CN104946578A - 一种单个细胞筛选的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种单个细胞筛选的方法及其应用，具体地说，本发明提供一种单个细胞筛选的方法，包括初步分散、显微镜辅助分散、计数稀释、培养液配制和培养几大步骤，以消化分散后的贴壁细胞或悬浮细胞为对象，调节细胞在培养瓶中的浓度，以高效地筛选出大量的单个细胞，易于操作，对操作人员的操作经验没有要求，可在无菌条件下快速地获得大量的、无菌的、变异少的单个细胞，在新药筛选、疫苗制备、单克隆抗体制备上具有较大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及单个细胞筛选的方法及其应用。
背景技术
传代细胞在生命科学方面用途非常广，是新药筛选、基因工程药物和细胞工程药物研究与开发领域的重要的研究对象，同时在疫苗和单克隆抗体的制备方法有着不可或缺的作用，如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
传代细胞是由原代细胞基础上通过胰酶等物质消化后继续用于细胞培养的细胞，它与原代细胞具有相同核型。这类细胞在体外可以无限制分裂。但是传代细胞含有很多不同类型的细胞。不同类型的细胞生物学特性不一样，在生物制品生产过程同一种传代细胞都表现出不同的性能，例如在病毒或生物活性物质产量方面存在差异等。因此，筛选性能好的细胞非常重要，在单抗筛选过程中更为重要，怎么样更好更快的筛到单个克隆细胞是筛选到制备合格单抗克隆抗体先决条件之一。
目前，单个细胞筛选的方法主要梯度稀释方法。但是这种方法存在如下困难：1)细胞稀释梯度低时，每个96孔中细胞量非常多；2)细胞稀释梯度高很容易出现每个96孔没有细胞的情况；同时稀释梯度高，例如当细胞为0.5-10个/毫升时，由于细胞数量少和细胞分布于培养液中不同位置，造成很难在显微镜下观察到并且计数。这也是造成细胞稀释梯度高很容易出现每个96孔没有细胞的情况的根本原因。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速获得大量、均一的单个细胞筛选的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种单层细胞筛选方法，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释100-1000倍，取出250-500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释200-500倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10-20mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；
5)培养：取250-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20-40mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100-200μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
作为优选，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释400-500倍，取出400-500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300-400倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；
5)培养：取400-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
作为优选，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释500倍，取出500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL,得培养液；
5)培养：取500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
作为优选，所述无血清培养基为不含血清的RPMI 1640或DMEM培养基。
作为优选，步骤1)中所述贴壁细胞为SP20细胞或MDCK细胞。
作为优选，步骤1)中所述悬浮细胞为SP20细胞或MDCK细胞。
作为优选，步骤3)中，无血清培养基沿培养瓶壁缓慢加入至培养瓶。
本发明的另一目的在于提供上述方法在新药筛选、疫苗制备、单克隆抗体制备上的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下技术效果：
1.本发明提供一种筛选单个细胞的方法，该方法相对于传统的有限稀释倍数稀释、有限梯度稀释、无限稀释、细胞计数等传统方法更为高效，在无菌条件下快速地获得大量的、无菌的、变异少的单个细胞；
2.本发明以消化分散后的贴壁细胞或悬浮细胞为对象，调节细胞在培养瓶中的浓度，以高效地筛选出大量的单个细胞，易于操作，无需操作人员的具备丰富的经验，具有较大的应用推广价值。
具体实施方式
以下实施例中所使用的试剂或药剂，如未特殊说明，均应理解为可市售；所用仪器，均符合生物无菌标准。
本发明提供一种单个细胞的筛选方法，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释100-1000倍，取出250-500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
在步骤1)中，稀释细胞的培养基中无血清，能有效地减少细胞贴壁造成的后续筛选工作无法进行；稀释后的细胞转移至培养瓶后，在培养瓶中分散形成细胞重叠粘结少的细胞液膜层，便于后期稀释和筛选；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
在步骤2)中，在显微镜的辅助作用下，细胞液在培养瓶中进一步分散形成单层、均匀的细胞液膜；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释200-500倍，得细胞液；
在步骤3)中，进一步使用显微镜进行随机取点观察，以更大概率地更加精准地控制细胞的分散情况；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10-20mL血清，加无血清培养基定容至100mL,得培养液；
5)培养：取250-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20-40mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100-200μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养；
在步骤5)中，最终96孔细胞板单个细胞占有细胞孔的比例达到10-45％。
本发明提供的方法可应用于新药筛选、疫苗制备、单克隆抗体制备等领域上。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：SP20单个细胞的筛选
1)初步分散：取消化分散的SP20细胞，用无血清的RPMI 1640培养基吹散SP20细胞并稀释400倍，取出400μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察SP20细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，记为V始，沿培养瓶瓶壁加入无血清RPMI 1640培养基稀释，记录稀释倍数，记为n；调整后每个视野中细胞平均数量记为V终，至V终＝1-3，用无血清RPMI 1640培养基稀释300倍；
4)培养液配制：向50mL无血清RPMI 1640培养基中加入20mL血清，加无血清培养基定容至100mL,得培养液；
5)培养：取400-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
统计最终96孔细胞板中有细胞的培养孔的孔数，记为N有；统计含有单个细胞的培养孔的孔数，记为N单；计算单个细胞的培养孔占有细胞的培养孔的比例；见表1：
表1 SP20单个细胞的筛选情况
由表1可知，经显微镜辅助分散后的，随机挑选的5个视野中，每个视野的V始＝10-30，即平均细胞数为10-30个，分布较均匀；采用本实施例1提供的方法，当稀释至V终＝1-3，即每个视野细胞平均数量为1-3时，最终含有单个细胞的培养孔占有细胞的培养孔的比例高达10-45％。
实施例2：MDCK单个细胞的筛选
1)初步分散：取0.25％胰酶消化分散的MDCK细胞，用无血清的DMEM培养基吹散MDCK细胞并稀释500倍，取出500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察MDCK细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，记为V始，加入无血清DMEM培养基稀释，记录稀释倍数，记为n；调整后每个视野中细胞平均数量记为V终，至V终＝1-3，用无血清DMEM培养基稀释300倍；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；
5)培养：取500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
统计最终96孔细胞板中有细胞的培养孔的孔数，记为N有；统计含有单个细胞的培养孔的孔数，记为N单；计算单个细胞的培养孔占有细胞的培养孔的比例；见表2
表2 MDCK单个细胞的筛选情况
由表2可知，经显微镜辅助分散后的，随机挑选的5个视野中，每个视野的V始＝10-30，即平均细胞数为10-30个，分布较均匀；采用本实施例2提供的方法，当稀释至V终＝1-3，即每个视野细胞平均数量为1-3时，最终含有单个细胞的培养孔占有细胞的培养孔的比例高达15-61％。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种单层细胞筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释100-1000倍，取出250-500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释200-500倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10-20mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；
5)培养：取250-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20-40mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100-200μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释400-500倍，取出400-500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300-400倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL,得培养液；
5)培养：取400-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释500倍，取出500μL移至25cm2培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；
2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；
3)计数：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300倍，得细胞液；
4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；
5)培养：取500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基为不含血清的RPMI 1640培养基或DMEM培养基。
5.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述贴壁细胞为SP20细胞或MDCK细胞。
6.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述悬浮细胞为SP20细胞或MDCK细胞。
7.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中，无血清培养基沿培养瓶壁缓慢加入至培养瓶。
8.如权利要求1至3任一项所述的方法在新药筛选、疫苗制备、单克隆抗体制备上的应用。
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