CN117821340B - 一种聚丙烯酰胺高效降解菌及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚丙烯酰胺高效降解菌及其筛选方法和应用，属于环境保护技术领域。该菌种保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.27890，保藏日期为：2023年07月14日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为粪产碱菌Alcaligenes faecalis，菌株号为EPDB‑5。本发明成功筛选的聚丙烯酰胺高效降解菌能够快速、高效地降解油田采出水中的聚丙烯酰胺，并能够解决自然降解时间长，化学降解会造成二次污染等问题。
Description
技术领域
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种聚丙烯酰胺高效降解菌及其筛选方法和应用。
背景技术
聚合物驱在提高原油采收率的同时，驱油过程中产生的采出水在油田也大量累积。特别是海上驱油工作受到平台设备限制，水力停留时间短，含聚采出水处理难度加大。采出水中含有大量的聚合物，其粘度增大，稳定性增强。传统的HPAM降解方法包括化学法、生物法以及多种方法的结合。现有的含HPAM污水处理工艺存在各种问题，比如时间过长、处理效率低，造成处理结果不理想等，而当前微生物降解HPAM是最环保、最彻底的降解方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚丙烯酰胺高效降解菌及其筛选方法，还提供该菌的具体应用，以弥补现有技术的不足。
一株聚丙烯酰胺高效降解菌，该菌种保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.27890，保藏日期为：2023年07月14日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为粪产碱菌Alcaligenesfaecalis，菌株号为EPDB-5。
所述菌株号为EPDB-5的聚丙烯酰胺高效降解菌，根据SEQ ID NO.1，通过BLAST比对发现，EPDB-5与粪产碱菌基因序列具有至少95％的相似度，其相似度在95％至99％之间。
所述聚丙烯酰胺高效降解菌筛选自油田活性污泥；所述聚丙烯酰胺包括任何由丙烯酰胺或丙烯酰胺与丙烯酸的组合物所制备的线型或交联型水溶性聚合物，其中包含HPAM等。
所述聚丙烯酰胺高效降解菌的基本特性：革兰氏染色为阴性，V-P试验为阴性，甲基红实验为阴性，接触酶实验为阳性，淀粉水解实验为阳性，纤维素水解实验为阳性，明胶液化实验为阳性。
所述聚丙烯酰胺高效降解菌的筛选方法，包括如下步骤：
(1)采集含聚丙烯酰胺的油田活性污泥为接种源，取一定量的含聚丙烯酰胺油田污泥加入到富集培养基中，连续培养4至15天，其中5至10天较好，7天为最佳；
(2)将步骤(1)培养得到的菌悬液接种到富集培养基中，分批添加30ppm至70ppm的聚丙烯酰胺溶液，其中添加50ppm的聚丙烯酰胺溶液为最佳，进行梯度驯化；
(3)将步骤(2)得到的菌悬液按比例稀释后均匀涂到分离培养基中，培养得到不同形貌的多株菌株；
(4)将步骤(3)得到多株菌株分别采用连续划线的方法接种到分离培养基中，进行纯化培养；
(5)将步骤(4)得到的各株纯化菌株接种于聚丙烯酰胺培养基中培养至对数期后，测定其各自的聚丙烯酰胺降解能力，得出最优菌株；
(6)将上述步骤(5)中得到的最优菌株接种到富集培养基中，待细菌生长至对数期后即得到所述聚丙烯酰胺高效降解菌。
所述聚丙烯酰胺高效降解菌能够应用于含聚丙烯酰胺污水处理中，尤其是含HPAM污水。
进一步的，所述聚丙烯酰胺高效降解菌用于降解油田采出水中的聚丙烯酰胺。
所述聚丙烯酰胺高效降解菌在降解含HPAM污水中，接种量在5％至15％之间，最佳接种量为12.5％，pH在5-9之间，最佳pH为6，温度在15℃至35℃之间，最佳温度为30℃，NaCl浓度在2000mg/L至20000mg/L之间，最佳浓度为2000mg/L。
本发明的优点和技术效果如下：
本发明成功筛选出一株聚丙烯酰胺高效降解菌，并对降解条件进行优化，在完成室内模拟实验的前提下进行工业化放大，将相关技术应用于处理现场实际含HPAM污水。聚丙烯酰胺高效降解菌能够快速、高效地降解油田采出水中的聚丙烯酰胺，并能够解决自然降解时间长，化学降解会造成二次污染等问题。
本发明筛选出的菌种来源于油田污泥，经过驯化获得，在多种油田采出水的应用中具有良好的适应性。聚丙烯酰胺高效降解菌生存能力强，在降解聚丙烯酰胺的过程中，不需要加入营养物质且表现出较高的降解率，该菌种能够针对高达2200万分子量和500ppm浓度的聚丙烯酰胺溶液进行有效降解。
附图说明
图1是本发明菌株的系统发育树。
图2菌株降解条件优化图；其中，(a)为HPAM根据接种量变化的生物降解率；(b)为HPAM根据pH值变化的生物降解率；(c)为HPAM根据温度变化的生物降解率；(d)为HPAM根据NaCl浓度变化的生物降解率。
图3是降解前后HPAM扫描电镜图；其中，(a)为降解前HPAM；(b)为降解后HPAM。
图4降解前后聚丙烯酰胺的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1：
一种用于降解油田采出水中聚丙烯酰胺的菌株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)取10g油田油泥加入到100mL富集培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡7天，使沉积物中的细菌充分释放出来；振荡结束后静止20min，待沉积物重新沉淀，得到上清液为菌悬液，取5mL菌悬液重新加入到100mL富集培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养7天。
(2)将筛选得到的菌悬液接种到100mL富集培养基中，加入50ppm的聚丙烯酰胺溶液，重复三次，累计30天，进行梯度驯化。
(3)将上述菌悬液使用细胞计数板在显微镜下进行计数，挑取菌浓最高的菌株采用连续划线法分离到分离培养基中，放置在生化培养箱中35℃培养。
(4)将分离得到的各株单菌分别挑取至100mL富集培养基中，置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养3天。
(5)将步骤(4)中得到的各株菌株加入聚丙烯酰胺培养基中，置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养7天，使用淀粉碘化镉方法测得培养基中聚丙烯酰胺含量，挑选出聚丙烯酰胺降解效果最好的菌株EPDB-5。
上述筛选方法中各种培养基组成如下：
所述富集培养基由胰蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、无菌去离子水组成，pH值在5至9之间调节。
进一步的，所述富集培养基由胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，无菌去离子水定容至1L，调节pH至7。
所述分离培养基由蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、琼脂、无菌去离子水组成，pH值在5至9之间调节。
进一步的，所述分离培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂20g，无菌去离子水定容至1L，调节pH至7。
所述聚丙烯酰胺培养基由聚丙烯酰胺、无菌去离子水组成，pH值在5至9之间调节。
进一步的，所述聚丙烯酰胺培养基由:聚丙烯酰胺0.5g，无菌去离子水定容至1L，调节pH至6。
以上培养基均在121℃、0.1MPa条件下湿式灭菌30min。
以下针对筛选得到菌株EPDB-5进行分析：
1、菌株的鉴定
挑取部分菌株EPDB-5进行DNA提取以及16S rRNA扩增及测序，其16S rRNA如SEQID NO.1所示。将菌株EPDB-5的序列提交至NCBI，将其在Blast在线程序GenbankS数据库中与已经刊登的序列进行同源性比较，挑选出其它同源性较高的菌株序列，采用MeGA11.0软件开展分析，并通过邻近法构建系统发育树，分析如图1所示。通过BLAST比对发现，EPDB-5与粪产碱菌序列的相似度达到了99％，因此，通过聚丙烯酰胺高效降解菌的菌落形态、菌体形态及16S rRNA测定，EPDB-5与粪产碱菌基因序列具有至少95％的相似度，其相似度在95％至99％之间，EPDB-5鉴定为粪产碱菌。
该菌株EPDB-5活化次数1-5次之间，接种量在5％至15％之间，活化次数1-5次之间，pH在5-9之间，温度在15℃至35℃之间，NaCl浓度在2000mg/L至20000mg/L之间均具有较好的降解活性。
2、菌株降解条件的优化
将菌株EPDB-5接种于富集培养基，置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养7天，作为种子液。改变菌株EPDB-5降解HPAM过程中的接种量、pH、温度和NaCl浓度等条件因素，分析降解效果。
菌株EPDB-5在不同条件的降解结果如图2所示，结果表明：接种量在5％至15％之间调节，最佳接种量为12.5％，pH在5-9之间调节，最佳pH为6，温度在15℃至35℃之间调节，最佳温度为30℃，NaCl浓度在2000mg/L至20000mg/L之间调节，最佳浓度为2000mg/L。
实施例2：降解验证实验
1、菌株EPDB-5降解聚丙烯酰胺溶液：
将菌株EPDB-5接种于富集培养基，置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养7天，作为种子液。在实验条件范围内，菌株EPDB-5的最佳降解条件为：接种量为12.5％，温度为30℃，pH为6，NaCl浓度为2000mg/L。在上述条件下，配置200ml浓度为500ppm聚丙烯酰胺溶液，并接种12.5％的菌株EPDB-5，菌株EPDB-5降解HPAM七天的降解率为75.09％、TN的去除率为71.96％、COD的去除率为67.98％，其中绝对降解率去除了HPAM自然降解的影响。
对使用菌株EPDB-5降解前后的HPAM进行表征，采用扫描电子显微镜(FEI-Verios460L)进行成像结果如图3所示，聚丙烯酰胺样品表面十分紧密且有光泽，而降解以后聚丙烯酰胺表面发生破碎，出现孔洞，说明菌株EPDB-5的生长代谢有效降解了聚丙烯酰胺，使其断裂为片段、低聚物或者其他小分子有机物。
采用红外光谱(FTIR,Bruker IFS113V,Germany)测定HPAM降解前后官能团的变化，菌株EPDB-5降解前后如图4所示，在1670cm-1处的C＝O伸缩振动产生的吸收峰在降解后发生红移，3345cm-1和3190cm-1处的两个酰胺基的特征双尖峰消失，取而代之的是在3100-3500cm-1区域内变成比较平滑且弱的宽峰，1398cm-1左右C-N伸缩振动峰和1458cm-1左右N-H弯曲振动峰消失，取而代之的是1401cm-1处羧基中-OH的强吸收峰，这充分说明菌株EPDB-5降解前后聚丙烯酰胺的酰胺基已被微生物降解为羧基。
2、本发明菌株对海上油田所使用聚丙烯酰胺溶液的降解实验
将菌株EPDB-5接种于富集培养基中，并置于恒温摇床中30℃，150r/min振荡培养3天，作为种子液。用真实海水配置200ml浓度为500ppm聚丙烯酰胺溶液，并接种12.5％的菌株EPDB-5，在30℃，150r/min振荡培养3天，菌株EPDB-5降解HPAM三天的降解率为57.48％。
3、本发明菌株对实际海上油田含聚丙烯酰胺废水的降解实验
将菌株EPDB-5接种于富集培养基中，置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养3天，作为种子液。向200ml海上油田的含聚丙烯酰胺废水中接种12.5％的菌株EPDB-5，30℃，150r/min振荡培养3天，菌株EPDB-5降解HPAM三天的降解率为29.97％。
上述实验说明了，本发明提供的菌株EPDB-5能够针对含HPAM污水进行有效快速降解。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一株聚丙烯酰胺高效降解菌，其特征在于，该菌种保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO. 27890，保藏日期为：2023年07月14日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为粪产碱菌（Alcaligenes faecalis），菌株号为EPDB-5。
2.权利要求1所述聚丙烯酰胺高效降解菌EPDB-5在含聚丙烯酰胺污水处理中的应用。
3.权利要求1所述聚丙烯酰胺高效降解菌EPDB-5在含HPAM污水处理中的应用。
4.权利要求1所述聚丙烯酰胺高效降解菌EPDB-5在降解油田采出水中的聚丙烯酰胺中的应用。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚丙烯酰胺高效降解菌EPDB-5在降解含聚丙烯酰胺污水中，接种量在5%至15%之间，pH在5-9之间，温度在15℃至35℃之间。
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