CN1840683A - 利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种抗菌肽的生产方法和产品，它是通过利用淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amylolique faciens)ES－2菌株，种子培养基扩大培养后，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，或接种于固体发酵培养基，经28～37℃培养2～4天后，提取，浓缩，吸附、干燥。本发明抗菌肽产品，分子量分别为994、1008、1022、1036和1449、1463、1477、1491 Da，它们是抗菌脂肽surfactin和fangycin两类同系物的混合物，纯品为黄色粘稠物，能耐受100℃30min的加热，在pH 2－12活性不丧失，对细菌、真菌具有广谱的抗菌活性、耐热性能好，据文献报道不易产生耐药性，利用此方法生产成本低、工艺相对简单，可作为食品防腐剂和饲料添加剂。

Description

利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法及产品
技术领域
本发明涉及一种利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法，利用淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产抗菌肽，此抗菌肽具有作为食品防腐剂和饲料添加剂的潜力。
技术背景
近年来，由于药物的滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，从而引发了人们对食品安全的关注，越来越多的国家开始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们的极大的研究兴趣，成为研究领域的热点之一。抗菌肽(Antibacterial Peptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽，一般其分子量小于5kD，氨基酸数目小于100，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽。这些抗菌肽不仅有广谱抗细菌能力，而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。此外，还具有稳定性好、水溶性好、抗菌机理独特、对高等动物正常细胞无害等特点，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。
国外，对抗菌肽已有较深的研究，在生产实际中有许多应用。在食品防腐领域，目前已得到广泛使用的抗菌肽是由乳酸链球菌产生的乳链菌肽(Nisin)，1990年被列入我国食品添加剂标准(GB2760)。由于Nisin可以被消化道的胰凝乳蛋白酶消化，不存在任何残留、对身体无害，是目前公认安全和应用范围最广的天然肽类食品防腐剂。但也存在局限性，例如：抑菌谱较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著的抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性，在中性和碱性条件下对热不稳定，从而使其在食品中的应用受到了一定限制。此外，从天然食品纳豆中分离的纳豆芽孢杆菌被证实也能产生抗菌肽，其在纳豆食品的防腐中起到重要作用。其它也还有很多关于抗菌肽食品添加剂的研究，主要集中在乳酸菌产生的抗菌肽，但在实际应用的还很少。因此，进一步开发抗菌谱更广，性能更加优良的抗菌肽防腐剂显得更加迫切。
在动物饲料添加剂领域，抗菌肽的促生长防病效果，已被大量实验证实。我国，抗菌肽作为饲料添加剂的研究，近些年成为业内人士的关注热点。华南农业大学将柞蚕抗菌肽基因在酵母中表达，利用酵母大量生产抗菌肽，用于饲料添加剂。据报道，柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡的白痢效果明显。应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料，饲喂试验结果表明，蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻。粤黄鸡饲养试验表明，酵母基因工程抗菌肽可促进小鸡生产和减少排泄物氮含量，对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂的应用效果显著。而其它大规模运用于生产实际的抗菌肽添加剂已不多见。
由于动物源抗菌肽的来源有限，限制了其在实际中的大规模应用。而微生物抗菌肽和动物源抗菌肽相比，具有明显的优势。利用微生物发酵生产抗菌肽，可大规模工业化生产，生产周期短，生产成本大大降低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，是克服抗菌肽实际应用技术瓶颈的最佳途径。
据报道，许多微生物可以产生抗菌肽，但未见利用淀粉化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)产生抗菌肽用于食品防腐及饲料添加剂的报道。淀粉液化芽孢杆菌通常被用来生产食品用淀粉酶，为食品中允许使用的食品微生物，具有极高的安全性。本技术利用淀粉化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的抗菌肽抗菌谱广、性能优良，在食品防腐及饲料添加剂领域具有很好的应用前景。
发明内容
技术问题  本发明是通过利用淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产抗菌肽，此抗菌肽具有广谱的抗菌活性、pH范围广、耐热性能好，可作为食品防腐剂和饲料添加剂。
技术方案
本发明利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法及产品，其特征在于：
以淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌种，种子培养基扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，或接种于固体发酵培养基，经28～37℃培养2～4天后，提取，浓缩，吸附、干燥，生产一种抗菌肽产品；其中
1)种子培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2；
2)液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.0；
3)固体发酵培养基：豆粕粉20％，麦麸70％，谷氨酸钠5％，葡萄糖5％。
上述利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法，其特征在于：
将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心，沉淀用乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入25％体积的乙酸乙酯进行提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，于发酵罐进行液体深层发酵，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后上清液用Millipore超滤膜截留分子量3000以内的生物分子，再将滤出液经过纳滤膜，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，接种于固体发酵培养基，经28～37℃培养2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品或再经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品。
上述方法生产的抗菌肽产品，其特征在于：本发明抗菌肽产品，是抗菌脂肽surfactin和fangycin两类同系物的混合物，一类同系物分子量分别为994Da、1008Da、1022Da和1036Da；另一类同系物分子量分别为1449Da、1463Da、1477Da和1491Da。纯品为黄色粘稠物，能耐受100℃ 30min的加热，能抑制金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、溶血链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等革兰氏阳性致病菌和大肠杆菌、荧光假单胞菌、沙门氏菌和耶尔森氏菌等革兰氏阴性菌，以及酵母和黑曲霉、黑根霉、点青霉、毛霉、米曲霉、扩展青霉、无花果曲霉、黄色镰刀霉、番茄灰霉和草莓灰霉病菌等多种食品腐败菌；在pH2-12活性不丧失。
有益效果  与现有技术相比，本发明的优点和积极效果为：
1.本发明首次利用淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产抗菌肽，用于食品防腐和动物饲料添加剂。该抗菌肽抗菌谱广，对多株革兰氏阴性、阳性细菌有效，对酵母菌、霉菌也有明显的抑制作用。而目前广泛应用的天然抗菌肽食品防腐剂Nisin抗菌谱相对较窄，仅对革兰氏阳性菌表现出显著的抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性。也显示了在作为动物促生长、防治肠道疾病和饲料防霉剂方面具有很好的应用前景。该抗菌肽在pH2-12活性不丧失，而Nisin仅在酸性条件下抗菌活性稳定。能耐受100℃ 30min的加热，显示了能耐受食品加工及饲料制粒的高温处理的优越性。
2.抗菌肽作为一种新型的食品防腐和饲料添加剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产的要求。淀粉液化芽孢杆菌通常被用来生产食品用淀粉酶，为食品中允许使用的食品微生物，具有极高的安全性。
3.本发明用微生物生产抗菌肽，可大规模工业化生产，生产周期短，生产成本大大降低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，是克服抗菌肽饲料添加剂实际应用技术瓶颈的最佳途径。
附图说明
图1本发明抗菌肽产品中的抗菌肽各组分的LC-MS图谱
具体实施方式
实施例1：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌种(公知公用菌株，16SrRNA基因序列GenBank登录号为DQ177319)通过种子的扩大培养，种子培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2；
再于发酵罐28～35℃，进行液体深层发酵30～48h(液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO40.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.0。)，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、干燥，得抗菌肽成品。经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。经LC-MS测定，该抗菌肽产品是抗菌脂肽surfactin和fangycin两类同系物的混合物，一类同系物分子量分别为994Da、1008Da、1022Da和1036Da；另一类同系物分子量分别为1449Da、1463Da、1477Da和1491Da(附图1)。对比试验结果表明，该抗菌肽产品在pH 2-12活性不丧失，而Nisin仅在酸性条件下抗菌活性稳定，能耐受100℃30min的加热，显示了能耐受食品加工及饲料制粒的高温处理的优越性。
实施例2：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通过种子的扩大培养后，于发酵罐28～35℃，进行液体深层发酵30～48h(液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.0。)，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心，沉淀用甲醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品，经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例3：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通过种子的扩大培养后，于发酵罐28～35℃，进行液体深层发酵30～48h(液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO4 0.5g，KCL 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ML，pH7.0。)，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入25％体积的乙酸乙酯进行提取，提取后进行干燥，提取物经赋型剂吸附，得抗菌肽成品，经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例4：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通过种子的扩大培养，于发酵罐28～35℃，进行液体深层发酵30～48h(液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.0。)，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后上清液用超滤膜截留分子量3000以内的生物分子，再将滤出液经过纳滤膜，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品，经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例5：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通过种子的扩大培养，接种于固体发酵培养基(固体发酵培养基(％)：豆粕粉20，麦麸70，谷氨酸钠5，葡萄糖5)，经28～37℃的培养2～4天后，经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品，经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例6：
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2通过种子的扩大培养，接种于固体发酵培养基(固体发酵培养基(％)：豆粕粉20，麦麸70，谷氨酸钠5，葡萄糖5)，经28～37℃的培养2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，经高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于5g/kg，可用于动物饲料添加剂。
                            表1 ES-2抗菌物质的抗菌谱
  菌名   抑菌圈直径(mm)   菌名   抑菌圈直径(mm)
  金黄色葡萄球菌AS1.2465大肠埃希氏杆菌AS1.487蜡样芽孢杆菌AS1.1846荧光假单胞菌AS1.1802嗜热链球菌AS1.1842嗜酸乳杆菌AS1.1576鼠伤寒沙门氏菌嗜热脂肪芽孢菌耶尔森氏菌溶血链球菌   27.8029.0021.7424.1119.3826.0614.6434.4524.0025.54   扩展青霉AS3.3703无花果曲霉AS3.349少根根霉AS3.321酒精酵母AS2.114五通桥毛霉AS3.25米曲霉AS3.951黑曲霉AS3.350点青霉AS3.3712啤酒酵母AS2.399啤酒酵母AS2.115   13.5928.9519.7017.8224.8824.1422.3616.4212.72-
注-：无效果；以上编号为AS系列的菌株来自于中国菌种保藏中心；其它菌株及其试验结果由江苏省疾病控制中心提供。

Claims (4)

1.一种利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法，其特征在于：
以淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌种，种子培养基扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，或接种于固体发酵培养基，经28～37℃培养2～4天后，提取，浓缩，吸附、干燥，生产一种抗菌肽产品；其中
1)种子培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2；
2)液体发酵培养基：葡萄糖20.0g，胰蛋白胨5.0g，MgSO40.5g，KCl0.5g，KH2PO41g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 5.0mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.0；
3)固体发酵培养基：豆粕粉20％，麦麸70％，谷氨酸钠5％，葡萄糖5％。
2.根据权利要求1所述一种利用淀粉液化芽孢杆菌生产抗菌肽的方法，其特征在于：
将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心，沉淀用乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，2％接种，28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入25％体积的乙酸乙酯进行提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，于发酵罐进行液体深层发酵，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后上清液用Millipore超滤膜截留分子量3000以内的生物分子，再将滤出液经过纳滤膜，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
或者将淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2菌株通过种子的扩大培养，接种于固体发酵培养基，经28～37℃培养2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品或再经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品。
3.用权利要求1或2所述方法生产的抗菌肽产品，其特征在于：该抗菌肽产品是抗菌脂肽surfactin和fangycin两类同系物的混合物，一类同系物分子量分别为994Da、1008Da、1022 Da和1036Da；另一类同系物分子量分别为1449 Da、1463 Da、1477 Da和1491 Da，纯品为黄色粘稠物，能耐受100℃30min的加热，能抑制金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、溶血链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等革兰氏阳性致病菌和大肠杆菌、荧光假单胞菌、沙门氏菌和耶尔森氏菌等革兰氏阴性菌，以及酵母和黑曲霉、黑根霉、点青霉、毛霉、米曲霉、扩展青霉、无花果曲霉、黄色镰刀霉、番茄灰霉和草莓灰霉病菌等多种食品腐败菌；在pH 2-12活性不丧失。
4.权利要求3所述抗菌肽产品在食品防腐、动物饲料添加剂中的应用。
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