CN110616178A

CN110616178A - 一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法

Info

Publication number: CN110616178A
Application number: CN201911103021.5A
Authority: CN
Inventors: 刘汉军; 陈立荣; 蒋学彬; 张敏; 陈雷; 李辉; 何天鹏; 舒畅; 张薇; 周鋆; 孟召伟
Original assignee: China National Petroleum Corp; CNPC Chuanqing Drilling Engineering Co Ltd
Current assignee: China National Petroleum Corp; CNPC Chuanqing Drilling Engineering Co Ltd
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110616178B

Abstract

本发明提供了一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，所述方法包括：采集样品；向样品中加入有机质、多种类型的水基钻井液添加剂和氮源得到混合物，调节混合物含水量并置于25℃～32℃下培养，提高各水基钻井液添加剂浓度，驯化，得到含有降解高效菌的混合物；对含有降解高效菌的混合物进行分离纯化；分别制备包含多种类水基钻井液添加剂中单一水基钻井液添加剂的培养液，各培养液中均接种纯化后菌株并测定各培养液中所含添加剂的降解量，选取对各培养液中水基钻井液添加剂降解量均较高的菌株得到粪产碱菌酚亚种。本发明的筛分培养方法简单有效，能够筛分培养出可同时降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、PMA和CMC等多种钻井液添加剂的菌株。

Description

一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法

技术领域

本发明涉及石油天然气勘探技术领域，更具体地讲，涉及一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法。

背景技术

天然气勘探开采过程中大量添加磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM (添加量在1％-5％)等高分子物质的水基钻井基液，清洁生产后，相当量的高分子添加剂残留在了钻井固废中。这些高分子物质均由多种有机物聚合而成，是水基钻井固废COD的重要来源；同时还具有难降解的特点，可污染环境并对人体健康造成危害，因此，开展水基钻井固废无害化处理研究意义重大。

微生物处理技术具有高效、低耗、无毒、污染降解彻底、消化量大，不受地域限制的优势，目前，该技术已成为有机污染土壤和水体修复的最佳选择。微生物处理技术的关键在于筛选出高效降解菌株，目前已报道了100多个属，200多个种的细菌、放线菌、酵母、霉菌以及藻类等微生物类群能够降解有机污染物，部分菌株已得到应用。但在石油和天然气勘探领域，钻井固废/泥浆微生物处理技术涉及的大多是石油烃类降解微生物，少见水基钻井固废的高分子有机物添加剂的高效降解微生物分离筛选出的报道。陈强等人在“一株卵形假埃希氏菌WNF15及其应用”和“一株短尾帚霉WNF22及其应用”专利中筛选出了2株磺化酚醛树脂和磺化褐煤降解真菌，但菌株都只降解一种添加剂。

因此，如何筛选同时降解多种添加剂的菌株，加强水基钻井固废和水基钻井液添加剂污染环境修复效果至关重要。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的之一在于解决上述现有技术中存在的一个或多个问题。例如，本发明的目的之一在于提供一种简单高效能够筛分培养粪产碱菌酚亚种的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，所述方法可以包括以下步骤：从石油天然气钻井井场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品；向所述样品中加入有机质、多种类型的水基钻井液添加剂和氮源得到碳氮比在15～20:1的混合物，调节混合物含水量至28％～30％并置于25 ℃～32℃条件下培养，淘汰无降解能力菌株，逐步提高各水基钻井液添加剂浓度，驯化后得到含有降解高效菌的混合物；对所述含有降解高效菌的混合物进行分离纯化，将分离纯化后的菌株保存备用；分别制备包含所述多种类型的水基钻井液添加剂中单一水基钻井液添加剂的培养液，各培养液中均接种所述保存备用的菌株并测定各培养液中所含水基钻井液添加剂的降解量，选取对各培养液中水基钻井液添加剂降解率均大于5％的菌株，得到粪产碱菌酚亚种，所述粪产碱菌酚亚种分类命名为Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14，已于2019年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019646，保藏地址：武汉大学。

与现有技术相比，本发明的筛分培养方法简单高效，能够筛分培养出可同时降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、PAM和CMC等多种钻井液添加剂的菌株，解决了以往分离的菌株只能降解单一物质，需使用复合菌系处理污染物的难题。

附图说明

通过下面结合附图进行的描述，本发明的上述和其他目的和特点将会变得更加清楚，其中：

图1示出了本发明一个示例性实施例的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法流程示意图；

图2示出了本发明一个示例性实施例的粪产碱菌酚亚种在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌体和菌落形态；

图3示出了本发明一个示例性实施例的粪产碱菌酚亚种的16S rDNA序列的系统发育图。

具体实施方式

在下文中，将结合附图和示例性实施例详细地描述根据本发明的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法。

本发明提供了一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法。在本发明的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法的一个示例性实施例中，所述粪产碱菌酚亚种分类命名为Alcaligenesfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14。该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年8月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019646。如图1所示，所示筛分培养方法可以包括：

S01，采集样品。从石油天然气钻井井场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品。例如，可以利用无菌采样袋从石油天然气钻井井场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品。所述样品即为粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp. Phenolicus GFB-14的来源。

S02，粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14的驯化。

向所述采集的水基钻井固废样品中，加入水基钻井液添加剂、有机质以及氮源得到混合物。用蒸馏水调节混合物的含水量在28％～30％并置于25℃～32℃条件下培养。在上述条件下可以使能够降解水基钻井固废添加剂的菌种大量繁殖。然后淘汰掉无降解能力的微生物(菌株)，逐步提高水基钻井液添加剂的浓度，以驯化出对添加剂的降解能力强和耐受力强的降解高效菌。所述有机质可以为玉米秸秆、米糠等易降解的有机质。所述氮源可以为氮肥，所述氮肥可以是碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵等。添加上述的有机质和氮肥是为了保持所述混合物中的碳氮比在15～20:1之间以利于菌株的生长，例如，碳氮比可以为18:1。将上述含水量控制在28％～30％，温度控制在25℃～32℃是为了菌株有更好的生物生产环境。含水量过低会导致生长环境太干燥，导致菌株缺氧。培养的温度太高或者太低都不适宜菌株的生长。进一步的，所述含水量可以控制在29％,，培养的温度可以为30℃。

进一步的，所述水基钻井液添加剂包括磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素(CMC)和聚丙烯酰胺(PAM)。

S03，粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14的分离纯化。

对含有降解高效菌的混合物进行分离纯化，将分离纯化后的菌株保存备用。进一步的，将分离纯化后的菌株接种至斜面培养基上保存备用。所述分离纯化过程中所使用的器皿和水均为100％无菌。

S04，对粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14进行复筛。

分别制备包含多种类型水基钻井液添加剂中单一水基钻井液添加剂的培养液(即每一种水基钻井液添加剂对应制备一种培养液，每一种培养液中含有单一种类的水基钻井液添加剂)，在各培养液中均接种所述分离纯化后的菌株，测定培养液目标底物的降低量(水基钻井液添加剂的降解量)，选取对各种水基钻井液添加剂降解率均较高的菌株即为本发明的粪产碱菌酚亚种 Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14。将得到的粪产碱菌酚亚种 Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14接种至斜面培养基并于4℃保存。在选取对各中水基钻井液添加剂的过程中可以选取降解率大于5％的菌株，例如，可以选取降解率大于7％的菌株。

以上，当所述水基钻井液添加剂为磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素(CMC)和聚丙烯酰胺(PAM)时，所述水基钻井液添加剂培养液分别可以为含磺化褐煤的培养液，含磺化酚醛树脂的培养液，含羧甲基纤维素的培养液以及含聚丙烯酰胺的培养液。选取上述对4种添加剂降解率均较高的菌株即可以得到本发明的粪产碱菌酚亚种Alcaligenesfaecalis subsp. Phenolicus GFB-14。

在本实施例中，所述分离纯化的方法可以采用稀释平板涂布法和平板划线法进行分离纯化。进一步的，所述分离纯化的方法可以包括：

S100，将含有降解高效菌的混合物振荡混匀，按不同比例稀释后得到不同浓度稀释溶液。例如，将含有降解高效菌的混合物盛入有无菌水的三角瓶中振荡混匀。所述不同浓度稀释溶液的浓度范围可以是在0.1％～4％的质量浓度范围之间选择。

S200，将所述不同浓度稀释溶液分别涂布于不同的牛肉膏蛋白胨平板上， 28℃～30℃，例如在29℃恒温培养24～36小时。

S300，将不同牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落接种到新的牛肉膏蛋白胨平板上并连续划线分离直至得到菌落和菌体特征一致的菌落，完成分离纯化。

在本发明示例性实施例中，所述含有单一水基钻井液添加剂的培养液可以包括：

对于含有磺化酚醛树脂的培养液包括：磺化酚醛树脂0.4g/L～0.6g/L，NaHPO₄0.1g/L～0.3g/L，KH₂PO₄ 0.9g/L～1.1g/L，乙酸铵0.2g/L～0.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.4g/L～0.6g/L，MnSO₄·H₂O 0.03g/L～0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L～0.005g/L。进一步的，磺化酚醛树脂0.5g/L，NaHPO₄ 0.2g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，乙酸铵0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.04g/L，CaCL₂ 0.004g/L。

对于含磺化褐煤的培养液：磺化褐煤0.4g/L～0.6g/L，NaHPO₄ 0.1g/L～0.3g/L，KH₂PO₄ 0.9g/L～1.1g/L，乙酸铵0.2g/L～0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L～0.6g/L，MnSO₄·H₂O 0.03g/L～0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L～0.005g/L。进一步的，磺化褐煤0.5g/L，NaHPO₄0.2g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，乙酸铵0.3g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.04g/L，CaCL₂0.004g/L。

对于含有羧甲基纤维素的培养液包括：羧甲基纤维素0.4g/L～0.6g/L， NaHPO₄0.1g/L～0.3g/L，KH₂PO₄ 0.9g/L～1.1g/L，乙酸铵0.2g/L～0.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.4g/L～0.6g/L，MnSO₄·H₂O 0.03g/L～0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L～0.005g/L。进一步的，羧甲基纤维素0.5g/L，NaHPO₄ 0.2g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，乙酸铵0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.04g/L，CaCL₂ 0.004g/L。

对于含有聚丙烯酰胺的培养液包括：聚丙烯酰胺0.4g/L～0.6g/L，NaHPO₄ 0.1g/L～0.3g/L，KH₂PO₄ 0.9g/L～1.1g/L，乙酸铵0.2g/L～0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L～0.6g/L，MnSO₄·H₂O 0.03g/L～0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L～0.005g/L。进一步的，聚丙烯酰胺0.5g/L，NaHPO₄ 0.2g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，乙酸铵0.3g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O0.04g/L，CaCL₂ 0.004g/L。

以上，对于含有各添加剂的培养液，pH值可以为7.0～7.2。各培养基在 121℃灭菌20min～30min制备得到。

在本实施例中，所述牛肉膏蛋白胨培养基和斜面培养基可以包括：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L。斜面培养基的pH值可以为7.0～7.2，培养基可以在121℃灭菌30min后制备得到。当然，在发明的菌株在分离纯化过程中也可以选择其他种类的分离培养基以代替牛肉膏蛋白胨培养基。

在本实施例中，所述粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.PhenolicusGFB-14为好氧型，进一步的为严格好氧型，只在好氧条件下可以使用。

在本实施例中，所述粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.PhenolicusGFB-14可以在pH为5.0～10.0，盐浓度0％～4％，温度15～45℃的条件下生长。进一步的，可以在pH为6.5～7.5，温度28～35℃，盐浓度0.5％～1％的条件下生长。

在本实施例中，提取粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.PhenolicusGFB-14的总DNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1 所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，GFB-14与GenBank中的模式菌株粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus J T的相似度最高(99.4％)，从而确定GFB-14在分类上属于粪产碱菌酚亚种。

在本实施例中，将所述粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落为圆形，乳白色(白色)，直径为2mm～3mm，边缘不整齐，呈现扁平润湿。

以上，本发明的粪产碱菌酚亚种Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14可同时降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、PMA和CMC等多种钻井液添加剂，解决了以往分离的菌株只能降解单一物质，需使用复合菌系处理污染物的难题。且分离的菌株适应耐碱和盐能力强，能在pH 5.0～10.0和盐浓度 0％～4％添加下发挥钻井固废添加剂降解作用，生长温度范围广(15℃～45℃)。并且，所述粪产碱菌酚亚种能够修复水基钻井液固废污染的介质，所述介质为土壤、水和空气。所述粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalissubsp.Phenolicus) GFB-14能够对水基钻井固废的总有机碳(total organic carbon)TOC进行降解。

为了更好地理解本发明的上述示例性实施例，下面结合具体示例对其进行进一步说明。

示例1

(1)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14(简称“菌株GFB-14”)的分离、纯化和保存。

从四川省遂宁市天然气钻井现场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品，低温保存带回实验室。

分别制备：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g， pH自然，水1000mL。

取水基钻井固废5kg，按10％(w:w，质量比浓度)向钻井固废中添加秸秆粉，添加碳酸氢铵，调节混合基质的C/N在15:1-20:1，用蒸馏水调节含水量在28％～30％；将混合基质装入白水的塑料盆(规格：长×宽×高＝60cm×35cm×10cm)，用保鲜膜封口，放置在30℃条件下培养。定期搅动充氧，并控制含水量在28％～30％。培养30d后取样，采用梯度稀释法，于牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，30℃恒温培养。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养。待培养16h，挑取一环进行重复划线培养，结合显微观察，直至纯化为止。纯化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面培养基保存。

如图2所示，本实施例的分离纯化得到的菌株GFB-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，培养48h后菌落为圆形，白色，直径为0.5mm～1mm，边缘整齐，扁平湿润，其中，图2(a)示出了菌落形态，图2(b)为菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养后的示意图。

(2)菌株GFB-14的16S rDNA的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，以总DNA为模板，用27F和1492R为引物扩增16S片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。

反应体系(50μl)：2×PCRMix25μl，引物27F和1492R(10μM)各1μl， DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl；引物27F和1492R的核苷酸序列如 SEQID No.2和SEQID No.3所示。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。

PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件DNA man6.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如SEQIDNo.1(序列表所示)。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中进行比对，发现GFB-14的16S rDNA基因序列与数据库中的模式菌株粪产碱菌酚亚种 (Alcaligenes faecalissubsp.Phenolicus)J ^T的相似度最高，为99.4％。根据 NCBI比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(如图3所示)，自展值 (bootstrap)1000。

基于以上特征，将菌株GFB-14鉴定为粪产碱菌酚亚种(Alcaligenes faecalissubsp.Phenolicus)。该菌株已于2018年8月19日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019646。

(3)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM能力实验

将GFB-14接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基上活化培养，待活化培养的菌悬液OD600＝1.0时，取菌液1.5mL，3000rpm离心5min，弃上清，无菌生理盐水洗涤菌体2次，用1.5mL无菌水悬浮，分别接种到已灭菌磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM浓度为1％的MS培养基中，30℃，140rpm振荡培养，以不接菌为对照，重复3次。

菌株降解磺化褐煤能力测定：将滤纸80℃烘干至恒重备用，称重并记录 (M1)，将上述试验培养7d后培养液用已称重的滤纸过滤，滤纸和固体残留物于80℃烘至恒重，称重并记录(M2)；同法称量对照残留物重量并记录(M3)。磺化褐煤降解率(％)＝(M2-M1)*100/(M3-M1)。

菌株降解磺化酚醛树脂/CMC/PAM能力测定：收集上述试验培养7d后培养液，1000rpm离心5min，收集上清液，测定其TOC含量并记录(T1)，同法测定处理液初始TOC含量并记录(T2)。磺化酚醛树脂/CMC/PAM降解率(％) ＝(T2-T1)*100/T1。

测定结果表明，培养7d后，接种GFB-14菌株的处理的磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM降解率分别达到26.12％、5.65％、32.0％和45.61％。

(4)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14的抗性实验

耐酸或碱能力测定：测定培养基的pH值，以10mol/L NaOH溶液和10 mol/L HCl溶液调节培养基的pH值为4，5，6，7，8，9，10。121℃灭菌30 min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，设三个重复，置于30℃恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

耐盐能力测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7；在基础牛肉膏蛋白胨培养基中添加NaC1，分别配制盐浓度为0.5％、1％、2％、4％、8％和10％的培养基。121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，设三个重复，置于30℃恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

生长温度范围测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7，121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，将接菌的培养基分别放置于4℃、15℃、30℃、45℃和55℃的恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，每个温度设3个重复，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

结果表明，粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14有良好的抗逆特性，其生长初始pH＝5.0～10.0；其耐盐能力较强，能在含4％ NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长；生长温度范围较广，能在15～45℃温度范围内生长。

(5)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14对水基钻井固废处理实验

按处理水基钻井固废量1％(m/m)接种GFB-14菌剂(OD600nm≈1.6) 于处理物(水基钻井固废：玉米秸秆＝9:1)，充分混匀，以不接菌为对照，重复3次。各处理的钻井固废重5.0kg。自然条件下处理45d(2019年6月至 2019年7月进行)，期间注意保持处理体系湿度25％左右。分别测定初始处理物和处理45d的接菌和不接菌处理样品的TOC(总有机碳)含量和浸出液 COD(化学需氧量)。

结果表明(表1)，经过45d处理，GFB-14对水基钻井固废中的TOC去除率达到了22.09％，浸出液COD降解率达到了80.35％，显著高于对照的 1.23％和20.67％，表现出了良好的降解潜力。

表1菌株GFB-14对水基钻井固废的处理效果

注：不同字母表示差异大显著水平(p<0.05)

综上所述，本发明的筛分培养方法简单有效，能够筛分培养出可同时降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、PMA和CMC等多种钻井液添加剂的菌株，解决了以往分离的菌株只能降解单一物质，需使用复合菌系处理污染物的难题。

尽管上面已经通过结合示例性实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求所限定的精神和范围的情况下，可对本发明的示例性实施例进行各种修改和改变。

序列表

<110> 中国石油集团川庆钻探工程有限公司中国石油天然气集团有限公司

<120> 一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 粪产碱菌酚亚种（Alcaligenes faecalis subsp. Phenolicus ）

<400> 1

gcgtcgccag ctttaccatg cagtcgaacg gcagcgcgag agagcttgct ctcttggcgg 60

cgagtggcgg acgggtgagt aatatatcgg aacgtgccca gtagcggggg ataactactc 120

gaaagagtgg ctaataccgc atacgcccta cgggggaaag ggggggatcg caagacctct 180

cactattgga gcggccgata tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggct caccaaggca 240

acgatccgta gctggtttga gaggacgacc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg ggaaaccctg atccagccat 360

cccgcgtgta tgatgaaggc cttcgggttg taaagtactt ttggcagaga agaaaaggta 420

tcccctaata cgggatactg ctgacggtat ctgcagaata agcaccggct aactacgtgc 480

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gtgtaggcgg ttcggaaaga aagatgtgaa atcccagggc tcaaccttgg aactgcattt 600

ttaactgccg agctagagta tgtcagaggg gggtagaatt ccacgtgtag cagtgaaatg 660

cgtagatatg tggaggaata ccgatggcga aggcagcccc ctgggataat actgacgctc 720

agacacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccctaaacg 780

atgtcaacta gctgttgggg ccgttaggcc ttagtagcgc agctaacgcg tgaagttgac 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900

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ctggaaagcc gaagagattt ggccgtgctc gcaagagaac cggaacacag gtgctgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

tcattagttg ctacgcaaga gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140

ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagggc ttcacacgtc atacaatggt 1200

cgggacagag ggtcgccaac ccgcgagggg gagccaatct cagaaacccg atcgtagtcc 1260

ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa 1320

tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 1380

tttcaccaga agtaggtagc ctaaccgtaa ggagggcgct accacggtga tcgtg 1435

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(27F)

<400> 2

agagttgatc ctggctcag 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(1492R)

<400> 3

cggttacctt gttacgactt 20

Claims

1.一种粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述筛分培养方法包括以下步骤：

从石油天然气钻井井场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品；

向所述样品中加入有机质、多种类型的水基钻井液添加剂和氮源得到碳氮比在15～20:1的混合物，调节混合物含水量至28％～30％并置于25℃～32℃条件下培养，淘汰无降解能力菌株，逐步提高各水基钻井液添加剂浓度，驯化后得到含有降解高效菌的混合物；

对所述含有降解高效菌的混合物进行分离纯化，将分离纯化后的菌株保存备用；

分别制备包含所述多种类型的水基钻井液添加剂中单一水基钻井液添加剂的培养液，各培养液中均接种所述保存备用的菌株并测定各培养液中所含水基钻井液添加剂的降解量，选取对各培养液中水基钻井液添加剂降解率均大于5％的菌株，得到粪产碱菌酚亚种，所述粪产碱菌酚亚种分类命名为Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14，已于2019年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019646。

2.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述多种类型水基钻井液添加剂包括磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素和聚丙烯酰胺。

3.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述对含有降解高效菌的混合物进行分离纯化采用稀释平板涂布法和平板划线法进行分离纯化。

4.根据权利要求1或3所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述对含有降解高效菌的混合物进行分离纯化包括：

将含有降解高效菌的混合物振荡混匀，按不同比例稀释后得到不同浓度稀释溶液；

将所述不同浓度稀释溶液分别涂布于不同的牛肉膏蛋白胨平板上，28℃～30℃恒温培养24～36小时；

将不同牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落接种到新的牛肉膏蛋白胨平板上并连续划线分离直至得到菌落和菌体特征一致的菌落，完成分离纯化。

5.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，含有单一水基钻井液添加剂的培养液的成分包括：单一水基钻井液添加剂0.4g/L～0.6g/L，NaHPO₄ 0.1g/L～0.3g/L，KH₂PO₄ 0.9g/L～1.1g/L，乙酸铵0.2g/L～0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L～0.6g/L，MnSO₄·H₂O 0.03g/L～0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L～0.005g/L，所述含有单一水基钻井液添加剂的培养液的pH值为7.0～7.2。

6.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述有机质包括玉米秸秆或米糠，所述氮源为氮肥，所述氮肥包括碳酸氢铵、硫酸铵或氯化铵。

7.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，将分离纯化后的菌株保存备用包括将分离纯化后的菌株接种至斜面培养基上保存备用，所述斜面培养基的pH值为7.0～7.2，所述斜面培养基在121℃灭菌20min～30min后得到。

8.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述粪产碱菌酚亚种为好氧型。

9.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述粪产碱菌酚亚种在pH为5.0～10.0，盐浓度0％～4％，温度15℃～45℃的条件下生长。

10.根据权利要求1所述的粪产碱菌酚亚种筛分培养方法，其特征在于，所述粪产碱菌酚亚种在pH为6.5～7.5，盐浓度0.5％～1％，温度28℃～35℃的条件下生长。