CN106544309B

CN106544309B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其抗菌蛋白和在对虾保鲜中的应用

Info

Publication number: CN106544309B
Application number: CN201710034665.8A
Authority: CN
Inventors: 黄儒强; 吴佩君; 朱宝君; 汪光华; 杨喆; 王静辉; 马广智; 陈祥茂; 陈珂; 王倩; 高林林
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2037-01-17
Also published as: CN106544309A

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其抗菌蛋白和在对虾保鲜中的应用。解淀粉芽孢杆菌PJ已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号是GDMCC NO:60076。本发明的新菌株及其抗菌蛋白具有抗假单胞菌、藤黄微球菌，希瓦氏菌和不动杆菌等生物活性，该抑菌物质可应用于保健品、食品保鲜和化妆品防腐等领域，是一种具有良好市场潜力的抑菌产品。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其抗菌蛋白和在对虾保鲜中的应用

技术领域

本发明属于生物保鲜领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其抗菌蛋白和在对虾保鲜中的应用。

背景技术

食品保鲜指的是利用物理、化学和生物的手段对食品进行处理，从而尽量减缓其腐败速度，保持其原有新鲜程度的方法。

海产品由于具有高蛋白与高水分的特点，在保存与运输过程中极易腐败变质，因而海产品防腐保鲜技术的更新刻不容缓。海产类食品常用保鲜方法有低温保鲜、气调保鲜、辐照保鲜、化学保鲜和生物保鲜等。

冷藏保鲜分为冷藏、冰温、微冻和冻藏四种保鲜方法；冷藏保鲜可减缓水产内酶催化反应作用，但此冷藏手段货架期短，不利于长途运输，且可影响食品鲜度与风味，阻碍海产品贸易的发展。

气调保鲜是指将食品藏于不同于正常大气组分的调节气体环境中，以抑制或减缓导致食品腐败的生理生化过程或微生物活动；气调保鲜未添加任何防腐剂，具有良好安全性，目前已广泛应用于蔬果肉类及水产品保鲜上。

辐照保鲜是指利用电离辐射产生的射线来照射食品以抑制或杀灭其表面和内部微生物从而延长食品保质期；辐照可以杀灭附着于食品表面的微生物，但辐照会对食品的口感跟风味产生负面影响，甚至降低其营养价值。

化学保鲜是指利用化学试剂抑制细菌生长或酶活性的性质来实现食品保藏目的。目前常用的保鲜剂有苯甲酸盐、山梨酸钾、硝酸盐及亚硝酸盐等；化学合成保鲜剂不仅经济，而且在短期内保鲜效果显著，但长期使用就会导致微生物耐药与化学试剂残留，继而引发食品安全性问题。

生物保鲜是融合多学科发展起来的一种食品保鲜技术，它主要以生物有机体的组分或其代谢产物为来源，利用它们对食品中腐败微生物或酶的抑制作用来实现食品保鲜目的。生物保鲜剂根据来源可分为植物源、动物源、微生物源与酶类生物保鲜剂。微生物源保鲜的作用机理主要是拮抗作用或抗生作用，主要成分为细菌同化作用产生的对病原菌生长繁殖有抑制作用的抗菌物质(拮抗物质)。拮抗物质在很低浓度下即可对病原菌的生长和代谢活动产生毒害作用。

从微生态观点来说，微生物的利用价值不仅取决于微生物的特性，更取决于宿主、环境及微生物三个方面的微生态平衡转化。因此在传统保鲜方法不能满足人们对水产鲜度与安全性要求的情况下，生物保鲜剂以其安全、天然、高效与广谱抗菌的特点在食品医药领域飞速发展，将可逐步代替化学防腐剂在食品保鲜中的应用，但生物保鲜剂由于成本高及对极端条件较敏感的特性不利于推广，因此降低其生产成本，改善生物保鲜剂的特性将利于其进一步推广与发展。

随着人们生活水平的提高，对水产品的消费要求从“数量消费”向“质量消费”转变，人们正在寻找一种无毒无害的生物保鲜方法取代传统的化学保鲜防腐方法，因此，微生物源防腐保鲜剂正成为研究的大热门，具有很大的研究空间以及发展潜力。

南美白对虾原产于南美洲太平洋沿岸海域，为当今世界养殖产量最高的三大对虾品种之一，亦为我国最重要的出口水产品之一。南美白对虾蛋白含量高，脂肪含量低，含有极低的碳水化合物与胆固醇含量，丰富的钙、镁、磷、钾、铁及维生素等成分，是理想的膳食食材。由于该对虾具有高蛋白高水分的特点，捕捞后容易在微生物和酶的作用下腐败变质，加上物流行业的局限性，对虾的腐败率甚高，影响着海产业的发展。

鲜活对虾的肌肉、体液及内脏均是无菌的，肠道的细菌也处于相互制约的平衡状态，但体表直接与水体接触的部分，附着多种微生物，它们在虾死亡后逐渐向内侵袭，分解营养物质，最终导致虾体腐败变质。筛选对人类无害而对对虾常见腐败菌有拮抗作用的微生物，可促进海产行业与物流市场的发展。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌PJ，该菌株是从南美白对虾肠道中筛选得到的。

本发明的另一目的在于提供一种抗菌蛋白的制备方法，该蛋白是从菌株PJ的发酵液中分离得到的。

本发明的再一目的在于提供由上述方法制得的抗菌蛋白，该蛋白对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)等几种对虾腐败致病菌有抑制作用。

本发明的第四个目的在于提供上述的抗菌蛋白在对虾保鲜中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株解淀粉芽孢杆菌PJ，已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号是GDMCC NO:60076。

解淀粉芽孢杆菌PJ由以下步骤筛选分离得到：

1、鲜活南美白对虾猝死，流水冲洗，取虾肠；称取1g虾肠，剪碎，浸泡于9ml生理盐水中，制成菌液悬浮液原液；

2、梯度稀释菌液悬浮液原液，选择0.5麦氏比浊度梯度的菌液浓度与NA培养基混合均匀，冷却后，于30℃培养箱培养24h；所述NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g，水1000ml，pH值7.0-7.2；

3、挑取表面粗糙有皱褶，白色不透明，形状为圆形或者不规则形状等符合解淀粉芽孢杆菌菌落特征的菌株，进行革兰氏染色，通过显微镜观察，挑取出杆状阳性菌株；

4、把杆状阳性菌株点种于PDA培养基平板中，待菌落长出后，往平板中滴加碘液，观察菌落周围是否有不变色透明圈，若有，即可初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌；所述PDA培养基配方是：马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂15g；

5、将初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌的菌株接种于100mL的NA液态培养基，30℃摇床振荡培养18h，取1mL菌液提取DNA后，进行16s rDNA、gyrA基因和rpoA基因的PCR特异性扩增，扩增产物进行测序，并在NCBI上与已知的解淀粉芽孢杆菌菌株进行序列比对；

6、利用VITEK 2全自动微生物分析系统鉴定目标菌，结合细菌外观状态、测序结果和生理生化测定结果确定为解淀粉芽孢杆菌；将所筛选到的新菌株命名为解淀粉芽孢杆菌PJ。

一种抗菌蛋白的制备方法，包括以下步骤：

解淀粉芽孢杆菌PJ活化后接种于NA液体培养基中，25-37℃、150-200r/min下摇菌培养8h，制备成种子发酵液；取种子发酵液接种于基础发酵培养基中，接种量3-6％(V/V)，于28-37℃、150-200r/min下摇菌12-18h；发酵完毕后，将得到的发酵液于10000r/min离心20min，收集上清液；往上清液中加入硫酸铵至40-100％的饱和度，静置过夜，然后离心收集沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，制得抗菌蛋白粉末；

所述的往上清液中加入硫酸铵，优选加入硫酸铵至40-80％的饱和度，进一步优选加入硫酸铵至40-60％的饱和度，特别优选加入硫酸铵至60％的饱和度；

所述基础发酵培养基的配方是：葡萄糖5g、酵母浸膏7.5g、蛋白胨7.5g、硫酸铵5g、氯化钠5g、水1000ml，pH值为7.0；

所述的真空冷冻干燥，真空度为180Pa，温度为-80℃。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

上述方法制得的抗菌蛋白粉末呈米白色，气味平淡，水溶性好。

解淀粉芽孢杆菌PJ用于对虾保鲜，是将解淀粉芽孢杆菌PJ菌粉与石粉按质量比1.0:(0.6-1.0)混合，添加到对虾基础饲料中用于对虾饲喂，基础饲料中解淀粉芽孢杆菌浓度为10^7-10⁹cfu/g；

所述基础饲料的配方如下：鱼粉30％，花生粕25％，全麦粉10％，虾糠6％，棉籽粕5％，麦饭石4％，混合油4％，预混料16％；所述的百分比是各原料占基础饲料总质量的百分比。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的新菌株及其抗菌蛋白具有抗假单胞菌、藤黄微球菌，希瓦氏菌和不动杆菌等生物活性，该抑菌物质可应用于保健品、食品保鲜和化妆品防腐等领域，是一种具有良好市场潜力的抑菌产品。

(2)本发明菌株的发酵液制备中采用真空浓缩的方法对发酵液进行浓缩，避免了常压浓缩条件下，高温对抑菌成分活性的影响。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌PJ在NA培养基上的菌落形态。

图2是解淀粉芽孢杆菌PJ的革兰氏染色结果图。

图3是解淀粉芽孢杆菌PJ在PDA培养基上的菌落形态。

图4是解淀粉芽孢杆菌PJ的扩增产物电泳图；其中，M-Marker，1-rpoA基因，2-gyrA基因。

图5是解淀粉芽孢杆菌PJ发酵液上清液及浓缩液的抑菌效果图；其中，A-蜡样芽胞杆菌，B-藤黄微球菌，C-嗜水气单胞菌，D-腐败希瓦氏菌，1表示浓缩液形成的抑菌圈，其他的则是发酵液上清液形成的抑菌圈。

图6是解淀粉芽孢杆菌PJ发酵液上清液经硫酸铵梯度沉淀后所得蛋白的抑菌效果图；其中，A-蜡样芽胞杆菌，B-藤黄微球菌，C-嗜水气单胞菌，D-哥伦比亚肠球菌，1表示40％硫酸铵沉淀蛋白，2表示60％硫酸铵沉淀蛋白，3表示80％硫酸铵沉淀蛋白，4表示100％硫酸铵沉淀蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌PJ的筛选和鉴定，包括以下步骤：

如图1所示，该菌株在NA培养基上菌落扁平，圆形，边缘整齐，稍隆起，表面米白色，光滑，有粘性，不透明；

如图2所示，该菌株革兰氏染色阳性，短杆状，产芽孢，中生至次端生；

4、把杆状阳性菌株点种于PDA培养基平板中，待菌落长出后(培养24h后)，往平板中滴加碘液，观察菌落周围是否有不变色透明圈，若有，即可初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌；所述PDA培养基配方是：马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂15g；

往平板上滴加碘液后如图3所示，菌落周围出现透明圈；

5、将初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌的菌株接种于100mL的NA液态培养基，30℃摇床振荡培养18h，取1mL菌液提取DNA后，进行16s rDNA、gyrA基因和rpoA基因的PCR特异性扩增，扩增产物进行电泳和测序，并在NCBI上和已知的解淀粉芽孢杆菌菌株进行序列比对；

rpoA基因的引物是：

上游引物：CGTAGAGCCACTTGAGCG(SEQ.ID.NO.1)

下游引物：CTGCCGTTACAGTTCCTT(SEQ.ID.NO.2)

gyrA基因的引物是：

上游引物：AAATCTGCCCGTATCGTCG(SEQ.ID.NO.3)

下游引物：GCGTCACGGCGR(A/G)ATCTCAA(SEQ.ID.NO.4)

电泳结果见图4。rpoA基因是枯草芽孢杆菌特有的，而gyrA基因是解淀粉芽孢杆菌特有的。从电泳结果来看，目标菌株DNA没有扩增出rpoA基因(泳道1)，说明目标菌株不是枯草芽孢杆菌；目标菌株DNA扩增除了gyrA基因条带(泳道2)，说明目标菌株是解淀粉芽孢杆菌。

另外，目标菌株的16s rDNA序列和gyrA序列分别如SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6所示。

6、利用VITEK 2全自动微生物分析系统鉴定目标菌，结合细菌外观状态、测序结果和生理生化测定结果(表1)确定为解淀粉芽孢杆菌；VITEK 2全自动微生物分析系统鉴定(Bios Merieumx)通过分析比对得出结果：目标菌株与其他解淀粉芽孢杆菌菌株的相似性为91％以上，结果见表2。

将所筛选到的新菌株命名为解淀粉芽孢杆菌PJ。

表1解淀粉芽孢杆菌生理生化测定结果

表2目标菌株同源性比较

实施例2

从解淀粉芽孢杆菌PJ的发酵液中分离制备抗菌蛋白，包括以下步骤：

解淀粉芽孢杆菌PJ活化后挑取1环接种于100mL NA液体培养基中，25-37℃、150-200r/min下摇菌培养8h，制备成种子发酵液；取种子液接种于pH值为6.5-7.2的基础发酵培养基中，接种量3-6％(V/V)，于28-37℃，150-200r/min中摇菌12-18h。发酵完毕后，将发酵液10000r/min离心20min，得到上清液，将上清液(即含有抗菌蛋白)浓缩至10ml为上清液浓缩液。往20ml上清液中分别加入硫酸铵至40-100％的饱和度，静置过夜，然后离心收集沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，制得抗菌蛋白粉末；

所述基础发酵培养基的配方：葡萄糖5g、酵母浸膏7.5g、蛋白胨7.5g、硫酸铵5g、氯化钠5g、水1000ml，pH值为7.0左右。

把南美白对虾的致病菌(蜡样芽胞杆菌、藤黄微球菌、嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌和哥伦比亚肠球菌)菌悬液涂布于NA平板中，用打孔器打孔，在孔内注入30-100μl发酵上清液或上清液浓缩液，并于30℃培养箱培养16-24小时，观察是否有抑菌圈，若有抑菌圈，测量抑菌圈的直径(表3)。

抑菌实验结果见图5。可以看出，含有抗菌蛋白的解淀粉芽孢杆菌PJ的发酵上清液及上清液浓缩液对蜡样芽胞杆菌、藤黄微球菌、嗜水气单胞菌和腐败希瓦氏菌都有一定的抑制效果，其中上清液浓缩液的抑菌效果优于上清液。

20ml上清液加入硫酸铵后静置过夜，离心收集沉淀，加入1ml 0.02M的PBS缓冲液，混匀后取30-100μl注入带有南美白对虾的致病菌(蜡样芽胞杆菌、藤黄微球菌、嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌和哥伦比亚肠球菌)菌悬液涂布的NA平板孔内，于30℃培养箱培养16-24小时，观察是否有抑菌圈，若有抑菌圈，测量抑菌圈的直径(表3)。

由图6可以看出，饱和度40％、60％、80％、100％的硫酸铵沉淀后所得的蛋白对蜡样芽胞杆菌、藤黄微球菌、嗜水气单胞菌和哥伦比亚肠球菌都有不同程度的抑制作用，但60％硫酸铵沉淀的活性蛋白效果最佳。

表3抑菌圈直径(mm)

由表3可知，解淀粉芽孢杆菌PJ的发酵液上清液、浓缩液和活性蛋白对南美白对虾腐败菌均有不同程度的抑制作用。其中，浓缩液所得抑菌圈大于上清液；不同饱和度硫酸铵沉淀的蛋白中，60％饱和度所得的沉淀蛋白抑菌圈最大，抑菌效果最好。

可以看出，本发明的解淀粉芽孢杆菌PJ繁殖速度快，对气单胞菌、肠球菌和希瓦氏菌等腐败菌引起的对虾腐败变质有抑制作用；该菌株培养条件简单，容易保存，易于提取分离蛋白，适于工业化生产，具有良好的开发前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其抗菌蛋白和在对虾保鲜中的应用

<130> 20170117

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

cgtagagcca cttgagcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

ctgccgttac agttcctt 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 3

aaatctgccc gtatcgtcg 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

gcgtcacggc gragatctca a 21

<210> 5

<211> 944

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 5

tacatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga 60

gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac 120

cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420

ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgaagcac gcgaagaacc ttaccaggtc ttga 944

<210> 6

<211> 687

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 6

ccgcacggtg actcagcggt ttacgaatca atggtcagaa tggcgcagga ttttaactac 60

cgctacatgc ttgttgacgg acacggcaac ttcggttcgg ttgacggcga ctcagcggcc 120

gcgatgcgtt acacagaagc gagaatgtca aaaatcgcaa tggaaatcct ccgggacatt 180

acgaaagata cgattgatta tcaagataac tatgacggcg cagaaagaga acctgtcgtc 240

atgccttcga gatttccgaa tctgctcgta aacggagctg ccggtattgc ggtcggaatg 300

gcgacaaata ttcctccgca tcagcttggg gaagtcattg aaggcgtgct tgccgtaagt 360

gagaatcctg agattacaaa ccaggagctg atggaataca tcccgggccc ggattttccg 420

actgcaggtc agattttggg ccggagcggc atccgcaagg catatgaatc cggacgggga 480

tccattacga tccgggctaa ggctgaaatc gaagagacat catcgggaaa agaaagaatt 540

attgtcacag aacttcctta tcaggtgaac aaagcgagat taattgaaaa aatcgcagat 600

cttgtccggg acaaaaaaat cgaaggaatt accgatctgc gtgacgaatc cgaccgtaac 660

ggaatgagaa tcgtcattga gatcgcc 687

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌PJ，已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号是GDMCC NO:60076。

2.一种抗菌蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌PJ活化后接种于NA液体培养基中，25-37℃、150-200r/min下摇菌培养8h，制备成种子发酵液；取种子发酵液接种于基础发酵培养基中，接种量3-6%（V/V），于28-37℃、150-200r/min下摇菌12-18 h；发酵完毕后，将得到的发酵液于10000 r/min 离心20min，收集上清液；往上清液中加入硫酸铵至40-100%的饱和度，静置过夜，然后离心收集沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，制得抗菌蛋白粉末。

3.根据权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的往上清液中加入硫酸铵，是加入硫酸铵至40-80%的饱和度。

4.根据权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的往上清液中加入硫酸铵，是加入硫酸铵至40-60%的饱和度。

5.根据权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的往上清液中加入硫酸铵，是加入硫酸铵至60%的饱和度。

6.根据权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml，pH值7.0-7.2。

7.根据权利要求2所述的抗菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述基础发酵培养基的配方是：葡萄糖5g、酵母浸膏7.5g、蛋白胨7.5g、硫酸铵5g、氯化钠5g、水1000ml，pH值为7.0。