CN114107109B

CN114107109B - 一种铅黄肠球菌及其在微生物发酵生产己酸中的应用

Info

Publication number: CN114107109B
Application number: CN202111431611.8A
Authority: CN
Inventors: 邹伟; 李韬; 郑佳; 陈聪
Original assignee: Sichuan University of Science and Engineering; Wuliangye Yibin Co Ltd
Current assignee: Sichuan University of Science and Engineering; Wuliangye Yibin Co Ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114107109A

Abstract

本发明公开了一种铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)及其在微生物发酵生产己酸中的应用，属于微生物发酵技术领域，该菌株筛选于浓香型大曲酒优质老窖泥，命名为Enterococcus casseliflavus BF‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CCTCC NO:M 2021871。本发明中的菌株对生长性能、免疫和具有潜在的益生影响，优化了发酵培养基，提高了己酸的产量，在现有单一变量优化的基础上，己酸产量可达3.01g/L；该己酸菌可进一步用于己酸生产，增强接种剂应用浓香型白酒生产过程。

Description

一种铅黄肠球菌及其在微生物发酵生产己酸中的应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及到一种铅黄肠球菌及其在微生物发酵生产己酸中的应用。

背景技术

己酸，是一种常见的羧酸，天然存在于动物脂肪和油中，是中链脂肪酸（MCFA）的最终产物之一。它是导致腐烂的银杏种子皮发出恶臭的化学物质之一。与短链脂肪酸（SCFA）相比，己酸具有更长的疏水碳链，其在20℃下的溶解度仅为10.82 g/L。己酸的分离纯化比乙醇蒸馏消耗更少的能量。同时，从能量的角度来看，己酸分子的O/C值较低，能量密度较高，使其成为更有利的高附加值产品。己酸可用作生产液体燃料的前体，也可用作合成化学品（如食品和动物饲料添加剂）的前体。此外，己酸还可用于生产农业用“绿色”抗菌剂、防腐剂、润滑剂、染料、橡胶和生物降解塑料。

目前，己酸的工业生产主要依靠原油的大规模化学合成。从经济角度来看，通过化学合成生产己酸的成本相对较低，但这些生产方法需要高能耗并造成严重污染。与典型的化学合成方法相比，微生物发酵生产己酸由于以下优点而越来越受到关注：（1）发酵过程中产生的污染物较少，（2）该过程有效地利用了有机废物，（3）反应条件一般较温和。现有大多数报道的己酸生产微生物是厌氧菌，包括梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、瘤胃球科和巨球形菌，它们可以使用乙醇、乳酸、葡萄糖、葡萄糖和葡萄糖来积累己酸，和D-半乳糖醇作为主要碳底物。此外，己酸菌通常被认为是浓香型白酒生态系统中最重要的功能微生物。因此，己酸菌的分离、筛选、鉴定和育种对于提高窖泥中己酸菌的数量和质量是具有非常重要的意义。

发明内容

针对上述的不足，本发明的目的是提供一种铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)及其在微生物发酵生产己酸中的应用。该菌株对生长性能、免疫和具有潜在的益生影响，优化了发酵培养基，提高了己酸的产量。该己酸菌可进一步用于己酸生产，增强接种剂应用浓香型白酒生产过程。

为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：

本发明提供一种铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)，该菌株筛选于浓香型大曲酒优质老窖泥，命名为Enterococcus casseliflavusBF-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月13日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO: M 2021871。

本发明还提供上述铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）在微生物发酵生产己酸中的应用。

一种适用于白酒生产的接种试剂，包括上述铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）。

综上所述，本发明具有以下优点：

1、本发明提供了一种铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）在微生物发酵生产己酸中的应用，该菌株对生长性能、免疫和具有潜在的益生影响，优化了发酵培养基，提高了己酸的产量，在现有单一变量优化的基础上，己酸产量可达3.01 g/L；该己酸菌可进一步用于己酸生产，增强接种剂应用浓香型白酒生产过程。

2、本发明中铅黄肠球菌适宜生长温度为33℃-37℃，最适生长温度为35℃；具有较好的酸碱耐受性，pH耐受范围为1~10，最适pH为7；耐乙醇浓度至5％；耐己酸浓度高达30 g/L。

附图说明

图1为本发明中铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）的镜检图；

图2为本发明中铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）序列进化树图；

图3为本发明中PCR产物电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）的分离和筛选

采用五点采样法采集了中国安徽省一家浓香型白酒工厂的窖泥样品。每点取50 g窖泥，加入密封袋，将5 g窖泥放入装有45 mL无菌水的150 mL三角形瓶中；摇晃良好后，将10%接种物接种到乙酸钠富集培养基中。富集培养基含有以下物质（每1000 mL）：醋酸钠15g、酵母提取物10 g、硫酸镁7H₂O 0.2 g、KH₂PO₄7 g、磷酸氢二钾7 g、(NH₄)₂SO₄0.5 g、L-半胱氨酸0.5 g、生物素0.02%、乙醇20 mL；pH 7.0，在35 ℃下培养4天。然后吮吸200 μL窖泥培养液，涂在固体板上，放入厌氧罐中，35 ℃培养至菌落生长。选择在平板上生长的单个菌落，并在固体平板上划线三次。

将单个菌落接种于100 mL电镜中，35 ℃厌氧培养12小时，培养2代，获得种子液。将种子液接种到接种量为5%的发酵培养基中，35 ℃厌氧静培养10天。

从坑泥中共筛选出41株，其中19株具有产生己酸的能力。菌株BF-1的己酸产率最高（0.88g/L）。因此，选择BF-1菌株进行进一步研究。

实施例2铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）的鉴定

（1）菌株形态、培养特征观察

将实施例1复筛获得的己酸产率最高的菌株接种在乙酸钠富集分离固体培养基，37 ℃培养18 h，观察菌落的形态特征，其镜检图如图1所示，菌落呈浅黄色，圆形扁平，表面湿润，光滑，边缘整齐，不透明，为革兰氏阴性菌。

（2）生理生化特性测定

生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》进行，生理生化实验结果如附表1所示。

表1 生理生化鉴定结果

注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。

（3）菌株分子生物学鉴定及其系统发育树的构建

1）DNA的提取

将纯化后不同形态的单菌落接种至发酵液体培养基中，35 ℃培养10 d，吸取2 mL培养液于无菌离心管中，13000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集菌体沉淀(共2～3次)。菌体沉淀使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并按操作步骤提取基因组DNA。

2）PCR扩增及系统发育树的构建

将步骤1）得到的DNA溶液作为扩增模板，采用细菌通用引物27F-1492R进行PCR扩增；PCR扩增体系为：5×Buffer(含Mg2⁺⁾10 μL，200 μmol/LdNTPs 1 μL，正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，模板DNA 3 μL，加无菌水补足至50 μL；扩增条件为：94 ℃预变性4min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 .5 min，共 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物在南京派森诺基因技术有限公司测序。测序序列通过BioEdit剪切后，将可靠序列片段上传至NCBI核酸比对网站进行比对，选取序列同源性最高的序列，使用MEGA 5 .0软件构建系统发育树。基于16SrDNA的系统发育进化树如图2所示。PCR扩增结果见图3，PCR产物大小为1428bp，经测序鉴定，菌株BF-1的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。

经过对BF-1菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定BF-1为铅黄肠球菌Enterococcus casseliflavus，且命名为Enterococcus casseliflavusBF-1。该菌适宜生长温度为33℃-37℃，最适生长温度为35℃，pH耐受范围为1～ 10，最适pH为7，耐乙醇浓度至5％。耐己酸浓度高达30g/L。

实施例3铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavusBF-1）的发酵培养及产己酸量检测

在实施例1和实施例2的基础上，选择了己酸产量最高的分离菌株铅黄肠球菌Enterococcus casseliflavusBF-1。厌氧条件下，按5%接种量接种到500 ml培养基中。每天检测己酸的产量，连续15天，以确定最佳发酵时间为10天，实验结果如图4所示。

将铅黄肠球菌Enterococcus casseliflavusBF-1菌株用接种环无菌操作接种于装有发酵液体培养基的试管中，于35 ℃厌氧培养箱培养3～5 d，得到种子液；将种子液5％接种量接种于100 mL已灭封灭菌的发酵液体培养基中35 ℃静置培养。用一次性的注射器于发酵10天时吸取适量发酵液过 0.2 μm微孔滤膜；并取1mL装于进样瓶采用外标法通过GC/MS进行定性定量分析。测定BF-1在发酵产丁酸和己酸的情况。每个样品做三个重复。

1、BF-1发酵产己酸的碳源探索

在乙酸钠培养基的基础上更换不同碳源，将种子液按照5％的接种量接种到100mL以乙酸钠(15 g/L)、乳酸钠(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乳糖(20 g/L)、半乳糖(20 g/L)、琥珀酸钠(20 g/L)为碳源，其余成分配比与发酵液体培养基一致的各培养基中，在35 ℃条件下密封培养10天后，无菌操作取适量发酵液过0 .2 μm滤膜后进行气相色谱检测其丁酸和己酸产量。检测结果如表2所示，从表中可以看出，在碳源为葡萄糖的条件下时，己酸产量较高，为产己酸的最佳碳源；其次，菌株利用乙酸钠时也表现了较高的产己酸能力，利用乳糖和半乳糖时产酸能力较弱。

表2 利用不同碳源时产酸情况（10d）

2、BF-1发酵产己酸的氮源探索

在发酵培养基的基础上更换不同氮源，将种子液按照5％的接种量接种到100mL以氨水（10 mL/L）、氯化铵(10 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、尿素(10 g/L)为氮源，其余成分配比与发酵液体培养基一致。从表3中可以看出，在氮源为蛋白胨的条件下时，己酸产量较高，为产己酸的最佳碳源；其次，菌株利用氯化铵时也表现了较高的产己酸能力。

表3 BF-1利用不同氮源时产酸情况（10d）

3、初始pH对BF-1发酵产己酸的影响。

由表4可知，该菌在培养基初始pH为7时，产己酸量最高为1.93 g/L。

在酸性和碱性也能产生少量的己酸，具有较好的酸碱耐受性。

表4.初始pH对BF-1发酵产己酸的影响

4、铵态氮的添加对BF-1发酵产己酸的影响。

由表5可知，该菌在铵态氮添加量为0.05%时，产己酸量最高为2.42 g/L。

表5 铵态氮添加量对BF-1产己酸的影响

5、乙醇的添加对BF-1发酵产己酸的影响。

由表6可知，该菌在乙醇添加量为2%时，产己酸量最高为2.48 g/L。

表6乙醇添加量对BF-1产己酸的影响

6、葡萄糖的添加对BF-1发酵产己酸的影响。

由表7可知，该菌在葡萄糖添加量为20 g/L时，产己酸量最高为3.01 g/L。

表7 葡萄糖添加量对BF-1产己酸的影响

7、生物素的添加对BF-1发酵产己酸的影响。

由表8可知，该菌在生物素的添加量为4x10^-7%时，产己酸量最高为1.79 g/L。

表8 生物素添加量对BF-1产己酸的影响

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。

序列表

<110> 四川轻化工大学

<120> 一种铅黄肠球菌及其在微生物发酵生产己酸中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatccacctt aggcggctgg ctccaaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 60

tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcgtgctg 120

atccgcgatt actagcgatt ccggcttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact 180

gagagaagct ttaagagatt agcttagcct cgcgacttcg caactcgttg tacttcccat 240

tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300

cctccggttt gtcaccggca gtctcgctag agtgcccaac taaatgatgg caactaacaa 360

taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420

catgcaccac ctgtcacttt gcccccgaag gggaagctct atctctagag tggtcaaagg 480

atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540

tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga 600

gtgcttaatg cgtttgctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcactcat 660

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgagcct 720

cagcgtcagt tacagaccag agagccgcct tcgccactgg tgttcctcca tatatctacg 780

catttcaccg ctacacatgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc 840

caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcgc 900

tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960

gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag ataccgtcaa gggatgaaca ttttactctc 1020

atccttgttc ttctctaaca acagagtttt acgatccgaa aaccttcttc actcacgcgg 1080

cgttgctcgg tcagactttc gtccattgcc gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140

gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctatgcatcg 1200

ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgca ccgcgggtcc atccatcagt 1260

gacgcaaaag cgcctttcaa ctttcttcca tgcggaaaat agtgttatac ggtattagca 1320

cctgtttcca agtgttatcc ccttctgatg ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtt 1380

cgccactctt tttctttcga tggagcaagc tccggtgaaa gaaaaagcgt tcgacttgca 1440

tgtattaggc acgccgccag cgttcgtcct gagcaataca aaaaaactct ata 1493

Claims

1. 一种铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)在微生物发酵生产己酸和丁酸中的应用，其特征在于，所述铅黄肠球菌命名为Enterococcus casseliflavus BF-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CCTCC NO: M 2021871。

2. 一种适用于白酒生产的接种试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的铅黄肠球菌Enterococcus casseliflavus BF-1。