CN112264459B - 出芽短梗霉菌jb16在修复重金属污染土壤中的应用 - Google Patents

出芽短梗霉菌jb16在修复重金属污染土壤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污染土壤中的应用，涉及菌株功能及应用技术领域。本发明中菌株JB16分离筛选自黑龙江省齐齐哈尔市扎龙湿地采集土壤，JB16能在含有1500mg/L Pb2+、750mg/L Cd2+培养基中存活，在含铅和镉的PDA培养基平板上进行培养时，铅镉复合浓度为1500/300mg/L时，JB16仍能存活，因此具有较好的耐铅镉性，能够利用淀粉、麦芽糖作为碳源生长，不能水解纤维素，在甲基红和明胶液化实验中皆显示为阴性，ITS序列鉴定为出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)，可为微生物修复重金属污染的土壤提供菌种资源。

Description

出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污染土壤中的应用
技术领域
本发明属于菌株功能及应用技术领域，具体涉及出芽短梗霉菌JB16在 修复重金属污染土壤中的应用。
背景技术
随着工业技术的发展，重金属污染成为主要的环境污染之一。重金属由 于其在环境中滞留时间长、毒性大、很难被降解，并通过食物链富集，会对 人体健康造成严重危害。如果土壤中存在大量重金属时，会降低土地活性， 影响植物的正常生长，导致粮食减产。因此如何有效治理重金属污染也成了 国内外学者们研究的热点，微生物修复重金属污染具有广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污 染土壤中的应用，JB16具有较好的耐铅镉性，可为微生物修复重金属污染 的土壤提供菌种资源。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)JB16在修复重金 属污染土壤中的应用，所述出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)JB16的 保藏编号为CGMCC NO.20260。
优选的，所述JB16的ITS基因序列登录号为MN209899。
优选的，所述重金属包括铅和/或镉。
优选的，利用所述JB16修复铅污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的 浓度不高于1500mg/L；
利用所述JB16修复镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中镉的浓度不高 于750mg/L；
利用所述JB16修复铅和镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度 不高于1500mg/L，镉的浓度不高于300mg/L。
本发明还提供了一种修复铅和/或镉污染的土壤的菌剂，所述菌剂的活性 成分包括所述出芽短梗霉菌JB16。
本发明提供了出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污染土壤中的应用，所 述JB16分离筛选自黑龙江省齐齐哈尔市扎龙湿地采集土壤，经阶梯性筛选， JB16能在含有1500mg/LPb2+、750mg/L Cd2+培养基中存活，具有较好的耐 铅镉性，能够利用淀粉、麦芽糖作为碳源生长，不能水解纤维素，在甲基红 和明胶液化实验中皆显示为阴性，ITS序列鉴定为出芽短梗霉菌 (Aureobasidium pullulans)。
本发明实施例中，将所述JB16在含铅的PDA平板培养基上进行培养时， 铅离子的最低抑制浓度为1500mg/L；在含镉的PDA平板培养基上进行培养 时，镉离子的最低抑制浓度为750mg/L；在含铅和镉的PDA培养基平板上 进行培养时，铅镉复合浓度为1500/300mg/L时，菌株JB16仍能存活。证明 所述JB16具有较好的耐铅镉性，可为微生物修复重金属污染的土壤提供菌 种资源。
生物保藏信息
出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)JB16，于2020年09月11日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20260。
附图说明
图1为利用ITS序列构建得到的进化树。
具体实施方式
本发明提供了出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)JB16在修复重金 属污染土壤中的应用，所述出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)JB16的 保藏编号为CGMCC NO.20260。
本发明所述JB16的ITS基因序列登录号优选为MN209899，其ITS基 因序列优选如SEQ ID NO.1所示： CGGAAGGATCATTAAAGAGTAAGGGTGCTCAGCGCCCGACCTCCAACC CTTTGTTGTTAAAACTACCTTGTTGCTTTGGCGGGACCGCTCGGTCTCG AGCCGCTGGGGATTCGTCCCAGGCGAGCGCCCGCCAGAGTTAAACCA AACTCTTGTTATTTAACCGGTCGTCTGAGTTAAAATTTTGAATAAATCA AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA TCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATTACACCACTCAAGCTATGCTTGGTATTGGGTGCCGTCCT TAGTTGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGAGGCCTCACCGGCTTTAGG CGTAGTAGAATTTATTCGAACGTCTGTCAAAGGAGAGGACTTCTGCCG ACTGAAACCTTTTATTTTTCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC CCGCTGAACTTAAGCATATATAG。本发明利用所述ITS序列与GenBank 中已有的ITS序列进行BLAST同源性分析，利用软件MEGA5构建进化树， 如图1所示，该菌株与出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的相似性较 高，确定分离到的菌株为出芽短梗霉菌，编号为JB16，序列已提交NCBI 的GENBANK数据库，菌株基因序列登录号为MN209899。
本发明所述JB16优选分离筛选自黑龙江省齐齐哈尔市扎龙湿地，本发 明对所述分离筛选的方法并没有特殊限定，优选包括：将10-5g/mL、10-6 g/mL、10-7g/mL浓度土壤悬液取0.1mL接种到铅浓度为300mg/L、镉浓度 为150mg/L的PDA培养基平板上，在恒温培养箱中30℃，培养3～5天，观 察是否有菌落长出，若有菌株长出，则继续增加PDA培养基中铅、镉浓度， 从而确定铅、镉离子的最低抑制浓度；因复合铅镉浓度的胁迫比单一铅、镉 浓度大，故再通过含复合铅镉浓度的PDA培养基进行筛选。本发明所述重 金属优选包括铅和/或镉。在本发明中，利用所述JB16修复铅污染的土壤时， 所述土壤的溶液中铅的浓度优选不高于1500mg/L；利用所述JB16修复镉污 染的土壤时，所述土壤的溶液中镉的浓度优选不高于750mg/L；利用所述 JB16修复铅和镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度优选不高于 1500mg/L，镉的浓度优选不高于300mg/L。
本发明还提供了一种修复铅和/或镉污染的土壤的菌剂，所述菌剂的活性 成分包括所述JB16。
下面结合实施例对本发明提供的出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污染 土壤中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的 限定。
实施例1
出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的分离和鉴定
一、JB16是从黑龙江省齐齐哈尔市扎龙湿地内筛选出的耐性菌株，具 体包括如下的步骤：
1.配制培养基
PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000 mL，自然pH值。PDA培养基具体配制过程：将200g马铃薯去皮并切成小 块，置于锅中加入适量水煮沸，熬至马铃薯小块易被玻璃棒碾碎时使用8层 纱布过滤，将滤液重新倒入锅中，加入20g葡萄糖用玻璃棒搅拌溶解，再加 入20g琼脂粉搅拌均匀并补水到1000mL，分装于250mL的三角瓶中，灭 菌锅设置为121℃、20min。
2.筛选培养
称取土样10g置于锥形瓶中，加入无菌水90mL制成土壤悬液，放入 适量玻璃珠后封口移入恒温摇床中，180r/min、30℃处理2h，静置30min。 取土壤悬液的1mL加入到9mL无菌水得到10-1的土壤菌悬液，继续稀释， 依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的浓度土壤菌悬液。将10-5、 10-6、10-7浓度菌悬液取0.1mL接种到铅浓度为300mg/L、镉浓度为150mg/L 的PDA培养基平板上，在恒温培养箱中30℃培养3～5天，观察是否有菌落 长出，若有菌株长出，则继续增加PDA培养基中铅、镉浓度，从而确定铅、 镉离子的最低抑制浓度。因复合铅镉浓度的胁迫比单一铅、镉浓度大，故再 通过含复合铅镉浓度的PDA培养基进行筛选。确定铅离子的最低抑制浓度 为1500mg/L；确定镉离子的最低抑制浓度为750mg/L，铅镉复合浓度为 1500/300mg/L时，JB16仍能存活。
二、采用ITS基因测序法对JB16进行分类鉴定
1.ITS基因PCR扩增引物为：
ITS1(SEQ ID NO.2)：5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；
ITS4(SEQ ID NO.3)：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
2.扩增程序为：预变性95℃300s；变性95℃30s，退火56℃30s， 延伸72℃90s，重复25次；修复延伸72℃600s，终止反应4℃。
基因扩增产物纯化后经美吉公司测序，将所得序列与GenBank中已有的 ITS序列进行BLAST同源性分析，利用软件MEGA5构建进化树。结果如 图1所示，该菌株与出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的相似性较高， 确定分离到的菌株为出芽短梗霉菌，编号为JB16，序列已提交NCBI的 GenBank数据库，菌株基因序列登录号为MN209899。
三、JB16的生理生化试验
1.甲基红试验
(1)葡萄糖蛋白胨培养基：7.5g蛋白胨，7.5g葡萄糖，7.5g磷酸氢二 钾，定容到1500mL，pH为7。
(2)步骤：将JB16接种到葡萄糖蛋白胨培养基中，灭菌棉塞封口，培 养温度30℃，24h后，向葡萄糖蛋白胨培养基中滴加1～2滴甲基红试剂，观 察颜色变化。若变为红色表示培养基中含有酸性物质则为阳性，用“+”表示； 若变为黄色表示培养基中不含有酸性物质则为阴性，用“-”表示。
2.明胶液化试验
(1)明胶液化培养基：蛋白胨5g，明胶200g，葡萄糖20g，蒸馏水 1000ml。
(2)步骤：将JB16接种于明胶表面，28℃下暗培养，每隔5d观察一 次。先将试管低温冷却，待未接种的CK试管中明胶凝固后观察记录。若冷 却后明胶不液化则无蛋白酶水解作用，反之则表明有蛋白酶水解作用。水解 为阳性用“+”表示，不水解为阴性用“-”表示。
3.淀粉水解试验
(1)淀粉水解培养基：磷酸氢二钾10g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠0.5 g，碳酸镁1g，硝酸钾1g，可溶性淀粉2.0g，琼脂15g，pH为7.2，蒸馏 水1000ml。
(2)步骤：将培养基倒入培养皿中，待培养基凝固后采用点接法接种， 28℃下暗培养10～20d后，将配制好的碘液倒入培养基表面。如有淀粉酶产 生，则菌落的周围不会变为蓝色，反之则变成蓝色，表明有淀粉酶产生。利 用形成的透明圈来检测是否产生淀粉酶。淀粉酶水解为阳性用“+”来表示， 淀粉酶不水解为阴性用“-”来表示。
4.纤维素水解试验
(1)纤维素水解培养基：硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g， 硝酸钾1g，滤纸条，蒸馏水1000ml。
(2)步骤：将滤纸条放置在试管的培养基中，一半浸入培养基中一半 在培养基上，将待测菌株接种于已灭菌的试管中的滤纸条上，28℃培养30d 后，观察其是否能在滤纸条上生长。纤维素水解为阳性用“+”表示，纤维素 不水解为阴性用“-”表示。
5.麦芽糖或纤维素利用测定
(1)土豆200g，麦芽糖或纤维素20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
(2)观察菌株能否正常生长。能正常生长则为阳性用“+”表示，不能正 常生长用“-”表示。
6.试验结果如表1所示
表1 JB16的生理生化性质
Figure BDA0002711271770000061
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 齐齐哈尔大学
<120> 出芽短梗霉菌JB16在修复重金属污染土壤中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 556
<212> DNA
<213> Aureobasidium pullulans
<400> 1
cggaaggatc attaaagagt aagggtgctc agcgcccgac ctccaaccct ttgttgttaa 60
aactaccttg ttgctttggc gggaccgctc ggtctcgagc cgctggggat tcgtcccagg 120
cgagcgcccg ccagagttaa accaaactct tgttatttaa ccggtcgtct gagttaaaat 180
tttgaataaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc 240
agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 300
cacattgcgc cccttggtat tccgaggggc atgcctgttc gagcgtcatt acaccactca 360
agctatgctt ggtattgggt gccgtcctta gttgggcgcg cctcaaagac ctcggcgagg 420
cctcaccggc tttaggcgta gtagaattta ttcgaacgtc tgtcaaagga gaggacttct 480
gccgactgaa accttttatt tttctaggtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 540
acttaagcat atatag 556
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)JB16在修复重金属污染土壤中的应用，其特征在于，所述出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)JB16的保藏编号为CGMCCNO.20260；
所述重金属为铅和/或镉；
利用所述JB16修复铅污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度不高于1500mg/L；
利用所述JB16修复镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中镉的浓度不高于750mg/L；
利用所述JB16修复铅和镉污染的土壤时，所述土壤的溶液中铅的浓度不高于1500mg/L，镉的浓度不高于300mg/L。
2.一种修复铅和/或镉污染的土壤的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1中的出芽短梗霉菌JB16。
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