CN112961793A

CN112961793A - 一株细菌纤维素产生菌株、筛选方法及细菌纤维素的制备

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Publication number: CN112961793A
Application number: CN201911275504.3A
Authority: CN
Inventors: 易正芳; 高红亮; 陆婷芬; 黄婕; 蒋德明; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN112961793B

Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素产生菌株及其鉴定方法，该菌株命名为驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2‑3)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17276。该菌株为革兰氏阴性、短杆状细菌，具备碳源和氮源选择范围广、生长速度快、菌体活性强、产纤维素能力强等特点，能够在静置培养和振荡培养时产生大量细菌纤维素，在发酵4天时产量分别可达5.12g/L和2.571g/L。通过生理生化特征、16SrDNA、dnaK、groEL和rpoB基因序列分析及基因组平均核苷酸指数(ANI)分析，确定该菌株为驹形杆菌。在细菌纤维素的工业化生产方面具有良好的实施前景。

Description

一株细菌纤维素产生菌株、筛选方法及细菌纤维素的制备

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株细菌纤维素产生菌株的分离、鉴定以及细菌纤维素的动态振荡发酵培养。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是由微生物发酵而形成纤维素。它是由葡糖通过β-1，4-糖苷键聚合形成的平行直链分子，无分支结构，分子内与分子间的氢键形成具有立体网状结构的一种生物大分子，属于微生物初级代谢产物的一种，主要起到维持细菌形态、保护菌体不受外界损伤的作用。与植物纤维素相比，BC不含木质素和半木质素使其具有高度的化学纯度、结晶度 (80-90％)、吸水能力和聚合度(高达8000)。良好的物理特性、生物相容性及可降解性使其在众多新型材料中脱颖而出，能够广泛应用于食品、电子工业和纺织等各个领域中。

现已有大量研究报道，驹形杆菌属(Komagataeibacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞杆菌属(Prudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligcncs)、气杆菌属(Aerobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)共9个属中的某些种具有产细菌纤维素的能力。其所产的凝胶膜状物质统称为细菌纤维素，但其中产量较高、能够应用于工业化生产的仅为驹形杆菌属一种。其中木葡糖驹形杆菌E25(K. xylinusE25)是最早发现，也是研究较为透彻的产纤维素菌种，是目前研究报道中合成细菌纤维素能力最强、产量最高的微生物菌种。

然而，上述菌株在实际工业化生产应用过程中都存在可利用碳源单一、生长和产纤维素速度慢、动态振荡发酵培养产量低下等问题。为进一步扩大产纤维素菌种范围，降低工业生产成本，缩短工业生产周期，筛选出可以快速产优良纤维素且遗传代谢稳定菌株对于扩大BC产能具有重要意义。此外，目前对BC产生菌株的鉴定主要是通过结合16S rDNA和生理生化的方法进行鉴定，该方法存在难以确定相邻种属的局限性，探寻新的准确分类产BC菌种的方法对于菌株后续的改造或研究具有重要意义。

发明内容

针对现有细菌纤维素工业化困难的生产现状及技术需求，本发明的目的是为了提供一株产纤维素速度快、动态发酵产量高、活性强的菌株。

其次，本发明还提供一种产纤维素速度快、动态发酵产量高、活性强的菌株筛选方法。

进一步地，本发明提供一种通过分子生物学鉴定技术，鉴定分离得到的产纤维素菌株种属的方法。

进一步地，本发明提供一种提取纯化菌株生产纤维素的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一株从枣中分离得到的细菌纤维素产生菌株，所述菌株为驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17276，保藏日期为2019年3月1日。

所述菌株为革兰氏阴性好氧菌，短杆状，不具有运动性，为细菌纤维素生产菌。区别于现有细菌纤维素生产菌株，具备碳源和氮源选择范围广、生长速度快、菌体活性强、产纤维素能力强等特点，具体包括：

(1)生长速度快：振荡培养条件下较现有菌株提前4h进入对数生长期；

(2)细菌纤维素生产能力强：较现有菌株动态产量高出60％、静置产量高出258％；

(3)可利用碳源和氮源广：可利用现有纤维素生产菌株不可利用的乙醇、

甘油、麦芽糖、木糖、甘露醇等；

(4)能够在静置培养和振荡培养时产生大量细菌纤维素，在发酵4天时产量分别可达5.12g/L和2.571g/L(现有静置培养技术产量为1.427g/L，振荡培养技术产量为1.611g/L)。在静置培养下所产纤维素结晶度高于振荡培养条件。

本发明还提出了一种细菌纤维素产生菌株的高效筛选方法，包括以下步骤：

(1)产纤维素菌种的一次富集：采集腐败水果样品，取果实腐败部分于一次富集培养基的玻璃试管中，28℃-37℃(优选30℃)静置培养至液面上长出凝胶状薄膜；

(2)产纤维素菌种的分离：取步骤(1)中所述的薄膜，用无菌生理盐水振荡洗涤2-3次，梯度稀释，涂布至HS平板培养基，28℃-37℃(优选30℃)倒置培养3-5天；

(3)产纤维素菌种的筛选：取步骤(2)倒置培养后的HS平板培养基，挑取单个菌落，接入装有HS液体培养基的小试管中，28℃-37℃(优选30℃)静置培养至长出凝胶状薄膜；

(4)产纤维素菌种的二次富集：取步骤(3)静置培养的凝胶状薄膜，用无菌生理盐水洗涤2-3次，将纤维素薄膜置于HS平板培养基上涂布，28℃-37℃(优选30℃)静置培养3-5天；

(5)产纤维素菌种的纯化及保存：刮取步骤(4)培养好的菌苔，接入HS 液体培养基中，28℃-37℃(优选30℃)振荡培养，确定为单一的纯菌种，得到所述优势驹形杆菌。菌种以甘油管形式-80℃保存；

(6)产纤维素菌种的验证：挑取步骤(5)在HS液体培养基中培养的菌落，接入发酵培养基中进行纤维素生产验证。

步骤(1)中，所述腐败水果包括但不限于自然腐败水果，选自葡、猕猴桃、梨、枣子、橘子、黑布林、橙子、李子、苹果、草莓、西瓜中的至少一种。

步骤(1)中，所述一次富集培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：甘油2-5％，蛋白胨0.2-0.7％，酵母粉0.2-0.7％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，一水合柠檬酸0.1-0.2％，纳他霉素0.1-0.4％，其余为水，调节pH为3.0-6.0。优选为，甘油2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，纳他霉素0.1％，pH为4.0。

步骤(1)中，所述静置培养的时间为2-10天；优选地，为7天。

步骤(2)中，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂粉1.8％，pH为6.0。

步骤(2)中，所述倒置培养的时间优选地，为3天。

步骤(3)中，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸 0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，其余为水，pH为6.0。

步骤(3)中，所述静置培养的时间为2-10天；优选地，为7天。

步骤(3)中静置培养得到的凝胶状薄膜应比步骤(1)中培养得到的凝胶状薄膜厚度更为均匀，颜色更为透亮。

步骤(4)中，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂粉1.8％，其余为水，pH为6.0。

步骤(4)中，所述静置培养的时间优选地，为3天。

步骤(5)中，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸 0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，其余为水，pH为6.0。

步骤(5)中，所述振荡培养的时间为16-24h；优选地，为22h。

步骤(5)中，所述单一纯菌种的鉴定方法为形态观察法，即观察平板培养基上单菌落的基本形态，包括形状、大小、表面光滑度、颜色、边缘锯齿状/光滑、表面湿润/干燥、结块程度等；和/或，革兰氏染色法，取菌苔在染色后于光学显微镜下观察并确保视野内菌体为统一形态。

步骤(5)中，所述优势驹形杆菌菌株，菌落较小，乳黄色、圆形、表面光滑、凸起、边缘整齐。

本发明还提供了一种通过分子生物学鉴定技术与生物信息学鉴定菌种的方法，利用16S rDNA序列分析、dnaK、groEL和rpoB保守基因序列分析与基因组平均核苷酸指数(ANI)分析结合，鉴定菌株的确切种属。

具体包括以下步骤：

(a)利用细菌16S rDNA扩增用的通用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 (1492R)扩增细菌16S rDNA序列，将所述保藏编号为CGMCC No.17276的细菌鉴定到属，测序得到如SEQID NO.3所述序列，通过比对和进化树构建，该菌株属于驹形杆菌属(Komagataeibacter)。

(b)通过全基因组测序，得到所述菌株dnaK、groEL和rpoB保守基因序列，分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

(c)利用上述序列比对和进化树的构建，得到所述保藏编号为CGMCC No.17276的细菌的dnaK、groEL和rpoB序列与Komagataeibacterxylinus1515^T (FN391641.1、FN391714.1、FN391787.1)的序列相似度分别为95.5％、98.2％、 94.7％，总体同源性为95％，低于同种菌株同源性需>97％的标准，这说明该菌株不同于现有驹形杆菌模式菌株，分类地位新。

(d)利用结合全基因组序列比对分析基因组平均核苷酸指数(ANI)，所述得到保藏编号为CGMCC No.17276的细菌与已知产纤维素菌种的ANI数值均低于同种菌株ANI需达到95％的标准，这说明该菌株不同于现有驹形杆菌模式菌株，分类地位新。

综合上述结果分析，本发明所分离出的菌株在分类地位上为一株新型的驹形杆菌。

本发明还提供了发酵用细菌纤维素产生菌种的保存方法，刮取驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)菌苔接入HS液体培养基中，30℃振荡培养20-24h，在HS平板培养基斜面上连续划线并于30℃培养箱中培养3-5天，将菌种转移到4℃冰箱冷藏保存。该菌种在两个月内有效。

其中，所述的HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，其余为水，pH为6.0。

其中，所述的HS平板培养基斜面是在HS液体培养基的基础上加入质量/ 体积百分比(w/v)为1.0-10.0％的琼脂粉获得的，优选为，2％。

本发明还提出了一种利用所述细菌纤维素产生菌株振荡培养生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

(Ⅰ)发酵种子液的培养：取装有细菌纤维素产生菌株甘油管接入HS液体培养基中，28℃-37℃(优选30℃)振荡培养16-24h，然后将所述细菌纤维素产生菌株菌液在HS平板培养基上连续划线并28℃-37℃(优选30℃)倒置培养3-5 天，刮取菌苔接入HS液体培养基中，28℃-37℃(优选30℃)静置培养24-30h；

(Ⅱ)发酵种子液的预处理：取步骤(Ⅰ)中静置培养的种子液，使用无菌脱脂棉进行过滤并收集；

(Ⅲ)细菌纤维素的发酵培养：将步骤(Ⅱ)收集所得的发酵种子液按体积百分比6-10％接种入装有50mL AE发酵培养基的带档板锥形瓶中，28℃-37℃(优选30℃)振荡培养3-7天。

(Ⅳ)细菌纤维素的提取及纯化：将步骤(Ⅲ)发酵所得的纤维素收集并纯化，测得各纤维素产生菌株的纤维素单位产量。

其中，步骤(Ⅰ)中使用本发明菌株所需培养时间较现有纤维素生产菌株缩短了3-5天。步骤(Ⅱ)中发酵种子液静置培养后使用无菌脱脂棉进行过滤的预处理方式相较于现有细菌纤维素生产平板培养刮取菌苔的接种方式发酵稳定性提高。

步骤(Ⅰ)中，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，其余为水，pH为6.0。

步骤(Ⅰ)中，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。优选为，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，磷酸氢二钠0.27％，一水合柠檬酸0.115％，琼脂粉1.8％，其余为水，pH为6.0。

步骤(Ⅲ)中，所述AE发酵培养基成分为(质量/体积百分比；w/v)：蔗糖 1-10％，蛋白胨0.2-10％，酵母粉0.1-10％，三水合磷酸氢二钾0.1-10％，七水硫酸镁1-10％，乙酸0.1-10％，乙醇0.1-10％，其余为水，调节pH为4.0-7.0。优选为，蔗糖5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.9％，三水合磷酸氢二钾0.3％，七水硫酸镁2％，乙酸0.2％，乙醇1.5％，其余为水，调节pH为6.0。

本发明还提出了由上述方法制备得到的细菌纤维素。

其中，所述菌株生产的细菌纤维素呈现透明凝胶状、均匀分散悬浮在培养基中。区别于现有细菌纤维素特征，所述菌株培养产生的纤维素结晶度为70％-80％相比于普通方法培养所产生的纤维素结晶度为40％-50％高出30％。

本发明在现有提纯技术基础上，优化并提出了一种提取纯化上述细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

(ⅰ)细菌纤维素的提取：利用上述方法，采用所述细菌纤维素产生菌株振荡培养生产细菌纤维素，取全部细菌纤维素发酵液，高速离心，弃上清，蒸馏水洗离心2-4次，弃上清获得纤维素沉淀；其中，所述高速是指9000-10000rpm离心 5min。

(ⅱ)细菌纤维素菌体去除：取0.1-0.4M NaOH加入步骤(ⅰ)中的纤维素沉淀中，搅拌混匀，100℃水浴0.5-1h，高速离心，弃上清；其中，所述高速是指 9000-10000rpm离心5min。

(ⅲ)细菌纤维素的纯化：在步骤(ⅱ)中的纤维素沉淀中加入1％-4％乙酸，搅拌均匀，高速离心，弃上清，沉淀水洗2-4次直至纤维素pH呈中性；

(ⅳ)细菌纤维素的产量测定(干重测定)：取纯化后的纤维素至于60-80℃，烘干过夜，测得干重，计算得到具体单位产量。

其中，区别于现有技术，0.1-0.4M的低浓度碱可在高温条件下有效破裂菌体，且不影响纤维素结构，加入1％-4％乙酸可快速中和纤维素中残留的碱性物质并不影响纤维素结构，提升纤维素纯化效率。

本发明中，所述质量/体积百分比(w/v)是指各组分用量分别占培养基体积的百分比。

本发明的有益效果在于：本发明分离筛选出一株新的细菌纤维素产生菌株，取材方便、操作简单。本发明通过分子生物学与生物信息学方法，鉴定出菌株的确切属，为一株新型的驹形杆菌，对后续菌株的基因改造具有重要意义。通过生理生化鉴定，该菌株为革兰氏阴性、短杆状的好氧菌，具有生长快、碳源利用广、适合动态振荡发酵产纤维素、产量高、耐剪切力等优势，并具有稳定遗传的能力，可以满足工业化生产细菌纤维素的需求。

本发明有益效果还包括：本发明分离的纤维素产生菌株利用本发明的培养方式所产生的细菌纤维素相比传统培养方式结晶度更高，对后续新型材料的研发应用具有重要意义。本发明所采用的纤维素提纯工艺更加简便、快速、节省中间原材料，可满足工业化提纯细菌纤维素的需求。

附图说明

图1为实施例2中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)平板菌落形态观察图。

图2为实施例2中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)光学显微镜菌体形态观察图。

图3为实施例4中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与相近菌株16SrDNA序列比对NJ法制作的系统进化树。

图4为实施例4中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与相近菌株保守基因dnaK、groEL和rpoB序列比对NJ法制作的系统进化树。

图5为实施例6中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)振荡培养与静置培养提纯后的纤维素结晶度比对。

图6为对比例1中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与产纤维素模式菌株动态振荡培养菌体生长情况的对比实验结果。

图7为对比例1中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与产纤维素模式菌株静置培养菌体生长情况的对比实验结果。

图8为对比例2中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与产纤维素模式菌株动态振荡发酵纤维素产量的对比实验结果。

图9为对比例2中驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)与产纤维素模式菌株静置发酵纤维素产量的对比实验结果。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1：产纤维素菌株的筛选

使用无菌的手术镊从自然腐烂葡、猕猴桃、梨、枣子、橘子、黑布林、橙子、李子、苹果、草莓、西瓜上挑取腐败组织果肉，加入到含一次富集培养基的无菌玻璃试管中，30℃静置培养，培养基液面上长出凝胶状薄膜且振荡后薄膜不易破碎者为阳性。夹取薄膜，使无菌生理盐水洗涤3次后于装有无菌生理盐水的无菌玻璃试管中振荡10min，梯度稀释涂布HS平板培养基，30℃倒置培养3天。挑取单菌落，接入装有HS液体培养基的小试管中，30℃静置培养，液面上长出凝胶状薄膜。夹取薄膜，用无菌生理盐水洗涤3次，将纤维素薄膜贴于HS平板培养基上涂布，30℃静置培养3天。刮取培养好的菌苔接入HS液体培养基中，30℃振荡培养22h，取菌液稀释涂布HS平板培养基，30℃倒置培养3天，观察菌落形态同时通过革兰氏染色光学显微镜观察，确定为单一的纯菌种，挑选较大的菌落划斜面4℃保藏2个月，得到本发明所述优势驹形杆菌(Komagataeibacter sp.171129Z2-3)。

实施例2：产纤维素菌株的形态学观察

平板菌落形态：30℃静置培养，HS平板培养基上培养3天，驹形杆菌171129Z2-3菌落形态特征为：乳黄色、圆形、表面光滑、凸起、边缘整齐、直径1mm、易挑取(见图1)。菌落随培养时间延长，在培养基表面形成纤维素块。

菌体形态：通过光学显微镜观察驹形杆菌171129Z2-3菌体，该菌为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，单个或成对存在，长约2.02±0.122μm，宽约0.49±0.46 μm(见图2)，不具有运动性。

实施例3：产纤维素菌株的生理生化鉴定

挑取HS平板培养基上30℃培养3天的单个菌落，接入HS液体培养基中，30℃振荡培养20h，吸取菌液进行生理生化鉴定，详细生理生化特征见表1，结果显示驹形杆菌171129Z2-3可利用碳源范围广。

表1驹形杆菌171129Z2-3的生理生化鉴定结果

表2 171129Z2-3与驹形杆菌(Komagataeibacter)属内生理生化比较菌种序列:1,171129Z2-3；2,K.sacchari；3,K.entanii；4,K.europaeus；5,K.intermedius；6,K.oboediens；7,K.hansenii；8,K.xylinus；9,K.swingsii；10,K.rhaeticus；11,K.saccharivorans；12,K. nataicola；13,K.kombuchae.符号:+,阳性；-,阴性；NR，未报道；

实施例4：产纤维素菌株的分子生物学鉴定

扩增产纤维素菌株171129Z2-3的16SrDNA基因，构建系统进化树，其主要步骤有：

从HS平板培养基上挑取单个菌落接种到含有纤维素酶的HS液体培养基中， 30℃，振荡培养22h。

用离心管收集2mL细菌培养液，高速离心收集菌体弃上清。用灭菌水将菌体沉淀重悬洗涤，离心后弃上清。使用细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN，China) 提取细菌总DNA。采用PCR的方法分别扩增16S rDNA基因。PCR体系为：总 DNA1μL，Taq Master Mix(novoprotein，China)25μL，正向引物2μL，反向引物 2μL，加去离子水至50μL。

(1)利用细菌16S rDNA通用引物27F(SEQ ID NO.1)和1492R(SEQ ID NO.2) 序列，将171129Z2-3鉴定到属，得到如SEQ ID NO.3(171129Z2-3 16S)所述序列，通过在NCBI中进行序列比对，利用MEGA软件制作Neighbor-Joining(NJ)系统进化树(见图3)，结果表明该菌株的16S rDNA序列与驹形杆菌属 (Komagataeibacter)的16S rDNA序列同源性为100％，与K.europaeusLMG 18890^T、K.swingsiiDST GL01^T,K.sucrofermentansBPR2001^T和K.nataicolaLMG 1536的16SrDNA序列相似性分别为99.15％，99.22％，99.01％和99.36％，序列同源性为58％，属于驹形杆菌属(Komagataeibacter)(见图3)。

(b)通过全基因组测序(NCBI登录号为CP041348)，得到所述菌株dnaK、 groEL和rpoB保守基因序列，分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

(c)利用上述序列比对和进化树的构建(见图4)，171129Z2-3的dnaK、 groEL和rpoB序列与Komagataeibacterxylinus1515^T(FN391641.1、FN391714.1、 FN391787.1)的序列相似度分别为95.5％、98.2％、94.7％，同源性为95％，低于同种菌株同源性需>97％的标准。

(d)利用结合全基因组序列比对分析基因组平均核苷酸指数(ANI)(见表 3)，1711129Z2-3与已知产纤维素菌种的ANI数值均低于同种菌株ANI需达到95％的标准。综合上述结果分析，本发明所分离出的菌株在分类地位上为一株新型的驹形杆菌。

表3.基因组平均核苷酸指数ANI比对

实施例5：细菌纤维素的振荡发酵培养

产纤维素菌株171129Z2-3的振荡发酵，其主要步骤有：

(1)发酵种子液的培养：取-80℃保存的171129Z2-3甘油管全部接入HS 液体培养基中，30℃振荡培养22h，连续划线，30℃倒置培养3天，刮取菌苔接入HS液体培养基中，30℃静置培养24h。使用无菌脱脂棉对静置培养的菌液进行过滤并收集。

(2)细菌纤维素的振荡发酵培养：将收集所得的发酵种子液按6％接种入 50mL AE发酵培养基中，30℃振荡培养4天。

实施例6：细菌纤维素的提取及纯化

产纤维素菌株171129Z2-3发酵所产的细菌纤维素提取与纯化，其主要步骤有：

(1)细菌纤维素的提取：取171129Z2-3全部发酵液，高速离心，弃上清，蒸馏水水洗离心3次，弃上清留下细菌纤维素沉淀。

(2)细菌纤维素的纯化：取0.1NaOH加入纤维素沉淀中，搅拌混匀，100℃水浴1h去除菌体，高速离心，弃上清留下细菌纤维素沉淀。取1％乙酸加入纤维素沉淀中，搅拌均匀，高速离心，弃上清，沉淀水洗3次直至纤维素pH呈中性。取纯化后的纤维素至于60℃，烘干过夜，测得干重，计算得到具体单位产量，171129Z2-3的4天振荡发酵产量(干重)约为2.571g/L(见图7)。

实施例7：细菌纤维素的结晶度测试

产纤维素菌株171129Z2-3发酵所产的细菌纤维素纯化后进行结晶度检测，具体步骤如下：

(1)将提纯后的纤维素冷冻干燥

(2)取1mg样品进行X-Ray结晶度检测

产纤维素菌株171129Z2-3振荡培养及静置培养的细菌纤维素结晶度检测如图7所示。静置培养的细菌纤维素结晶度为73.63％，高于振荡培养的细菌纤维素结晶度44.67％。该结果说明本发明所分离得到的171129Z2-3细菌纤维素合成菌株所产的纤维素性质与已知的纤维素产生菌株所产的纤维素性质基本相同，具有良好的研究前景与应用前景。

对比例1：产纤维素菌株菌体生长对比试验

将保藏于4℃的驹形杆菌171129Z2-3菌株和产细菌纤维素的模式菌株木葡糖驹形杆菌K.xylinusATCC 53263，K.xylinus DSM 2004，K.xylinusDSM 46603和中间驹形杆菌K.intermediusDSM 11804，分别用接种环于HS平板培养基上刮取菌苔并分别接种于含纤维素酶的HS液体培养基中，30℃振荡培养22h。

测量活化后的171129Z2-3和其他模式菌株种子培养基的OD₆₀₀，分别接种于含纤维素酶的HS液体培养基中，控制接种后种子培养基初始OD₆₀₀，30℃振荡培养(见图5)或静置培养(见图6)。每种菌种每个生长检测时间点选取3瓶使用紫外分光光度计检测OD₆₀₀，具体菌体生长情况见图5(振荡培养)、图6(静置培养)。该结果说明本发明所分离得到的171129Z2-3细菌纤维素合成菌株比传统的木葡糖驹形杆菌生长更快，具有更明显的生长优势。

对比例2：快速产纤维素对比试验

将保藏于4℃的驹形杆菌171129Z2-3菌株和产细菌纤维素的模式菌株木葡糖驹形杆菌K.xylinusATCC 53263,K.xylinus DSM 2004，K.xylinusDSM 46603和中间驹形杆菌K.intermediusDSM 11804，分别用接种环于HS平板培养基上刮取菌苔并分别接种于HS液体培养基中，30℃静置培养24h。使用无菌脱脂棉过滤培养后的种子液并收集。驹形杆菌171129Z2-3和产细菌纤维素的模式菌株分别按照 6％接种量接种于50mL AE发酵培养基中，30℃振荡培养(具体产量见图7)或静置培养(具体产量见图8)。收集发酵产物细菌纤维素，提取并纯化后测定干重产量。其中菌株171129Z2-3的4d静置培养纤维素产量为5.122g/L，而ATCC 53263、DSM 2004、DSM46603和DSM11804的产量分别为0.798g/L、0.796g/L、0.604g/L和1.427g/L；菌株171129Z2-3的4d振荡培养纤维素产量为2.571g/L，而ATCC53263、DSM 2004、DSM46603和DSM11804的产量分别为0.964g/L、 0.765g/L、0.65g/L和1.611g/L。该结果说明本发明所分离得到的171129Z2-3细菌纤维素合成菌株比传统的木葡糖驹形杆菌具有更优良的产纤维素能力，产量更高，产纤维素更快。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120>一株细菌纤维素产生菌株、筛选方法及细菌纤维素的制备

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F

<400> 1

agagtttgatcctggctcag

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 1492R

<400> 2

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<210> 3

<211> 1417

<212> DNA

<213>171129Z2-3 16S

<400> 3

ggggggctgcttaccatgcagtcgcacgaacctttcggggttagtggcggacgggtgagtaacgcgtagggatctgtccatgggtgggggataactttgggaaactgaagctaataccgcatgacacctgagggtcaaaggcgcaagtcgcctgtggaggaacctgcgttcgattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgatgatcgatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggttttcggattgtaaagcactttcagcggggacgatgatgacggtacccgcagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggcaagcgttgctcggaatgactgggcgtaaagggcgcgtaggcggttgacacagtcagatgtgaaattcctgggcttaacctgggggctgcatttgatacgtggcgactagagtgtgagagagggttgtggaattcccagtgtagaggtgaaattcgtagatattgggaagaacaccggtggcgaaggcggcaacctggctcatgactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtgtgctggatgttgggtgactttgtcattcagtgtcgtagttaacgcgataagcacaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagggcttgacatgcggaggccgtgtccagagatgggcatttctcgcaagagacctccagcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttgccatcacgtttgggtgggcactctaaaggaactgccggtgacaagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggaagccaggtagcgataccgagccgatctcaaaaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtttgaccttaagccggtgagcgaacccgcaaggggcgcagccgaccacggtcgggtcagcgactgggggaagtcgaacaagagtcct

<210> 4

<211> 490

<212> DNA

<213> 171129Z2-3 dnaK

<400> 4

gccgacgagttcaagcgcgagcagggcatcgacctgcgtcaggacaagctggccctgcagcgcctgaaggaagcggcggaaaaggcgaagatcgagctttcctcctccaaggaaaccgagatcaacctgccgttcatcaccgctgatgcgtctggccccaagcatctcgtggtcaagctgagccgtgcgaagctcgaaagcctggtcgatgacctgatccagcgcacgctcgagccctgccgcgcggcgatgaaggatgcgtccgtctcgtcgggtgagatcaacgaagtcatccttgtgggcggcatgacccgcatgcccaaggtgatcgaggccgttaaggagttcttcggcaaggaacccgcccgcaacgtgaaccccgacgaagtggtcgccatcggcgccgccgtgcagggtgcggtgctgcagggtgacgtgaaggacgtgctgctgctcgacgtgaccccgctgtcgctgggcatcgagacgc

<210> 5

<211> 579

<212> DNA

<213> 171129Z2-3 groEL

<400> 5

atgcagttcgaccgtggctacatctccccgtatttcgtgacgaacgcggagaagatgaccgtcgatctggacagcccctacatcctgatccacgagaagaagctctcctcgctccagcccatcctgccgctgcttgaagctgtcgtgcagtccggccgtccgctgctgatcatcgctgaagacgtcgatggcgaagcgctggcgaccctggtggtcaacaagctgcgtggtggcctgaagatcgccgccgtgaaggcaccgggctttggcgaccgccgcaaggccatgctggaagacatcgcgatcctgaccggtggccaggtcatcagcgaagacctcggcatcaagctcgagagcgtgacgctggacatgctgggcaccgccaagaaggtgcacatcgacaaggaaaacaccaccattgtcgagggtgccggtgcaggcgaggccatcaagggccgttgcagccagatccgcgcgcagatcgaggaaaccacctccgactacgaccgcgagaagctgcaggaacgcctggccaagctggcaggcggcgttgccgtgatccgcgtgggtggttccacc

<210> 6

<211> 727

<212> DNA

<213> 171129Z2-3 rpoB

<400> 6

ttcgggcaagttcctgtttgctgcccgcgtcattccctatcgcggctcgtggctcgatttcgagttcgacagcaaggacctgatctacgtccgcatcgaccgcaagcgcaagctgccagtcacgacgctgctgtacgcacttgaaggcgccgcctccgaggccgcccgtgctgccaaggctgccgagggcggggatgtggagtcgatggaaatccagggcatggaccctgatgagatcctgtcctacttctatggcaaggtggagttcaccaagaccgagaagggctgggcgcgtcgtttcgatgccgatgccttccgtggccagaagctgctcgagccgctgatcgatgcccagactggcgaggaagtggctccggccgacgccaagctgaccgcccgcatggtgcgcaagattgccgagaccaccaaggaagtgctcgtcggcccggcagggctgatcggtcgcttcattgcaagcgatatcgtcaacgagcacaccggcgagatctatgccgaggctggcgacgagttgaccgagcagaagcttgaggaactcgagggcgaaggtctgaccacgctgaccacgctggcggtggacgcggccaatggcccgtggatccgcaacacgctggcggtggacaagaacgcctcacgcgaggaagcgctgaccgatatctaccgtgtcatgcgcccaggcgagccgcccacgcccgagacggcggaagcg

Claims

1.一种细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株为驹形杆菌Komagataeibactersp.171129Z2-3，于2019年3月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17276。

2.根据权利要求1所述的细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA的基因序列如SEQ ID No.3所示，所述dnaK、groEL和rpoB的基因序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求1所述的细菌纤维素高产菌株，其特征在于，所述菌株为革兰氏阴性好氧菌，短杆状，不具有运动性，生长速度快，可利用多种碳源和氮源生长，为细菌纤维素生产菌。

4.一种根据权利要求1所述的细菌纤维素产生菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)产纤维素菌种的一次富集：采集果实腐败部分于一次富集培养基中，28℃-37℃静置培养至长出凝胶状薄膜；

(2)产纤维素菌种的分离：取步骤(1)中所述的薄膜，用生理盐水振荡洗涤，梯度稀释，涂布至HS平板培养基，28℃-37℃倒置培养3-5天；

(3)产纤维素菌种的筛选：取步骤(2)倒置培养后的HS平板培养基，挑取单菌落，接入装有HS液体培养基的小试管中，28℃-37℃静置培养至长出凝胶状薄膜；

(4)产纤维素菌种的二次富集：取步骤(3)静置培养的凝胶状薄膜，用无菌生理盐水洗涤，将纤维素薄膜贴于HS平板培养基上涂布，28℃-37℃静置培养3-5天；

(5)产纤维素菌种的纯化及保存：刮取步骤(4)培养好的菌苔，接入HS液体培养基中，28℃-37℃振荡培养，确定为单一的纯菌种，得到所述优势驹形杆菌。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述果实选自葡、猕猴桃、梨、枣子、橘子、黑布林、橙子、李子、苹果、草莓、西瓜中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述一次富集培养基成分及质量/体积百分比w/v为：甘油2-5％，蛋白胨0.2-0.7％，酵母粉0.2-0.7％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，水合柠檬酸0.1-0.2％，纳他霉素0.1-0.4％，调节pH为3.0-6.0。

7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比w/v为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0；和/或，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比w/v为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。

8.一种按权利要求4-7之任一项所述的筛选方法制备得到的细菌纤维素产生菌株。

9.一种通过分子生物学鉴定技术与生物信息学鉴定细菌纤维素产生菌株的方法，其特征在于，利用16SrDNA、dnaK、groEL和rpoB保守基因序列分析和基因组平均核苷酸指数ANI分析，鉴定所述细菌纤维素产生菌株的确切属。

10.一种细菌纤维素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(Ⅰ)发酵种子液的培养：取细菌纤维素产生菌株甘油管接入HS液体培养基中，28℃-37℃振荡培养16-24h，然后将所述细菌纤维素产生菌株菌液在HS平板培养基上连续划线，28℃-37℃倒置培养3-5天，刮取菌苔接入HS液体培养基中，28℃-37℃静置培养24-30h；

(Ⅲ)细菌纤维素的发酵培养：将步骤(Ⅱ)收集所得的发酵种子液按体积百分比6-10％接种入AE发酵培养基中，28℃-37℃振荡培养4天。

(Ⅳ)细菌纤维素的提取及纯化：将步骤(Ⅲ)发酵所得的纤维素收集并纯化，测得细菌纤维素产生菌株的纤维素单位产量。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述HS液体培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-1％，酵母粉0.1-1％，磷酸氢二钠0.1-1％，一水合柠檬酸0.1-1％，其余为水，调节pH为6.0-7.0；和/或，所述HS平板培养基成分及质量/体积百分比w/v为：葡萄糖1-10％，蛋白胨0.1-10％，酵母粉0.1-10％，磷酸氢二钠0.1-10％，一水合柠檬酸0.1-10％，琼脂粉1.0-10％，其余为水，调节pH为6.0-7.0。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(Ⅲ)中，所述AE发酵培养基成分及质量/体积百分比(w/v)为：蔗糖1-10％，蛋白胨0.2-10％，酵母粉0.1-10％，三水合磷酸氢二钾0.1-10％，七水硫酸镁1-10％，乙酸0.1-10％，乙醇0.1-10％，其余为水，调节pH为4.0-7.0。

13.一种按权利要求9-12之任一项所述方法制备得到的细菌纤维素。

14.一种细菌纤维素的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(ⅰ)细菌纤维素的提取：取细菌纤维素发酵液，高速离心，弃上清，蒸馏水水洗离心2-4次，弃上清获得纤维素沉淀；

(ⅱ)细菌纤维素菌体去除：取0.1-0.4M NaOH加入步骤(ⅰ)中的纤维素沉淀中，搅拌混匀，100℃水浴0.5-1h，高速离心，弃上清；

(ⅲ)细菌纤维素的纯化：取1％-4％乙酸加入步骤(ⅱ)中的纤维素沉淀中，搅拌均匀，高速离心，弃上清，沉淀水洗2-4次直至纤维素pH呈中性；

(ⅳ)细菌纤维素的产量测定：取纯化后的纤维素至于60-80℃，烘干过夜，测得干重，计算得到具体单位产量。