CN110591971A - 藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用。发明所提供的藤黄单胞菌分离自土壤，保藏编号为KCTC 72425。本发明所提供的藤黄单胞菌新菌种中温生长(30℃)，易培养，且具有产生几丁质酶以降解几丁质的功能，可为利用自然界中广泛存在的几丁质生产N‑乙酰氨基葡萄糖提供一种新的菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用。
背景技术
藤黄单胞菌属的分离源十分广泛，分离自根际土壤、空气、海底沉积物等环境。2000年，由Finkmann等首次分离鉴定并命名。至目前，已有Luteimonas composti，Luteimonas marina，Luteimonas aquatica，Luteimonas aestuarii，Luteimonasterricola，Luteimonas lutimaris和Luteimonas cucumeris等多个菌种被分离鉴定。
N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的二号位羟基被一个乙酰氨基取代后的衍生物，是构成几丁质的最小单元。近年来，N-乙酰氨基葡萄糖被发现具有修复软骨组织、减轻治疗骨关节炎关节疼痛、抗菌抗氧化以及保水保湿等功能，因此在医药、食品与化妆品等领域均有广泛应用。
目前N-乙酰氨基葡萄糖的生产主要有化学法、发酵法与生物转化法。化学法依靠强酸环境对几丁质进行水解，虽产量较高但存在着污染环境、高耗能等问题，其产品也不能达到食品级要求；发酵法利用微生物以各类原料合成N-乙酰氨基葡萄糖，存在着发酵周期长、成本高等问题，目前还未大规模使用。
与上述两种方法相比，生物转化法具有产品生物活性好，工艺简单，条件温和，环境友好等优点。且该方法所需的原料几丁质在自然界中分布广泛，是虾蟹及昆虫等动物外壳的主要成分，制备成本低。转化所需的酶也广泛分布于自然界中的各类生物，因此该方法具有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种藤黄单胞菌属的新菌种。
为实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：
一种藤黄单胞菌，其保藏编号为KCTC 72425。
本发明的目的之二在于提供该新菌种的培养方法。该方法的具体步骤为：将藤黄单胞菌接种于培养基中，在20-50℃，pH 5.0-12.0的条件下进行培养。
进一步的，上述的培养基为LB培养基。
进一步的，上述的培养温度为30℃。
进一步的，上述的pH为8.0。
进一步的，上述的培养基中还有质量百分比为1％的NaCl。
进一步的，上述的培养在需氧条件下进行。
本发明的目的之三在于提供上述的藤黄单胞菌在液体发酵法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的应用；具体包括如下步骤：
(1)种子培养：将藤黄单胞菌接种至LB培养基进行种子培养；
(2)发酵培养：将步骤(1)获取的培养液接种至发酵培养基，培养获得发酵菌种；
(3)将发酵菌种接种于种子罐的LB培养基中培养，培养基中预先投入几丁质粉末以诱导微生物分泌几丁质酶；培养24h后离心去除菌体，获取上清液，为降解菌剂；
(4)向降解菌剂中加入胶体几丁质，反应获取N-乙酰氨基葡萄糖。
进一步的，所述步骤(4)中，反应温度为37℃。
本发明提供了类芽孢菌属的一个新种Luteimonas wenzhouensis YD-1，该种该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的藤黄单胞菌新菌种中温生长(30℃)，易培养，且具有产生几丁质酶以降解几丁质的功能，可为利用自然界中广泛存在的几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖提供一种新的菌种资源。
附图说明
图1是本发明菌株的16S rDNA系统发育进化树。
图2是本发明菌株发酵产N-乙酰氨基葡萄糖的产物浓度变化图。
本发明所述的生物材料，其保藏编号为KCTC 72425，分类命名为Luteimonaswenzhouensis，名称为YD-1，已于2019年8月13日保藏于韩国典型培养物保藏中心(简称KCTC，地址：韩国)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1本发明新菌株YD-1的分离制备
取来自于浙江省温州市某菜地土壤浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30℃培养2-3天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。
LB培养基成分为：蛋白胨10g；酵母浸出粉5g；NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL。固体培养基添加琼脂。
保藏获得的纯化菌株，其保藏编号为KCTC 72425。
实施例2本发明新菌株YD-1的表观特征
1.菌落特征
取菌株YD-1的单菌落，转接到LB固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株YD-1在LB固体培养基上形成边缘整齐，微凸起，光滑，不透明，黄色的菌落，直径约2-3mm。
2.细胞形态学特征
菌株YD-1细胞为革兰氏阴性杆菌，顶端圆钝，无鞭毛；细胞菌体大小为0.9-1.1μm×2.6-4.7μm，单生。
实施例3本发明新菌株YD-1的生长特性
挑取在R2A固体培养基上培养24h的新鲜培养物，接种到LB液体培养基，30℃摇床培养20-24h，作为种子。
生长温度：
将所培养的YD-1种子按2％(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种LB液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24h和48h时测定其生长情况。得到菌株YD-1生长温度范围为20～50℃，最适温度30℃。
生长NaCl耐受性
所培养的YD-1种子按2％(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0％、2.0％、5.0％、7.0％、9％、10.0％、11.0％和12.0％的LB培养基，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。结果显示菌株YD-1的最适生长NaCl浓度为1％。
生长pH范围
用无菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH将灭好菌的LB培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，将所培养的YD-1种子按2％接种量接入，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。得到菌株YD-1生长的pH范围为5.0～12.0，最适pH为8.0。
实施例4本发明新菌株YD-1的生理生化特性
利用API ZYM和API20E鉴定系统及常规的生理生化测定方法对菌株YD-1进行生理生化特征鉴定。
鉴定结果如下表：
实施例5本发明新菌株YD-1的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测定
1.基因组DNA的提取
将YD-1接种于R2A培养基，与30℃条件下培养24h，离心收集菌体，使用生理盐水重悬菌体以除去残留培养基。后再次离心收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YD-1的基因组DNA。
2.16S rDNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16S rDNA基因的8-27和1541-1557碱基。
反应体系如下：
反应程序如下：
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行测序。
序列分析结果表明YD-1的16s rDNA序列(SEQ ID NO：1)与Luteimons Marina有较高相似度，故可将该菌株归为藤黄单胞菌属。进化树分析结果见图1。
实施例6DNA分子杂交
菌株YD-1同遗传亲缘关系最相似的菌种Luteimons Marina进行杂交试验。
步骤如下：
DNA样品处理：提取待试菌株的DNA，实验前需先置冰浴中用超声波40W处理24分钟(设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm2.0，将DNA样品剪切为2-5×105道尔顿的片段。
将待测DNA样品分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8～2.0，且两者OD260nm值一致(精确到0.001)；
进入控制程序，设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。
将比色杯的温度稳定在最适复性温度。
取两株菌种DNA样品各400μL分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200μL装在同一个离心管中为混合样品；
单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过控温系统设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；
根据实验结果利用计算机软件得到同源杂交率。
结果显示，菌株YD-1同Luteimons Marina的DNA同源性为26.1％，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，在最适的条件下，DNA同源性在70％以上是属于同一种的，在20％以上是属于同一属的，由此判断菌株BD3526属于藤黄单胞菌菌属的一个新种。
实施例7本发明新微生物的用途
菌株YD-1对几丁质的降解效果：
在LB培养基中降解菌株YD-1对几丁质降解特性测定：挑取YD-1单菌落于50mL LB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3mL培养好的新鲜菌液经6000rpm离心5min，弃去上清液，加入10mL无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量达为6×107CFU/mL以上。
在LB培养基中加入终浓度为10g/L的胶体几丁质，按3％体积比的接种量接入菌株YD-1的种子液；同时在LB培养基中加入终浓度为10g/L的胶体几丁质，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株YD-1种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养24h，结果表明24h内接种有YD-1的培养基中胶体几丁质损失率为85％，对照试验中胶体几丁质未有损失。
实施例8菌株YD-1降解菌剂的制备
1)将实施例1分离筛选的降解菌株YD-1接种到含3mL的LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL)试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
2)将上述制得发酵菌种按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的20升种子罐的培养基中培养(培养基为已经121℃高压湿热灭菌的LB培养基，使用前需冷却)，培养基中预先投入5g/L几丁质粉末以诱导微生物分泌几丁质酶，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为150rpm，培养温度为30℃；培养24h后离心去除菌体，所得上清液即为降解菌剂。
实施例9菌株YD-1降解菌剂的应用
取1L实施例8中所制备降解菌剂，向其中加入20g胶体几丁质，于37℃条件下置于200rpm摇床中反应24h，每隔4小时取样检测反应体系中N-乙酰氨基葡萄糖浓度，结果如图2所示。结果表明，24小时内反应体系中的胶体几丁质可被降解92％，N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达18.4g/L，这表明本发明菌种YD-1具有较好的应用前景。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 藤黄单胞菌新菌种及其培养方法和应用
<130> xb19101102
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcagcgccc tccttgcggt taggctacct gcttctggtg caacagactc ccatggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca gcaatgctga tctgcgatta 120
ctagcgattc cgacttcacg gagtcgagtt gcagactccg atccggactg agagaaggtt 180
tctgggattg gcttgccctc gcgggttcgc agccctctgt ccttcccatt gtagtacgtg 240
tgtagccctg gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300
tcaccggcgg tctccttaga gttcccacca ttacgtgctg gcaactaagg acaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca 420
cctgtctcac ggttcccgaa ggcaccaatc catctctgga aagttccgtg gatgtcaagg 480
ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat actccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg cgaacttaac 600
gcgttagctt cgatactgaa ggcctgattg cccccaacat ccagttcgca tcgtttaggg 660
cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgtgcc tcagtgtcag 720
tactggtcca ggtggccgcc ttcgccacgg atgttcctcc tgatctctac gcatttcact 780
gctacaccag gaattccgcc accctctacc gtactctagc ccgccagtat ccaatgcaat 840
tcccaggttg agcccggggc tttcacatca gacttaacga accacctacg cacgctttac 900
gcccagtaat tccgagtaac gcttgcaccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt 960
tagccggtgc ttattctttg ggtaccgtca tcctctccgg gtattaaccg gaaagatttc 1020
tttcccaaca aaagggcttt acaacccgag ggccttcttc acccacgcgg catggctgga 1080
tcaggctttc gcccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140
tgtctcagtc ccagtgtggc tgatcatcct ctcagaccag ctacggatcg tcgccttggt 1200
gggccattac cccaccaact agctaatccg acgtcggctc atctttctgc gtgaggcctt 1260
gcggtccccc actttcaccc gtaggtcgta tgcggtatta gcgtaagttt ccctacgtta 1320
tcccccacaa aaaggcagat tccgacgtat tcctcacccg tccgccactc gccgcccggg 1380
gagcaagctc ccctgcgctg ccgttcgact tgca 1414
Claims (10)
1.一种藤黄单胞菌，其特征在于，其保藏编号为KCTC 72425。
2.一种培养权利要求1所述的藤黄单胞菌的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：将藤黄单胞菌接种于培养基中，在20-50℃，pH 5.0-12.0的条件下培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养温度为30℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的pH为8.0。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的培养基中还有质量百分比为1％的NaCl。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
8.权利要求1所述的藤黄单胞菌在降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子培养：将藤黄单胞菌接种至LB培养基进行种子培养；
(2)发酵培养：将步骤(1)获取的培养液接种至发酵培养基，培养获得发酵菌种；
(3)将发酵菌种接种于种子罐的LB培养基中培养，培养基中预先投入几丁质粉末以诱导微生物分泌几丁质酶；培养24h后离心去除菌体，获取上清液，为降解菌剂；
(4)向降解菌剂中加入胶体几丁质，反应获取N-乙酰氨基葡萄糖。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，反应温度为37℃。
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2019
- 2019-10-11 CN CN201910963318.2A patent/CN110591971A/zh not_active Withdrawn
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