CN110055191A - 分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌lm-w及其应用 - Google Patents

分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌lm-w及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株分离自喷漆房废气淋洗废水底泥的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM‑W及其在含丙烯酸废水处理中的应用。具体而言，本发明公开了一种分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM‑W，保藏编号：CGMCC No.17168；该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，其能用于去除含丙烯酸废水中的丙烯酸。

Description

分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌LM-W及其应用
技术领域
本发明涉及一株分离自喷漆房废气淋洗废水底泥的拜耶林克氏菌(Beijerinckiasp.)LM-W及其在含丙烯酸废水处理中的应用。
背景技术
丙烯酸是一种重要的化工原料，是现代(有机)化工中极为重要的基础原料和中间体，因其具有活性强的极性分子、不饱和(双键)及羧酸结构，故可以衍生出很多种拥有良好性能的聚合物配方，并经乳液聚合、溶液聚合、共聚等加工方式制备出塑性、交联等聚合物。以丙烯酸酯所制得的高聚合物具有优良的耐热、耐水、耐紫外光等独特的性能，因此其被广泛应用于油漆、化学纤维、造纸、黏合剂以及清洁剂等行业。但在丙烯酸生产过程中会产生大量的难降解、有毒有害的废水，其ρ(COD)高达30000mg/L。丙烯酸对鼻、喉等有刺激性，即使接触极低含量的丙烯酸，也能引起皮肤刺痒和皮疹。眼接触可致灼伤，造成永久性损害。接触高浓度丙烯酸还可能引起肺、肝、肾损害。因此必须对含丙烯酸废水进行有效处理，达标后再排放。
丙烯酸废水往往具有有机物含量高、水质复杂，可生化性差等特点，导致处理难度大。目前对丙烯酸废水常用的处理方法为电化学法、催化氧化法、焚烧法等，其处理原理往往是通过强氧化反应直接将有机物转化为CO2、H2O等无机物，存在操作条件苛刻，运行成本偏高等问题，影响到其的广泛应用和推广，因此需寻找经济高效的替代处理技术，国外研究发现微生物技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而相关技术研究我国较少。
目前已知的拜耶林克氏菌的用途多为固氮功能微生物，已有研究表明，拜耶林克氏菌表现出较强的固氮作用(https://baike.baidu.com/item/拜耶林克氏菌属/1767100；盘赛昆和吴文礼，淮海工学院学报(自然科学版)，2001，10(1)：56-59；田颖，李宏高，牛育华等，关中地区小麦根际联合共生固氮菌的初步研究，陕西科技大学学报(自然科学版)，2005,23(1)：31-34)，其在好氧条件下可固定大气氮。至于其在对污染物的代谢方面的研究较少，国内未见报道，国外仅有少量报道展示拜耶林克氏菌对联苯、多环芳烃具有一定的降解功能(Gibson D T，Cschwendt B，Yeh W K et al.,Initial reaction in theoxidation of ethylbenzene by Pseudomonas putida.Biochemistry,1973,12:1520-1528；王玉芹，周晶，杨军等，多环芳烃蒽的生物降解研究进展，生物学教学，2013,38(9)：2-4)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株能够用于含丙烯酸废水处理的菌株——拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种分离自喷漆废水底泥(分离自喷漆房废气淋洗废水底泥)的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W：为拜耶林克氏菌Beijerinckia sp.，保藏编号：CGMCC No.17168。
作为本发明的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W的改进：该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还同时提供了上述拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W的用途：处理含丙烯酸废水。
作为本发明的用途的改进：去除含丙烯酸废水中的丙烯酸。
本发明菌株的保藏信息如下：
保藏名称：拜耶林克氏菌Beijerinckia sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.17168，保藏日期：2019年01月11日。
该菌株的菌落特征如下：为杆菌，表面粗糙，不产胞子，具有小的荚膜，分裂方式为二分裂(单体细胞横向分裂形成两个子代细胞)，革兰氏阴性，菌体大小为(1.5～2.5)μm×(0.3～0.5)μm，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈奶白色，不透明。
该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的菌株由采集上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥中筛选获得，根据Sherlock MIS软件系统对菌株LM-W定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌LM-W为拜耶林克氏菌(Beijerinckiasp.)，相似指数SI(similarity index)为0.98；用16S rDNA测序鉴定方法也证明该菌株为拜耶林克氏菌。
将本发明菌株接种至含丙烯酸废水中，在15～35℃、150～200r·min-1的好氧条件下进行培养0.5～2d，可有效去除废水中的丙烯酸。
本发明所述的含丙烯酸废水，是指主要含丙烯酸的废水，其丙烯酸浓度为50～50000mg·L-1。
该菌株能用于含丙烯酸废水处理，在好氧条件下、pH6.8、温度(25～30)℃、OD415nm0.2、丙烯酸浓度30000mg·L-1(CODcr为52000mg·L-1)转速180r·min-1的条件下，培养2天，过滤，丙烯酸的去除率为99.99％，丙烯酸浓度降低至3mg·L-1，CODcr降低至284mg·L-1，从而达到国家污水综合排放标准(GB8978-1996)进入城市污水管网的三级标准(CODcr为500mg·L-1)。
综上所述，本发明经筛选获得了一株用于含丙烯酸废水处理的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W，其具有高效处理含丙烯酸废水的潜力。本发明为控制含丙烯酸废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W(放大30000倍)；
图2为16S rDNA PCR扩增结果(ZA：菌株LM-W；Marker：DNA标准分子量)；
图3为基于16S rDNA序列的菌株LM-W系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、降解菌株的筛选与鉴定
1材料与方法
1.1培养基和试剂
富集培养基：丙烯酸(5、10、20、30或50g，逐步提高加入进行驯化富集)，CaCl2·6H2O 0.1g，MgCl2 0.25g，K2HPO4 1.5g，NH4Cl 1g，蛋白胨9g，H2O 500mL，pH＝6.5～7.0；
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O 1000mL，pH4.0；
基础培养基加入1.5％(w/v，每100mL加1.5g)琼脂和50g.L-1的丙烯酸即配成相应的固体基础培养基；
pH6.5、丙烯酸浓度30000mg·L-1(CODcr为52000mg·L-1)的含丙烯酸废水。
1.2菌株对含丙烯酸废水处理效能的测定
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL含丙烯酸废水(pH6.5、丙烯酸浓度30000mg·L-1，CODcr为52000mg·L-1)250mL三角瓶中，以不接菌的含丙烯酸废水作对照，在30℃、180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，用0.20μm膜过滤，除去菌丝体，滤液用于相应丙烯酸和CODcr的测定，丙烯酸的含量用气相色谱测定，CODcr值采用COD仪测定。
去除率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量。
1.3优势降解菌株选育
1.3.1菌株来源
采集上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥。
1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选
从每份喷漆房废气淋洗废水底泥中取10g，在无菌的条件下，分别加到100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中.在30℃下180r·min-1摇床上培养7天后，按10％接种量转移到下一批富集培养基上(丙烯酸梯度依次为5、10、20、30或50g·L-1)，同条件驯化培养7天。然后再按10％接种量转接到含100g·L-1丙烯酸的无菌液体的基础培养基(即，丙烯酸浓度为100g·L-1基础培养基)中，继续培养7天，连续转接2次后；取0.1mL所得的发酵液于固体基础培养基上反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。
上述丙烯酸浓度为100g·L-1基础培养基为每1000ml基础培养基中加入100g丙烯酸配制而得。
1.3.3菌株鉴定
菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system(MIS)软件系统，该系统将基础培养基上纯化的单菌落按照MIDI公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库(Library)进行比对，根据相似指数SI(similarity index)鉴定未知菌种，相似指数SI大于0.9就基本可确定是某种微生物。该系统是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定系统，已得到较广泛的应用(吴愉萍，徐建明，汪海珍等.SherlockMIS系统应用于土壤细菌鉴定的研究.土壤学报，2006，43(4):642-647)。
此外，同时用16S rDNA鉴定方法进行验证，与Sherlock microbial identitysystem(MIS)进行比较。以LM-W菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较。
1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定
将菌株接种在固体基础培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英)。
2.结果
2.1菌株的分离与筛选
经分离、纯化、筛选获得1株能有效处理含丙烯酸废水的细菌，命名为LM-W，而筛选过程中获得的其它菌株降解力都不同程度地衰退，好氧培养2天，发现LM-W对丙烯酸的去除率分别为99.99％。
2.2菌株的鉴定
2.2.1菌株LM-W基本形态及生理生化特征
该菌表面粗糙，不产胞子且具有小的荚膜，分裂方式为二分裂(单体细胞横向分裂形成两个子代细胞)，革兰氏阴性，菌体大小约为长(1.5～2.5)μm、宽(0.3～0.5)μm(如图1)，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈奶白色，不透明。乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阳性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。
表1、拜耶林克氏菌的生理生化特性
测试项目 结果 生理生化测试 结果
革兰氏染色 - V-P实验 +
甲基红 - 吲哚实验 -
脂酶 - 硫化氢 -
赖氨酸脱羧酸 + 苯丙氨酸脱氨酶 -
鸟酸氨脱羧酶 + 氧化酶 +
柠檬酸盐 - 脲酶水解 -
木糖 - 精氨酸双水解酶 -
葡萄糖产气 - 蔗糖产酸 -
丙二酸 + 麦芽糖产酸 -
乳糖 - 卫矛醇产酸 -
L-丙氨酸 + 反硝化 -
水杨酸 + 液化明胶 -
注：+阳性反应；-阴性反应
2.2.2菌株LM-W鉴定
(1)Sherlock MIS系统对LM-W的鉴定
根据Sherlock MIS软件系统对菌LM-W脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌LM-W为拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)，相似指数SI(similarity index)为0.98。
(2)16S rDNA鉴定方法对LM-W的验证
I.DNA提取结果
以LM-W菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用因为进行PCR扩增，得到1条约为1kb的片段(图2)。扩增片段经回收、测序明确其大小为1338bp(SEQ ID NO.1)。
II.16S rDNA基因PCR扩增和序列分析
将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较发现，LM-W菌株与拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)具有较高的同源性，同源性接近100％，遗传距离较近。
综合LM-W的生理生化性质、Sherlock MIS(MIDI鉴定系统)及16S rDNA系统进化分析可以看出，该菌属于拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)。
3结论
1)从上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥中分离得到1株能够用于含丙烯酸废水处理的高效菌LM-W(CGMCC No.17168)，经SherlockMIS系统和16S rDNA鉴定为拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)。
将LM-W进行了保藏，保藏信息如下：
保藏名称：拜耶林克氏菌Beijerinckia sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.17168，保藏日期：2019年01月11日。
实施例2、菌株对含丙烯酸废水处理性能检测
1材料与方法
1.1培养基和试剂
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O1000mL，pH4.0；
pH6.5、丙烯酸浓度30000mg·L-1、CODcr为52000mg·L-1的含丙烯酸废水。
1.2菌株对对含丙烯酸废水处理性能
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL含丙烯酸废水(pH6.5、丙烯酸浓度30000mg·L-1、CODcr为52000mg·L-1的含丙烯酸废水)250mL三角瓶中，以不接菌的含丙烯酸废水作对照，在30℃,180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，按照实施例1方法测定菌株LM-W对丙烯酸和CODcr的去除率。
2.结果
菌株LM-W在pH6.5、OD415nm0.2、转速180r·min-1及好氧环境条件下，对丙烯酸的去除率分别为99.99％，丙烯酸残余浓度分别为3mg·L-1，CODcr为284mg·L-1，可达到国家污水综合排放标准(GB8978-1996)进入城市污水管网的三级标准(CODcr为500mg·L-1)，表明本研究分离、筛选的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W是一株可有效处理含丙烯酸废水的高效菌株，对控制含丙烯酸废水对环境的影响具有一定的应用潜力。
对比实验、将筛选过程中获得的其余菌株以及目前现有的拜耶林克氏菌(如下表2所述)，替代LM-W后，按照实施例2所述方法进行检测，所得结果与LM-W的结果对比如下表2所述。
表2
可见本发明所发现的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W是一株可有效处理含丙烯酸废水的高效菌株，可高效去除废水中的丙烯酸，对控制含丙烯酸废水对环境的影响具有一定的应用潜力，而其他相近属却没有该能力或者能力较弱。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌LM-W及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1338
<212> DNA
<213> 拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)
<400> 1
agtcgaacgc ccctttcggg gggagtggca gacgggtgag taacacgtgg gaacgtacct 60
ctttgttcgg aataactcat ggaaacgtga gctaataccg gatacgccct tttggggaaa 120
gatttatcgc agagagatcg gcccgcgtct gattagctag ttggtgaggt aatggctcac 180
caaggcgacg atcagtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg 240
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggggc aaccctgatc 300
cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttta tccgggaaga 360
taatgactgt accggaagaa taagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac 420
gaagggggct agcgttgttc ggaatcactg ggcgtaaagg gcgcgtaggc ggacgattaa 480
gtcaggggtg aaatcccggg gctcaacctc ggaattgccc ttgatactgg ttgtcttgag 540
attggaagag gtaagtggaa ttgcgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcgcaagaa 600
caccggtggc gaaggcgact tactggtcca tatctgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 660
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatggatgc cagctgttgg 720
agagcatgct cttcagtggc gcagtcaaca cattaagcat cccgcctggg gagtacggtc 780
gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 840
aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag ctcttgacat cccgtgctac atggagagat 900
tcatggttcc cttcggggac gcggagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 960
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg tccctagttg ccatcatttg 1020
gttgggcact ctagggatac tgccggtgat aagccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1080
tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac acgtgctaca atggcggtga cagagggcag 1140
cgaaagggcg accttcagct aatccctaaa aaccgtctca gttcagattg tactctgcaa 1200
ctcgagtgca tgaaggcgga atcgctagta atcgcagatc agcatgctgc ggtgaatacg 1260
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag ttggttctac ccgacggcgc 1320
tgcgctgacc gcaaggag 1338

Claims (4)

1.分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W，其特征在于：为拜耶林克氏菌Beijerinckia sp.，保藏编号：CGMCC No.17168。
2.根据权利要求1所述的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W，其特征在于：该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W的用途，其特征在于：处理含丙烯酸废水。
4.根据权利要求3所述的拜耶林克氏菌(Beijerinckia sp.)LM-W的用途，其特征在于：去除含丙烯酸废水中的丙烯酸。
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