CN111961630A - 一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法 - Google Patents

一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，包括平板菌落计数步骤；96孔细胞培养板铺制步骤；土壤样本稀释和点板步骤；放线菌培养和纯化步骤；放线菌筛选和鉴定步骤。与现有技术相比，该方法在稀有放线菌新种发现上具有独特优势。

Description

一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法；尤其涉及一种能消除培养皿平板培养时微生物间的竞争、抑制等影响的从土壤中筛选稀有放线菌的方法。
背景技术
稀有放线菌是指用常规分离程序和手段筛选放线菌时，出现频率比链霉菌低得多的放线菌。稀有放线菌可产生种类多样的抗生素，如红霉素、庆大霉素、利福霉素、万古霉素、马杜拉霉素等，已创造出巨大的经济价值，稀有放线菌产生新抗生素的潜力极大。
迄今为止，科研人员通过设计新型培养基、进行样品前处理和采集极端或特殊生境样品等方式，在稀有放线菌资源开发上取得了显著进步，越来越多的稀有放线菌新分类单元得以发现。然而，目前从土壤中筛选稀有放线菌主要依赖传统的培养皿平板涂布法。培养皿平板培养时，适应力强、生长快的霉菌或链霉菌会在平板上率先形成大的菌落，竞争资源和空间，其代谢过程中产生的过氧化物、自由基和超氧化物可能使其周围适应力较差或生长较慢的放线菌受到抑制或毒害，处于休眠状态或死亡，导致其不可培养，限制了稀有放线菌的发现。
通过对现有专利文献的检索发现，CN101974470A公开了一种主要用于土壤稀有放线菌的分离方法；其通过无菌水多次淘洗减少土壤样品中的优势菌群；根据放线菌容易紧密依附于营养基质的特点，通过接种淘洗后剩下的沉淀泥于放线菌选择培养基上来提高稀有放线菌分离的成功率，解决了分离放线菌时土壤中优势菌群的干扰问题。然而，该专利在土壤样品处理后采用培养皿平板培养法，菌落间的相互抑制无法回避。
发明内容
本发明针对培养皿平板培养法筛选稀有放线菌的缺陷，提供一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室，土壤样本经稀释后添加至96孔板各孔室进行放线菌培养，达到隔离培养的效果。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
S1、平板菌落计数：称取土壤样本，加入无菌水进行系列稀释，得到稀释倍数成梯度的稀释液；分别吸取稀释液涂布ISP2平板，28-30℃培养7-14天，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系；(放线菌从自然生境土壤转移到人工培养基中，需要一个适应期，之后进入繁殖期，适应力强繁殖快的放线菌3-5天内可形成肉眼可见的菌落，适应力弱繁殖慢的放线菌则需要1-2周甚至更长时间，为了培养种类更多的放线菌，一般培养7-14天)
S2、96孔细胞培养板铺制：将呈液体状态的ISP2培养基倒入储液槽，使用微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基，待凝固后使用；
S3、土壤样本稀释和点板：根据平板菌落计数结果换算出土壤样本稀释倍数达到0.4-0.8个菌落/孔的理论值；称取土壤样本，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释，得待筛选土壤稀释液；使用微量移液器向步骤S2中96孔板的各孔室加入所述待筛选土壤稀释液，静置；
S4、放线菌培养和纯化：将步骤S3的96孔板置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养7-12天后，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线，划线后置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养2-10天；
S5、放线菌筛选和鉴定：基于菌落特征识别霉菌，霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。
进一步的，步骤S1和S4中，所述ISP2平板是将ISP2培养基倒入培养皿，待培养基凝固制备而得。
进一步的，所述ISP2培养基是将酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入K2Cr2O7和萘啶酮酸，混合均匀而得；所述K2Cr2O7的终浓度为50μg/ml，所述萘啶酮酸的终浓度为20μg/ml。
进一步的，步骤S1中，稀释倍数成梯度的稀释液为10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。
进一步的，步骤S2中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基100或200μl。
进一步的，步骤S3中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入所述待筛选土壤稀释液5-10μl，静置5-10min，使菌液吸附进培养基。在本发明的方案中，合适的稀释倍数是关键，稀释倍数偏大，后果是96孔板中大多数孔没有菌落，导致分离效率低下；而稀释倍数偏小，后果是96孔板中大多数孔菌落数超过3个，达不到隔离培养、消除抑制的初衷。
进一步的，步骤S5中，霉菌菌落的培养特征包括霉菌菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。
进一步的，步骤S5中，16S rDNA序列分析法鉴定步骤包括菌株小量培养、基因组DNA小量提取、PCR扩增16S rDNA片段和16S rDNA序列比对分析。
进一步的，PCR扩增16S rDNA片段采用细菌16S rRNA基因测序通用引物27F和1492R作为PCR扩增引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)与传统的培养皿平板培养法相比，本发明设计了一种应用96孔细胞培养板筛选稀有放线菌的方法，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室制成固体培养板，然后将土壤样本稀释至合适浓度后添加至96孔板各孔室中，达到隔离培养的效果，借此消除培养皿平板培养时微生物间的竞争、抑制等影响，以获得出现频率低的稀有放线菌；
2)与设计新型培养基的方式相比，本发明不需花费时间设计特殊培养基，使用常见的放线菌选择培养基(比如ISP2培养基)即可；
3)与进行样品前处理的方式相比，样品前处理过程不可避免会损失部分放线菌，本发明对样品进行简单地涡旋混匀即可；
4)与采集极端和特殊生境样品的方式相比，本发明使用常见且容易采集的土壤样品即可，大大降低了采样门槛。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的技术路线图；
图2为平板菌落计数图；
图3为96孔细胞培养板培养图；
图4为东极岛土壤稀有放线菌的分子鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
针对培养皿平板培养法的缺陷，本发明设计了一种应用96孔细胞培养板筛选稀有放线菌的方法，其策略是将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室制成固体培养板，然后将土壤样本稀释至合适浓度后添加至96孔板各孔室中，达到隔离培养的效果，借此消除培养皿平板培养时微生物间的竞争、抑制等影响，以获得出现频率低的稀有放线菌。本发明应用96孔细胞培养板筛选稀有放线菌，其过程包括：平板菌落计数、96孔细胞培养板铺制、土壤样本稀释和点板、放线菌培养和纯化、放线菌筛选和鉴定。
下述实施例的设计路线见图1。下面结合具体示例对发明做详细介绍。
实施例
本实施例所用土壤样本采自我国东海舟山东极岛，本实施例的具体步骤为：
(1)平板菌落计数
ISP2培养基的配制：成分为酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入K2Cr2O7(终浓度为50μg/ml)和萘啶酮酸(终浓度为20μg/ml)，混合均匀后倒入培养皿，待培养基凝固后使用。
土壤稀释液的制备：称取土壤样本，加入无菌水稀释至0.01g/ml，漩涡混匀，进行系列稀释，获得10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。
平板涂布：吸取稀释液100μl涂布ISP2平板，三个稀释度分别涂布3块。
菌落计数：28℃培养2周，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系。
(2)96孔细胞培养板铺制
96孔细胞培养板的铺制：按步骤(1)所述方法配制ISP2培养基，将呈液体状态的培养基倒入储液槽，使用8道微量移液器向96孔板各孔室加入培养基100μl，在加培养基过程中尽量避免气泡，待培养基凝固后使用。
(3)土壤样本稀释和点板
土壤样本稀释倍数的确定：根据平板菌落计数结果换算出稀释倍数，达到0.5个菌落/孔的理论值。
土壤稀释液的制备：称取土壤样本，加入无菌水稀释至0.01g/ml，漩涡混匀，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释。
点板：使用12道微量移液器向各孔室加入土壤稀释液10μl，静置5min，使菌液吸附进培养基。
(4)放线菌培养和纯化
放线菌的培养：将96孔板装入包装盒，置于恒温培养箱中28℃倒置培养12天。
放线菌的纯化方法：按步骤(1)所述方法准备ISP2平板，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线。划线后，将培养皿置于恒温培养箱中28℃倒置培养2-10天。
(5)放线菌筛选和鉴定
基于菌落特征识别霉菌：霉菌菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状，通过培养特征容易识别。
霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。
16S rDNA序列分析法鉴定步骤包括菌株小量培养、基因组DNA小量提取、PCR扩增16S rDNA片段和16S rDNA序列比对分析。
菌株小量培养方法如下：用无菌牙签从ISP2平板上挑取生长良好的单菌落，加入含1ml ISP2液体培养基的5ml无菌离心管中，置于恒温摇床中28℃180r/min振荡培养2～3天。
基因组DNA小量提取方法如下：取振荡培养2～3天的菌液，9000r/min离心8min收集菌体，弃培养液，加入400μL TE缓冲液，吹吸均匀。加入50μL 1％的溶菌酶，37℃水浴30min。加入50μL 0.5mol/L EDTA，50μL 10％SDS和10μL 0.2％蛋白酶K，混合均匀后55℃水浴1h。加入300μL 7.5mol/L醋酸铵，混合均匀。12000r/min离心20min，吸取上清液至新的1.5mL离心管。加入等体积异丙醇，–20℃沉淀30min。12000r/min离心10min，弃上清。用70％乙醇洗涤沉淀2次，每次洗完，12000r/min离心5min，弃上清。待乙醇挥发后，加入50μL TE缓冲液溶解DNA。提取的DNA保存于4℃备用。
PCR扩增16S rDNA片段方法如下：采用细菌16S rRNA基因测序通用引物27F和1492R作为PCR扩增引物。PCR反应体系(40μL)：2╳ExTaq 20μL，10μmol/L 27F 1μL，10μmol/L1492R 1μL，DMSO 2μL，DNA模板0.3μL，ddH2O 15.7μL。PCR反应程序：95℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR产物纯化，测序及序列拼接由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
16S rDNA序列比对方法如下：对拼接得到的长约1400bp的16S rDNA序列进行手动校对，序列校对后提交到NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)与数据库中标准菌株的16S rDNA序列进行比对，得到最相似的标准菌株及序列相似度，序列相似度≥99.0％归为同一种，<99.0％归为同属的潜在新种。
具体操作对应的结果如下：
1、平板菌落计数
本实施例提供了土壤放线菌培养皿平板培养和菌落计数的具体操作及结果：操作按步骤(1)所述进行，结果如图2所示(说明：其中1块涂布10倍稀释液的平板有真菌生长无法准确进行菌落计数，因此未放入图中。第一、二、三行分别为涂布10倍、100倍、1000倍稀释液的平板)。结果显示，涂布100μl 10倍稀释液的平板平均出现30个菌落。
2、96孔细胞培养板铺制
本实施例提供了96孔细胞培养板铺制培养基的具体操作及结果：操作按步骤(2)所述进行，使用8道微量移液器向96孔板各孔室加入培养基100μl，共铺制96孔板14块。
3、土壤样本稀释和点板
本实施例提供了土壤样本稀释和点板的具体操作及结果：操作按步骤(3)所述进行，基于涂布100μl 10倍稀释液的平板平均出现30个菌落的结果，要达到预设的0.5个菌落/孔的理论值，96孔板各孔室应添加10μl 60倍稀释液，据此将土壤样本稀释倍数确定为60倍。共点96孔板14块。
4、放线菌培养和纯化
本实施例提供了土壤放线菌培养和纯化的具体操作及结果：操作按步骤(4)所述进行，96孔板放置12天如图3所示。结果显示，96孔板大多数孔室有单菌落形成，少数有2个及以上菌落形成，少数未出现菌落(集中在边缘位置)。96孔板中近1/3孔室为真菌，但只局限于各自孔室内生长，未影响周围孔室。最终从11块96孔板挑取70个菌株进行纯化。
5、放线菌筛选和鉴定
本实施例提供了土壤放线菌筛选和鉴定的具体操作及结果：操作按步骤(5)所述进行，基于培养特征归类，代表菌株16S rDNA测序和序列比对，最终60株鉴定为放线菌，其中35株是链霉菌，25株是稀有放线菌，包括Amycolatopsis(拟无枝酸菌)10株，Amnibacterium 3株，Arthrobacter(节杆菌)3株，Actinoallomurus(放线异壁酸菌)2株，Mycobacterium(分枝杆菌)2株，Phycicoccus(海藻球菌)2株，Nocardia(诺卡氏菌)1株，Terrabacter(地杆菌)1株和Tetrasphaera(四球菌)1株。21株稀有放线菌的16S rDNA序列比对结果如图4所示，另有4株(DJ25，DJ60，DJ66和DJ69)虽未测序，但基于培养特征可归于Amycolatopsis rifamycinica。以16S rDNA序列相似度高于99.0％作为判定同种水平的标准，5个种代表了潜在新种(DJ42，DJ20，DJ45，DJ55和DJ49)。稀有放线菌出新率高达20％，表明了本发明在土壤放线菌新种发现上的优势。
以上实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Claims (10)

1.一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室，土壤样本经稀释后添加至96孔板各孔室进行放线菌培养，达到隔离培养的效果。
2.根据权利要求1所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、平板菌落计数：称取土壤样本，加入无菌水进行系列稀释，得到稀释倍数成梯度的稀释液；分别吸取稀释液涂布ISP2平板，28-30℃培养7-14天，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系；
S2、96孔细胞培养板铺制：将呈液体状态的ISP2培养基倒入储液槽，使用微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基，待凝固后使用；
S3、土壤样本稀释和点板：根据平板菌落计数结果换算出土壤样本稀释倍数达到0.4-0.8个菌落/孔的理论值；称取土壤样本，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释，得待筛选土壤稀释液；向步骤S2中96孔板的各孔室加入所述待筛选土壤稀释液，静置；
S4、放线菌培养和纯化：将步骤S3的96孔板置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养7-12天后，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线，划线后置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养2-10天；
S5、放线菌筛选和鉴定：基于菌落特征识别霉菌，霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。
3.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1和S4中，所述ISP2平板是将ISP2培养基倒入培养皿，待培养基凝固制备而得。
4.根据权利要求1或2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述ISP2培养基是将酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入K2Cr2O7和萘啶酮酸，混合均匀而得；所述K2Cr2O7的终浓度为50μg/ml，所述萘啶酮酸的终浓度为20μg/ml。
5.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1中，稀释倍数成梯度的稀释液为10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。
6.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S2中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基100或200μl。
7.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S3中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入所述待筛选土壤稀释液5-10μl，静置5-10min，使菌液吸附进培养基。
8.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，霉菌菌落的培养特征包括霉菌菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。
9.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，16S rDNA序列分析法鉴定步骤包括菌株小量培养、基因组DNA小量提取、PCR扩增16S rDNA片段和16S rDNA序列比对分析。
10.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，PCR扩增16S rDNA片段采用细菌16S rRNA基因测序通用引物27F和1492R作为PCR扩增引物。
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