和3例癫痫中的2例得到的主要是神经元而不适神经胶质。具有神经元染色特征的培养物的比例为15-89％。平均有20％的存活平铺细胞是具有纤维的细胞。存活的分离细胞为每毫克组织9,000个细胞(±2,000S.E.，n＝10，表2)。
为提供出现神经元的细胞神经元特征的其它形态学证据，将来自70岁脑膜瘤病例的样品培养3周以建立突触，然后再固定并电子显微镜检测。电子显微照片显示了具有微管的均匀纤维，微管是轴突的特征，并显示了带有多种均匀直径清晰小泡的明显的突触结。突触后密度也是明显的。不是所有纤维间的接触都具有突触特征。基于相差光学显微镜对纤维接触区域的选择，随后的电子显微镜检测显示突触形成的频率约为纤维接触的10％，这与胚胎大鼠海马神经元不同(Brewer，未公布的结果)。
患者的年龄与神经丝阳性细胞的比例无关(R2＝0.03；数据未显示)。获自患者的组织和由神经外科医师提供的组织类型从恶性肿瘤变为癫痫。50％的恶性肿瘤病例(3/6)和1/3的癫痫病例产生了50％以上神经丝阳性细胞。病例数目不够大，因此无法得出进行细胞培养的最佳患者材料的确切结论。
营养和激素支持的需求。在初步试验中，评价了人神经元对FGF2的营养需求，这种需求在成年大鼠神经元中观察到(Brewer，J.Neurosci.Methods，1997；71：143-155)。对于对神经丝染色的细胞，FGF2使阳性细胞的比例从53±10％提高到67±7％(t试验，p＜0.02，n＝6个区域，每个区域约20个细胞，样品1，表2)。以后的试验都在有FGF2的情况下进行。在3例病例中，与FGF2相比，10μg/ml的DHEAS可促进存活。各个病例中，在促进神经丝阳性、神经元样细胞存活方面，DHEAS和FGF2一样有效。培养在无FGF2和DHEAS(A)、或有FGF2(B)、或DHEAS(C)条件下的成年人神经元的形态和神经丝染色没有显著差异。在两个病例中，DHEAS和FGF2对存活的综合效果并不比只有一种要好。然而，在较低浓度时，DHEAS和FGF2对存活有协同作用(图1)。无DHEAS时，存活的ED50接近1ng/ml FGF2。有DHEAS(10μg/ml)时，ED50降低了10倍，约为0.1ng/ml FGF2(图1)。将1μg/ml和3μg/ml DHEAS混合可产生0-10μg/ml之间的中间存活率(数据未显示)。在一个试验中(样品4，表2)，除FGF2外还加入了营养因子NT3或EGF。这些组合物对于神经丝阳性细胞的存活不比单独的FGF2更有效。在另一个试验中(样品6，表2)，在B27/Neurobasal内的FGF2和DHEAS中加入了性激素睾酮和雌二醇，但没有效果。
实施例2 在脑外科手术中，蛛网膜下隙、脑薄壁组织和切除腔通常用生理盐水冲洗。由于生理盐水在人开颅术时被用来清洗手术部位，且盐水可在大鼠皮层损伤中造成神经胶质增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；15：2021-2029)，测试了生理盐水在维持神经元在模型系统(即培养物中的大鼠胚胎海马神经元)中存活的能力。除去培养基并用盐水处理这些神经元24小时后，一半以上的细胞死亡，但所有细胞都丧失了产生树突的能力。48小时后，盐水使几乎所有细胞死亡。用Neurobasal/B27处理的平行培养物显示典型的最大存活率约为50-60％。
为评价本发明的无菌液体培养基对脑的作用，在大鼠伞毛-穹隆上建立了大鼠皮层的吸引术损伤，用培养基清洗损伤，然后将浸透培养基的明胶海绵移植到受损的腔中。以利用仪器不用肉眼的规程，在36只大鼠上进行操作：每组6只大鼠，接受浸透以下组合物之一的明胶海绵：(1)生理盐水，植入皮层损伤腔；(2)表1中更优选的组合物，用啮齿动物适用的皮质酮(0.01-0.05μM)代替皮质醇；(3)Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)，添加10ng/ml FGF2；(4)表1中更优选的组合物，用啮齿动物适用的皮质酮(0.01-0.05μM)代替皮质醇，并添加5ng/mlFGF2；和(5)对照(即无损伤或伪受损)。无需任何有关治疗的知识，神经科医师确定在这些大鼠中获得了靶伞毛-穹隆的损伤。通过计数中间隔膜中甲酚紫染色的神经元确定处理4周后的神经元密度。用本发明的无菌液体培养基处理使神经元密度增加了55％(图2)。用本发明的培养基处理得到的提高明显高于用盐水进行的处理(p＝0.01)，且用本发明的培养基处理的神经元的密度接近未受损病例的神经元密度。用26mM碳酸氢钠制备的类似制品的功效稍差(图2)。通常，添加了FGF2的基础组合物和单独的基础组合物对于保持中间隔膜的神经元密度一样有效。因此，上表1中“更加优选的范围”一栏所述的无菌液体培养基的基础组分通常是优选的。这些结果强调了本发明的组合物对于隔开神经元的作用，这些神经元的轴突已被切断或经历轴索显微外科术，这种情况通常发生在脑或脊髓外科手术或头或脊髓损伤中。
实施例3.用脑损伤模型在体外测试了用本发明的无菌液体培养基保持神经元的生存力。进行大鼠皮层吸引术(直径约1mm)以产生损伤腔，在腔中填满浸透(1)盐水、(2)表1中所列优选的本发明的无菌液体培养基(即第一种无菌液体培养基)，或(3)用26mM碳酸氢钠缓冲液而不是MOPS缓冲液进行缓冲的表1的无菌液体培养基(即第二种无菌液体培养基)的明胶海绵。恢复4周后，通过固定、石蜡包埋、切片和用甲酚紫染色来评价皮层神经元的存活。损伤周围神经元的存活是距损伤边缘和对测的距离的函数。距损伤边缘第一个100μm的图象显示，与盐水相比，无论用本发明的哪种无菌液体培养基，细胞损失都较小。手术一个月后，与盐水处理相比，用第一种无菌液体培养基处理的大鼠神经元密度的保存平均增加了27％(裂区中有一个块变量，F(1，10)＝7.1，p＝0.02)(图3A)。用以碳酸氢盐缓冲的本发明的培养基处理的损伤与上述盐水有相同的作用，但不显著(F(1，10)＝4.1，p＝0.07)。与伪损伤的动物(无损伤穿颅)，第一种和第二种方面无菌液体培养基都可几乎完全保存神经元密度。然而，第一种无菌液体培养基通常可提供较好的保存效果。
至于占皮层未受损对侧相同区域神经元密度的百分数，用第二种(碳酸氢盐缓冲的)无菌液体培养基处理的损伤与盐水处理的损伤无异(图3B)。然而，用第一种无菌液体培养基处理使神经元密度在中间距离(200-400μm)甚至高于未受损侧(图3B)。超过这一距离，第一种无菌液体培养基使神经元密度高于盐水处理约15％，但不显著(F(1，4)＝4，p＝0.09)。损伤导致的神经元的对侧损失或神经纤维网的变化可能是由于缺乏较大区别造成的。在感觉运动皮层损伤中，对侧神经纤维网扩大，这可能造成神经元密度降低。因此，重新测量了损伤对侧神经元密度的原始数据。用盐水处理观察到了令人吃惊的对侧神经元密度的大量减少，而第一种无菌液体培养基显示出对对侧神经元密度的较好保存。这些结果进一步证实了本发明的无菌液体培养基对于保存神经元密度的作用。
还用添加了5ng/ml FGF2的表1的无菌液体培养基处理了大鼠损伤，和以前公布的添加10ng/ml FGF2的DMEM(Otto等，J.Neurosci.Res.，1989；22：83-91)进行比较。图3C显示添加FGF2的本发明的无菌液体培养基使细胞密度较之盐水明显高出50％，且明显优于添加FGF2的DMEM(p＝0.03)和盐水(p＝0.002)。这些结果证明了如本发明所述的将无菌液体培养基和FGF2结合的额外好处。
上述处理后，切片还被脱蜡和对GFAP(角质细胞原纤维酸性蛋白)免疫染色，以观察随脑损伤发生的神经胶质增生。测量免疫染色的密度，它是距吸引损伤边缘的距离的函数。图4显示了用盐水处理产生的高密度的神经胶质增生(Gomez-Pinilla等，J.Neurosci.，1995；15：2021-2029)。通过伪受损处理显示GFAP染色的背景水平。用本发明的培养基处理的大鼠皮层中损伤GFAP染色明显降低(本发明的无菌液体培养基，p＝0.002)。
实施例4.测试了本发明的培养基对培养物中人肿瘤生长的作用。5个连续肿瘤样品获自接受包括损伤切除术的开颅术患者。将样品置于4℃的无菌转移培养基(HibernateTM/B27，如美国专利No.6,180,404所述；www.siumed.edu/BrainBits)，并通过冷敷连夜运输。在4℃保存1-3天后，在Mcllwain组织切片机上将组织切成0.5mm的切片。切片在30℃在Hibernate A(BrainBits)中用木瓜蛋白酶(2mg/ml，Worthington)消化30分钟，然后在Hibernate A/B27/0.5mM谷氨酰胺(GIBCO)中研磨。将样品分成两份并在200×g离心1分钟。将其中一个沉淀物再次悬浮在加有0.5mM谷氨酰胺的本发明培养基；另一个再次悬浮在加有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基。用锥虫蓝计数活细胞，并铺在2cm2经培养物处理的24孔板的聚苯乙烯孔中，它已经用50μg/ml聚-D-赖氨酸预涂布。在37℃、5％CO2和9％O2(Thermo-Forma)培养的第1天和第6或7天，用20x Nikon目镜通过Spot cooled CCD照相机(Diagnostic Instruments)获得相差图象。在0.373mm2的12块邻近区域通过肉眼或Image-Pro+软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)的帮助计数分离的相明亮区域。用标准误差表示每平方毫米培养物面积的平均细胞密度。用Plotit软件(Scientific Programming Enterprises)计算处理间的t-试验结果。
生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的脑膜瘤细胞在7天后显示令人吃惊的生长。这些细胞分散到基质中并增殖，平均细胞面积达到3015+453μm2(平均值+/-S.E.，n＝12细胞)(图5A)。以同样密度铺在本发明培养基上的相同细胞在培养7天后没有扩散或增殖(平均面积＝936μm2)(t-试验，p＝0.0001)(图5B)；在本发明的培养基中几乎没有活细胞。
类似地，生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的扩展到基质中并增殖(图5C)。相反，生长在本发明培养基中的成胶质细胞瘤细胞在培养7天后没有扩展或增殖(图5D)。
使脑膜瘤细胞生长10天。培养10天后，生长在添加10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基内的细胞产生融合生长。用胰蛋白酶处理收集这些细胞，并将其置于含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基或本发明的培养基。下面的表3和图6显示细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal A培养基中继续生长，但在本发明的培养基中生长受到抑制，并有细胞死亡。
表3
| 培养天数 | 累积群体加倍 | |
| Neurobasal A/血清 | 本发明的培养基 | |
| 3 | 0 | 0 |
| 5 | 1.63 | -0.37 |
| 7 | 1.48 | -0.08 |
| 10 | 1.76 | -1.34 |
| 更换血清培养物 | ||
| 12 | 1.76 | 1.76 |
| 15 | 2.81 | 1.44 |
| 17 | 2.39 | 0.69 |
| 19 | 2.79 | -0.22 |
在表4中比较了各种类型肿瘤的细胞生长。表4中的数据显示了第6或第7天细胞的增加，增加是用第6天或第7天的细胞数除以开始培养时的细胞数。这些结果还显示在图7中。对于这5种连续肿瘤病例，本发明的培养基导致生长停滞或抑制以及细胞死亡，而含有胎牛血清的Neurobasal A培养基使所有原发性肿瘤的细胞增殖而使转移肿瘤的细胞生长停滞。
表4
| 肿瘤类型 | 比例 | Neurobasal A/血清(S.E.) | 本发明的培养基(S.E.) | 概率 |
| 脑膜瘤 | 1 | 2.80(0.26) | 0.94(0.15) | 3×10-6 |
| 2 | 3.19(0.19) | 0.45(0.09) | 6×10-12 | |
| 成胶质细胞瘤 | 1 | 2.00(0.14) | 1.14(0.12) | 1×10-4 |
| 2 | 1.55(0.17) | 0.59(0.07) | 2×10-5 | |
| 转移 | 1 | 0.99(0.15) | 0.31(0.09) | 2×10-3 |
有上述试验可见，本发明的培养基可抑制培养物中人肿瘤细胞的生长。
Claims (35)
1.一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，其特征在于，所述方法包括对脑或脊髓组织施用含水的无菌液体培养基，所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μML-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂包含约0.001-约0.1μM皮质醇、约0.5-约16μM还原的谷胱甘肽、约0.05-约20μM亚油酸、约0.1-约10μM亚麻酸、约0.001-约0.1μM孕酮、约0.02-约1μM醋酸视黄酯，0-约0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、约0.1-约10μM DL-α生育酚、约0.1-约10μM DL-α生育酚乙酸酯、约5-约200μM人白蛋白、约0.001-约0.1μM过氧化氢酶、约0.1-约5μM胰岛素、约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶和约0.01-约0.32μM运铁蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基用3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸缓冲。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基用3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸缓冲。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述无菌含水培养基还含有(1)L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸各约0-约5000μM；(2)约0-约3000μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸各约0-约2400μM；(4)L-组氨酸和L-甲硫氨酸各约0-约1200μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各约0-约500μM；(6)约0-约120μM L-丙氨酸；(7)约0-约60μM L-半胱氨酸；(8)约0-约30μM L-天冬酰胺；(9)约0-约240μM i-肌醇，(10)约0-约200μM烟酰胺，(11)约0-约200μM胆碱，(12)约0-约120μM吡哆醛，(13)硫胺、叶酸和D-泛酸钙各约0-约100μM，(14)约0-约6μM核黄素，(15)约0-约2.5μM生物素，以及(16)约0-约1.2μM维生素B12。
6.如权利要求2所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基(1)L-异亮氨酸、L亮氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸各约0-约5000μM；(2)约0-约3000μM L-谷氨酰胺；(3)L-精氨酸、甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸各约0-约2400μM；(4)L-组氨酸和L-甲硫氨酸各约0-约1200μM；(5)L-色氨酸和L-脯氨酸各约0-约500μM；(6)约0-约120μM L-丙氨酸；(7)约0-约60μM L-半胱氨酸；(8)约0-约30μM L-天冬酰胺；(9)约0-约240μM i-肌醇，(10)约0-约200μM烟酰胺，(11)约0-约200μM胆碱，(12)约0-约120μM吡哆醛，(13)硫胺、叶酸和D-泛酸钙各约0-约100μM，(14)约0-约6μM核黄素，(15)约0-约2.5μM生物素，以及(16)约0-约1.2μM维生素B12。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有脱氢表雄酮-4-硫酸盐。
8.如权利要求2所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有脱氢表雄酮-4-硫酸盐。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述脱氢表雄酮-4-硫酸盐的量为约2-约200μM。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述脱氢表雄酮-4-硫酸盐的量为约2-约200μM。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有人FGF2。
12.如权利要求2所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有人FGF2。
13.如权利要求8所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有人FGF2。
14.如权利要求10所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基还含有人FGF2。
15.如权利要求12所述的方法，其中，所述人FGF2的量为约1-约20ng/ml。
16.如权利要求13所述的方法，其中，所述人FGF2的量为约1-约20ng/ml。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述人FGF2的量为约2-约10ng/ml。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述人FGF2的量为约2-约10ng/ml。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基通过用含水的无菌液体培养基冲洗或灌输脑或脊髓组织局部用于脑或脊髓组织。
20.如权利要求2所述的方法，其中，所述含水的无菌液体培养基通过用含水的无菌液体培养基冲洗或灌输脑或脊髓组织局部用于脑或脊髓组织。
21.如权利要求1所述的方法，其中，用浸渍或渗透有含水的无菌液体培养基的手术包扎材料来施用所述含水的无菌液体培养基，所述经浸渍或渗透的手术包扎材料与脑或脊髓组织接触。
22.如权利要求2所述的方法，其中，用浸渍或渗透有含水的无菌液体培养基的手术包扎材料来施用所述含水的无菌液体培养基，所述经浸渍或渗透的手术包扎材料与脑或脊髓组织接触。
23.如权利要求1所述的方法，其中，用注射器或泵施用所述含水的无菌液体培养基，所述含水的无菌液体培养基与脑或脊髓组织接触。
24.一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统；所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μMNaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μMD(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，；所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂包含约0.001-约0.1μM皮质醇、约0.5-约16μM还原的谷胱甘肽、约0.05-约20μM亚油酸、约0.1-约10μM亚麻酸、约0.001-约0.1μM孕酮、约0.02-约1μM醋酸视黄酯、0-约0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)、约0.1-约10μM DL-α生育酚、约0.1-约10μM DL-α生育酚乙酸酯、约5-约200μM人白蛋白、约0.001-约0.1μM过氧化氢酶、约0.1-约5μM胰岛素以及约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶和约0.01-约0.32μM运铁蛋白；所述含水的无菌液体培养基还含有约2-约200μM脱氢表雄酮3-硫酸盐和约1-约20ng/ml人FGF2。
26.如权利要求24所述的方法，其中，用含水的无菌液体培养基处理干细胞或神经系统细胞或组织受到所述含水的无菌液体培养基中干细胞或神经系统细胞或组织的储存或转移的影响。
27.如权利要求25所述的方法，其中，用含水的无菌液体培养基处理干细胞或神经系统细胞或组织受到所述含水的无菌液体培养基中干细胞或神经系统细胞或组织的储存或转移的影响。
28.如权利要求24所述的方法，其中，在输递之前，用含水的无菌液体培养基处理干细胞或神经系统细胞或组织受到所述干细胞或神经系统细胞或组织和所述含水的无菌液体培养基的综合影响，所述含水的无菌液体培养基被用作输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统的载体。
29.如权利要求25所述的方法，其中，在输递之前，用含水的无菌液体培养基处理干细胞或神经系统细胞或组织受到所述干细胞或神经系统细胞或组织和所述含水的无菌液体培养基的综合影响，所述含水的无菌液体培养基被用作输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统的载体。
30.一种有效提高脑或脊髓损伤或手术后人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力，或有效提高欲输递至人的脑、脊髓或神经系统的神经系统细胞或组织的神经细胞生存力的含水组合物，所述含水组合物含有0-约3000μM CaCl2；约0.1-约1.2μM Fe(NO3)3；约2500-约10,000μM KCl；0-约4000μM MgCl2；约30,000-约150,000μM NaCl；约100-约30,000μM NaHCO3；约250-约4000μM NaH2PO4；约0.01-约0.4μM亚硒酸钠；约0.2-约2μM ZnSO4；约2500-约50,000μM D-葡萄糖；约1-约50μM L-肉碱；约3-约80μM乙醇胺；约15-约400μM D(+)-半乳糖；约5-约200μM人白蛋白；约40-约800μM腐胺；约20-约500μM丙酮酸钠；约0.01-约0.32μM运铁蛋白；0-约120μM L-丙氨酸；0-约2400μM L-精氨酸；0-约30μM L-天冬酰胺；0-约60μM L-半胱氨酸；0-约3000μM L-谷氨酰胺；0-约2400μM甘氨酸；0-约1200μM L-组氨酸；0-约5000μM L-异亮氨酸；0-约5000μM L-亮氨酸；0-约5000μM L-赖氨酸；0-约1200μM L-甲硫氨酸；0-约2400μM L-苯丙氨酸；0-约500μM L-脯氨酸；0-约2400μM L-丝氨酸；0-约5000μM L-苏氨酸；0-约500μM L-色氨酸；0-约2400μM L-酪氨酸；0-约5000μML-缬氨酸；约0.5-约16μM还原的谷胱甘肽；约0.1-约10μM α-生育酚；约0.1-约10μM α-生育酚乙酸酯；约0.001-约0.1μM过氧化氢酶；约0.01-约0.5μM超氧化物歧化酶；约0.001-约0.1μM皮质醇；0-约200μM DHEAS；约0.001-约0.1μM孕酮；约0.02-约1μM醋酸视黄酯；约0.1-约5μM胰岛素；0-约0.6μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；约0.05-约20μM亚油酸；约0.1-约10μM亚麻酸；0-约2.5μM生物素；0-约100μM D-泛酸钙0-约200μM胆碱；0-约100μM叶酸；0-约240μM i-肌醇；0-约200μM烟酰胺；0-约120μM吡哆醛；0-约6μM核黄素；0-约100μM硫胺和0-约1.2μM钴胺素；所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOsm，含有约5000-约25000μM氢离子缓冲液，缓冲液的pKa为约6.9-约7.7，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
31.如权利要求30所述的含水组合物，所述含水组合物含有约500-约2500μMCaCl2；约0.05-约0.6μM Fe(NO3)3；约3000-约8000μM KCl；约300-约2000μMMgCl2；约40,000-约103,000μM NaCl；约200-约1800μM NaHCO3；约400-约2000μM NaH2PO4；约0.03-约0.2μM亚硒酸钠；约0.4-约1.5μM ZnSO4；约10,000-约40,000μM D-葡萄糖；约3-约25μM L-肉碱；约6-约40μM乙醇胺；约30-约200μM D(+)-半乳糖；约15-约90μM人白蛋白；约80-约400μM腐胺；约100-约400μM丙酮酸钠；约0.02-约0.16μM运铁蛋白；约6-约60μM L-丙氨酸；约120-约1200μM L-精氨酸；约1.5-约15μM L-天冬酰胺；约3-约30μML-半胱氨酸；约150-约1500μM L-谷氨酰胺；约120-约1200μM甘氨酸；约60-约600μM L-组氨酸；约250-约2500μM L-异亮氨酸；约250-约2500μM L-亮氨酸；约250-约2500μM L-赖氨酸；约60-约600μM L-甲硫氨酸；约120-约1200μM L-苯丙氨酸；约25-约250μM L-脯氨酸；约120-约1200μM L-丝氨酸；约250-约2500μM L-苏氨酸；约25-约250μM L-色氨酸；约120-约1200μM L-酪氨酸；约250-约2500μM L-缬氨酸；约1-约8μM还原的谷胱甘肽；约0.5-约5μM α-生育酚；约0.5-约5μM α-生育酚乙酸酯；约0.002-约0.04μM过氧化氢酶；约0.02-约0.25μM超氧化物歧化酶；约0.002-约0.3μM皮质醇；约5-约100μMDHEAS；约0.005-约0.06μM孕酮；约0.05-约0.6μM醋酸视黄酯；约0.2-约2μM胰岛素；约0.0005-约0.2μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；约1-约10μM亚油酸；约0.2-约5μM亚麻酸；约0.01-约1.2μM生物素；约2-约40μM D-泛酸钙；约9-约90μM胆碱；约2-约40μM叶酸；约12-约120μM i-肌醇；约10-约100μM烟酰胺；约6-约60μM吡哆醛；约0.3-约3μM核黄素；约2-约40μM硫胺；约0.05-约1μM钴胺素和约1-约50ng/ml人FGF2。
32.如权利要求31所述的含水组合物，所述含水组合物含有约1200-约2400μMCaCl2；约0.1-约0.3μM Fe(NO3)3；约4000-约6000μM KCl；约600-约1000μM MgCl2；约66,000-约86,000μM NaCl；约780-约980μM NaHCO3；约800-约1000μM NaH2PO4；约0.06-约0.1μM亚硒酸钠；约0.57-约0.77μM ZnSO4；约15,000-约35,000μM D-葡萄糖；约6约18μM L-肉碱；约12-约20NM乙醇胺；约60-约100μM D(+)-半乳糖；约30-约45μM人白蛋白；约160-约200μM腐胺；约130-约330μM丙酮酸钠；约0.04-约0.08μM运铁蛋白；约10-约30μM L-丙氨酸；约200-约600μM L-精氨酸；约2.5-约7.5μM L-天冬酰胺；约5-约15μM L-半胱氨酸；约300-约700μM L-谷氨酰胺；约200-约600μM甘氨酸；约100-约300μM L-组氨酸；约600-约1000μM L-异亮氨酸；约600-约1000μM L-亮氨酸；约600-约1000μML-赖氨酸；约100-约300μM L-甲硫氨酸；约200-约600μM L-苯丙氨酸；约60-约80μM L-脯氨酸；约200-约600μM L-丝氨酸；约600-约1000μM L-苏氨酸；约40-约160μM L-色氨酸；约200-约600μM L-酪氨酸；约600-约1000μM L缬氨酸；约2-约4μM还原的谷胱甘肽；约1-约3μM α-生育酚；约1-约3μM α-生育酚乙酸酯；约0.005-约0.02μM过氧化氢酶；约0.04-约0.12μM超氧化物歧化酶；约0.005-约0.015μM皮质醇；约10-约30μM DHEAS；约0.01-约0.03μM孕酮；约0.1-约0.3μM醋酸视黄酯；约0.4-约0.8μM胰岛素；约0.02-约0.08μM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)；约2.5-约4.5μM亚油酸；约0.5-约2μM亚麻酸；约0.2-约0.6μM生物素；约6-约24μM D-泛酸钙；约20-约40μM胆碱；约4-约14μM叶酸；约20-约60μM i-肌醇；约15-约50μM烟酰胺；约10-约30μM吡哆醛；约0.5-约1.5μM核黄素；约5-约20μM硫胺；约0.1-约0.3μM钴胺素和约2-约10ng/ml人FGF2。
33.如权利要求30所述的含水组合物，其中，所述氢离子缓冲液是3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸。
34.如权利要求31所述的含水组合物，其中，所述氢离子缓冲液是3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸。
35.如权利要求32所述的含水组合物，其中，所述氢离子缓冲液是3-[N-吗啉基]丙烷-磺酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32665801P | 2001-10-02 | 2001-10-02 | |
| US60/326,658 | 2001-10-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1599792A true CN1599792A (zh) | 2005-03-23 |
Family
ID=23273135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA02823992XA Pending CN1599792A (zh) | 2001-10-02 | 2002-10-01 | 在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030077564A1 (zh) |
| EP (1) | EP1451294A2 (zh) |
| CN (1) | CN1599792A (zh) |
| AU (1) | AU2002330167A1 (zh) |
| CA (1) | CA2462802A1 (zh) |
| WO (1) | WO2003029417A2 (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560876A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-29 | 广州赛吉生物科技有限公司 | 一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基 |
| CN105067581A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-18 | 遵义医学院 | 大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法 |
| CN105288591A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-02-03 | 段懿玲 | 碱性成纤维细胞生长因子组合物及其在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用 |
| CN105431525A (zh) * | 2013-04-17 | 2016-03-23 | 索尔克生物学研究所 | 用于神经细胞培养的培养基组合物 |
| CN108841780A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-20 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 适合大规模生产pedv疫苗的无血清培养基 |
| CN114214278A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-22 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 一种神经元细胞体外培养方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005099758A2 (en) * | 2004-04-17 | 2005-10-27 | The Board Of Trustees The Leland Standford Junior University | Injectable bioartificial tissue matrix |
| TWI398272B (zh) * | 2005-03-08 | 2013-06-11 | Intervet Int Bv | 化學定義的安定劑 |
| EP2175273B1 (en) | 2005-11-09 | 2013-09-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Kokumi-imparting agent |
| WO2007055388A2 (en) | 2005-11-09 | 2007-05-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Calcium receptor activator |
| US8420144B2 (en) | 2005-11-09 | 2013-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Kokumi-imparting agent, method of using, and compositions containing same |
| AU2008249287C1 (en) | 2007-05-08 | 2015-06-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Low-fat food |
| DK2205189T3 (en) * | 2007-10-10 | 2018-03-12 | Univ Wake Forest Health Sciences | Devices for the treatment of spinal cord tissue |
| BR112014000522B1 (pt) * | 2011-07-12 | 2021-03-23 | Foodchek Systems, Inc. | Meio de cultura e método para cultivar salmonella e e. coli |
| CN102772407B (zh) * | 2012-08-01 | 2014-09-17 | 岳茂兴 | 一种促进神经损伤修复的药物组合物及其应用 |
| US8992951B2 (en) | 2013-01-09 | 2015-03-31 | Sapna Life Sciences Corporation | Formulations, procedures, methods and combinations thereof for reducing or preventing the development, or the risk of development, of neuropathology as a result of trauma |
| SG11201505965TA (en) | 2013-01-31 | 2015-09-29 | Ajinomoto Kk | Culture method for stable undifferentiated proliferation of pluripotent stem cells |
| EP2953640B1 (en) * | 2013-02-07 | 2020-04-08 | The Cleveland Clinic Foundation | Nanoencapsulated superoxide dismutase and catalase for treating spinal cord injury |
| WO2015079404A1 (en) | 2013-11-28 | 2015-06-04 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Novel culture medium for in vitro organotypic culture of an adult brain tissue sample |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4812447A (en) * | 1985-10-22 | 1989-03-14 | City Of Hope | Method for the treatment of nervous system degeneration |
| US5677288A (en) * | 1991-05-15 | 1997-10-14 | Cypros Pharmaceutical Corporation | Use of aminoglycosides to protect against excitotoxic neuron damage |
| WO1997038090A1 (en) * | 1996-04-09 | 1997-10-16 | Board Of The Trustees Of Southern Illinois University | A cultural medium for maintaining neural cells in ambient atmosphere |
| AU7963998A (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-30 | University Technology Corporation | Transplantation of immortalized dopamine cells to improve neurological deficits |
| US6225122B1 (en) * | 1998-03-02 | 2001-05-01 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | Human spinal cord cell lines and methods of use therefor |
-
2002
- 2002-09-30 US US10/261,462 patent/US20030077564A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-01 CN CNA02823992XA patent/CN1599792A/zh active Pending
- 2002-10-01 CA CA002462802A patent/CA2462802A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-01 EP EP02766430A patent/EP1451294A2/en not_active Withdrawn
- 2002-10-01 AU AU2002330167A patent/AU2002330167A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-01 WO PCT/US2002/031137 patent/WO2003029417A2/en not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-04-27 US US11/115,479 patent/US20050208028A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-29 US US11/927,037 patent/US20080160006A1/en not_active Abandoned
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105431525A (zh) * | 2013-04-17 | 2016-03-23 | 索尔克生物学研究所 | 用于神经细胞培养的培养基组合物 |
| CN105431525B (zh) * | 2013-04-17 | 2020-04-10 | 索尔克生物学研究所 | 用于神经细胞培养的培养基组合物 |
| CN104560876A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-29 | 广州赛吉生物科技有限公司 | 一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基 |
| CN104560876B (zh) * | 2014-12-31 | 2018-03-16 | 广州吉帝生物科技有限公司 | 一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基 |
| CN105067581A (zh) * | 2015-07-30 | 2015-11-18 | 遵义医学院 | 大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法 |
| CN105288591A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-02-03 | 段懿玲 | 碱性成纤维细胞生长因子组合物及其在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用 |
| CN108841780A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-20 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 适合大规模生产pedv疫苗的无血清培养基 |
| CN108841780B (zh) * | 2018-06-29 | 2019-03-12 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 适合大规模生产pedv疫苗的无血清培养基 |
| CN114214278A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-22 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 一种神经元细胞体外培养方法 |
| CN114214278B (zh) * | 2021-12-23 | 2024-03-19 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 一种神经元细胞体外培养方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2002330167A1 (en) | 2003-04-14 |
| EP1451294A2 (en) | 2004-09-01 |
| WO2003029417A2 (en) | 2003-04-10 |
| CA2462802A1 (en) | 2003-04-10 |
| US20080160006A1 (en) | 2008-07-03 |
| US20030077564A1 (en) | 2003-04-24 |
| WO2003029417A3 (en) | 2003-12-04 |
| US20050208028A1 (en) | 2005-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1599792A (zh) | 在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基 | |
| EP0925067B1 (en) | Graft from submucosal intestinal tissue for repairing neurological tissue | |
| JP3311351B2 (ja) | 新規なケラチノサイト培養物，その調製方法及び創傷治療物質としてのその用途 | |
| Tachibana et al. | Evaluation of the healing process after dural reconstruction achieved using a free fascial graft | |
| JP5227024B2 (ja) | 毛包真皮毛根鞘細胞の培養法 | |
| JP5391488B2 (ja) | 接着結合を持つ細胞の増殖を刺激するＲＮＡｉ方法および組成物 | |
| JP2007130027A (ja) | 星状細胞の増殖の誘導方法およびそのための組成物 | |
| DE69635924T2 (de) | Isolierung und züchtung von schwannzellen | |
| CN1571835A (zh) | 在创伤治疗中可用作生物活性物质的角质细胞 | |
| US20060177927A1 (en) | Method for growth of human conjunctival tissue equivalents for research, clinical ocular surface transplantation and tissue engineering | |
| JP2009527250A (ja) | 結膜組織系 | |
| JP7008360B2 (ja) | 軟骨細胞の無血清培養方法，及び無血清培地 | |
| Smeringaiova et al. | Ex vivo expansion and characterization of human corneal endothelium for transplantation: a review | |
| Tannemaat et al. | Genetic modification of human sural nerve segments by a lentiviral vector encoding nerve growth factor | |
| TW506827B (en) | Method for expansion of epithelial stem cells on an amniotic membrane and resulting graft | |
| Buyuklu et al. | Viability of crushed human auricular and costal cartilage chondrocytes in cell culture | |
| CN115003321A (zh) | 胶原凝胶配制品 | |
| Maini et al. | Case series describing the use of low-temperature vacuum-dehydrated amnion (Omnigen) for the treatment of corneal ulcers in cats and dogs: 46 cases (2016-2017) | |
| JP2009225675A (ja) | 上皮系細胞シートの作製のための同種皮膚由来フィーダー細胞 | |
| JP2017529087A (ja) | インビトロでの卵母細胞発育方法 | |
| EP3893904A1 (en) | Generation and cryopreservation of pluripotent stem cell-derived clinical grade corneal endothelial cells | |
| PL212052B1 (pl) | Sposób pozyskiwania glejowych komórek węchowych i ich zastosowania | |
| Figueiredo et al. | Corneal Epithelial Stem Cells: Methods for Ex Vivo Expansion | |
| RU2489176C1 (ru) | Способ тканевой инженерии спинного мозга после его анатомического разрыва | |
| Mitra et al. | Neural placode tissue derived from myelomeningocele repair serves as a viable source of oligodendrocyte progenitor cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |