CN105067581A - 大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法 - Google Patents

大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，取SD乳鼠，消毒后处死，取出脊髓，分离出脊髓背角组织，剥除脊髓外膜，将组织剪成小块，转移至离心管中，加入胰蛋白酶消化；然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，离心后弃上清液；加入NB/B27培养基重悬细胞，接种于激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置；加入含青霉素和链霉素的NB/B27培养基；以荧光指示剂负载，置于培养箱内孵育，NB培养基漂洗，再以NB培养基覆盖细胞，激光扫描共聚焦显微镜扫描检测。本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，可用于观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响，为研究皮质酮对脊髓背角感觉神经元功能的调节及其作用机制创造了条件。

Description

大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，具体涉及一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法。
背景技术
糖皮质激素(glucocorticoid，GC)具有广泛的生理作用，调节机体的多种功能。临床常用于抗炎、抑制免疫反应和膜稳定等。GC通过基因组和非基因组两种途径发挥作用，其中，非基因组作用是近30年来才被慢慢认识并重视的，其效应发生迅速，不涉及基因表达和蛋白质合成，但其分子机制尚不明确。
近期研究表明，GC在伤害性信息的传递及病理性疼痛的发生中充当着重要的角色。文献资料显示，GC在疼痛的外周和中枢神经机制中均参与伤害性信息的调制。背根节神经元是感觉传入的第一级神经元，GC可通过基因组和非基因组两条途径改变初级感觉神经元的兴奋性，从而调节伤害性信息的产生传导。GC在疼痛中枢机制的研究主要集中于脊髓水平，脊髓背角感觉神经元上糖皮质激素受体(glucocorticoidreccptor，GR)可通过调节谷氨酸受体等与疼痛密切相关的神经活性物质受体的功能，增强脊髓背角神经元的兴奋性，从而促成病理性疼痛的产生与发展，这些效应发生慢，为基因组作用。GC能否通过非基因组作用途径快速影响脊髓背角神经元的兴奋性，继而影响伤害性信息的传递，尚不明确。作为重要的胞内信使，Ca2+对神经元的多种生理功能如兴奋性、突触传递以及神经元的发育分化、修复再生等产生决定性影响。GC能否通过调节脊髓背角神经元Ca2+浓度而影响其功能，尚有待实验证明。
发明内容
本发明的目的之一是为提供一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，通过该方法可以观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响。
本发明提供一种大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，包括以下步骤：
取出生未满三日的SD乳鼠，经75％乙醇消毒后断头处死，取出脊髓，分离出脊髓背角组织，剥除脊髓外膜，将所述脊髓背角组织剪成小块，转移至离心管中，加入胰蛋白酶置于细胞培养箱内消化；然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，离心后弃上清液；加入NB/B27培养基重悬细胞，接种于激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置3h；加入1.5ml含青霉素和链霉素的NB/B27培养基；以荧光指示剂负载，置于培养箱内孵育，NB培养基漂洗，再以NB培养基覆盖细胞，激光扫描共聚焦显微镜扫描检测。
进一步的，所述脊髓背角组织剪成1mm3小块。
进一步的，所述胰蛋白酶浓度为0.125％。
进一步的，所述细胞培养箱内消化条件为37℃、5％CO2，消化30min。
进一步的，所述离心条件为1000r/min离心5min。
进一步的，所述重悬细胞时NB/B27培养基加入量为200μl。
进一步的，接种的所述激光共聚焦专用皿经多聚赖氨酸和层黏连蛋白双重包被。
进一步的，所述荧光指示剂为浓度2μmol/L的Fluo-4/AM。
进一步的，所述培养箱内的孵育条件为37℃孵育30min。
进一步的，所述扫描条件为激发波长488nm，发射波长515nm，检测15min，得到钙荧光图像。
本发明的有益效果在于：Ca2+作为重要的胞内信使，对神经元的多种生理功能如兴奋性、神经递质的释放、突触传递等产生决定性影响，故细胞内Ca2+浓度变化是细胞功能检测的一项重要指标。本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，可用于观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响，为研究皮质酮对脊髓背角感觉神经元功能的调节及其作用机制创造了条件。
附图说明
图1所示为本发明实施例加入CORT(1μmol/L)前脊髓背角神经元的基础荧光图；
图2所示为本发明实施例加入CORT(1μmol/L)后脊髓背角神经元荧光图；
图3所示为本发明实施例加入CORT(1μmol/L)后脊髓背角神经元量效结果中钙荧光强度曲线变化图；
图4所示为本发明实施例不同剂量CORT对脊髓背角神经元Ca2+浓度影响的统计图；
图5所示为本发明实施例加入CORT(1μmol/L)后脊髓背角神经元信号通路中钙荧光强度变化曲线图；
图6所示为本发明实施例孵育液中无钙离子时加入CORT(1μmol/L)后脊髓背角神经元信号通路中钙荧光强度变化曲线图；
图7所示为本发明实施例RU38486(10μmol/L)预孵育20min后加入CORT(1μmol/L)后的钙荧光强度曲线图；
图8所示为本发明实施例PTX(100ng/ml)预孵育24h后加入CORT(1μmol/L)后的钙荧光强度变化曲线图；
图9所示为本发明实施例CORT致脊髓背角神经元Ca2+浓度升高作用的药理学特征图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例
本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，包括以下步骤：
1脊髓背角神经元的培养
取SD乳鼠(＜3d)，经75％乙醇消毒后断头处死，迅速取出脊髓，在解剖显微镜下眼科刀沿界沟分离出脊髓背角组织，迅速剥除脊髓外膜，将脊髓背角组织剪成小块(约1mm3)，转移至离心管中，加入0.125％胰蛋白酶置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内消化30min；然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，置离心机1000r/min离心5min，弃上清液；加入NB/B27培养基200μl重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸和层黏连蛋白双重包被的激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置3h；加入1.5mlNB/B27培养基(含青霉素、链霉素)。
2激光共聚焦技术检测神经元Ca2+浓度变化
将脊髓背角神经元接种在激光共聚焦专用皿中，实验为5组：
1)对照组；
2)皮质酮(CORT)组(0.1、1、10μmol/L)；
3)无钙液+CORT组：孵育液为无钙液时，给予CORT(1μmol/L)；
4)糖皮激素受体阻断剂RU38486+CORT组：孵育液含糖皮激素受体(glucocorticoidreccptor，GR)拮抗剂RU38486时，给予1μmol/L的CORT；
5)百日咳毒素(PTX)+CORT组：孵育液含G蛋白活化抑制剂PTX时，给予1μmol/L的CORT。
各组细胞以荧光指示剂Fluo-4/AM(2μmol/L)负载，置于37℃培养箱内孵育30min，NB培养基漂洗3遍，再以少许NB培养基覆盖细胞，避光待测。
3扫描参数为：激发波长488nm，发射波长515nm，检测15min，得到钙荧光图像并存入计算机中，Ca2+荧光强度的动态变化反映胞内Ca2+浓度的变化。
4统计学处理：计量资料以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件，两组间差异显著性检验采用两独立样本的t检验，多组均数间显著性比较用单因素方差分析。
5结果
1、CORT对脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响
如图1和图2所示，图2中钙荧光强度明显高于图1，说明加入1μmol/L的CORT后脊髓背角神经元的钙荧光强度明显增强。如图3所示，1μmol/L的CORT孵育数分钟可致培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度显著升高。如图4所示，CORT升高神经元Ca2+浓度效应呈现剂量依赖性，在0.1～10μmol/L范围内，随着CORT浓度的增高，其升高神经元Ca2+浓度效应亦增强(P＜0.05)。
2、细胞外钙浓度对CORT诱导的神经元Ca2+浓度升高效应的影响
为了检测CORT所致的神经元Ca2+浓度升高是依赖于细胞外钙内流抑或是内钙释放，使用EGTA螯合孵育液中的Ca2+(Ca2+:EGTA＝0.2:1mmol/L，预孵育20min)，如图5和图6所示，螯合孵育液中钙可显著减弱CORT所致的神经元Ca2+浓度升高(P＜0.01)，说明CORT诱导的神经元Ca2+浓度升高是以外钙内流为主。
3、PTX、RU38486对CORT所致的神经元Ca2+浓度升高效应的影响
为了检测CORT导致神经元Ca2+浓度升高效应是由G蛋白偶联的膜受体抑或是经典的胞浆GR介导，分别用G蛋白阻断剂PTX、GR拮抗剂RU38486预孵育脊髓背角神经元。如图7和图8所示，实验发现CORT升高神经元Ca2+浓度的效应可被PTX(100ng/ml，预孵育24h)阻断(P＜0.01)，而RU38486(10μmol/L，预孵育20min)不影响CORT的作用。
如图9所示，CORT明显升高脊髓背角神经元Ca2+浓度(P<0.01)；孵育液中无钙、百日咳毒素(PTX)可阻断CORT所致的脊髓背角神经元Ca2+浓度升高(P<0.01)，而糖皮质激素受体拮抗剂RU38486对CORT的效应无抑制作用。a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.01，与CORT组比较。
由上述实施例可知，本发明提供的方法可有效针对大鼠脊髓角神经元钙浓度进行测定，Ca2+作为重要的胞内信使，对神经元的多种生理功能如兴奋性、神经递质的释放、突触传递等产生决定性影响，故细胞内Ca2+浓度变化是细胞功能检测的一项重要指标。本发明的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，可用于观察皮质酮对培养的脊髓背角神经元Ca2+浓度的影响，为研究皮质酮对脊髓背角感觉神经元功能的调节及其作用机制创造了条件。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (10)

1.大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
取出生未满三日的SD乳鼠，经75％乙醇消毒后断头处死，取出脊髓，分离出脊髓背角组织，剥除脊髓外膜，将所述脊髓背角组织剪成小块，转移至离心管中，加入胰蛋白酶置于细胞培养箱内消化；然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止其消化；吹打成细胞悬液，离心后弃上清液；加入NB/B27培养基重悬细胞，接种于激光共聚焦专用皿中，培养箱内静置3h；加入1.5ml含青霉素和链霉素的NB/B27培养基；以荧光指示剂负载，置于培养箱内孵育，NB培养基漂洗，再以NB培养基覆盖细胞，激光扫描共聚焦显微镜扫描检测。
2.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述脊髓背角组织剪成1mm3小块。
3.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述胰蛋白酶浓度为0.125％。
4.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述细胞培养箱内消化条件为37℃、5％CO2，消化30min。
5.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述离心条件为1000r/min离心5min。
6.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述重悬细胞时NB/B27培养基加入量为200μl。
7.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，接种的所述激光共聚焦专用皿经多聚赖氨酸和层黏连蛋白双重包被。
8.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述荧光指示剂为浓度2μmol/L的Fluo-4/AM。
9.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述培养箱内孵育的条件为37℃孵育30min。
10.如权利要求1所述的大鼠脊髓角神经元钙浓度测定方法，其特征在于，所述扫描的条件为激发波长488nm，发射波长515nm，检测15min，得到钙荧光图像。
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