CN103981119A - 含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含油污泥中石油的高效降解菌及菌组及应用。所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO.8646和保藏编号：CGMCC NO.8647，名称为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum(RS1)。本发明还提供一种菌组，由RS3，其保藏编号CGMCC NO.8646和RS1，其保藏编号CGMCCNO.8647组成，本发明提供的混合菌组对n-C₁₂～n-C₃₄的正构烷烃均有明显降解，通过GC-MS分析表明，对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强。

Description

含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及降解石油烃的菌株，尤其是一种含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用。 

背景技术

石油是当今社会生活生产中必不可少的能源之一，同时也是全球公认的对环境最具严重影响的污染物之一。石油的勘探、开发和加工运输过程中会产生大量含油污泥。含油污泥中通常含有烷烃、芳香烃、非烃化合物和沥青质等物质，会通过土壤和地下水污染生态环境威胁人类健康，因此,含油污泥的安全处置是一个重大问题。含油污泥的处理处置，主要涉及油含量的减少以及水和油泥的分离。当前焚烧、制砖等处理方法均有一定局限性，而利用微生物对石油污染进行降解修复安全性高、无二次污染，是一项成本低、效益高且环境友好型的处理技术。由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。 

申请者从渤海油田含油污泥中分离出二株高效石油烃降解菌，并进一步研究菌株及菌组对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含油污泥中石油的高效降解菌及菌组的应用，本发明提供一种假单胞菌，以及由该假单胞菌与棒状杆菌组成的菌组，该菌种及菌组对石油烃的降解效果明显，大幅提高了降解率，为制备一种高效的石油污泥降解剂提高良好的技术支持。 

本发明实现目的的技术方案是： 

一种含油污泥中石油的高效降解菌，所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8646，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri，保藏日期：2013年12月27日。 

而且，所述降解菌对芳香烃的降解率达到8.08%。 

而且，所述降解菌对石油的降解条件为42℃、盐度1%、pH6～10。 

而且，所述对含油污泥中总石油烃的降解率为53.29%。 

含油污泥中石油的高效降解菌作为含油污泥净化剂的应用。 

一种含油污泥中石油的高效降解菌组，所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8646，施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri；保藏日期：2013年12月27日。另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum，保藏日期：2013年12月27日。 

而且，所述菌组对n-C₁₂～n-C₃₄的正构烷烃均有明显降解，且对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%、27.79%、30.78%和39.43%。 

含油污泥中石油的高效降解菌组作为含油污泥净化剂的应用。 

本发明的有益效果和优点是： 

1、本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油烃降解菌，其保藏编号CGMCC8646，经过试验证实，RS3对芳香烃的降解率最高，达到8.08%，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃（TPH）的降解率分别为53.29%，该细菌对石油的最适降解条件分别为42℃、盐度1%、pH6～10。 

2、本发明还提供一种菌组，由RS3，其保藏编号CGMCC8646和RS1，其保藏编号CGMCC8647组成，本发明提供的混合菌组对n-C₁₂～n-C₃₄的正构烷烃均有明显降解，通过GC-MS分析表明，对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%、27.79%、30.78%和39.43%。 

附图说明

图1为本发明温度对降解率的影响； 

图2为本发明盐度对降解率的影响； 

图3为本发明pH值对降解率的影响； 

图4为本发明TPH降解率随时间变化； 

图5为本发明菌株对石油烃不同组分的降解效果； 

图6处理组（T）与对照组（C）的m/z85选择离子色谱图，图中标记1～23分别代表正构烷烃n-C₁₂～n-C₃₄。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

本申请通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株的各项优异性能，具体内容如下： 

1材料与方法 

1.1含油污泥 

含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70.55%，pH值为6.4，盐度3.0%。 

1.2培养基 

1.2.1富集分离培养基（g/L）酵母粉3，NaCl5，MgSO₄·7H₂O0.25，(NH₄)₂SO₄1，K₂HPO₄10，KH₂PO₄4，pH7.2～7.4。 

1.2.2斜面固体培养基LB固体培养基。 

1.2.3含油液体培养基（g/L）酵母粉3，NaCl5，MgSO₄·7H₂O0.25，(NH₄)₂SO₄1，K₂HPO₄10，KH₂PO₄4，原油10，pH7.2～7.4。 

1.3降解菌的分离和形态观察 

（1）称取10g含油污泥样品，加入40mL吐温80-水溶液（1‰v/v），静置1～2h。取上层悬浊液1mL加到含有9mL吐温水的试管中，重复以上步骤3次。分别取100μL菌悬液涂抹于富集固体培养基平板，于培养箱中37℃培养24h。 

（2）挑取形态不同的单独菌落，接种于装有50mL液体富集培养基的150mL锥形瓶中，每个菌种做3个平行，将锥形瓶置于恒温震荡培养箱中37℃、100rpm培养24h后进行划线分离。 

（3）重复步骤（2）对菌株进行纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于斜面固体培养基，4℃保存。以上实验均在无菌操作条件下进行。 

使用扫描电镜（SEM）对分离菌株进行形态观察。 

菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的两株石油烃降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为： 

27F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′； 

1492R：5′CTACGGTTACCTTGTTACGAC3′； 

PCR反应体系(50μL)为：Mix25μL，模板2.0μL，引物各1.0μL，ddH₂O21μL。 

PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，以上共进行30个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。 

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。 

1.4菌株的鉴定 

菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA 提取试剂盒对筛选出的二株石油降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为： 

27F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′； 

1492R：5′CTACGGTTACCTTGTTACGAC3′； 

PCR反应体系(50μL)为：Mix25μL，模板2.0μL，引物各1.0μL，ddH₂O21μL。 

PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，以上共进行30个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。 

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。 

1.5降解菌的最适降解条件 

将活化后的降解菌接种于装有50mL含油液体培养基的150mL三角瓶中，采用单因素实验，在其它条件因素相同的情况下，分别改变温度、盐度和pH条件进行摇瓶培养，培养7d，每组实验做三个平行，对照组不接种降解菌。采用紫外分光光度法测定培养基中石油含量，计算降解率η（%）： 

温度、盐度和pH值分别设定为以下几个梯度：（1）温度：22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、50℃；（2）盐度：0.5%、1%、2%、3%、5%、7%、8%；（3）pH：4、5、6、7、8、9、10、11。 

1.6降解菌对含油污泥的降解 

1.6.1含油污泥总TPH的降解 

将活化后的二株石油烃降解菌接种于富集液体培养基中，37℃振荡培养24h，然后将RS1，RS3和投加比例为1:1的混合菌菌液各30mL加入盛有100g左右含油污泥的烧杯中，对照组则加入等量富集液体培养基，每组设三个平行，实验进行30d，每3d测定TPH质量分数，含油污泥的TPH质量分数的测定采用超声萃取-紫外分光光度法测定。 

1.6.2石油烃不同组份的降解 

取5g左右添加菌液处理7d的含油污泥置于具塞比色管中，分三次加入50mL二氯甲烷（20mL、20mL、10mL），每次超声萃取30min，收集萃取液于圆底烧瓶中。将滤液用事先烘干的WhatmanGF/F玻璃纤维滤膜过滤，过滤后的萃取液使用旋转蒸发仪浓缩后定容至10mL，氮吹至1mL用于硅胶柱层析。 

层析柱内径1cm，高30cm，从下至上依次填入玻璃纤维，25cm硅胶和1cm无水硫酸钠，加入1mL滤液样品，分别用30mL正己烷、50mL正己烷-二氯 甲烷（体积比1:1）洗脱，所得到的饱和烃、芳香烃组份用事先称重的圆底烧瓶接取。将所得组份风干后用万分之一分析天平称重，用重量法测得各组分含量，按照式（1）计算石油烃降解菌对饱和烃和芳香烃的降解率。 

然后将称重后的芳香烃和饱和烃组份用适量正己烷完全溶解，旋转蒸发至适量后氮吹至1mL装入样品瓶进行GC-MS检测。 

仪器分析条件：PAHs和正构烷烃的分析均使用Agilent7890A气相色谱-5975C质谱联用仪进行，色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。（1）PAHs分析气相条件：进样口温度290℃，初始温度70℃保持1min，10℃/min升到260℃保持4min，5℃/min升到300℃保持4min。质谱条件：传输线温度280℃，离子源温度230℃，电离方式：EI，扫描方式：SIM。载气为He，流速为1mL/min。（2）正构烷烃的仪器分析条件为：进样口温度220℃，程序升温，传输线温度250℃，离子源温度250℃，扫描方式：fullscan。 

2结果与讨论 

2.1降解菌的分离和形态 

从含油污泥样品中分离纯化得到二株石油烃降解菌，编号为RS1和RS3。通过扫描电镜观察到RS1大小为0.6～0.8μm×0.8～1.4μm，RS3大小为0.6～0.8μm×1.2～2.0μm；RS1为椭圆形，RS3为短杆状。 

2.2菌株的16SrRNA基因鉴定 

测序结果显示两株细菌的16SrRNA基因序列长度分别为1422bp、1415bp。将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息（表1）。 

表1两株菌的16SrRNA基因序列BLAST比对结果 

2.3菌株的最适降解条件 

2.3.1最适降解温度由图1可以看出，RS1对温度的适应性较好，在实验所选的温度范围内对石油均有超过10%的降解，其降解的最适温度范围为27℃ ～42℃，37℃时其对石油降解率最高；RS3在42℃时石油降解率最高，其降解的最适温度范围为32℃～42℃。 

温度直接影响酶的活性，而微生物作用于原油主要依靠酶催化反应对其进行降解。本申请中RS3对高温有一定适应能力，RS1适用于常温条件下降解石油烃，二株细菌均不适合在低温条件下降解石油。 

2.3.2最适降解盐度由图2可以看出，RS1对盐度的适应性较好，在盐度为0.5%～5%的环境下对石油烃具有25%以上的降解率；RS3的降解最适盐度范围均为0.5%～3%。在5%的较高盐度条件下，只有RS1的降解率依然高于25%，而盐度为8%时由于盐度太高，两株石油降解菌均失去对石油烃降解能力。 

盐度较高时降解菌对石油的降解率均明显下降，其原因经分析有两种可能，一是微生物在盐度太高的环境中会由于细胞外界的渗透压过高致使细胞原生质膜中的离子发生种类和数量上的变化，抑制微生物的生长繁殖；二是盐度过高时，钠离子随之增多，抑制了微生物中脱氢酶和氧化酶等酶物质的产生，直接影响微生物对石油的利用和降解。 

2.3.3最适降解pH值 

pH值对降解率的影响如图3所示，可以明显看出RS3在碱性环境下对石油烃的降解效果好，其降解的最适pH范围可达6～10；RS1适应中性环境，降解的最适pH范围均为6～8。 

pH值也是影响微生物降解石油烃的重要条件之一。由于含油污泥性质的复杂，有些需处理的碱性油泥的pH值较高，本申请分离出的菌株RS3对碱性环境适应性较强，在pH为10的条件下降解率仍可接近35%，因此，RS3可以用于碱性油泥的微生物降解处理研究。 

国内外对降解菌的最适降解条件的报道表明，最适降解温度低至15℃高达50℃不等，耐高温或低温石油降解菌对盐度的耐受能力普遍不高，微生物在38℃时对PAHs的降解率最高。本研究的细菌最适温度最高可达42℃，盐度可达3%，对温度和盐度耐受能力均较高。本申请的假单胞菌RS3的最适降解条件为42℃、盐度1%、pH6～10。 

2.4降解菌的降解特性 

2.4.1降解菌对油泥中TPH的降解 

相对于只添加营养的对照组，实验组油泥TPH均有明显降低，RS1和RS3作用于油泥，TPH的降解率分别为39.69%、53.29%，而混合菌的降解效果明显高于单一菌株，降解率为58.08%。二株菌对TPH的降解均在实验进行到20d左 右开始趋于缓慢。如图4所示。 

2.4.2菌株对石油烃不同组分的降解 

如图5所示，二株石油降解菌均表现出对饱和烃有较好的降解，其中，RS1对饱和烃的降解率最高，达20.74%；而对芳香烃降解效果不如饱和烃，其中RS3对芳香烃的降解率最高，达到8.08%。混合菌对饱和烃和芳香烃的降解能力均高于任意单一菌株，降解率分别为24.65%和10.77%。 

本申请分离出的假单胞菌RS3对芳香烃的降解率最高，棒状杆菌RS1对烷烃的降解率最高，处理7d降解率可达20.74%，具有良好的应用前景。 

2.4.3PAHs的GC-MS分析 

对处理组（加入混合菌菌液）和对照组（加入同体积富集培养基）两组样品中层析分离出的芳香烃组分进行GC-MS分析，检测其中16种优先控制PAHs的降解效果。使用内标法计算出对照组与处理组中几种.检测到的PAHs含量，得出混合菌对它们的降解率（表2）。 

表2混合菌对多环芳烃的降解率 

混合菌对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%、27.79%、30.78%和39.43，而对其它PAHs的降解效果则不明显。 

降解菌对初始浓度较低的PAHs降解效果较好。这是由于PAHs的降解与微生物的活性密切相关。含油污泥性质十分复杂，且PAHs相对烷烃毒性更大，PAHs含量越高其对微生物的毒性越大，微生物的活性越低。混合菌对萘的降解率最高，可能是由于假单胞菌RS3的作用，研究发现假单胞菌对萘有较强的降解效果。环数越多PAHs的毒性越大，不易被微生物降解，本研究发现混合菌对毒性较高的四环的屈、五环的苯并[b]荧蒽有较高的降解率，这是由于低环的萘和苊刺激 了细菌对屈和苯并[b]荧蒽的降解，形成了共代谢作用。 

2.4.3正构烷烃的GC-MS分析 

对混合菌液处理7d的含油污泥中正构烷烃进行GC-MS分析，由图6可见与对照组相比油泥样品中的正构烷烃n-C₁₂～n-C₃₄均有明显降解。 

混合菌对正构烷烃n-C₁₂～n-C₃₄均有明显降解，对其中n-C₁₂～n-C₁₅、n-C₂₇～n-C₃₄的降解效果较好，混合菌株对短链烷烃的降解效果较好，这是由于长链烷烃的毒性较高致使其生物利用度较低，限制其被微生物降解，且短链烷烃易挥发，因此，短链烷烃比长链烷烃更容易被微生物降解。Grossi等在研究微生物对海洋沉积物中石油烃的降解过程中发现在近6个月的降解后，短链正构烷烃（≤n-C₂₅）和长链正构烷烃例如n-C₃₀被大部分降解。混合降解菌对长链烷烃降解率较高，这可能是由于碳链较长的正构烷烃被降解菌作用后断裂成较短的烷烃导致。 

本发明筛选的菌种RS3保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8646。 

本发明筛选的菌种RS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8647。 

Claims (8)

1.一种含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于：所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8646，施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri。 

2.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于：所述降解菌对芳香烃的降解率达到8.08%。 

3.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于：所述降解菌对石油的降解条件为42℃、盐度1%、pH6～10。 

4.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于：所述对含油污泥中总石油烃的降解率为53.29%。 

5.权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌作为含油污泥净化剂的应用。 

6.一种含油污泥中石油的高效降解菌组，其特征在于：所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC NO. 8646，施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri；另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCCNO. 8647，分类号为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum。 

7.根据权利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌组，其特征在于：所述菌组对n-C₁₂～n-C₃₄的正构烷烃均有明显降解，且对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%、27.79%、30.78%和39.43%。 

8.权利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌组作为含油污泥净化剂的应用。