CN111172058B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株降解含氮化合物能力强的解淀粉芽孢杆菌B4；经解淀粉芽孢杆菌B4处理20h，氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的降解率就高达92.32％；经解淀粉芽孢杆菌B4处理20h，反硝化培养基(DM)中亚硝酸盐氮的降解率就高达100％。本发明通过将解淀粉芽孢杆菌B4进行高密度发酵，制备得到了主要成分为富含芽孢的解淀粉芽孢杆菌B4的水体净化剂；此水体净化剂净化水体的能力强、可适应不同氨氮浓度的水体环境且可提高水生动物养殖的成活率；经此水体净化剂处理24h，初始氨氮浓度分别为1、10、20mg/L的水体中的氨氮就几乎被完全去除。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着世界市场对水产品的需求量日益增大，水产养殖业也趋于集约化、密集化。这种集约化、密集化的养殖方式大大增加了水产养殖业的产出量，但是，由于在养殖中后期，养殖水体中的饵料残余、生物代谢物以及动物尸体等成分不能得到完全的分解，导致养殖水体中氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的浓度高出正常范围，因此，集约化、密集化的养殖方式常伴随着严重的环境污染，这大大限制了水产养殖的集约化、密集化。并且，研究表明，浓度过高的氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物会给鱼虾类的生存带来压力，导致其生长缓慢，幼体成活率低，这也成为了限制水产集约化、密集化养殖的重要因素之一。
目前，水产养殖户常使用由光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、芽孢杆菌和乳酸菌等可降解氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的微生物以单一或复配的形式组成的微生物水体净化剂来消除养殖水体中的含氮化合物，但是，现有的微生物水体净化剂均存在明显的缺陷。
例如，公开号为CN104560811A的专利申请文本中公开了一种由纳豆芽孢杆菌、乳酸芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌这几种微生物复配而得的微生物水体净化剂；公开号为CN102517237A的专利申请文本中公开了一种由枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、丁酸羧状芽孢杆菌和酵母菌这几种微生物复配而得的微生物水体净化剂；公开号为CN109650556A的专利申请文本中公开了一种由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌这几种微生物复配而得的微生物水体净化剂。上述微生物水体净化剂均可很好的降低养殖水体氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的含量，但是，上述微生物水体净化剂需由多种微生物复配，制备过程较为繁琐、复杂。
公开号为CN108913680A的专利申请文本中公开了一种由沼泽红假单胞菌PSB20这一种微生物单一组成的微生物水体净化剂；公开号为CN109762748A的专利申请文本中公开了一种由杰丁毕赤酵母MA1这一种微生物单一组成的微生物水体净化剂。上述微生物水体净化剂成分单一，制备过程相对简单，但是，上述微生物水体净化剂在养殖池塘中降解氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的速率比较较缓慢，常需连续投入一个月，才可获得较为理想的净化效果。
上述缺陷可能是由于现有的光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、芽孢杆菌和乳酸菌等微生物快速降解氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的能力不足造成的，因此，急需找到降解氨氮和亚硝酸盐氮等含氮化合物的能力更强、效率更高的微生物以解决现有的微生物水体净化剂存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株降解含氮化合物能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019853，保藏日期为2019年10月25日。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4来源于无锡地区的池塘土壤样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在EZBioCloud中进行核酸序列比对，结果显示菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4在LB固体培养基上的菌落初期呈乳白色，后期变为黄色，不透明，表面暗且较粗糙，边缘不规则呈树枝状像四周伸展，菌落中心粘液呈圈状。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4适宜温度为30～40℃，低于30℃时生长变慢。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4适宜pH为7～9。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4可在NaCl浓度为0～30‰(v/v)的条件下正常生长。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4摇瓶发酵可产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶。
本发明还提供了一种水体净化剂，所述水体净化剂含有上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4。
在本发明的一种实施方式中，所述水体净化剂的制备方法为先将上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4接种至种子培养基进行培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，最后将发酵液进行干燥，得到水体净化剂；
或者，所述水体净化剂的制备方法为先将上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4接种至种子培养基进行培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，再将发酵液与食品或药学上可接受的载体混合，得到混合物，最后将混合物进行干燥，得到水体净化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液中，上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4的活菌含量为0.5×108～1×109CFU/mL；所述种子液在发酵培养基中的添加量占发酵培养基总体积的5～15％。
在本发明的一种实施方式中，所述水体净化剂中，上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4的活菌含量不低于2×1010CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述食品或药学上可接受的载体为玉米芯粉、秸秆粉、稻壳粉、壳聚糖、沸石粉和/或麦饭石。
在本发明的一种实施方式中，所述食品或药学上可接受的载体为玉米芯粉。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米芯粉的粒径为100～300目。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含葡萄糖12～20g/L、胰蛋白胨10～20g/L、酵母浸膏10～20g/L、氯化钠1～3g/L、氯化锰0.03～0.1g/L、磷酸二氢钾0.8～1.5g/L以及氯化钙0.03～0.1g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为28～38℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖12～20g/L、胰蛋白胨10～20g/L、酵母浸膏10～20g/L、氯化钠1～3g/L、氯化锰0.03～0.1g/L、磷酸二氢钾0.8～1.5g/L以及氯化钙0.03～0.1g/L
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～38℃、通气量为0.5～1.5vvm、转速为200～800rpm、pH为6.0～7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程中，待发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后，在发酵培养基中以5～20g/L·h的速度补加葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的时间为20～28h。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为45～55℃恒温干燥12～48h。
本发明还提供了一种养殖水生动物的方法，所述方法为将上述水体净化剂投到水生动物养殖水体中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述水体净化剂和辅助剂投到水生动物养殖水体；所述辅助剂为碳源。
在本发明的一种实施方式中，所述水体净化剂在水生动物养殖水体中的投入量为0.001～0.01g/L。
在本发明的一种实施方式中，投入碳源后，所述水生动物养殖水体的碳氮比为5:1～10:1。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源为糖类。
在本发明的一种实施方式中，所述糖类为葡萄糖、糖蜜、蔗糖和/或玉米淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所述水生动物为青虾。
本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或上述水体净化剂在降解含氮化合物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述含氮化合物为氨基氮和/或亚硝态氮。
本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或上述水体净化剂在净化水体中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述净化水体是指降低水体中氨氮含量。
本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、上述水体净化剂或上述养殖水生动物的方法在水生动物养殖中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述水生动物为青虾。
[有益效果]
(1)本发明提供了一株降解含氮化合物能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4；经解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4处理20h，氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的降解率就高达92.32％；经解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4处理20h，反硝化培养基(DM)中亚硝酸盐氮的降解率就高达100％。
(2)本发明通过将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4进行高密度发酵，制备得到了主要成分为富含芽孢的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的水体净化剂；此水体净化剂净化水体的能力强、可适应不同氨氮浓度的水体环境且可提高水生动物养殖的成活率；经此水体净化剂处理24h，初始氨氮浓度分别为1、10、20mg/L的水体中的氨氮就几乎被完全去除；将青虾养殖于含有此水体净化剂的模拟高氨氮浓度(20mg/L)养殖水体中，养殖6d后，青虾的成活率高达59.33±0.02％，较将青虾养殖于不含此水体净化剂的养殖水体中时提高了16％。
生物材料保藏
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4已于2019年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019853，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：经解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4处理后，氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的降解率。
图2：经解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4处理后，反硝化培养基(DM)中氨氮和亚硝酸盐氮的降解率。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的玉米芯粉购自阿里巴巴；下述实施例中涉及的青虾购自无锡施瑞水产科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L。
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。
基础分离培养基：葡萄糖3.75g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、硫酸镁七水0.05g/L、硫酸亚铁七水0.01g/L、硫酸镁四水0.01g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，PH＝7。
低氨氮去除测试培养基：葡萄糖5g/L、硫酸铵0.25g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁七水0.05g/L、硫酸铁七水0.01g/L、硫酸镁四水0.01g/L、氯化钠5g/L，PH＝7。
氨氮去除测试培养基(NM)：葡萄糖3.75g/L、硫酸铵0.5g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁七水0.05g/L、硫酸亚铁七水0.01g/L、硫酸镁四水0.01g/L、氯化钠5g/L，PH＝7。
反硝化培养基(DM)：葡萄糖3.75g/L、亚硝酸钠0.49g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁七水0.05g/L、硫酸亚铁七水0.01g/L、硫酸镁四水0.01g/L、氯化钠5g/L，PH＝7。
种子培养基：葡萄糖12g/L、蛋白胨15g/L、酵母浸膏15g/L、氯化钠3g/L、氯化锰0.03g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、氯化钙0.03g/L。
发酵培养基：葡萄糖12g/L、蛋白胨15g/L、酵母浸膏15g/L、氯化钠3g/L、氯化锰0.03g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、氯化钙0.03g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
氨氮浓度以及氨氮去除/降解率的测定：采用苯酚次氯酸盐比色法(具体可见参考文献：水产科学，2005，24(10):22-24.3)；
氨氮去除/降解率的计算公式如下：
氨氮去除/降解率＝(C1-C0)/C0×100％；
式中，C0为初始氨氮浓度，C1为剩余氨氮浓度。
亚硝酸态氮以及亚硝酸态氮降解率的测定：采用N-乙二胺分光光度法，先将样品稀释到标准曲线最大浓度下。再取待测样2mL，加2mLA液(对氨基苯磺酸盐酸溶液)以及2mLB液(N-萘-乙二盐酸盐溶液)混合均匀后室温静置20min后，用酶标仪测量其A538最大吸收光值；
亚硝酸态氮浓度的计算公式如下：
亚硝酸盐氮浓度＝C×F；
式中，C为稀释测定的亚硝酸盐氮浓度，F为稀释倍数；
亚硝酸态氮降解率的计算公式如下：
亚硝酸态氮降解率＝(C1-C0)/C0×100％；
式中，C0为初始亚硝酸态氮浓度，C1为剩余亚硝酸态氮浓度。
淀粉酶的测定：取1mL发酵液、3mL去离子水以及1mL浓度为2％的可溶性淀粉水溶液混合均匀，60℃保温5min后，加入1mLpH为6.0的柠檬酸缓冲液，60℃保温30min，加入1.5mL的DNS试剂，沸水水浴5min，冷却后定容到20mL，在520nm波长下比色，测定葡萄糖含量；
酶活的定义为：在60℃、pH 6.0条件下，30min水解产生1mg葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(1U)；
酶活的计算公式如下：
酶活力(U)＝C×D×V；
式中，C为葡萄糖含量(mg)，D为酶液稀释倍数，V为酶液体积(mL)。
蛋白酶酶活测定：取1mL发酵液，加0.5％酪素2mL，于37℃水浴中反应15min，然后加入三氯乙酸3mL，离心除去沉淀；取清液1mL，加入浓度为0.55M的碳酸钠5mL，再加入福林试剂1mL，于37℃水浴显色15min，在680nm波长下比色，测光密度，计算酪氨酸标含量；
酶活的定义为：在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位(1U)；
酶活的计算公式如下：
酶活力(U)＝A/15×F；
式中，A为酪氨算含量(μg)，F为酶液最终稀释倍数，15为反应时间(min)。
脂肪酶测方法：取浓度为0.025M的磷酸缓冲液(pH7.5)5mL，聚乙醇橄榄油乳化液4mL，浓度为95％的乙醇15mL，40℃水浴预热5～10分钟后，加入1mL发酵液，40℃水浴反应15min，加入15mL的浓度为95％的乙醇终止反应，然后加入3滴酚酞指示剂，用浓度为0.05M的氢氧化钠溶液进行滴定；
酶活的定义为：在40℃下每分钟水解脂肪产生1μmol脂肪酸所需的酶量为一个酶活力单位(1U)；
酶活的计算公式如下：
酶活力(U)＝[(A-B)/N]/t；
式中，A为样品耗碱液数(mL)，B为对照组耗碱液数(mL)，N为每毫升碱液微克分子数，t为作用时间(min)。
实施例1：菌株的筛选、鉴定、培养和观察
1、筛选
将1～5g来源于无锡地区的池塘土壤样本加入10～20mL无菌水中，用玻璃珠打碎混匀，得到混合液；将混合液按3％(v/v)的接种量接入基础分离培养基中，37℃、220rpm进行富集驯化培养2d；2d后，将培养得到的菌液于80℃水浴锅中加热20min，杀死不能形成芽孢的杂菌，然后将菌液稀释102～104倍后在基础分离培养基上涂布，37℃培养箱中培养3d；3d后，挑取基础分离培养基上生长较快、菌落较大的单菌落在LB固体培养基上划线进行分离纯化，得到单菌落；将单菌落进行革兰氏染色(革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》作者：诸葛健著)，挑取革兰氏染色阳性菌株的单菌落接种于LB固体培养基，28～30℃培养20～36h进行活化，得到活化菌株A；挑取活化菌株A的单菌落接入种子培养基，110～220rpm、28～30℃培养20～36h，得到种子液A；将种子液A按4％(v/v)的接种量接入低氨氮去除测试培养基，110～220rpm、28～30℃培养20～36h，得到培养液A；吸取1mL培养液A于12000r/min离心1min，得到上清液；以未接种种子液的低氨氮去除测试培养基为对照，对上清液中的氨氮含量进行测定，得到可完全去除低氨氮去除测试培养基中氨氮的6株菌，6株菌分别命名为为菌株B1～B6；挑取菌株B1～B6的单菌落接种于LB固体培养基中，28～30℃培养20～36h进行活化，得到活化菌株B；挑取活化菌株B的单菌落接入种子培养基，110～220rpm、28～30℃培养20～36h，得到种子液B；将种子液B按4％(v/v)的接种量接入氨氮去除测试培养基(NM)，110～220rpm、28～30℃摇床培养，每5h取培养液B，离心，测定上清液中的氨氮含量，并根据测定结果计算6株菌去除氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的去除率，得到氨氮去除率最高的菌株(检测结果见表1)；根据表1可知，菌株B4去除氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的去除率最高。
表1不同菌株去除氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的去除率
Figure BDA0002325596860000081
2、鉴定
提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在在EZBioCloud中进行核酸序列比对，结果显示菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4。
3、培养和观察
挑取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的单菌落接入LB固体培养基上，30℃培养24h，24h后，观察解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4在LB固体培养基上的菌落特征。
观察可得，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4在LB固体培养基上的菌落初期呈乳白色，后期变为黄色，不透明，表面暗且较粗糙，边缘不规则呈树枝状像四周伸展，菌落中心粘液呈圈状。
根据教科书《常见细菌系统鉴定手册》作者：东秀珠著，考察解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的生理生化特征(观察结果见表2)。
由表2可知，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4硝酸盐反应阳性、卵磷脂酶反应阴性、淀粉水解阳性、V-P反应阳性、D-果糖产酸、可厌氧生长，具有解淀粉芽孢杆菌的典型特征。
挑取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的单菌落接入LB液体培养基中，分别于200rpm、10～45℃的条件下培养24h，24h后，通过紫外分光光度计检测培养液中的OD600值，发现其适宜温度为30～40℃且低于30℃时生长变慢。
挑取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的单菌落分别接入pH为3～11的LB液体培养基中，于200rpm、30℃的条件下培养24h，24h后，通过紫外分光光度计检测培养液中的OD600值，发现其适宜pH为7～9。
挑取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的单菌落分别接入NaCl浓度为0～30‰(v/v)的LB液体培养基中，于200rpm、30℃的条件下培养24h，24h后，通过紫外分光光度计检测培养液中的OD600值，发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4可在NaCl浓度为0～30‰(v/v)的条件下正常生长。
挑取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的单菌落接入LB液体培养基中，30℃的条件下培养24h进行活化，得到活化菌株；挑取活化菌株的单菌落接入种子培养基，200rpm、30℃的条件下培养24h，得到种子液；将种子液4％(v/v)的接种量接入发酵培养基，200rpm、30℃的条件下培养24h，得到发酵液；检测发酵液中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的酶活，发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4可产淀粉酶(24.94U/mL)、蛋白酶(25.17U/mL)、脂肪酶(9.05U/mL)。
表2解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的生理生化特征
Figure BDA0002325596860000091
Figure BDA0002325596860000101
实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4降解不同含氮化合物的能力
将实施例1获得的种子液B按4％(v/v)的接种量分别接入氨氮去除测试培养基(NM)和反硝化培养基(DM)中，30℃、110rpm摇床培养，得到培养液；每4h吸取1mL培养液于12000r/min离心1min，得到上清液。
检测上清液中氨氮和亚硝酸盐氮的含量，并根据检测结果计算经解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4处理后，氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的降解率以及反硝化培养基(DM)中氨氮和亚硝酸盐氮的降解率(计算结果见图1-2)。
由图1-2可知，经解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4处理20h，氨氮去除测试培养基(NM)中氨氮的降解率就高达92.32％；经解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4处理20h，反硝化培养基(DM)中亚硝酸盐氮的降解率就高达100％。
实施例3：水体净化剂的制备
将实施例1获得的种子液B按10％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，于温度为37℃、通气量为1.0vvm、转速为400rpm、pH为6.0～7.5的条件下进行发酵，发酵过程中，待发酵培养基中的葡萄糖消耗完毕后(即发酵第5h时)，在发酵培养基中以10g/L·h的速度补加葡萄糖，待发酵培养基中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的活菌含量不再变化后停止补料，停止补料后，继续发酵24h，得到发酵液A；取200mL发酵液A与100g玉米芯粉(200目)混合，搅拌均匀，50℃下干燥24h，得到水体净化剂A。经平板涂布计数，发酵液A中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的芽孢的浓度为1.12×1010CFU/mL，水体净化剂A中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的的活菌含量为2.34×1010CFU/g。
将实施例1获得的种子液B按10％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，于温度为37℃、通气量为1.0vvm、转速为400rpm、pH为6.0～7.5的条件下发酵24h，24h后，进行静置培养12h，得到发酵液B；取200mL发酵液B与100g玉米芯粉(200目)混合，搅拌均匀，50℃下干燥36h，得到水体净化剂B。经平板涂布计数，发酵液B中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B4的芽孢的浓度为2.06×109CFU/mL，水体净化剂B中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的的活菌含量为0.5×1010CFU/g。
实施例4：水体净化剂在净化水体中的应用
分别在1L自来水中加入0.004、0.04、0.08g的硫酸铵使自来水的初始氨氮浓度分别为1、10、20mg/L，并且，分别在初始氨氮浓度为1、10、20mg/L的自来水中加入0.025、0.25、0.5g的葡萄糖使自来水的初始碳氮比为10:1，获得需净化水体A、B、C；分别在需净化水体A、B、C中加入实施例3获得的水体净化剂A，30℃、110rpm培养48h，得到培养液A1、B1、C1；
分别在1L自来水中加入0.004、0.04、0.08g的硫酸铵使自来水的初始氨氮浓度分别为1、10、20mg/L，并且，分别在初始氨氮浓度为1、10、20mg/L的自来水中加入0.025、0.25、0.5g的葡萄糖使自来水的初始碳氮比为10:1，获得需净化水体A、B、C；分别在需净化水体A、B、C中加入实施例3获得的水体净化剂B，30℃、110rpm培养48h，得到培养液A2、B2、C2；
需净化水体中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的初始活菌浓度均为1×105CFU/mL，每组实验做三个平行。
检测培养液A1、B1、C1、A2、B2、C2中的氨氮含量(即剩余氨氮浓度)，检测结果见表3。
由表3可知，无论是在低浓度的初始氨氮浓度为1mg/L的水体，还是高浓度的初始氨氮浓度分别为10、20mg/L氨氮的水体，经水体净化剂A处理24h后，水体中的氨氮均几乎被完全去除；而水体净化剂B的效果远差于水体净化剂A。可见，水体净化剂A净化水体的能力强且可适应各氨氮浓度的水体环境。
表3不同水体净化剂对不同初始氨氮浓度水体中的剩余氨氮浓度的影响
Figure BDA0002325596860000111
实施例5：水体净化剂在养殖青虾中的应用
在自来水(60L，装于玻璃缸)中加入硫酸铵、葡萄糖和磷酸盐，使得自来水中的氨氮浓度为20mg/L、葡萄糖浓度为125mg/L、磷离子浓度为为0.4mg/L；将自来水分为实验组和对照组，实验组和对照组的自来水中分别放入45只健康青虾，每日早晚投喂6g虾饲料进行饲养，24h保持通气，温度为25℃。
饲养青虾的第1d，在实验组的自来水中投加0.3g实施例3获得的水体净化剂A，对照组的自来水中不添加任何物质；饲养青虾过程中，每天定时对实验组和对照组的自来水进行取样并检测水样中的氨氮含量(检测结果见表4)；饲养6d后，检测实验组和对照组的自来水中青虾的成活率(检测结果见表5)；实验组和对照组分别做三个重复，分别为实验组1、实验组2、实验组3、对照组1、对照组2、对照组3。
由表4可知，各对照组的自来水中的氨氮含量变化不大，说明，自来水中的土著微生物没有产生净化水体的作用；各实验组在投入水体净化剂A1d后，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的芽孢开始萌发，1d～2d是氨氮主要去除时期，水体中氨氮含量快速下降，3d后氨氮含量降至最低，平均降解率达88％，4d后由于水体净化剂A中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B4的大量裂解导致自来水中氨氮含量略有回升。
由于4d后自来水中仍存在5～7mg/L的氨氮，第5d，在实验组的自来水中继续投加0.3g实施例3获得的水体净化剂A，同时，在实验组的自来水中投加葡萄糖使自来水的碳氮比为10:1。由表4可知，继续投加水体净化剂A 3d后，自来水中氨氮被全部去除，但第9d自来水中氨氮含量略有回升。
第10d，在实验组的自来水中继续投加0.3g实施例3获得的水体净化剂A，同时，在实验组的自来水中投加葡萄糖使自来水的碳氮比为10:1。由表4可知，继续投加水体净化剂A4d后，水体中的氨氮含量稳定在0.2mg/L以下，处于比较理想的养殖水体状态。
由表5可知，实验组的青虾死亡率为远低于对照组，说明，在较恶劣的水体条件下，水体净化剂A的使用对青虾的存活产生了有益作用。
表4水体净化剂A对模拟青虾养殖水体中氨氮含量的影响
Figure BDA0002325596860000121
Figure BDA0002325596860000131
表5水体净化剂A对模拟青虾养殖水体中青虾成活率的影响
Figure BDA0002325596860000132
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
无锡施瑞水产科技有限公司
<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1405
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cttta 1405

Claims (11)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019853，保藏日期为2019年10月25日。
2.一种水体净化剂，其特征在于，所述水体净化剂含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
3.如权利要求2所述的一种水体净化剂，其特征在于，所述水体净化剂的制备方法为先将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)接种至种子培养基进行培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，最后将发酵液进行干燥，得到水体净化剂；
或者，所述水体净化剂的制备方法为先将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)接种至种子培养基进行培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，再将发酵液与食品或药学上可接受的载体混合，得到混合物，最后将混合物进行干燥，得到水体净化剂。
4.如权利要求3所述的一种水体净化剂，其特征在于，所述种子液中，权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的活菌含量为0.5×108～1×109CFU/mL；所述种子液在发酵培养基中的添加量占发酵培养基总体积的5～15％。
5.如权利要求2-4任一所述的一种水体净化剂，其特征在于，所述水体净化剂中，权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的活菌含量不低于2×1010CFU/g。
6.一种养殖水生动物的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2-5任一所述的一种水体净化剂投到水生动物养殖水体中。
7.如权利要求6所述的一种养殖水生动物的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求2-5任一所述的一种水体净化剂和辅助剂投到水生动物养殖水体；所述辅助剂为碳源。
8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或权利要求2-5任一所述的一种水体净化剂在降解含氮化合物中的应用。
9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或权利要求2-5任一所述的一种水体净化剂在净化水体中的应用。
10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或权利要求2-5任一所述的一种水体净化剂在水生动物养殖中的应用。
11.权利要求6或7所述的方法在水生动物养殖中的应用。
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