CN112662582B - 产纤维素酶的海洋细菌hn b15及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物制剂技术领域，特别涉及产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法。该产纤维素酶的海洋细菌的保藏编号为CCTCC NO：M 20191040。本发明从中国海南海草床生态系统中筛选适用于海南等热带对虾海水养殖环境的产纤维素酶的芽孢细菌并开展其应用基础评价，为开发高效利用廉价的纤维素的海洋微生物制剂和构建基人工添加蔗渣等廉价人工碳源的对虾海水养殖模式奠定基础。

Description

产纤维素酶的海洋细菌HN B15及其微生物制剂和天然纤维素 的降解方法

技术领域

本发明涉及微生物制剂技术领域，特别涉及产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法。

背景技术

据2018年统计，我国水产养殖总产量大于5000万吨，成为世界水产品总量超过捕捞总量的渔业国家。虽然高密度养殖能带来高收益，但是高蛋白质饵料和排泄物大量积累会加重养殖水体的恶化。据研究报道，养殖过程中残饵和粪便是产生氮磷等元素的主要来源，而碳元素相对缺乏导致水体恶化。最近新兴的生物絮团养殖模式通过额外添加碳源来调控水体碳氮比，然而人为添加碳源（蔗糖、糖蜜等）成本太高，无法大规模推广，因此寻求一种廉价的碳源成为目前的研究热点。

甘蔗是一种在海南种植广泛的制糖作物，甘蔗渣是制糖工业中最为主要副产品，是甘蔗在经过破碎和提取蔗汁后剩余的纤维性残渣，属于农业废弃物的一种。目前按照我国年产蔗糖1100万吨来测算，全国制糖企业每年可剩余甘蔗渣600-650万吨。其含有大量纤维素，可作为廉价易得的碳源来源。然而在自然界中，纤维素降解困难，需利用微生物将纤维素降解成动物可直接利用的单糖。

产纤维素酶菌是一种能产生纤维素酶降解纤维素生成葡萄糖的一种微生物。产纤维素酶菌所产生的纤维素酶可将甘蔗渣中的纤维素快速降解为葡萄糖，可更为快速、更为直接的提供碳源。现有的报道中，利用微生物进行甘蔗渣的降解主要集中于对真菌的研究。大多数应用于商业和实验室纤维素酶均为真菌产生，但其降解时间长，培养条件要求高；而细菌，例如芽孢杆菌，与真菌相比生长速率更高，酶产生速率更高，且易培养。

如公开号CN103468602A发明公开了一株产纤维素酶芽孢杆菌(Bacillussp.)H1，保藏编号为CGMCCNo.7395。该发明方法简单快速，易于实施，对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值。又如公开号CN102586133A发明公开了一株产生纤维素酶的芽孢杆菌属(Bacillussp.)菌株和利用此菌株生产纤维素酶的生产方法，经过培养基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂具有良好的酶活性。

研究表明，产纤维素酶菌等水产益生菌具有地理种群的特殊性。现有产纤维素酶菌株常筛选自营养丰富，生态结构复杂的陆源环境。由于我国内陆地区和海南岛的环境、气候有明显的差异，所获得的产酶菌株通常耐受性不高且不稳定，导致许多水产益生菌在海南岛的使用效果不明显。现有常见水产益生菌并不适合利用纤维素。现有的产纤维素酶菌也主要集中在陆源纤维素功能菌的筛选。因此寻找适用于海南热带海洋环境且产纤维素酶的海水细菌迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法。本发明首次获得适用于对虾养殖环境的安全无害、遗传稳定、耐酸碱和具广盐性的可降解甘蔗渣的产纤维素酶菌株，为今后开发相应的微生态制剂提供菌种基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种产纤维素酶的海洋细菌，其保藏编号为CCTCC NO：M 20191040。

本研究从海南海草床生态系统中筛选适应于海南凡纳滨对虾养殖环境产纤维素酶的土著益生菌。首先以凡纳滨对虾为研究对象，进行动物安全性实验和抗生素药敏分析，并开展遗传稳定性、pH和盐度耐受性的研究，以获得安全无害、遗传稳定和耐受性广的产纤维素酶菌株，为今后开发相应的微生态制剂提供菌种。

作为优选，海洋细菌的筛选方法包括：采集海草床附近3cm以下底质泥样，涂布于2216E海水琼脂培养基上，经培养、纯化，得到产纤维素酶的海洋细菌。

作为优选，2216E海水琼脂培养基的组成为：0.5%胰蛋白，0.1%酵母，0.01‰磷酸铁，1.7％琼脂，水余量。

作为优选，培养的温度为30℃，培养的时间为15~30h。

优选地，培养的时间为18h。

本发明还提供了一种天然纤维素的降解方法，包括：将上述海洋细菌接种于2216E液体培养基进行培养，得到培养上清液；将所得培养上清液与天然纤维素混合，酶解。

作为优选，培养的温度为30℃，培养的时间为12~16h。

作为优选，酶解的pH值为4.6~5.0，酶解的温度为48~52℃，酶解的时间为0.5~2h。

优选地，酶解的pH值为4.8，酶解的温度为50℃，酶解的时间为1h。

作为优选，天然纤维素为甘蔗渣粉。

作为优选，甘蔗渣粉为100~200目、碱液处理后的甘蔗渣粉。

优选地，甘蔗渣粉为150目、碱液处理后的甘蔗渣粉。

作为优选，碱液处理为：用85℃、2%的NaOH溶液浸泡甘蔗渣粉1 h，冷却后水洗至中性，烘干。

本发明还提供了另一种天然纤维素的降解方法，包括：将上述海洋细菌接种于含有天然纤维素的液体培养基振荡培养。

作为优选，振荡培养的温度为30℃，振荡培养的转速为180rpm，振荡培养的时间为10~20天。

优选地，振荡培养的时间为15天。

本发明还提供了一种产纤维素酶的海洋微生物制剂，包括上述海洋细菌。

本发明还提供了一种海洋水产的养殖方法，以天然纤维素作为人工碳源，在养殖水体中加入上述海洋细菌或海洋微生物制剂。

本发明提供了产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法。该产纤维素酶的海洋细菌的保藏编号为CCTCC NO：M 20191040。本发明具有的技术效果为：

本发明从中国海南海草床生态系统中筛选适用于海南等热带对虾海水养殖环境的产纤维素酶的芽孢细菌并开展其应用基础评价，为开发高效利用廉价的纤维素的海洋微生物制剂和构建基人工添加蔗渣等廉价人工碳源的对虾海水养殖模式奠定基础。

生物保藏说明

分类命名：芽孢杆菌HN B15（Bacillus sp.HN B15），于2019年12月13日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏中心地址为湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：M 20191040。

附图说明

图1示海洋中采样位置坐标；

图2示纤维素酶酶活力标准曲线；

图3示安全性实验中对虾存活率；

图4示不同pH值对菌体生长的影响；

图5示不同盐度对菌体生长的影响。

具体实施方式

本发明公开了产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的产纤维素酶的海洋细菌及其微生物制剂和天然纤维素的降解方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.采集样品

2018年12月23日在文昌市会文镇红树林地区海草床生态系统（19°28′11.66″N，110°47′41.22′′E ）（图1）采集海草床附近3cm以下底质泥样。采集的泥样置于无菌拉链塑料袋中，在4℃冰盒里保存。

2.微生物分离纯化

在收集样品24小时内，用无菌勺称取0.5g泥样悬浮于无菌生理盐水溶液（0.85％NaCl）中，搅拌均匀，以此为原液，用无菌生理盐水溶液连续稀释水样，以获得1:10、1:100和1:1000的稀释液，各取100μL稀释的样品均匀涂布在2216E海水琼脂培养基（0.5%胰蛋白，0.1%酵母，0.01‰磷酸铁和1.7％琼脂）上，并在30℃的恒温箱下培养18小时。根据常见细菌系统鉴定手册研究琼脂平板上菌落形态，包括形状、大小、高度和颜色。选择形态上不相同的菌落并将其划线在2216E海水琼脂培养基上以获得纯菌落。挑取单菌落于无菌2216E液体培养基中培养，参照麦氏比色法，培养菌株浓度达到OD₆₀₀=1，补充甘油使其终浓度为15%，在温度为-80℃的冰箱里保存。部分纯化的菌落保存在4℃以进一步鉴定。

3.初步筛选产纤维素酶的海水细菌

使用羧甲基纤维素（CMC）琼脂培养基和刚果红染色法进行筛选。取2216E液体过夜生长的培养物，2μL点涂在CMC琼脂平板上（0.1％酵母，0.5％羧甲基纤维素钠，2％NaCl，0.5%胰蛋白和1.7％琼脂）。琼脂平板在30℃恒温箱下培养18小时，将CMC琼脂平板用1mg/mL刚果红浸染，并在室温下静置30分钟。最后用1mol/L氯化钠漂洗液充分复染平板10分钟。氯化钠漂洗后，菌落显示刚果红变色的认为有良好的纤维素酶活性。

4. 二次筛选产纤维素酶菌株

将菌株重新活化过夜培养，取2μL培养液点涂到CMC琼脂平板上进行重新检测，利用广陆电子数显卡尺（0-200mm）测量菌落直径和水解圈的直径。根据纤维素分解区的直径与细菌菌落直径之间的比率计算确定纤维素分解活性的水解能力（Hydrolytic ability，简写HC，也叫D/d）值，实验重复三次。水解能力（HC）= 透明圈的直径/菌落的直径，比值越大则产酶能力越强。

5 .16SrRNA测序和分离株的分析

在阳性筛选和HC测量后，通过分子遗传分析，对选择的纤维素分离物进行鉴定。使用TIANGEN试剂盒方法提取细菌基因组DNA。将选择的分离物在2216E液体培养基里培养过夜。取细菌培养液1mL，10,000rpm离心1min，吸净上清。加入180μL缓冲溶液，37℃处理30min。向管内加入20μL Proteinase K溶液，混匀。加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中（该步骤重复一次）。将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱转置一个无菌干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。取10μL离心管中的DNA放在PCR小管中，方便后续实验。将剩余的DNA样品加入2.5倍无水乙醇，保存于-20℃。分装得到的DNA样品经1%（m/v）的琼脂糖凝胶电泳检测其含量和完整性。PCR反应混合物如下：22.5μL Green Taq Mix，22.5μL ddH₂O，2μL通用16S反向引物（1492R）（GGCTACCTTGTTACGATT），2μL 16S通用正向引物（27F）（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1μL DNA，最高50μL。 PCR扩增在LongGene系列A100 PCR基因扩增仪中进行。进行30个循环：在95℃下预变性5min，在94℃变性1min，在50℃下退火20sec，在72℃下延伸2min，然后在72℃下10min进行最后的延伸。将反应混合物保持在4℃直至使用。将PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳，电压140V，15min进行检测。将条带清晰明亮的PCR产物送至中国深圳华大基因股份有限公司进行测序分析。BioEdit Sequence Alignment Editor（v 7.0.5）用于从正向和反向引物组装拼接序列。序列分别上传至NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行比较。

6.结果分析

从文昌市会文镇红树林地区海草床生态系统中分离出1株产纤维素酶的海洋土著细菌，菌株产纤维素酶菌株水解能力为2.34±0.04（D/d），具高纤维素酶活。经过分子鉴定NCBI比对结果表明，WCHSL181223M15菌株（HN B15）属于厚壁菌门芽孢杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科高山芽孢杆菌属。

实施例2

1.滤纸酶活的测定

取2216E液体过夜生长的培养物，在4℃、5000rpm、15min离心；取0.5mL上清酶液，加入pH值为4.8、0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lmL中，再加入50±0.5mg滤纸(1cm×6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；加入DNS显色液3mL，放入已沸腾的水中沸水浴10min，流水冷却后在540nm下测吸光度；同时用100℃煮沸10min后失活的酶液做对照，扣除本底；根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算：

X=（W×N×1000）／（T×M）

X：为滤纸酶酶活力，单位U／mL。

W：从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。

N：酶液稀释总倍数。

T：反应时间。

M：样品的体积。

结果分析：菌株WCHSL181223M15的滤纸酶活力为0.053±0.051U／mL。

2.标准商品酶活力与相对定量的测定

由于1mg 商品纤维素酶（来自黑曲霉）含量为2.41U/g，在刚果红平板中D/d值为3.13，试验期间以D/d值做横坐标，纤维素酶含量做纵坐标绘制标准曲线y = 0.7258x2 -1.9762x + 1.4079，R2 = 0.9922（图2），将产纤维素酶细菌的水解能力值代入，可计算出对应的商品酶（来自黑曲霉）纤维素酶含量U/g。

结果分析：菌株WCHSL181223M15对应标准商品纤维素酶活含量为3.13±0.04U/g。

3.遗传稳定性实验

第一天将富集好的WCHSL181223M15菌株在2216E海水琼脂平板上三区划线传代，第二天，挑取琼脂平板上的单个菌落，在新的2216E海水琼脂平板上传代，并且将挑起的单菌落放入2216E液体培养基中培养18h；次日，将富集的菌液取2μL点涂于CMC筛选培养基中培养18h后，用游标卡尺测量菌落直径，然后用刚果红溶液浸染平板30min，1mol/L氯化钠漂洗液充分复染平板10min，测量菌落直径，记录第一代的水解能力。每次传代待平板上长出单个菌落，再挑取单个菌落，在新的2216E海水琼脂平板上传代。紧接着将富集的菌液取2μL点涂于CMC筛选培养基中培养，用刚果红浸染每天重复传至20代，将第1代至第20代菌株培养达到OD₆₀₀=1的保种浓度，补充甘油使其终浓度为15%放置-80℃保存备用。

实验结果如下：

表1 菌株遗传稳定性

从表中可以得知，对WCHSL181223M15进行传代培养，其水解能力稳定在2.23±0.06（D/d）和2.97±0.02（D/d）之间，具有良好的遗传稳定性，可作为生产用菌株。

4.安全性实验

（1）动物活体实验

第一天用高锰酸钾将6个箱子浸泡一天；第二天将6个箱子洗净，然后每个箱子注入新海水3L（盐度25‰的海水）充氧一天；第三天将健康的凡纳滨对虾幼虾平均分到6个箱子里，每箱放入10尾，3组一个平行，暂养一天，暂养期间每日投喂时间分别为07:30、11:30、17:30持续通气，喂食45min后将残饵和粪便捞出。正式进行实验时，确保3个实验组均添加100mL且菌体浓度为10⁷cfu/mL，其余3组对照组添加100mL的2216E液体作为对照。试验期间保持水温恒定，持续充氧，试验期间不换水，持续7天，每天观察并记录其死亡数。

实验结果：经过7天的安全性检测实验，M15与空白对照组均无对虾死亡，表明菌株在对虾养殖过程中为安全菌株（图3）。

（2）菌株对抗生素的安全性检测

根据平板扩散法使用2216E琼脂培养基进行抗生素敏感性试验。首先从-20℃冰箱里取出药敏纸片，放常温后，在灭过菌的超净工作台里打开。用无菌棉签蘸取18小时培养的菌株培养液，在2216E琼脂平板上，每旋转平板90°就涂抹一次，然后沿着平板边缘再涂抹一周，室温等待干燥5min，最后用灭过菌的镊子，把抗生素药敏纸片轻放在平板上进行测试，倒置培养。在30℃恒温培养箱培育19小时后，用游标卡尺测量平板周围的生长抑菌区。根据CLSI《抗菌药物敏感性试验标准》2013版判断抗菌药物敏感性，结果敏感记为S（Susceptible），中介敏感记为I（Intermediary）和耐药记为R（Resistant），本次实验选择6类20种抗生素用于抗生素敏感试验测试，一式三份。

实验结果如下：

表2 抗生素敏感试验结果

由表2可知，菌株WCHSL181223M15对大部分水产养殖常用抗生素如四环素类、氟喹诺酮类等敏感，即耐药性低，为安全性菌株。

5.pH耐受性实验

首先配制pH=4-10的培养基，在配制基础的2216E海水培养基下，pH=4-6使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节，pH=7-8使用Tris-HCl缓冲液调节，pH=9-10使用甘氨酸-NaOH缓冲液调节。利用生长曲线仪，每个pH梯度做3个平行，每个孔里添加200μL的培养基和1%菌液混合液，设置温度为30℃，时间为：48h，测频为每5个小时测一次OD₆₀₀，振幅为Medium。

实验结果：由图4可知，时菌株WCHSL181223M15可在pH=5-10生长，在pH=6-9时生长良好，具备耐酸碱性，且pH=7-8为凡纳滨对虾养殖水体常见pH，表明菌株M15适用于对虾养殖水体。

6.盐度耐受性实验

首先配制盐度为0‰-40‰的培养基，在配制基础的2216E海水培养基下，使用氯化钠调节盐度。利用生长曲线仪，每个pH梯度做3个平行，每个孔里添加200μL的培养基和1%菌液混合液，设置温度为30℃，时间为：48h，测频为每5个小时测一次OD₆₀₀，振幅为Medium。

实验结果：由图5可知菌株WCHSL181223M15，在盐度为0‰-40‰时均可生长，具有广盐性。

7.甘蔗渣腐解率实验

实验方法：将250 μL WCHSL181223M15菌株加入到5mL甘蔗渣液体培养基（甘蔗渣4g、MgSO₄ 0.24g、CaCl₂ 0.011g、Na₂HPO₄ 6.778g、KH₂PO₄ 3.00g、NaCl 0.50g、NH₄Cl 1.00g、1L、pH 7.0，121℃ 20min）中，在30℃、180rpm下振荡培养，以未加菌液处理为对照，即NC+甘蔗渣和WCHSL181223M15菌株+甘蔗渣，每组重复3次。时间15天，取待测样品置于100 mL碘瓶中，加入70 mL中性洗涤剂，之后放入已沸的高压锅，100℃保温40 min，115-121℃保温20min，取出用3号30 mL沙芯坩埚过滤至pH 6.5- 7.0，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，将残渣置烘干至衡重Wo。

注：以上为待测样品为1g时的试剂用量，测定时可按实际质量重新折算。

甘蔗渣腐解率(%)=(原甘蔗渣质量(g)-烘干甘蔗渣质量(g)/原甘蔗渣质量(g))×100%

实验结果如下：

表3 甘蔗渣腐解率

由上表可知菌株WCHSL181223M15的甘蔗渣腐解率为50. 48%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种产纤维素酶的海洋细菌，其特征在于，该海洋细菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.），其保藏编号为CCTCC NO：M 20191040。

2.一种天然纤维素的降解方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述海洋细菌接种于2216E液体培养基进行培养，得到培养上清液；将所得培养上清液与天然纤维素混合，酶解。

3.根据权利要求2所述的降解方法，其特征在于，所述酶解的pH值为4.6~5.0，酶解的温度为48~52℃，酶解的时间为0.5~2h。

4.根据权利要求2所述的降解方法，其特征在于，所述天然纤维素为甘蔗渣粉，所述甘蔗渣粉为100~200目、碱液处理后的甘蔗渣粉。

5.一种天然纤维素的降解方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述海洋细菌接种于含有天然纤维素的液体培养基振荡培养。

6.根据权利要求5所述的降解方法，其特征在于，所述振荡培养的温度为30℃，振荡培养的转速为180rpm，振荡培养的时间为10~20天。

7.一种产纤维素酶的海洋微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述海洋细菌。

8.一种海洋水产的养殖方法，其特征在于，以天然纤维素作为人工碳源，在养殖水体中加入权利要求1所述海洋细菌或权利要求7所述海洋微生物制剂。

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