CN114854608B - 可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途。本发明提供的类酵母真菌菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022153。该菌株具有生长增殖速度快、培养难度低、生产成本低的特点，能够持续、高效地降解水体(如海洋水、工业废水)中含有的聚氨酯类微塑料，为当前水体环境中日益严重的聚氨酯类微塑料的污染问题提供了新的解决方案。

Description

可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途。

背景技术

微塑料是目前大洋环境中的关键污染物，去除大洋水体中的微塑料在大洋环境保护方面起到关键作用。微塑料作为一种难降解的高分子化合物，长期在海洋环境中累积，严重威胁着海洋生态系统的健康。一方面，微塑料易被海洋动物所摄食，进而对海洋动物产生机械损伤，如堵塞食道，产生假的饱腹感等，影响海洋动物的生长与健康，而且，浮游动物等低营养级海洋生物更易摄取微塑料，并通过食物网的传递与放大，引起生物累积效应。另一方面，微塑料还会向海洋环境释放增塑剂等具有内分泌干扰毒性的有毒物质，影响海洋生物的生殖与发育。此外，微塑料还能富集高浓度的持久性有机污染物和重金属，成为海水中有毒化学物质的载体，并产生生物放大作用，对海洋生物产生生态毒理学效应。

聚氨酯类微塑料是微塑料中最为常见的一种，生物降解是去除水体中聚氨酯类微塑料的非常有效且备受关注的方法。然而，相关技术中用于生物降解聚氨酯类微塑料的微生物仍然较少。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的用于生物降解聚氨酯类微塑料的微生物仍然较少的缺陷，从而提供一种可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途。

为此，本发明提供一种类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022153。

所述类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)，于2022年02月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022153，该菌株的检测结果为存活。

所述类酵母真菌菌株，是从福建平潭(25°37′47″N，119°44′44″E)排放口附近采集到的水样中分离纯化获得的。具体地，通过将福建平潭(25°37′47″N，119°44′44″E)排放口附近采集到的水样在醋酸纤维膜上孵育，随后进行分离、纯化和鉴定，得到所述类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)。

本发明还提供了一种含有上述类酵母真菌菌株和/或上述类酵母真菌菌株的代谢物的微生物菌剂。

本发明还提供了上述类酵母真菌菌株或者微生物菌剂在降解聚氨酯中的用途。

可选的，所述用途为降解水体中的聚氨酯的用途；

可选的，所述水体为海洋水和/或工业废水。

可选的，所述用途为降解水体中粒径小于5mm的聚氨酯类微塑料的用途。其中，所述微塑料是指粒径较小的塑料颗粒以及纺织纤维，通常认为粒径小于5mm的塑料纤维、颗粒或者薄膜即为微塑料，部分微塑料的粒径可达微米级乃至纳米级。

可选的，所述用途为降解聚氨酯中的酯键的用途。

本发明还提供了一种降解聚氨酯的方法，使上述类酵母真菌菌株或微生物菌剂与聚氨酯在水体中接触。

可选的，所述降解聚氨酯的条件包括：温度为4～35℃，pH为5.5～7.5。

可选的，所述降解聚氨酯的温度为10～35℃，pH为5.5～7.0。

可选的，所述降解聚氨酯的温度为20～28℃，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃；pH为5.5～6.5，例如5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。优选的，温度为28℃，pH为6.0。

本发明还提供了一种筛选具有聚氨酯降解活性的类酵母真菌菌株的方法，所述方法包括：

取水样，过滤，滤膜孵育至出现白色菌体；

取所述白色菌体，分离培养，得到至少一个单菌菌落；

取所述至少一个单菌菌落中的每一个单菌菌落，利用以聚氨酯为唯一碳源的纯化培养基进行培养，取出现菌落生长及透明圈的纯化培养基，得到具有聚氨酯降解活性的类酵母真菌菌株。

可选的，采用醋酸纤维膜进行所述过滤。

可选的，采用PDA培养基进行所述分离培养。

可选的，所述纯化培养基的培养条件包括：温度为24～28℃，例如28℃；pH为6.0～6.5，例如6.0；时间为4～5天。

可选的，所述纯化培养基包括：6.9～7.1g/L K₂HPO₄，1.9～2.1g/L KH₂PO₄，0.9～1.1g/L(NH₄)₂SO₄，0.05～0.1g/L MgSO₄·7H₂O，0.0005～0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.00008～0.00015g/L CuSO₄·5H₂O，0.008～0.015g/L FeSO₄·7H₂O，0.0018～0.0022g/L MnSO₄·7H₂O，体积分数为0.25～0.35％的聚氨酯，以及余量的水；

可选的，所述纯化培养基为经灭菌处理后的培养基，灭菌方法可以是本领域人员熟知的，例如可以是高温高压灭菌法。所述纯化培养基中还含有抗生素，所述抗生素可以是硫酸链霉素，所述抗生素的浓度为28～32μg/mL。

本发明还提供了上述类酵母真菌菌株的鉴定方法，包括：

确定待测菌株的ITS序列测序结果与SEQ ID NO:1所示序列的相似度，在所述相似度大于等于97％的情况下，确定所述待测菌株为权利要求1所述的类酵母真菌菌株。

可选的，所述鉴定方法还包括采用SEQ ID NO:2～3所示的引物对待测菌株的ITS序列进行扩增的步骤，以及对扩增结果进行测序的步骤。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的类酵母真菌菌株，具有生长增殖速度快、培养难度低、生产成本低的特点，能够持续、高效地降解水体(如海洋水、工业废水)中含有的聚氨酯类微塑料，为当前水体环境中日益严重的聚氨酯类微塑料的污染问题提供了新的解决方案。

2.本发明提供的降解聚氨酯的方法，利用本发明的类酵母真菌菌株进行聚氨酯降解，具有降解效率高、环保、无二次污染、低成本、易操作的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2中类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)在固体平板CMA培养基上的菌落外观图；

图2是本发明实施例2中类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)在显微镜下的菌体形态特征图；

图3是本发明实施例4中各温度梯度下菌液上清液中OD₆₀₀测量值随培养时间的变化曲线；

图4是本发明实施例5中各pH梯度下菌液上清液中OD₆₀₀测量值随培养时间的变化曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例用于说明本发明的类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)的分离过程和纯化过程：

(1)配制纯化培养基和对照培养基：

纯化培养基：将各成分原料加入蒸馏水中，使得配制后的纯化培养基包括：7g/LK₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0001g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.002g/L MnSO₄·7H₂O，和体积分数0.3％的聚氨酯；

对照培养基：将各成分原料加入蒸馏水中，使得配制后的对照培养基包括：7g/LK₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0001g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.002g/L MnSO₄·7H₂O，和质量分数0.3％的PET粉末。

分别调节纯化培养基和对照培养基的pH值至6.0，并进行高温高压灭菌，灭菌冷却后分别加入终浓度为30μg/mL的硫酸链霉素，混合均匀。

(2)富集培养：将从福建平潭(25°37′47″N，119°44′44″E)排放口附近采集到的水样用醋酸纤维膜过滤，过滤后的醋酸纤维膜于室温进行孵育，直至观察到有白色菌体生长。

(3)分离：挑取富集培养的白色菌体点接在分离培养基平板上，25℃下培养至有明显菌落长出。其中，分离培养基为20％营养的PDA分离培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，每1L分离培养基中含有马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g和琼脂粉15.0g，以及终浓度为30μg/mL的硫酸链霉素。

(4)纯化：从分离培养基上挑取单个菌落的菌丝分别接种在纯化培养基和对照培养基中，28℃下培育4-5天，纯化培养基平板上观察到有菌落生长，且菌落周围出现明显的透明圈，对照培养基上未观察到菌落生长，也无透明圈出现。取纯化培养基，得纯化后的类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)。

实施例2

本实施例用于说明类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)的生物学鉴定过程：

真菌的生物学鉴定主要是对其真菌的菌丝的显微结构进行鉴定，具体步骤如下：

配制玉米粉琼脂培养基(CMA，玉米粉40.0g，吐温80 10mL，琼脂粉15.0g)，并用配制好的该培养基倒平板，在倒平板时控制培养基厚度，避免培养基偏厚。用接种环从实施例1步骤(4)中培养后的纯化培养基平板上挑取一环菌落，并在CMA培养基上“之”字型划线。在划过线的CMA培养基平板中用手术刀切出两个长方形培养基，取出置于培养皿中，放上盖玻片后在25℃的恒温箱里培养7天。培养结束后将培养皿放在倒置显微镜(Olympus IX51)下，找出有代表性的菌落，并拍摄照片。

培养结果如图1和图2所示。图1为类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)在固体平板CMA培养基上的菌落外观图，由图1可以看出：类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)的菌落为煎蛋型，乳白色，质地粘稠，中心为褶皱状，外圈为发散状的菌丝体。图2为类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)在显微镜下的菌体形态特征图，从图2中可以看出：该菌株的菌丝发达，有分枝，无色，菌丝无隔膜。

实施例3

本实施例用于说明类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)的基因序列分析：

取实施例1步骤(4)中培养后的纯化培养基平板上的纯种真菌，刮去菌丝，利用FastDNA^TM SPIN Kit for Soil试剂盒(厂家：MP Biomedicals公司，货号：116560-200)提取菌种DNA。

提取的DNA在热循环仪(厂家：Biometre，货号：T3)上通过ITS4引物(SEQ ID NO:2：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS5引物(SEQ ID NO:3：5′-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3′)扩增基因组的ITS序列，其中，扩增体系为：

MIX 26μL；

ITS4引物(0.2μmol/L) 2μL；

ITS5引物(0.2μmol/L) 2μL；

样品DNA模板(100ng/μl) 2μL；

超纯水 18μL。

扩增程序为：将聚合酶链反应(PCR)扩增条件设置为在95℃初始变性5分钟，然后循环条件为95℃30s，55℃30s，72℃50s，最后的延伸步骤是在72℃下进行10分钟。

获得PCR产物后进行凝胶电泳，使用胶回收试剂盒提取扩增子，根据制造商的说明使用AMPure XP Beads(美国Beckman Agencourt)进行纯化，得到序列长度大约为600bp的PCR产物。

扩增好的ITS序列的PCR产物委托厦门铂瑞生物科技公司进行26SrDNA-ITS区基因序列分析，测序成功后对真菌的ITS序列用BioEdit软件去除多余序列，保留波峰较整齐部分的序列，如SEQ ID NO:1所示。然后对真菌的ITS序列进行Blast分析比对，根据序列相似度97％至100％为标准来确定真菌种属地位。结合实施例2中观察到的菌落形态和显微菌丝结构，确定该真菌菌株为类酵母(Pseudozyma sp.)，命名为Pseudozyma sp.JK-464，并于2022年02月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022153，该菌株的检测结果为存活。

其中，SEQ ID NO:1的序列如下所示：

TTGATGTTGTAGAATATACTACATCGTTCCCTTCCCGACGTGTGCGGGCATGGGCGGGGTTCAGAAGCACTCCAACCAGCAAAACACGGTGCGTCCAGCTCTAACCCAGACCCTCTTCTCCCCTCCGAAGTCCTGATATTATCAAAACCCGGCAGGAGGAAGAGGAGGGCGAAAAAGCGAGCTTTCGTCCGTCCTTGCCTCTCAAATGGATGCGCTAATGCATTTCGAGGGAGCCATGGTAACTGGCAACCCCTCACTACCGATCCGCCAACTCTCTCGCCAAAAAAAAAAAGGAAAAAAGCTGCCGTCCGAAACAATTCGCGGCCCTCAAACAGGCATGCTCCCCAAATTAAATCTGCAGGGAGCGCAAGGGGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGGGAAAACCAAGAGATCCGTTGCCAAAAGTTGTTTTTTAGTTAAAAAATTAAACTTTTCTTTCATTCAACTCCTAAATCATCAAAAGTGTTTTGGTGTAAAAAGTGTCGACCGCCTTTCCAGCAGCGAACGCGAGGTCCGCGCTGTTGGACAGCCAACCGATGCAACCGTGTTAAAAGGGGGTAGCTCAAGTTTAGTTAGACAGGTGCGAGCCACACCTCAAGAAAAAAGGGTTTTCATCGAAATGATCCATCTGCAGGTTCA。

实施例4

本实施例用于检测不同温度下类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)对聚氨酯的降解能力：

配制以聚氨酯为唯一碳源的培养液：每1L蒸馏水中含有7g/L K₂HPO₄，2g/LKH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0001g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.002g/L MnSO₄·7H₂O和体积分数为0.3％的聚氨酯，用50％的盐酸调节pH为6.0。上述培养液装于三角瓶中，每瓶分装100ml培养液，分装完毕后高温高压灭菌，灭菌冷却后分别加入终浓度为30μg/mL的硫酸链霉素，混合均匀。

在灭菌之后的每瓶培养液中以质量分数为5％的接种量接种类酵母真菌(Pseudozyma sp.JK-464)，之后对三角瓶进行密封，分别放入4℃、10℃、20℃、28℃、35℃的环境中(每个温度梯度设置三个摇瓶)以120r/min震荡培养7天，在第0天至第7天，每天从三角瓶中取出1mL混匀的菌液，在EP管中以3000rpm离心1min，取200μl上清液，通过酶标仪对其进行OD₆₀₀吸光度的测量，结果见表1。

针对各温度梯度，根据OD₆₀₀测量值随培养时间的变化作变化曲线，并将其与空白培养基(第0天)的OD₆₀₀值进行对比，由此判断各温度梯度下菌种对聚氨酯的降解能力，结果见图3。

表1不同温度、不同培养时间下菌液上清液中OD₆₀₀测量值

从表1和图3可以看出，本发明的类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)能够在聚氨酯为唯一碳源的条件下有效地将聚氨酯降解且具有较强的聚氨酯降解能力，其中，在20℃和28℃的培养组中，真菌对聚氨酯的降解效果明显优于较低温的4℃、10℃以及高温的35℃的培养组，并且发现28℃的培养组中真菌对聚氨酯的降解效果最好。

实施例5

本实施例用于检测不同pH下类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)对聚氨酯的降解能力：

配制以聚氨酯为唯一碳源的培养液：每1L蒸馏水中含有7g/L K₂HPO₄，2g/LKH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，0.001g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0001g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.002g/L MnSO₄·7H₂O和体积分数为0.3％的聚氨酯。

上述培养液装于三角瓶中，每瓶分装100ml培养液，用50％的盐酸和1M的NaOH将培养液的pH分别调节至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5(每个pH梯度三个摇瓶)，完毕后高温高压灭菌，灭菌冷却后分别加入终浓度为30μg/mL的硫酸链霉素，混合均匀。

在灭菌之后的每瓶培养液中以5％的接种量接种类酵母真菌(Pseudozyma sp.JK-464)，之后对三角瓶进行密封，放入28℃的环境中以120r/min震荡培养7天，在第0天至第7天，每天从三角瓶中取出1mL混匀的菌液，在EP管中以3000rpm离心1min，取200μl上清液，通过酶标仪对其进行OD₆₀₀吸光度的测量，结果见表2。

针对各pH梯度，根据OD₆₀₀测量值随培养时间的变化作变化曲线，并将其与空白培养基(第0天)的OD₆₀₀值进行对比，由此判断各pH梯度下菌种对聚氨酯的降解能力，结果见图4。

表2不同pH、不同培养时间下菌液上清液中OD₆₀₀测量值

从表2和图4可以看出，本发明的类酵母真菌菌株(Pseudozyma sp.JK-464)能够在聚氨酯为唯一碳源的条件下有效地将聚氨酯降解且具有较强的聚氨酯降解能力，其中，在pH为6.0和6.5的培养组中，真菌对聚氨酯的降解效果较其它组好，又以pH为6.0的培养组中降解效果最好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

深圳大学

<120> 可降解聚氨酯类酵母真菌菌株及鉴定方法与用途

<130> ZHA202200054

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgatgttgt agaatatact acatcgttcc cttcccgacg tgtgcgggca tgggcggggt 60

tcagaagcac tccaaccagc aaaacacggt gcgtccagct ctaacccaga ccctcttctc 120

ccctccgaag tcctgatatt atcaaaaccc ggcaggagga agaggagggc gaaaaagcga 180

gctttcgtcc gtccttgcct ctcaaatgga tgcgctaatg catttcgagg gagccatggt 240

aactggcaac ccctcactac cgatccgcca actctctcgc caaaaaaaaa aaggaaaaaa 300

gctgccgtcc gaaacaattc gcggccctca aacaggcatg ctccccaaat taaatctgca 360

gggagcgcaa ggggcgttca aagattcgat gattcacttc tgcaattcac attacttatc 420

gcaattcgct gcgttcttca tcgatgggaa aaccaagaga tccgttgcca aaagttgttt 480

tttagttaaa aaattaaact tttctttcat tcaactccta aatcatcaaa agtgttttgg 540

tgtaaaaagt gtcgaccgcc tttccagcag cgaacgcgag gtccgcgctg ttggacagcc 600

aaccgatgca accgtgttaa aagggggtag ctcaagttta gttagacagg tgcgagccac 660

acctcaagaa aaaagggttt tcatcgaaat gatccatctg caggttca 708

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatagc 19

Claims (8)

1.一种类酵母真菌菌株，其特征在于，菌株名称为Pseudozyma sp.JK-464，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022153。

2.一种含有权利要求1所述的类酵母真菌菌株的微生物菌剂。

3.权利要求1所述的类酵母真菌菌株或者权利要求2所述的微生物菌剂在降解聚氨酯中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用途为降解水体中的聚氨酯的用途；

所述水体为海洋水和/或工业废水。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为降解水体中粒径小于5mm的聚氨酯类微塑料的用途。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的用途，其特征在于，所述用途为降解聚氨酯中酯键的用途。

7.一种降解聚氨酯的方法，其特征在于，使权利要求1所述的类酵母真菌菌株或权利要求2所述的微生物菌剂与聚氨酯在水体中接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降解聚氨酯的条件包括：温度为4～35℃，pH为5.5～7.5。