CN104031879A - 一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，取7～10日龄SD大鼠分离的大脑皮质，经Ⅱ型分散酶消化、两次加入15％葡聚糖溶液三次离心后获得大鼠脑微血管段，用胶原酶/分散酶消化后，在37℃、5％CO₂培养箱中进行原代细胞培养。本发明的体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，简易可行、获得细胞纯度较高，成功分离培养了大鼠脑微血管内皮细胞，倒置显微镜下单个细胞呈短梭形或多角形，汇合后呈铺路石样，单层贴壁生长；经免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性。

Description

一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。

背景技术

脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)是构成血脑屏障的主要成分，是各种生理、病理因素作用的靶细胞。BMECs能通过选择性双向跨细胞膜转运系统以及细胞间的紧密连接将脑组织与血液分开，限制大多数极性分子和蛋白质进入脑组织，只有少部分蛋白质和多肽能通过转胞吞作用通过血脑屏障进入血液。BMECs具有不同于外周内皮细胞的特性：细胞间连接紧密，跨膜电阻高，延迟细胞旁的通量；细胞缺乏孔窗结构，胞饮作用弱，毒素不易通过血脑屏障；细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，产生“两极分化”的表现型。为了更好地在体外研究血脑屏障和脑微血管内皮细胞，原代培养的脑微血管内皮细胞越来越重要。由于目前现有报道的体外培养方法虽然能够培养出脑微血管内皮细胞，但都有一定的缺陷，本发明通过反复试验和改进，成功摸索出相对简单，纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞RBMECs的方法。

发明内容

本发明解决的一个技术问题就是，提供一种简易可行、获得细胞纯度较高的体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。

为了解决上述问题，本发明的技术方案是：

一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，取7～10日龄SD大鼠分离的大脑皮质，经Ⅱ型分散酶消化、两次加入15％葡聚糖溶液三次离心后获得大鼠脑微血管段，用胶原酶/分散酶消化后，在37℃、5％CO₂培养箱中进行原代细胞培养。

所述方法还包括对得到的原代细胞进行纯化并传代培养的步骤。

所述方法还包括对纯化并传代培养得到的大鼠脑微血管内皮细胞进行鉴定的方法，所述鉴定方法是利用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法结合细胞形态学观察对培养的细胞进行鉴定。所述第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法的步骤包括：将细胞传代至共聚焦细胞培养板中，至细胞生长至80％～90％汇合状态时，吸弃培养基，用37℃预热的PBS轻轻清洗3次，加入预冷的95％乙醇；于-20℃固定20min，吸去乙醇，用PBS连续漂洗3次，每次3min；向培养孔中滴加1mL兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清，阴性对照不加，37℃孵育4h；用PBS漂洗3次，每次3min；滴加FITC标记的羊抗兔IgG1mL，37℃孵育1.5h；用PBS液漂洗3次，每次3min；用去离子水冲洗，激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。

本发明的方法，其中体外分离并原代培养阶段具体包括以下步骤：无菌取5只7～10日龄SD大鼠的大脑，D-Hank’s清洗3次，将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动去除软脑膜及大血管，剥离大脑皮质；将分离得到的大脑皮质在D-Hank’s中清洗3次，1000rpm离心2min弃上清液；加入15％Ⅱ型分散酶，用5mL移液枪吹打，吹成匀浆状；37℃水浴消化10min，每隔3min用移液枪吹打数次，800g4℃离心5min，弃上清；加入15％葡聚糖溶液，涡旋2min充分混匀，4500g4℃离心10min，将上层神经及大血管移入另一离心管，加入15％葡聚糖溶液，涡旋2min，4500g4℃离心8min；合并两次离心得到的红色沉淀物，4500g4℃再次离心6min，弃去上层神经组织和大血管，保留底部红色沉淀；用D-Hank’s重悬沉淀，800g4℃离心5min，弃上清；加入1mL胶原酶/分散酶，37℃水浴消化20min，每隔5min吹打数次，取10μL消化液于载玻片在显微镜下观察，可见串珠状微血管段；加入等量的完全培养基终止消化，800g4℃离心5min，加入完全培养基重悬，接种在细胞培养板中；在37℃、5％CO₂恒湿恒温细胞培养箱中培养，24h更换完全培养基，得到原代细胞。对得到的原代细胞可再进行纯化并传代培养。并通过第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法结合细胞形态学观察进行鉴定。

所述纯化并传代培养的步骤包括：原代培养细胞，用37℃预热的D-Hank’s清洗3次，然后加入含0.005％EDT A的0.05％胰蛋白酶，37℃消化2～3min，待大部分细胞收缩变圆时，弃去胰蛋白酶，加入完全培养基，用移液器轻轻吹打使细胞脱壁，吸取细胞悬液，添加等量的完全培养基，混匀，按照1：2接种于细胞培养板，培养箱静置孵育2h更换完全培养基。

上述步骤中提及的完全培养基优选为：20％FBS、1％L-谷氨酰胺、青霉素1×10⁴U·ml^-1、链霉素1×10⁴U·ml^-1、ECGS15μg·mL^-1。

本发明的体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，成功分离培养了大鼠脑微血管内皮细胞，倒置显微镜下单个细胞呈短梭形或多角形，汇合后呈铺路石样，单层贴壁生长；经免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性。

本发明的体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，采用15％葡聚糖三次离心，简便易行且能获得较高纯度BMECs；培养大鼠BMECs的重要步骤之一是分离出较纯的大脑皮质微血管段。常规方法采用组织匀浆和过筛的方式，该方法能有效除去杂细胞，获得纯度较高的微血管段，但这种方法大大降低了微血管段的活性，细胞生长速度慢，一次需要消耗大量大鼠；也有试验表明percoll梯度离心能够纯化微血管段，但经过多次尝试发现，percoll离心过后得到的微血管段活性比离心前大大降低，不利于细胞的生长，且会损耗一部分微血管段，舍去此步骤能够减少纯化微血管段的时间和离心次数，对微血管段的活性损伤小，并且对其纯度影响不大。本发明采用15％葡聚糖4℃三次离心的方法能获得较大量的较纯的微血管段，此前发现采用葡聚糖离心时间均为15min，试验发现此方法很容易使神经组织和大血管混入微血管段，所得脑微血管段纯度不高，本发明最后确定的最优条件是：三次离心时间分别为10min、8min、6min，每次离心前都涡旋使其充分混合。采用水平转子离心，能避免上层神经组织和大血管混入微血管中，缩短离心时间也有利于保护微血管的活性，方法简单易行，对试验条件要求不高。大鼠BMECs相对其他微血管内皮细胞分裂能力较弱，生长条件要求较高，第2～4代细胞活性都比较高，形态也比较稳定，可选用此阶段的细胞进行试验。

另外本发明还发现细胞培养板上不铺布明胶、鼠尾胶等物质不影响BMECs贴壁及生长，在进行原代培养时加入适量的ECGS能促进细胞的生长，如不添加ECGS，采用含有25％～30％FBS的培养基也能促进大鼠BMECs的生长，但其效果较ECGS差。

附图说明

图1为原代及传代培养的RBMECs，其中：

A.分离的大鼠脑皮质微血管段(40×)；B.1d后从微血管段长出的RBMECs(40×)；C.微血管段周围生长的RBMECs(40×)；D.7d左右的RBMECs(40×)；E.生长至汇合状态的RBMECs(40×)；F.2代RBMECs(40×)；G.2代RBMECs(100×)；H.3代RBMECs(100×)；I.6代衰老的RBMECs(100×)；J.7代RBMECs(200×)；

图2为RBMECs第Ⅷ因子鉴定结果(400×)，其中：

A.RBMECs第Ⅷ因子鉴定阳性；B.RBMECs第Ⅷ因子鉴定对照组阴性。

具体实施方式

下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例：

1方法

1.1动物

7～10日龄SD大鼠，雌雄均可，购自中科院遗传所实验动物中心。

1.2主要仪器和器材

CO₂培养箱(SANYO，型号：MCO217AC)，倒置显微镜(OLYMPUS，型号：IX71-A21PH)，高速低温离心机(SIGMA6-16K)，酸度计(赛多利斯，型号：UB-7)，细胞培养板(Costar公司)，激光共聚焦显微镜LEICA等。

1.3试剂

Hankc’s(GIBCO，批号:H2387)，胎牛血清(FBS，PAA LaboratoriesGmbh，批号:A04105-1121)，DMEM高糖培养基(SIGMA，批号:1136551)，胰蛋白酶(1：250，GIBCO，批号:2750018)，Ⅱ型胶原酶(SIGMA，批号:30H6812)，L-谷氨酰胺(SIGMA，批号:G-3126)，兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清(SIGMA，批号:30677904)，羊抗兔IgG-FITC(SIGMA，批号:58630)，胶原酶/分散酶(Roche，货号:10269638001)，ECGS(内皮细胞生长添加剂)(Millipore，批号：02-102)。

1.4RBMECs的原代培养

取5只7～10日龄SD大鼠，脱颈椎处死，75％酒精浸泡消毒，无菌取出大脑，D-Hank’s清洗3次，将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动去除软脑膜及大血管，剥离大脑皮质。将大脑皮质在D-Hank’s中清洗3次，1000rpm离心2min弃上清液。加入15％dispaseⅡ，用5mL移液枪吹打，吹成匀浆状。37℃水浴消化10min，每隔3min用移液枪吹打数次，800g4℃离心5min，弃上清。加入15％dextran溶液，涡旋2min充分混匀，4500g4℃离心10min，将上层神经及大血管移入另一离心管，加入15％dextran溶液，涡旋2min，4500g4℃离心8min。合并两次离心红色沉淀物，4500g4℃离心6min，弃去上层神经组织和大血管，保留底部红色沉淀。用D-Hank’s重悬沉淀，800g4℃离心5min，弃上清。加入1mL胶原酶/分散酶，37℃水浴消化20min，每隔5min吹打数次，取10μL消化液于载玻片在显微镜下观察，可见串珠状微血管段。加入等量的完全培养基终止消化，800g4℃离心5min，加入完全培养基(20％FBS、1％L-谷氨酰胺、青霉素1×10⁴U·ml^-1、链霉素1×10⁴U·ml^-1、ECGS15μg·mL^-1)重悬，接种在细胞培养板中。在37℃、5％CO₂恒湿恒温细胞培养箱中培养，24h更换完全培养基。第7～10天细胞汇合铺满后，消化传代。

1.5RBMEC_s的纯化与传代培养

选取生长至近完全汇合状态的培养孔，吸弃原培养基，用37℃预热的D-Hank’s清洗3次，然后加入的0.05％胰蛋白酶(含0.005％EDT A)，37℃消化2～3min，待大部分细胞收缩变圆时，弃去胰酶，加入的完全培养基，用移液器轻轻吹打使细胞脱壁，吸取细胞悬液，添加等量的完全培养基，混匀，按照1：2接种于细胞培养板，培养箱静置孵育2h更换完全培养基。

1.6RBMECs的鉴定

1.6.1倒置显微镜下细胞形态观察

将培养有原代和传代细胞的培养板置于倒置显微镜下观察细胞贴壁、生长情况及其形态，并拍照记录。

1.6.2第Ⅷ因子免疫荧光鉴定

将细胞传代至共聚焦细胞培养板中，至细胞生长至80％～90％汇合状态时，吸弃培养基，用37℃预热的PBS轻轻清洗3次，加入预冷的95％乙醇；于-20℃固定20min，吸去乙醇，用PBS连续漂洗3次，每次3min；向培养孔中滴加1mL兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清(阴性对照不加)，37℃孵育4h；用PBS漂洗3次，每次3min；滴加FITC标记的羊抗兔IgG1mL，37℃孵育1.5h；用PBS液漂洗3次，每次3min；用去离子水冲洗，激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。

2结果

2.1细胞形态学观察结果

取10μL消化液于载玻片在倒置显微镜下观察，可见大量微血管段，呈串珠样，管壁较光滑、清晰、长度不等，呈单枝或多分枝状，并散在许多微血管内皮细胞，呈小圆形，分布不规则。培养24h后，可见大量细胞从微血管段游出，呈短梭形或多角形。培养7～10天，可见细胞铺满培养孔，生长至汇合状态，形成典型的铺路石样外观。细胞经传代至2代、3代后形态没有明显变化，分裂活性高。细胞经传代至6～7代时细胞形态开始发生变化，分裂能力降低，折光性降低。(见图1)

2.2第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定结果

细胞经免疫荧光染色后，在激光共聚焦扫描显微镜下观察，细胞核周围均出现黄绿色荧光，表明培养的脑微血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色为阳性，显微镜下计数，阳性率达90％，胞质与胞核间界限明显，而对照组细胞不染色(阴性)，表明培养的细胞为RBMECs(见图2)。

发明人曾多次尝试贴块法、非连续梯度的percoll分离微血管段法等方法对BMECs进行分离培养，效果不甚理想，经过改良和总结，最后采用15％葡聚糖三次离心，摸索出了这种简便易行且能获得较高纯度BMECs的培养方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，其特征在于：取7～10日龄SD大鼠分离的大脑皮质，经Ⅱ型分散酶消化、两次加入15％葡聚糖溶液三次离心后获得大鼠脑微血管段，用胶原酶/分散酶消化后，在37℃、5％CO₂培养箱中进行原代细胞培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对得到的原代细胞进行纯化并传代培养的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对纯化并传代培养得到的大鼠脑微血管内皮细胞进行鉴定的方法，所述鉴定方法是利用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法结合细胞形态学观察对培养的细胞进行鉴定。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：无菌取5只7～10日龄SD大鼠的大脑，D-Hank’s清洗3次，将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动去除软脑膜及大血管，剥离大脑皮质；将分离得到的大脑皮质在D-Hank’s中清洗3次，1000rpm离心2min弃上清液；加入15％Ⅱ型分散酶，用5mL移液枪吹打，吹成匀浆状；37℃水浴消化10min，每隔3min用移液枪吹打数次，800g4℃离心5min，弃上清；加入15％葡聚糖溶液，涡旋2min充分混匀，4500g4℃离心10min，将上层神经及大血管移入另一离心管，加入15％葡聚糖溶液，涡旋2min，4500g4℃离心8min；合并两次离心得到的红色沉淀物，4500g4℃再次离心6min，弃去上层神经组织和大血管，保留底部红色沉淀；用D-Hank’s重悬沉淀，800g4℃离心5min，弃上清；加入1mL胶原酶/分散酶，37℃水浴消化20min，每隔5min吹打数次，取10μL消化液于载玻片在显微镜下观察，可见串珠状微血管段；加入等量的完全培养基终止消化，800g4℃离心5min，加入完全培养基重悬，接种在细胞培养板中；在37℃、5％CO₂恒湿恒温细胞培养箱中培养，24h更换完全培养基，得到原代细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对得到的原代细胞进行纯化并传代培养的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述纯化并传代培养的步骤包括：原代培养细胞，用37℃预热的D-Hank’s清洗3次，然后加入含0.005％EDT A的0.05％胰蛋白酶，37℃消化2～3min，待大部分细胞收缩变圆时，弃去胰蛋白酶，加入完全培养基，用移液器轻轻吹打使细胞脱壁，吸取细胞悬液，添加等量的完全培养基，混匀，按照1：2接种于细胞培养板，培养箱静置孵育2h更换完全培养基。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述完全培养基为：20％FBS、1％L-谷氨酰胺、青霉素1×10⁴U·ml^-1、链霉素1×10⁴U·ml^-1、ECGS15μg·mL^-1。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法的步骤包括：将细胞传代至共聚焦细胞培养板中，至细胞生长至80％～90％汇合状态时，吸弃培养基，用37℃预热的PBS轻轻清洗3次，加入预冷的95％乙醇；于-20℃固定20min，吸去乙醇，用PBS连续漂洗3次，每次3min；向培养孔中滴加1mL兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清，阴性对照不加，37℃孵育4h；用PBS漂洗3次，每次3min；滴加FITC标记的羊抗兔IgG1mL，37℃孵育1.5h；用PBS液漂洗3次，每次3min；用去离子水冲洗，激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。