PL212052B1 - Sposób pozyskiwania glejowych komórek węchowych i ich zastosowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu izolowania ludzkich glejowych komórek węchowych (GKW) z błony śluzowej nosa i opuszki węchowej zwłok oraz przechowywania i oczyszczania tych komórek. Metoda ta umożliwia wykorzystanie GKW do allogenicznej transplantacji w celu zastosowania do leczenia uszkodzeń w ośrodkowym i/lub obwodowym układzie nerwowym powstałych wskutek urazu, niedokrwienia, demielinizacji lub degeneracji.

Opis stanu techniki. Glejowe komórki węchowe znajdują się w blaszce właściwej błony węchowej jamy nosowej, wokół wypustek neuronów węchowych oraz w zewnętrznych warstwach opuszki węchowej. Tworzą one osłonkę wokół pęczków aksonów węchowych neuronów receptorowych, towarzysząc im zarówno w obwodowej części drogi węchowej jak i w części centralnej (opuszka węchowa). GKW należą do populacji komórek makrogleju i są odpowiedzialne za proces powstawania nowych węchowych neuronów receptorowych z prekursorowych komórek podstawnych, który zachodzi stale w nabłonku węchowym dorosłych ssaków [1]. Poza tym GKW mają zdolność do stymulacji regeneracji neuronów węchowych gdy dojdzie do uszkodzenia ich aksonów [2,3].

Wykonano szereg doświadczeń, w których oceniano zdolność GKW do stymulacji regeneracji uszkodzonych włókien nerwowych w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym w rdzeniu kręgowym. Wyniki badań, w których szczurze GKW przeszczepiano do ogniska uszkodzenia rdzenia kręgowego (RK) szczura wskazują, że GKW stymulują regenerację aksonów neuronów korowych, pniowych i rdzeniowych uszkodzonych wskutek urazu RK. Poza tym GKW mogą tworzyć przepuszczalny dla odrastających włókien pomost pomiędzy proksymalnym i dystalnym odcinkiem uszkodzonego rdzenia kręgowego [4,5]. Wykazano, że dordzeniowa transplantacja GKW warunkowała również istotny powrót funkcji motorycznej, sensorycznej i wegetatywnej u szczurów z eksperymentalnie uszkodzonym rdzeniem kręgowym [6,7,8]. W innych badaniach GKW pobrane z opuszki węchowej psa powodowały remielinizację w modelu doświadczalnej demielinizacji rdzenia kręgowego psa [9]. Również ludzkie GKW pobrane z opuszki węchowej żywego dawcy a następnie przeszczepione szczurom do ognisk demielinizacyjnych w RK lub podanych do ogniska kompresyjnego uszkodzenia RK wykazywały właściwości naprawcze - zachowywały zdolność do mielinizacji oraz do indukcji neuroregeneracji w OUN [10,11].

U ludzi transplantacja do uszkodzonego rdzenia kręgowego GKW hodowanych z opuszek węchowych pochodzących z ludzkich płodów, powodowała statystycznie istotną poprawę czucia w teście ukłucia szpilką [12]. Zabiegi dordzeniowej implantacji autoprzeszczepów zawierających całe fragmenty błony węchowej, powodowała powrót zarówno czucia jak i dowolnej funkcji ruchowej w niektórych mięśniach poniżej miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego u wszystkich z 7 opisywanych przez Limę i wsp., pacjentów [13].

Uważa się, że GKW w różnej formie (np. z hodowli pierwotnych lub modyfikowane genetycznie, oczyszczone lub wraz z innymi komórkami i macierzą komórkową) mogą, mieć zastosowanie w leczeniu uszkodzeń w ośrodkowym i/lub obwodowym układzie nerwowym powstałych wskutek urazu, niedokrwienia, demielinizacji lub degeneracji po przeszczepieniu w miejsce uszkodzenia.

Jednym z problemów transplantologii związanych z przeszczepianiem tkanek/komórek jest dostępność materiału do przeszczepienia. Szansa na osiągnięcie sukcesu terapeutycznego rośnie wraz ze wzrostem liczebności populacji potencjalnych dawców (co umożliwia dobranie jak najlepszego pod względem zgodności dawcy) oraz ilością materiału dostępnego do wykonania przeszczepu. W przypadku zastosowania GKW w leczeniu np. urazów RK bardzo ważnym problemem jest określenie takiego źródła i metody pozyskiwania tych komórek, które pozwalałyby nie tylko na otrzymanie ich w wystarczającej liczbie ale również przeszczepienie w optymalnym okresie po urazie RK, tak aby GKW mogły umożliwić funkcjonalną regenerację włókien nerwowych. Dlatego wciąż poszukuje się sposobów umożliwiających pobieranie i izolowanie GKW z różnych nowych źródeł.

Dotychczas ujawniono metody pobierania od osób żywych fragmentów błony węchowej zawierającej GKW. Opisano sposób pobierania dużych fragmentów błony śluzowej nosa od pacjentów z urazem rdzenia kręgowego i ich bezpośredniej autogenicznej transplantacji do ogniska uszkodzenia w RK [13]. Opatentowano technikę biopsji małych fragmentów błony węchowej zawierającej GKW [14]. Otrzymane tą drogą bioptaty mogą być następnie poddane procedurze in vitro, w wyniku której powstają hodowle oczyszczonych GKW do przeszczepienia chorym z urazem RK [14].

Głównym problemem związanym z pobieraniem GKW drogą biopsji jest trudność w lokalizacji obszaru węchowego błony śluzowej jamy nosowej. Badania anatomiczne wykazały, że nabłonek

PL 212 052 B1 węchowy u ludzi (w odróżnieniu od innych ssaków) jest nieregularnie rozproszony i tworzy w jamie nosowej „wysepki” poprzedzielane przez zwykły nabłonek oddechowy [15]. Według Ferrona i wsp. prawdopodobieństwo otrzymania fragmentów nabłonka węchowego drogą biopsji błony śluzowej jamy nosowej z okolic gdzie powinien się on znajdować (grzbietowo-tylna cześć małżowiny nosowej górnej i przegrody nosa oraz przednia część małżowiny nosowej środkowej) waha się w populacji zdrowych młodych ludzi od 30% do 76% [15]. Dane te zostały częściowo potwierdzone przez Leopolda i wsp. [16]. Dlatego u części pacjentów może być konieczne kilkukrotne pobranie fragmentów błony węchowej [15]. Mimo, że lokalizacja pola węchowego u człowieka nie jest stała istnieje miejsce, w którym stale obecne są komórki układu węchowego, w tym GKW. Jest nim okolica błony śluzowej znajdująca się bezpośrednio pod blaszką sitową kości sitowej, w miejscu gdzie aksony węchowych neuronów receptorowych w postaci tzw. „nici węchowych” przechodzą do przestrzeni wewnątrzczaszkowej. Jednakże wykonanie u pacjenta biopsji błony śluzowej nosa z okolicy blaszki sitowej obarczone jest ryzykiem groźnego powikłania jakim jest złamanie blaszki sitowej kości sitowej z przerwaniem opony twardej i następowym wyciekiem płynu mózgowo-rdzeniowego (blaszka sitowa jest mało odporną na urazy okolicą podstawy czaszki, szczególnie u pacjentów cierpiących na przewlekły nieżyt błony śluzowej nosa lub z wrodzonym niedorozwojem blaszki sitowej) [17]. Poza tym biopsja błony śluzowej nosa może prowadzić do trwałych zaburzeń węchu, spowodowanych m.in. metaplazją nabłonka oddechowego albo powstaniem bliznowatych zrostów w jamie nosowej [15,18].

Z kolei metoda leczenia oparta na transplantacji całych fragmentów tkankowych zawierających GKW wymaga usunięcia blizny glejowej, co nie jest możliwe we wczesnej fazie urazu RK, ze względu na brak możliwości określenia zakresu zmian pourazowych i tworzącej się blizny glejowej w RK [13].

Pobranie od żywego dawcy opuszki węchowej jako źródła GKW w celu ich transplantacji wymagałoby przeprowadzenia inwazyjnej operacji neurochirurgicznej (kraniotomii) i wiązałoby się z jednostronną (lub całkowitą w przypadku pobrania obu opuszek) utratą węchu. Skutkiem takiego zabiegu mogłyby być takie powikłania jak neuroinfekcje, uszkodzenie tkanki mózgowej (stłuczenie), krwawienie śródczaszkowe, padaczka oraz typowe powikłania związane z zabiegiem operacyjnym wymagającym zastosowania znieczulenia.

Dlatego pożądane jest opracowanie sposobów otrzymywania GKW, które umożliwiałyby przeszczepienie tych komórek w dowolnie wybranym przez lekarza momencie, nie narażałyby dawcy na poważne powikłania.

Rozwiązaniem tych problemów jest np. pobieranie GKW od zmarłych dawców. Dotychczas opisano możliwość pobierania i technikę hodowli ludzkich GKW z opuszek węchowych martwych płodów (tzw. płodowe GKW) w celu allogenicznej transplantacji tych komórek [12]. Z patentu Moreno-Flores i wsp. wynika, że istnieje możliwość wyhodowania GKW z opuszek pobranych ze zwłok, jednak autorzy nie ujawnili sposobu pobierania opuszek ze zwłok [19]. Również informacje o metodach pobierania i izolacji GKW z błony śluzowej ze zwłok nie zostały dotąd ujawnione.

W większości z proponowanych metod leczenia z zastosowaniem GKW zakłada się przeszczepianie mniej lub bardziej oczyszczonych GKW, tzn. pozbawionych innych rodzajów komórek np. komórek nabłonka, śródbłonka i fibroblastów. Ujawnionych jest kilka metod oczyszczania pierwotnych hodowli GKW. Ramon-Cueto i wsp. przedstawili sposób oczyszczania GKW z użyciem metody powierzchni immunopanningu [5]. Metoda ta polega na wykorzystuje zjawisko wiązania specyficznych receptorów p75-NGFR występujących na GKW z przeciwciałami, którymi jest opłaszczona płytka hodowlana. Barnett i wsp. zastosowali inną metodę pozytywnej selekcji GKW z użyciem przeciwciał przeciwko receptorowi p75-NGFR związanych z kulkami feromagnetycznymi [20]. GKW związane z takimi przeciwciałami zostają zatrzymane na kolumnie pod wpływem pola magnetycznego. Nash i wsp. ujawnili metodę oczyszczania GKW, która polega na wykorzystaniu zróżnicowanych właściwości adhezji GKW i innych towarzyszących im komórek do szkła [21]. W metodzie tej do oczyszczenia GKW dochodzi poprzez wielokrotne pasaże zawiesiny komórek zawierającej GKW na szklanych płytkach hodowlanych. Patent Ferona i Makay-Sima ujawnia metodę oczyszczania GKW poprzez ich hodowanie w medium bez surowicy, z dodatkiem neurotrofiny 3 [14].

Hodowla pierwotnych GKW może być prowadzona tylko przez ograniczony czas, ponieważ po upływie kilku tygodni dochodzi do degeneracji tych komórek. Jedną z metod umożliwiających długotrwałe przechowywanie GKW jest ich zamrożenie w ciekłym azocie [9,22]. Nie ujawniono, czy tą metodę można zastosować do przechowywania ludzkich GKW pobranych ze zwłok. Inną metodę umożliwiającą długotrwałe przechowywanie GKW w hodowli ujawnia patent Moreno-Flores i wsp. [19]. W tej metodzie pierwotne GKW zostają odwracalnie unieśmiertelnione przy użyciu wektorów lenti- i adenowiru4

PL 212 052 B1 sowych co umożliwia ich długotrwałą hodowlę. Ta metoda została opracowana przy użyciu GKW wyizolowanych z ludzkich zwłok.

Istota wynalazku. Opisane powyżej problemy są nieoczekiwanie rozwiązywane w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sposób pozyskiwania ludzkich glejowych komórek węchowych (GKW) ze zwłok charakteryzujący się tym, że:

a) przeprowadza się wstępne odkażenie nozdrzy,

b) uzyskuje się operacyjny dostęp do podstawy czaszki,

c) pobiera się co najmniej jeden region tkanki zawierającej GKW wybranej spośród opuszek węchowych, nici węchowych i węchowego obszaru błony śluzowej nosa, przy czym pobranie opuszek węchowych przeprowadza się w warunkach krążenia lub do 40 minuty od jego zatrzymania, natomiast pobranie węchowego obszaru błony śluzowej nosa wraz z przylegającą do niego częścią kości sitowej przeprowadza się do 180 minuty od zatrzymania krążenia,

d) odkaża się błonę śluzową przylegającą do pobranego fragmentu kości sitowej,

e) izoluje się, hoduje się i ewentualnie poddaje dalszemu oczyszczaniu uzyskane GKW z błony śluzowej ze zwłok,

f) przechowuje się uzyskane GKW.

W korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie

a) wstępne odkażanie nozdrzy prowadzi się za pomocą roztworu wody utlenionej i/lub amikacyny lub innych znanych środków odkażających do stosowania zewnętrznego zawierających roztwór wody utlenionej lub inny środek nadający się do odkażania błony śluzowej, ewentualnie z dodatkiem antybiotyku.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie b) operacyjny dostęp do podstawy czaszki uzyskuje się poprzez wykonanie zmodyfikowanego cięcia środkowo-czołowego i kraniotomii i/lub kraniektomii środkowo-podstawno-czołowej.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie c) prowadzi się zasadniczo jednoczesne pobieranie opuszek węchowych, nici węchowych i węchowego obszaru błony śluzowej nosa.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie d) odkażanie prowadzi się za pomocą roztworu wody utlenionej lub innych środków zawierających ten składnik.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie e) prowadzi się hodowlę wytrząsaną.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie e) prowadzi się hodowlę w dopuszczalnych mediach hodowlanych zawierających czynniki stymulujące wzrost. Jako przykładowe czynniki wzrostu i media, które mogą być stosowane w sposobie według wynalazku można wymienić: aFGF ( ang.: acidic Fibroblast Growth Factor), bFGF (ang.: basic Fibroblast Growth Factor), BDNF (ang.: Brain-Derived Neurotrophic Factor), CNTF (ang.: Ciliary Neurotrophic Factor), Fors (ang.: Forskolin), GGF 2 ( ang.: Glial Growth Factor 2), HGF (ang.:

Hepatocyte Growth Factor), hrgpi (ang.: heregulin beta 1), IGF 1 (ang.: Insulin-like Growth Factor 1), IGF 2 (ang.: Insulin-like Growth Factor 2), NGF (ang.: Nerve Growth Factor), NT-3 (ang.: Neurotrophin-3), NT-4 (ang.: Neurotrophin-4), NT-5 (ang.: Neurotrophin-5), PDGF (ang.: Platelet-Derived Growth Factor), PE (ang.: Pituitary Extract), ACM (ang.: Astrocyte Conditioned Medium), Neurobasal® czyli medium podstawowe z suplementem B27.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że etap e) prowadzi się w pojemnikach uniemożliwiających przyklejenia się GKW do podłoża, korzystnie pojemnikach z polipropylenu.

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie e) prowadzi się hodowlę metodą zróżnicowanej adhezji komórek do podłoża (tj. metody opisanej przez Nasha).

W równie korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w punkcie e) prowadzi się długotrwałe przechowywanie w ciekłym azocie GKW z hodowli pierwotnych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób hodowania ludzkich glejowych komórek węchowych (GKW) charakteryzujący się tym, że hodowlę prowadzi się w standardowym medium płynnym w warunkach utrudniających ich adhezję. W sposobie tym, korzystnie hodowlę prowadzi się w warunkach wytrząsania. Równie korzystnie hodowlę prowadzi się w mediach zawierających czynniki

PL 212 052 B1 stymulujące wzrost. Równie korzystnie hodowlę prowadzi się w pojemnikach uniemożliwiających przyklejenie się GKW do podłoża, korzystnie pojemnikach z polipropylenu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie GKW uzyskanych sposobami według wynalazku do otrzymywania produktów do transplantacji i/lub leczenia uszkodzeń w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym. Korzystnie uszkodzenie jest wybrane spośród uszkodzenia pourazowego, niedokrwiennego, degeneracyjnego lub demielinizacyjnego, natomiast otrzymywany produkt przeznaczony jest do auto- lub allogenicznej transplantacji GKW, zwłaszcza w celu stymulacji neuroregeneracji.

W przedstawionym opisie wynalazku zastosowano szereg pojęć, wymagających ścisłego zdefiniowania:

zwłoki/zmarły dawca - osoba uznana za zmarłą na podstawie komisyjnego stwierdzenia śmieci pnia mózgu;

kraniotomia - rodzaj otwarcia kości czaszki, polegający na zdjęciu za pomocą piły kostnej (kraniotomu) płata kostnego w całości, z możliwością jego przywrócenia kraniektomia - rodzaj otwarcia kości czaszki, polegający na zdjęciu kości, bez możliwości wytworzenia płata kostnego;

czas ciepłego niedokrwienia - odstęp czasu pomiędzy momentem zamknięcia aorty a momentem pobrania danego narządu/tkanki;

pobranie wielonarządowe - pobranie w czasie jednego zabiegu więcej niż jednego narządu lub tkanek z różnych narządów;

wpw - skrót od: w polu widzenia.

Reasumując należy stwierdzić, że wynalazek ujawnia:

1) metodę izolacji GKW ze zwłok z uwzględnieniem, takich etapów jak: a) przygotowanie zwłok do pobrania tkanek;

b) pobranie opuszek węchowych i błony węchowej ze zwłok;

c) izolacja błony węchowej i nici węchowych;

2) metodę hodowli i oczyszczania GKW uzyskanych z różnych źródeł;

3) metodę przechowywania ludzkich GKW izolowanych ze zwłok.

Nie ograniczając wynalazku do tej szczególnej realizacji, można zaproponować następującą, szczególną realizację sposobu według wynalazku.

Przygotowanie do pobrania tkanek celem wyhodowania GKW z błony węchowej ze zwłok wykonuje się wg metody, która polega na wstępnym przemyciu przewodów nosowych środkiem odkażającym, w czasie do 6 godzin przed planowanym pobraniem tkanek. Do odkażania można użyć na przykład 3% roztwór wody utlenionej albo innych preparatów do dezynfekcji błon śluzowych (np. Skinsept mucosa; Ecolab), bez lub z antybiotykiem (np. 25 mg/ml amikacyny). W odkażonych nozdrzach można pozostawić waciki (lub inne materiały) nasączone środkiem odkażającym.

Do zabiegu pobrania opuszek węchowych i/lub błony węchowej zwłoki układa się w pozycji leżącej na plecach z głową przygiętą maksymalnie do przodu. Po odkażeniu i sterylnym obłożeniu pola operacyjnego, wykonuje się cięcie proste skóry w linii łączącej najwyższe punkty łuków brwiowych o długości 7-9 cm (zmodyfikowane cięcie środkowo-czołowe). Po odwarstwieniu powłok od kości czaszki i odsłonięciu nasady nosa i gładzizny wykonuje się kraniektomię lub kraniotomię środkowo-podstawno-czołową wraz ze zdjęciem obu ścian zatoki czołowej. Po obustronnym łukowatym wycięciu opony twardej, należy wykonać resekcję biegunów płatów czołowych. W kolejnym etapie zabiegu eksponuje się przedni dół czaszki - przyśrodkową część stropu oczodołu, strop zatoki sitowej oraz okolicę blaszki sitowej kości sitowej. Wgląd do struktur podstawy przedniego dołu czaszki można uzyskać za pomocą mikroskopu operacyjnego lub różnego rodzaju światła zogniskowanego (np. lampa Clara).

W celu pobrania opuszki węchowej leżącej na blaszce sitowej należy delikatnie unieść podstawę płata czołowego i pobrać opuszkę (np. za pomocą pęsety lub zasysając do pipety Pasteurowskiej), po jej odcięciu od pasma węchowego. Ustrojowe krążenie krwi może być zatrzymane u dawcy do 40 min. przed pobraniem opuszek węchowych.

W celu pobrania błony węchowej, należy odwarstwić za pomocą dissektora i wyciąć oponę twardą z górnej powierzchni kości sitowej a następnie oddzielić kość sitową od pozostałych kości przedniego dołu czaszki. Następnie wyciąga się kość sitową wraz z przylegającą do niej błoną śluzową jamy nosowej. W skład tak pobranego fragmentu kości sitowej powinny wchodzić obie blaszki sitowe,

PL 212 052 B1 grzebień blaszki pionowej (crista gali) oraz górna część blaszki pionowej kości sitowej. Ustrojowe krążenie krwi może być zatrzymane u dawcy do 180 min. przed pobraniem błony węchowej.

Pobrany fragment lub fragmenty kości sitowej wraz z przylegającymi tkankami odkaża się poprzez przemycie lub zanurzenie (na 10-30 sek.) w 3% roztworze wody utlenionej, po czym umieszcza się w probówce z medium hodowlanym.

Pobranie kości sitowej en bloc, wraz z przylegającą do niej błoną śluzową, umożliwia przeprowadzenie dokładnej lokalizację węchowego obszaru błony śluzowej nosa (błony węchowej). Błonę śluzową nosa należy oddzielić mechanicznie od kości sitowej, przy użyciu dissektora, pęsety i nożyczek. Do izolacji GKW wykorzystuje się fragmenty błony śluzowej, znajdujące się bezpośrednio poniżej blaszki sitowej kości sitowej, błonę śluzową z okolicy przegrody nosa w bezpośrednim sąsiedztwie z blaszką sitową oraz fragmenty nici węchowych biegnących w kierunku blaszki sitowej kości sitowej.

Do izolacji i hodowli GKW z błony węchowej ze zwłok stosuje się metodę Ferona i Mackay-Sima, opracowaną dla GKW otrzymanych z bioptatów błony węchowej od żyjących dawców oraz metodę Nasha opracowaną dla GKW z opuszki węchowej szczura [14,21].

W trakcie naszych badań obserwowaliśmy, że w czasie prowadzenia hodowli i oczyszczania GKW metodą wg Nasha, ludzkie GKW przyklejają się do stosowanych w tej metodzie szklanych szalek. Powoduje to utratę części GKW w kolejnych etapach oczyszczania. Dlatego zastosowaliśmy uproszczoną metodę hodowli i oczyszczania GKW, która polega na hodowaniu GKW w zawiesinie, w sposób uniemożliwiający ich adhezję do podłoża. W tym celu hodowlę GKW prowadzi się w naczyniach wykonanych z materiałów uniemożliwiających adhezję komórek (np. polipropylen), jak również hodując GKW w standardowych plastikowych naczyniach używanych do hodowli komórkowych w warunkach stałego wstrząsania. Metoda ta może być zastosowana do hodowli i oczyszczania GKW pozyskanych ze zwłok i od żyjących dawców.

Do długotrwałego przechowywania GKW ze zwłok można zastosować metodę mrożenia tych komórek w ciekłym azocie, która była dotychczas używana do przechowywania GKW izolowanych od żywych dawców i zwierząt [9,22, 23].

Zalety wynalazku. Prezentowany wynalazek umożliwia izolację GKW ze wszystkich odcinków zarówno centralnej i obwodowej części drogi węchowej, w których mogą znajdować się te komórki. Pozwala na uzyskanie GKW do allogenicznych transplantacji bez konieczności pobierania tkanek od żywych dawców co mogłoby narażać ich na różne powikłania. Umożliwia również przeszczepienie GKW pacjentom, u których uzyskanie własnych GKW jest niemożliwe z powodu trudnych warunków anatomicznych lub schorzeń, powodujących degenerację błony śluzowej jamy nosowej.

Przedstawiona metoda operacji pozwala na dotarcie w stosunkowo krótkim czasie (około 10-15 min.) do struktur przedniego dołu czaszki. Tym samym w przypadku konieczności przeprowadzenia operacji w warunkach zatrzymania krążenia zwiększa się szansa na pobranie żywotnych opuszek węchowych i na izolację z nich GKW. Poza tym nasza metoda pozwala na pozyskanie jak największego obszaru centralnej i obwodowej części drogi węchowej (opuszka węchowa, nici węchowe i błona węchowa), w których mogą znajdować się glejowe komórki węchowe. Pobieranie w całości kości sitowej wraz z przylegającą do niej błoną śluzową jamy nosowej gwarantuje pobranie do izolacji GKW tych fragmentów błony śluzowej, w których z definicji powinien znajdować się nabłonek węchowy, tj. błona śluzowa znajdująca się bezpośrednio pod blaszką sitową kości sitowej. Tym samym nasza metoda rozwiązuje problem związany z trudnością w lokalizacji i pobraniu fragmentów błony węchowej z nosa przy użyciu metod biopsji przez jamę nosową a jednocześnie problem powikłań związanych z pobieraniem fragmentów błony węchowej z jamy nosowej od osób żywych. Nasza metoda zapewnia także dobry efekt kosmetyczny po zamknięciu powłok ciała (wygląd twarzoczaszki).

Zastosowanie metody hodowli GKW w zawiesinie, w sposób uniemożliwiający ich adhezję do podłoża, pozwala na uzyskanie częściowo oczyszczonych hodowli GKW. Proporcja GKW do innych komórek w takiej hodowli jest zbliżona do proporcji (50:50), jaką Li i wsp. uważają za korzystnie warunkującą działanie neurotroficzne GKW, po przeszczepieniu do uszkodzonego rdzenia kręgowego [4,24]. Nasza metoda umożliwia również przechowywanie GKW w zawiesinie przez okres do 2 tygodni od ich izolacji. W ten sposób GKW mogą być przeszczepione bez konieczności użycia enzymów stosownych do odklejania komórek od podłoża, co może uszkadzać komórki lub niszczyć ważne dla ich funkcji struktury na powierzchni błony komórkowej.

Opracowana procedura długotrwałego przechowywania GKW w ciekłym azocie pozwala na wyizolowanie i zgromadzenie dowolnej ilości GKW tak aby przeprowadzić ich transplantację w dowolnie

PL 212 052 B1 wybranym przez lekarza momencie. Umożliwia to stworzenie banku GKW do allogenicznej transplantacji.

Dla lepszego zobrazowania istoty przedmiotowego wynalazku do niniejszego opisu załączone zostały następujące figury:

Figura 1: schematyczne przedstawienie zmodyfikowanego cięcia środkowo-czołowego (1) oraz dostępu środkowo-podstawno-czołowego do podstawy przedniego dołu czaszki (2). 3 - łuki brwiowe.

Figura 2: pobrany fragment kości sitowej wraz z przylegającą do niej błoną śluzową jamy nosowej, zawierający obie blaszki sitowe, grzebień blaszki pionowej (crista gali) oraz górna część blaszki pionowej kości sitowej. A. Widok od strony podstawy czaszki. B. Widok od strony jamy nosowej.

Figura 3: ekspresja antygenu S100 na GKW izolowanych z opuszek węchowych ze zwłok (powiększenie x100). A. Pojedyncze p75-LNGFR-pozytywne GKW w hodowli (+) od dawcy Z09. B. Liczne S100-pozytywne GKW w hodowli (+ +) od dawcy Z06. C. Bardzo liczne, tworzące w hodowli sieć (+ + +) S100-pozytywne GKW od dawcy Z05.

Figura 4: ekspresja antygenu S100 i p75-LNGFR na GKW izolowanych z błony węchowej ze zwłok (powiększenie x100). A. Bardzo liczne, tworzące w hodowli sieć (+ + +) S100-pozytywne GKW od dawcy Z02. B. Bardzo liczne, tworzące w hodowli sieć (+ + +) p75-LNGFR-pozytywne GKW od dawcy Z07.

Figura 5: ekspresja antygenu S100 i p75-LNGFR na GKW po ich rozmrożeniu (powiększenie x100). A. S100+ GKW izolowane z opuszki węchowej. B. p75-LNGFR-pozytywne GKW izolowana z opuszki węchowej. C. S100-pozytywne GKW izolowane z błony węchowej.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie zwłok do pobrania tkanek celem wyhodowania GKW z błony węchowej

Przygotowanie martwego dawcy do pobrania tkanek celem wyhodowania GKW z błony węchowej wykonywano wg metody, polegającej na wstępnym przemyciu przewodów nosowych środkiem odkażającym. Przed rozpoczęciem odkażania z nozdrzy usuwano sondę żołądkową i inne ciała obce. Do odkażania używano 3% roztworu wody utlenionej albo preparatu Skinsept mucosa (Ecolab) (zawierający w 100 g 10,4% etanolu 96%, 1,5 g glukonianu chlorheksydyny 20%, 1,67% nadtlenku wodoru 30%) bez lub z antybiotykiem, np. 25 mg/ml amikacyny (Biodacyna; Bioton). Środkiem odkażającym przemywano nozdrza do 6 godzin przed planowanym pobraniem tkanek. W odkażonych nozdrzach pozostawiano do czasu zabiegu waciki setonowe nasączone środkiem odkażającym. Takie postępowanie umożliwiło izolację komórek z błony węchowej, które nie ulegną infekcji w hodowli.

Opisana metoda została opracowana w oparciu o wyniki kilku badań, w których stosowano różne sposoby przygotowania zwłok do pobrania tkanek do hodowli GKW. Niezależnie od metody przed zabiegiem zmarłym dawcom podawano profilaktycznie antybiotyki (np. z grupy cefalosporyn) zgodnie ze standardową procedurą przygotowania dawcy do zabiegu. Wyizolowane wg ujawnionych w niniejszym wynalazku komórki hodowano w sterylnych plastikowych szalkach (Corning) w medium do hodowli z dodatkiem antybiotyków (mieszanina 1:1 zmodyfikowanego przez Dulbeco medium Eagla i medium odżywczego Hama F-12 (Sigma) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone), 2 mM L-glutaminy (Sigma), 10 mg/ml streptomycyny (Polfa Tarchomin) i 100 IU/ml penicyliny (Polfa Tarchomin)). Obserwacje prowadzono w mikroskopie świetlnym przez co najmniej 10 dni.

Pierwszy sposób polegał na względnie aseptycznym pobraniu fragmentów kości sitowej wraz z przylegającą do niej błoną węchową nosa bez wstępnego odkażania nozdrzy a następnie zanurzeniu fragmentów pobranych tkanek przez 30 sekund w 1% roztworze polyvidonum iodum (Povidone Iodine, Polfa Kutno) zalecanym przez producenta w tym stężeniu do odkażania jam ciała. W każdym z dwóch przypadków, kiedy tkanki do hodowli GKW pobierano w ten sposób, w hodowli obserwowano kolonizację bakteryjną.

Drugi sposób polegał na wstępnym odkażeniu błony śluzowej jamy nosowej za pomocą Skinsept mucosa (Ecolab) a następnie zanurzeniu fragmentów pobranych tkanek przez 30 sekund w 1% roztworze polyvidonum iodum. Tkanki do hodowli GKW pobierano w ten sposób jednym przypadku i nie obserwowano kolonizacji bakteryjnej.

Trzeci sposób polegał na wstępnym odkażeniu błony śluzowej jamy nosowej za pomocą roztworu wody utlenionej (3%) a następnie zanurzeniu fragmentów pobranych tkanek przez 30 sekund w 3% roztworze wody utlenionej. W każdym z czterech przypadków, kiedy tkanki do hodowli GKW pobierano w ten sposób, w hodowli nie obserwowano kolonizacji bakteryjnej.

Czwarty sposób polegał na wstępnym odkażeniu błony śluzowej jamy nosowej za pomocą roztworu wody utlenionej (3%) i antybiotyku (25 mg/ml amikacyny (Biodacyna; Bioton) a następnie zanurzeniu

PL 212 052 B1 fragmentów pobranych tkanek przez 30 sekund w 3% roztworze wody utlenionej. W każdym z czterech przypadków, kiedy tkanki do hodowli GKW pobierano w ten sposób, w hodowli nie obserwowano kolonizacji bakteryjnej.

P r z y k ł a d 2

Pobieranie opuszek węchowych i błony węchowej ze zwłok

W celu opracowania metody pobrania tkanek zawierających GKW zmodyfikowano opisywane w literaturze cięcie skórne środkowo-czołowe (ang. midforehead incision) oraz zastosowaliśmy dostęp środkowo-podstawno-czołowy (ang. midfrontobasal approach) do struktur przedniego dołu czaszki [25,26]. Cięcie skórne środkowo-czołowe jest stosowane w chirurgii plastycznej twarzoczaszki do tzw. liftingu czołowego [25]. Znalazło ono również zastosowanie w chirurgii szczękowo-twarzowej oraz w neurochirurgii - do operacji w obrębie zatoki czołowej lub środkowej części przedniego dołu czaszki [27,28]. Wykonanie cięcia skórnego środkowo-czołowego skraca czasu zabiegu oraz minimalizuje okołooperacyjną utratę krwi w porównaniu do alternatywnego cięcia wieńcowego [27]. Zaproponowana modyfikacja tego cięcia polegała na obniżeniu linii cięcia do linii łączącej najwyższe punkty łuków brwiowych, równoległej do linii zmarszczek czołowych.

Otwarcie kostne w dostępie środkowo-podstawno-czołowym wykonano metodą kraniotomii lub kraniektomii środkowo-czołowo-podstawnej [26,28].

Metoda pobrania opuszek węchowych

W pierwszym etapie zmarłego dawcę układano w pozycji leżącej na plecach z głową przygiętą maksymalnie do przodu. Po odkażeniu i sterylnym obłożeniu pola operacyjnego, wykonywano cięcie proste skóry w linii łączącej najwyższe punkty łuków brwiowych o długości 7-9 cm. Po odwarstwieniu powłok od kości czaszki i odsłonięciu nasady nosa i gładzizny wykonywano kraniektomię lub kraniotomię środkowo-podstawno-czołową wraz ze zdjęciem obu ścian zatoki czołowej (ryc. 1). Po obustronnym łukowatym wycięciu opony twardej odsłaniano szpatułką mózgową oba bieguny płatów czołowych i wykonywano za pomocą ssaka resekcję biegunów płatów czołowych. W drugim etapie eksponowano za pomocą szpatułki mózgowej przyśrodkową część stropu oczodołu, strop zatoki sitowej oraz okolicę blaszki sitowej kości sitowej. W celu odsłonięcia leżącej na blaszce sitowej opuszki węchowej unoszono delikatnie podstawę płata czołowego. Opuszki pobierano w zależności od ich konsystencji pęsetą guzową, jeśli konsystencja była twarda lub pipetą Pasteurowską jeśli była rozpulchniona. Ubytek po zdjętej kości uzupełniano sztucznym materiałem (np. gazikiem). Powłoki zszywano warstwowo (nicią chirurgiczną 2-0), a skórę - szwem śródskórnym ciągłym (nicią chirurgiczną 2-0 albo 3-0 w niektórych przypadkach). Wgląd do struktur podstawy przedniego dołu czaszki uzyskiwano za pomocą mikroskopu operacyjnego lub różnego rodzaju światła zogniskowanego (np. lampa Clara).

Metoda pobrania błony węchowej oraz „ nici węchowych”

Błonę węchową pobierano z dostępu wewnątrzczaszkowego. Pierwszy etap zabiegu polegał na dotarciu do podstawy przedniego dołu czaszki. Był on analogiczny do pierwszego etapu metody pobrania opuszek węchowych. W drugim etapie, za pomocą dissektora odwarstwiano i wycinano oponę twardą z górnej powierzchni kości sitowej. Przy użyciu długiego dłuta albo piły oscylacyjnej oddzielano kość sitową od pozostałych kości przedniego dołu czaszki. Następnie za pomocą kleszczy Puncha wyciągano kość sitową wraz z przylegającą do niej błoną śluzową jamy nosowej (ryc. 2). W skład tak pobranej kości sitowej wchodzą obie blaszki sitowe, grzebień blaszki pionowej (crista gali) oraz górna część blaszki pionowej kości sitowej. Przy użyciu dissektora, pesety i nożyczek oddzielano tą część błony śluzowej, która znajdowała się bezpośrednio poniżej blaszki sitowej kości sitowej. Taki sposób pobrania błony śluzowej pozwalał również na pozyskanie niektórych pęczków aksonów węchowych neuronów receptorowych, tworzących tzw. „nici węchowe”. Uzupełnienie ubytku po zdjętej kości oraz zszycie powłok wykonywano tak jak w przypadku pobrania opuszek węchowych.

Wgląd do struktur podstawy przedniego dołu czaszki można uzyskać za pomocą mikroskopu operacyjnego lub różnego rodzaju światła zogniskowanego (np. lampa Clara).

Zastosowanie kilkucentymetrowego cięcia skórnego środkowo-czołowego a następnie kraniektomii/kraniotomii środkowo-podstawno-czołowej pozwalało neurochirurgowi na dotarcie w krótkim czasie (do 15 min.) do struktur przedniego dołu czaszki. Taka metoda może być zastosowana do pobrania opuszki zawierającej żywe GKW, w warunkach nagłego zatrzymania krążenia dawcy, do którego może dojść przykładowo:

1. w trakcie pobrania wielonarządowego, gdy ze względu na pobranie innych narządów konieczne jest zatrzymanie krążenia przed momentem pobrania opuszek;

PL 212 052 B1

2. w sytuacji kiedy u dawcy z powodu niestabilności hemodynamicznej dojdzie do nagłego zatrzymania krążenia przed pobraniem tkanek do hodowli GKW. Opisana technika szybkiego pobrania opuszki węchowej pozwala rozwiązać problem niekorzystnego wpływu ciepłego niedokrwienia na możliwość wyizolowania GKW z opuszki węchowej a tym samym możliwość izolacji z niej GKW. Problem ten zostanie szczegółowo poruszony poniżej.

Określenie momentu pobrania materiału pozwalającego na skuteczne wyhodowanie GKW w odniesieniu do momentu zatrzymania krążenia

Pobranie narządów/tkanek ze zwłok może mieć m.in. miejsce w warunkach:

1. samoistnego zatrzymania krążenia u zmarłego dawcy;

2. pobrania wielonarządowego, podczas którego konieczna jest synchronizacja momentu zatrzymania krążenia u zmarłego dawcy z kolejnością i momentem pobrania poszczególnych narządów w zależności od ich wrażliwości na niedokrwienie, tak aby zachować ich żywotność.

Poszczególne narządy i tkanki mają różną wrażliwość na niedokrwienie. Wykazano na przykład, że bezpieczny czas ciepłego niedokrwienia w przypadku wątroby nie powinien przekraczać 30 min. a w przypadku trzustki 60 min. [29,30,31]. W związku z tym należy spodziewać się, że również GKW w opuszce i błonie węchowej mają ograniczony czas przeżycia w warunkach niedokrwienia.

Opisana metoda rozwiązuje ten problem. Na podstawie przeprowadzonych badań ustaliliśmy, że w sytuacji zatrzymania krążenia ustrojowego, procedura pobierania opisaną powyżej metodą opuszek węchowych, z których można z dużym prawdopodobieństwem wyhodować GKW, powinna być zakończona do 40 min. od indukcji zatrzymania krążenia.

T a b e l a 1.

Wyniki hodowli GKW z opuszek węchowych pobranych ze zwłok

Lp.	kod pacjenta	czas od zatrzymania krążenia	wynik hodowli *	markery identyfikujące GKW
1	Z08	0 min	+ +	p75-LNGFR
2	Z05	20 min	+ + +	p75-LNGFR, S100
3	Z09	25 min	+	p75-LNGFR
4	Z01	30 min	+	S100
5	Z07	30 min	-	-
6	Z06	40 min	+ +	S100
7	Z02	120 min	-	-
8	Z03	125 min	+	p75-LNGFR, S100
9	Z04a	135 min	+	S100
10	Z04b	155 min	-	-

* legenda: (-) brak GKW w hodowli; (+) pojedyncze GKW w hodowli (0-20 komórek wpw); (++) liczne GKW w hodowli (20-50 komórek wpw);

(+++) bardzo liczne GKW w hodowli (powyżej 50 komórek wpw tworzących sieci)

GKW wyhodowano w 5 z 6 przypadków, w których zastosowano taką procedurę ich pobierania (tab. 1; dawcy Z01, Z05, Z06, Z08, Z09). W połowie tych 6 przypadków wyhodowano liczne bądź bardzo liczne GKW, przy czym liczne GKW obserwowano w hodowli z opuszek pobranych nawet 40 min. po zatrzymaniu krążenia. W pozostałych 4 badanych przypadkach, gdy opuszki pobierano w czasie powyżej 40 min. od zamknięcia aorty, zaledwie w 2 przypadkach stwierdzono pojedyncze GKW w hodowli (tab. 1; dawcy Z03 i Z04a).

Pobieranie błony węchowej z zastosowaniem opisanej wcześniej metody, powinno być zakończone w czasie do 180 min. po indukcji zatrzymania krążenia, aby możliwe było wyhodowanie GKW z pobranej tkanki.

PL 212 052 B1

T a b e l a 2.

Wyniki hodowli GKW z błony węchowej i nici węchowych pobranej ze zwłok

Lp.	kod pacjenta.	czas od zatrzymania krążenia	wynik hodowli *	markery identyfikujące GKW
1	Z08	30 min	+ +	p75-LNGFR
2	Z05	40 min	**	-
3	Z09	45 min	**	-
4	Z01	50 min	+	p75-LNGFR
5	Z07	55 min	+ + +	p75-LNGFR, S100
6	Z03	175 min	+ + +	p75-LNGFR, S100
7	Z02	180 min	+ + +	p75-LNGFR, S100
8	Z04	180 min	+	S100

* legenda: (-) brak GKW w hodowli; (+) pojedyncze GKW w hodowli (0-20 komórek wpw);

(++) liczne GKW w hodowli (20-50 komórek wpw);

(+++) bardzo liczne GKW w hodowli (powyżej 50 komórek wpw tworzących sieci) ** błona węchowa pobierana inną metodą (biopsja fragmentów błony śluzowej nosa po uprzednim rozfragmentowaniu blaszek sitowych kości sitowej)

W 4 przypadkach, w których pobierano błonę węchową, w czasie do 180 min. po indukcji zatrzymania krążenia, wyhodowano bardzo liczne GKW (Z02, Z03, Z07, Z08) a w 2 przypadkach (Z01 i Z04) wykazano pojedyncze GKW w hodowli (tab. 2). Zastosowanie 2 przypadkach (Z05 i Z09) innej metody pobierania błony węchowej, polegającej na biopsji mniejszych fragmentów błony śluzowej nosa po uprzednim rozfragmentowaniu blaszek sitowych kości sitowej, nie pozwoliło na wyhodowanie GKW (tab. 2). Ten sposób pobrania materiału nie pozwalał na dokładne zidentyfikowanie obszaru węchowego błony śluzowej.

P r z y k ł a d 3

Metoda hodowli GKW uzyskanych ze zwłok

Bezpośrednio po pobraniu opuszki były umieszczane w probówce z medium hodowlanym (mieszanina 1:1 zmodyfikowanego przez Dulbecco medium Eagla i medium odżywczego Hama F-12 (DMEM/F-12, Sigma) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Hyclone), 2 mM L-glutaminy (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny (Polfa Tarchomin) i 100 IU/ml penicyliny (Polfa Tarchomin).

Pobrany fragment lub fragmenty kości sitowej wraz z przylegającymi tkankami odkażano poprzez przemycie lub zanurzenie (na 10-30 sek.) w 3% roztworze wody utlenionej, po czym umieszczano w probówce z medium hodowlanym.

Materiał tkankowy transportowano w temperaturze 2-8°C. Izolację GKW z opuszki węchowej i błony węchowej nosa rozpoczynano w czasie 40 do 55 min. od pobrania tkanek.

Po usunięciu fragmentów opony miękkiej opuszki węchowe umieszczano w płynie Hanksa z dodatkiem kolagenazy H (5 mg/ml, Sigma) i rozdrabniano na mniejsze fragmenty za pomocą nożyczek oraz poprzez nabranie materiału do strzykawki kolejno przez igły o rozmiarze 19G i 20G. Po 15 min.

inkubacji w temp. 37°C działanie kolagenazy H przerywano dodając do zawiesiny komórek medium hodowlanego z dodatkiem EDTA w stężeniu końcowym 0,5 mM. Po odwirowaniu (5 min., 800xg) komórki zawieszano w medium do hodowli, ponownie rozdrabniano poprzez nabranie materiału do strzykawki kolejno przez igły o rozmiarze 20G, 22G i 25G otrzymując zawiesinę komórek do hodowli

GKW.

Błonę śluzową nosa oddzielano mechanicznie od kości sitowej i rozdrabniano na mniejsze fragmenty za pomocą skalpela i nożyczek, a następnie inkubowano w buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej (PBS) z dodatkiem 2 Ul/ml dispazy (GibcoBRL) przez 45 min. w temp. 37°C. Działanie dispazy przerywano dodając równą objętość płynu Hanksa, z dodatkiem 10% FCS. Następnie, pod mikroskopem oddzielano mechanicznie nabłonek od blaszki właściwej błony śluzowej nosa. Odwirowane (5 min., 800xg) fragmenty blaszki właściwej błony węchowej rozdrabniano mechanicznie i trawiono enzymatycznie w identyczny sposób jak opuszkę węchową.

Przygotowany w ten sposób materiał do hodowli składał się z pojedynczych komórek i jak również niewielkich fragmentów, z których komórki wyrastały w postaci eksplantów. Hodowle GKW prowadzono w oparciu o metodę ujawnioną przez Nasha i wsp. polegającą na wykorzystaniu zróżniPL 212 052 B1 cowanych właściwości adhezji GKW i innych towarzyszących im komórek [21]. Komórki inkubowano w temp. 37°C, w atmosferze powietrza zawierającego 5% CO2. Co drugi dzień wymieniano połowę objętości medium hodowlanego.

GKW identyfikowano na podstawie ekspresji specyficznych antygenów, pomiędzy 8 a 38 dniem od założenia hodowli (tab. 1 i 2). W reakcji immunofluorescencji pośredniej badano ekspresję charakterystycznych antygenów GKW [32]. Ekspresję receptora dla czynnika wzrostu nerwów o niskim powinowactwie (p75-LNGFR) badano przy użyciu monoklonalnego mysiego przeciwciała przeciwko ludzkiemu p75-LNGFR (Kamiya) i koziego przeciwciała przeciwko mysiej immunoglobulinie G związanego z fluoresceiną (Sigma). Ekspresję białka cytoplazmatycznego S100 badano przy użyciu poliklonalnego króliczego przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi S100 (Dako) i koziego przeciwciała przeciwko króliczej immunoglobulinie G związanego z fikoerytryną (Sigma).

Na podstawie 2 pierwszych badanych przypadków (Z01 i Z02), z których wyhodowano GKW z błony węchowej nosa, wykazano, że w hodowlach komórkowych tkanek pobieranych z opisanego obszaru błony węchowej nie stwierdza się obecności komórek Schwanna. Zostało to potwierdzone brakiem ekspresji antygenu powierzchniowego HNK-1 obecnego na powierzchni komórek Schwanna [33].

P r z y k ł a d 4

Hodowla i oczyszczanie GKW

W trakcie naszych badań obserwowaliśmy, że w czasie prowadzenia hodowli i oczyszczania GKW metodą wg Nasha, ludzkie GKW przyklejają się do stosowanych w tej metodzie szklanych szalek. Powoduje to utratę części GKW w kolejnych etapach oczyszczania. Dlatego zastosowaliśmy uproszczoną metodę hodowli i oczyszczania GKW polegającą na hodowaniu GKW w zawiesinie, w sposób uniemożliwiający ich adhezję do podłoża. Osiągnęliśmy to zarówno prowadząc hodowlę GKW w naczyniach wykonanych z materiałów uniemożliwiających adhezję komórek (np. polipropylen), jak również hodując GKW w standardowych plastikowych naczyniach używanych do hodowli komórkowych w warunkach stałego wstrząsania.

Zawiesiny komórek do hodowli, pobranych z błony śluzowej nosa ludzkich zwłok, uzyskiwano w sposób opisany powyżej, a następnie inkubowano w temp. 37°C, w atmosferze powietrza zawierającego 5% CO2, w płaskodennych pojemnikach polipropylenowych bez wytrząsania lub w standardowych naczyniach do hodowli komórkowych z polistyrenu (Corning) umieszczonych na mieszadle (MINI 3D, Omega; 20 obr./min.), które wymuszało stały ruch komórek w zawiesinie utrudniający przyklejenie się komórek do podłoża. Po 7 lub 14 dniach zawiesinę komórek przenoszono do naczyń hodowlanych, opłaszczonych poli-L-lizyną. Po następnych 4-11 dniach hodowli komórek w postaci adherentnej obecność GKW w hodowli oceniano na podstawie ekspresji antygenu p75-LNGFR na powierzchni komórek. Stopień oczyszczenia GKW w hodowli określano jako średni stosunek komórek p75-LNGFR⁺ do wszystkich komórek w hodowli z co najmniej 8 losowo wybranych pól widzenia. Liczbę wszystkich komórek ustalano na podstawie fluorescencji jąder komórkowych z użyciem fluorochromu Hoechst 33342 barwiącego przyżyciowo DNA. Kontrolę do oceny stopnia oczyszczenia stanowiły komórki wyizolowane z tego samego materiału tkankowego hodowane od początku w postaci adherentnej w takich samych naczyniach hodowlanych opłaszczonych poli-L-lizyną.

Po 4 dniach hodowli wyizolowanych komórek uprzednio inkubowanych przez 7 dni w pojemnikach polipropylenowych lub standardowych naczyniach hodowlanych umieszczonych na mieszadle, obserwowaliśmy, że średni odsetek GKW w hodowlach wynosił odpowiednio 65% (pojemniki polipropylenowe) i 56% (naczynia na mieszadle). W komórkach kontrolnych, hodowanych od początku tj. przez 11 dni w standardowych naczyniach hodowlanych, odsetek ten wynosił 13%. W innym eksperymencie potwierdziliśmy, że nawet po 14 dniach inkubacji zawiesiny komórek wyizolowanych z błony węchowej nosa ze zwłok w pojemnikach polipropylenowych, możliwe jest wyhodowanie z niej GKW (obecność GKW oceniano po 11 dniach hodowli komórek w postaci adherentnej).

P r z y k ł a d 5

Metoda przechowywania ludzkich GKW

Badano możliwość długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie GKW izolowanych ze zwłok. Opuszki węchowe oraz błonę węchową pobierano metodą opisaną szczegółowo w przykładzie 2. Po izolacji (również metodą opisaną szczegółowo w przykładzie 2) komórek z pobranych tkanek, zawiesiny komórek w medium hodowlanym, przeznaczone do zamrożenia, wzbogacano przez dodanie 20% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone) i 10% dimetylosulfotlenku (ICN) i przenoszono do probówek do mrożenia (NUNC Cryotube) [9, 22]. Probówki te wkładano do pojemnika do mrożenia (Nalgene Cryo

PL 212 052 B1

Freezing Container), który następnie przez 12 godz. był przechowywany w temp. -70°C. Po tym czasie probówki z zamrożonymi komórkami przenoszono do zbiornika (dewara) wypełnionego ciekłym azotem. Po upływie 5 miesięcy zawiesiny komórek rozmrożono. Po wyjęciu z dewara probówki inkubowano w temp. pokojowej. Bezpośrednio po rozmrożeniu do zawiesin komórek dodano medium hodowlanego (mieszanina 1:1 zmodyfikowanego przez Dulbecco medium Eagla i medium odżywczego Hama F-12 (DMEM/F-12, Sigma) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Hyclone), 2 mM L-glutaminy (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny (Polfa Tarchomin) i 100 lU/ml penicyliny (Polfa Tarchomin) i odwirowano (800xg, 5 min.). Żwirowane komórki zawieszono w medium i umieszczono w naczyniach hodowlanych (plastikowe szalki do hodowli komórkowych; Corning) i hodowano w temp.

37°C, w atmosferze powietrza zawierającego 5% CO2. Obecność GKW w hodowli potwierdzono w 20 dniu hodowli na podstawie ekspresji antygenu p75-LNGFR i S100 dla GKW izolowanych z opuszek węchowych i antygenu S100 dla GKW izolowanych z błony węchowej (ryc. 5). Ekspresję receptora dla czynnika wzrostu nerwów o niskim powinowactwie (p75-LNGFR) badano przy użyciu monoklonalnego mysiego przeciwciała przeciwko ludzkiemu p75-LNGFR (Kamiya) i koziego przeciwciała przeciwko mysiej immunoglobulinie G związanego z fluoresceiną (Sigma). Ekspresję białka cytoplazmatycznego S100 badano przy użyciu poliklonalnego króliczego przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi S100 (Dako) i koziego przeciwciała przeciwko króliczej immunoglobulinie G związanego z fikoerytryną (Sigma).

Piśmiennictwo:

[1] Costanzo RM, Graziadei PPC. Development and plasticity of the olfactory system. W: Neurobiology of Taste and Smell. Red.: Finger TE, Silver WL. John Wiley&Sons. 1987; pp 233-250.

[2] Graziadei P, Monti Graziadei G. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. III. Deafferentation and reinnervation of the olfactory bulb following section of the fila olfactoria in rat. J Neurocytol. 1980; 9: 145-162.

[3] Oakley B, Riddle DR. Receptor cell regeneration and connectivity in olfaction and taste. Exp Neurol. 1992; 115: 50-54.

[4] Li Y, Field PM, Raisman G. Regeneration of adult rat corticospinal axons induced by transplanted olfactory ensheathing cells. J Neurosci. 1998; 18(24): 10514-10524.

[5] Ramon-Cueto A, Plant GW, Avila J, Bunge MB. 1998. Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants. J Neurosci. 1998; 18(10): 3803- 3815.

[6] Lu J, Feron F, Mackay-Sim A, Waite PM. Olfactory ensheathing cells promote locomotor recovery after delayed transplantation into transected spinal cord. Brain. 2002,125:14-21.

[7] Ramon-Cueto A, Cordero MI, Santos-Benito FF, Avila J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 2000; 25:

425-435.

[8] Li Y, Decherchi P, Raisman G. Transplantation of olfactory ensheathing cells into spinal cord lesions restores breathing and climbing. J Neurosci. 2003; 23(3): 727-731.

[9] Smith PM, Lakatos A, Barnett SC, Jeffery ND, Franklin RJ. Cryopreserved cells isolated from the adult canine olfactory bulb are capable of extensive remyelination following transplantation into the adult rat CNS. Exp Neurol. 2002; 176: 402-406.

[10] Kato T, Honmou O, Uede T, Hashi K, Kocsis JD. Transplantation of human olfactory ensheathing cells elicits remyelination of demyelinated rat spinal cord. Glia. 2000; 30: 209-218.

[11] Keirstead H: cyt. wg Cocke A. Researchers explore the boundaries of regeneration. Brain Work. The Neuroscience Newsletter, red. Cocke A., Dana Press, Washington, Jan. Feb. 2003,13(1):5-6.

[12] Huang H, Chen L, Wang H i wsp. Influence of patient's age on functional recovery after transplantation of olfactory ensheathing cells into injured spinal cord injury. Chin Med J. 2003; 116(10): 1488-1491.

[13] Lima C, Vital J, Escada P i wsp. Olfactory mucosa autografts in human spinal cord injury. W: Proceedings of 12th European Congress of Neurosurgery. Lizbona 2003, p 96.

[14] Feron F, Mackay-Sim A. Olfactory ensheating cells isolated from the lamina propria. International patent No. WO0130982 (A1).

[15] Feron F, Perry C, McGrath J, Mackay-Sim A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurones. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1998; 124: 861-866.

[16] Leopold DA, Hummel T, Schwob JE, Hong SC, Knecht M, Kobal G. Anterior distribution of human olfactory epithelium. Laryngoscope. 2000; 110: 417-421.

PL 212 052 B1

[17] Greenberg MS. Skull fractures. W: Hanbook of Neurosurgery. Thieme New York (wyd. 5). 2001; pp 655-658.

[18] Nakashima T, Kimmelman CP, Snow JB. Immunohistopatology of human olfactory epithelium, nerve and bulb. Laryngoscope. 1985; 95:391-396.

[19] Moreno-Flores M, Martin BM, Avila J, Wandosell JF, Diaz NJ. Reversibly immortalised olfactory ensheathing glia and their use to promote neuronal regeneration. International patent No. WO 2005/0125513 (A1).

[20] Barnett SC, Alexander CL, Iwashita Y, Gilson JM, Crowther J, Clark L, Dunn LT, Papanastassiou V, Kennedy PG, Franklin RJ. Identification of a human olfactory ensheathing cell that can effect transplant-mediated remyelination of demyelinated CNS axons. Brain. 2000; 123: 1581-1588.

[21] Nash HH, Borke RC, Anders JJ. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 2001; 34: 81-87.

[22] Gudino-Cabrera G, Nieto-Sampedro M. Ensheathing cells: large scale purification from adult olfactory bulb, freeze-preservation and migration of transplanted cells in adult brain. Restor Neurol Neurosci. 1996; 10: 25-34.

[23] Tabakow P, Międzybrodzki R, Fortuna W, Jarmundowicz W, Czapiga B. Studies on the application of cells from olfactory bulb in the treatment of complete spinal cord injuries. Culture and cryopreservation of human olfactory ensheathing cells (abstrakt nr NE0064). W: II International Congress on Neuroregeneration. Abstracts. Rio de Janeiro 2004; pp 33-34.

[24] Li Y, Field PM, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997; 277(5334): 2000-2002.

[25] McKinney P, Mossie RD, Łukowski ML. Criteria for the forehead lift. Aesthetic Plast Surg. 1991; 15(2): 141-147.

[26] Koos WT, Spetzler RF, Lang J. Tumors of the anterior skuli base. W: Color atlas of microneurosurgery. Tom 1,2. Thieme Verlag, 1993, p 207.

[27] Cheney ML, Gliklich R, Li KK, Topf P, Montgomery W. Midforehead incision: an approach to the frontal sinus and the upper face. J Craniofac Surg. 1995 6(5): 408-411.

[28] Hallacq P, Moreau JJ, Fisher G, Beziat JL. Frontal sinus approach to olfactory groove meningiomas. Neurochirurgie. 1999: 45(4): 329-337.

[29]. He XS, Ma Y, Wu LW, Ju WQ, Wu JL, Hu RD, Chen GH, Huang JF. Safe time to warm ischemia and posttransplant survival of liver graft from non-heart-beating donors. World J Gastroenterol. 2004; 10(21) :3157-3160.

[30]. He XS, Ma Y, Wu LW, Ju WQ, Chen GH, Hu RD, Huang JF. Influence of warm ischemia injury on hepatic functional status and survival of liver graft in rats. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2003; 2(4): 504-508.

[31]. Florack G, Sutherland DE, Ascherl R, Heil J, Erhardt W, Najarian JS. Definition of normothermic ischemia limits for kidney and pancreas grafts. J Surg Res. 1986; 40(6): 550-563.

[32] Au E, Roskams AJ. Olfactory ensheathing cells of the lamina propria in vivo and in vitro. Glia. 2003;41:224-236.

[33] Martini R, Schachner M. Immunoelectron microscopic localization of neural cell adhesion molecules (L1, N-CAM, and MAG) and their shared carbohydrate epitope and myelin basic protein in developing sciatic nerve. J Cell Biol. 1986; 103: 2439-2448.

Claims (17)

1. Sposób pozyskiwania ludzkich glejowych komórek węchowych (GKW) ze zwłok, znamienny tym, że:

a) uzyskuje się operacyjny dostęp do podstawy czaszki,

b) pobiera się tkankę zawierającą GKW, przy czym pobranie opuszek węchowych przeprowadza się w warunkach krążenia lub do 40 minuty od jego zatrzymania, natomiast pobranie węchowego obszaru błony śluzowej nosa wraz z przylegającą do niego częścią kości sitowej przeprowadza się do 180 minuty od zatrzymania krążenia,

c) izoluje się i hoduje się uzyskane GKW.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie a) wstępne odkażanie nozdrzy prowadzi się za pomocą roztworu wody utlenionej i/lub amikacyny lub innych znanych środków odkażają14

PL 212 052 B1 cych do stosowania zewnętrznego zawierających roztwór wody utlenionej lub inny środek nadający się do odkażania błony śluzowej, ewentualnie z dodatkiem antybiotyku.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie a) operacyjny dostęp do podstawy czaszki uzyskuje się poprzez wykonanie zmodyfikowanego cięcia środkowo-czołowego i kraniotomii i/lub kraniektomii środkowo-podstawno-czołowej.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie b) prowadzi się zasadniczo jednoczesne pobieranie opuszek węchowych, nici węchowych i węchowego obszaru błony śluzowej nosa.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie b) prowadzi się odkażanie błony śluzowej przylegającej do pobranego fragmentu kości sitowej za pomocą roztworu wody utlenionej lub innych środków nadających się do odkażania błony śluzowej.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie c) prowadzi się hodowlę wytrząsaną.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie c) prowadzi się hodowlę w mediach hodowlanych zawierających czynniki stymulujące wzrost.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap c) prowadzi się w pojemnikach uniemożliwiających przyklejenie się GKW do podłoża, korzystnie pojemnikach z polipropylenu.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie c) prowadzi się hodowlę metodą zróżnicowanej adhezji komórek do podłoża.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w punkcie c) prowadzi się długotrwałe przechowywanie w ciekłym azocie GKW z hodowli pierwotnych.

11. Sposób hodowania ludzkich glejowych komórek węchowych (GKW), znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w standardowym medium płynnym w warunkach utrudniających adhezję.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w warunkach wytrząsania.

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w mediach zawierających czynniki stymulujące wzrost.

14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w pojemnikach uniemożliwiających przyklejenie się GKW do podłoża, korzystnie pojemnikach z polipropylenu.

15. Zastosowanie GKW uzyskanych sposobem według zastrz. od 1 do 10 albo sposobem według zastrz. od 11 do 14 do otrzymywania produktów do transplantacji i/lub leczenia uszkodzeń w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że uszkodzenie jest wybrane spośród uszkodzenia pourazowego, niedokrwiennego, degeneracyjnego lub demielinizacyjnego.

17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że otrzymywany produkt przeznaczony jest do transplantacji GKW, zwłaszcza w celu stymulacji neuroregeneracji.