CN102321182A - 纳豆芽孢杆菌nt-6菌株生产的复合抗菌肽及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌产生的复合抗菌肽及其生产方法，该复合抗菌肽产品为抗菌脂肽类物质iturins、fengycins和surfactins三类同系物的混合物，它们的比例分别是10~20%、25~35%和50~60%；该抗菌肽纯品为黄色粘稠物，能耐受100℃30min的加热，在pH2-12活性不丧失，对细菌、真菌具有广谱的抗菌活性，对原虫和癌细胞也具有强烈的杀伤作用，实验证实具有较高的安全性；本发明还公开了该复合抗菌肽的生产方法，用此法生产工艺简单、成本相对较低，可作为食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂、医药和动物防病剂等。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽及其方法，属于生物技术领域。该方法生产的抗菌脂肽具有广谱的抗菌活性和生物表面活性，在医药、农业、食品和环境治理等领域有广泛的应用前景。
背景技术
细菌性豆豉(在日本称为纳豆)在中国是一种非常普遍的富含风味物质的大豆发酵食品，已有2000多年的历史。其发酵菌株是纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）。纳豆芽孢杆菌能产生许多功能因子，使发酵产品对人体具有许多有益功能。目前，国内外针对纳豆菌的研究，主要集中在具有溶栓作用的代谢产物纳豆激酶。而其产生的抗菌作用，近些年来才受到人们重视。据文献报道，纳豆菌对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及大肠杆菌等致病菌的作用，其抗菌谱较广，而且具有一定的耐热性（钟青萍等，食品科学，2002，23（10）：109- 112）。尽管对纳豆菌的抗菌性已有一些研究报道，但对其产生的抗菌物质多没有明确的研究报告。有研究者认为产生的抗菌物质是2，6- 吡啶羧酸，也有人认为是多粘菌素或杆菌肽或抗菌蛋白，但没有鉴定的资料（纪宁等，食品研究与开发， 2006， 27 (1): 138-142）；曹小红等对Bacillus natto TK-1菌株产生的抗菌物质进行了研究，发现了一种有抗菌活性的分子量为1036Da的脂肪酸链上有15个碳的环状脂肽surfactin（曹小红等，中国生物工程志，2009， 29(2):54-58）。除此之外未见其它相关纳豆菌抗菌物质的鉴定文献，特别是未见一种菌株同时产生二十多种抗菌脂肽同系物的文献报道。
抗菌脂肽具有生物表面活性和广谱的抗菌活性，对细菌、真菌、原虫和癌细胞具有很强的杀伤作用，在医药、农业、食品及化妆品、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景。特别是由于抗菌脂肽具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产的要求，在食品防腐、饲料添加剂、动物防病和农业生物防治等领域受到广泛的关注。
发明内容
本发明的主要目的是利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto) 通过深层发酵或固态发酵及下游工艺生产一种复合抗菌脂肽，此抗菌肽具有广谱的抗菌活性、pH适应范围广、耐热性能好、安全，可作为食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂和环境治理剂等。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
1. 本发明利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto) NT-6菌株产生的抗菌肽，特征如下：
该抗菌肽主要含有三组抗菌物质，它们的分子量分别为：一组：10432、1057.2、1071.0、1071.0；二组：1491.7、1492.5、1505.7、1519.7；三组：994.3、1009.0、1008.8、1009.9、1008.7、1022.7、1022.6、1036.8、1036.5、1036.6、1051.8、1050.6、1051.2、1051.6、1065.8、1080.2（LC-MS图谱见附图1）。该抗菌肽为抗菌脂肽类物质，由一系列同系物组成，第一组物质为iturin系列，第二组物质为fengycin系列，第三组为surfactin系列；它们的比例分别是10~20%、25~35%和50~60%；纯品为黄色粘稠物；在水中溶解性好；能耐受100℃30min的加热；在pH 2-12活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；有广谱的抗菌活性，它对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特氏菌、沙门氏菌等具有很好的抑制作用；对食品腐败细菌，如藤黄微球菌、大肠埃希氏杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、肠膜明串珠菌等，食品腐败霉菌，如黑曲霉、米曲霉、少根根霉、青霉、镰孢菌、黄曲霉等抑制作用较好；对许多植物致病菌，如扩展青霉、点青霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病、小麦纹枯病菌、八角炭疽病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等显示了很强的抑制作用；对动物致病菌，如猪肠炎沙门氏菌、溶血性大肠杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、水霉、鳃霉、链弧菌等也有较好的抑制作用。
2. 本发明生产上述复合抗菌肽是通过以下方法实现的:：
该方法采用的生产菌株为纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NT-6菌株，16SrRNA 基因序列 GenBank 登录号为JN180628；
所用培养基的组成为：
1）种子培养基(g/L): 胰蛋白胨8.0~12.0g， 酵母膏3.0~8.0g， NaCl 3.0~7.0g，水1000mL，pH7.0~7.5；
2) 液体发酵培养基：培养基-1: 葡萄糖8.0~12.0g，谷氨酸钠3.0~7.0g，MgSO4 0.3~0.7g， KCl 0.3~0.7g，KH2PO4 0.8~1.2g，FeSO4 0.10~0.20mg，MnSO4 3.0~7.0mg，CuSO4 0.15~0.18mg，水1000mL，pH6.5~7.0；或培养基-2: 葡萄糖8~12g，土豆80~120g，水1000mL；
3）固体发酵培养基：稻壳或甘蔗渣50~80g， 麸皮15~25g，谷氨酸钠3~7g， 葡萄糖3~7g，水150mL；
方法一：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl 调整pH到2，静置后离心，沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法二：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；
方法三：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法四：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，将5-10%接种于固体发酵培养基，在28～37℃的条件下培养2～4天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。
上述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。
本发明的主要优点和积极效果如下：
1. 本发明首次利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)生产抗菌肽，用于食品防腐和动物饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂等。目前实践中应用的天然抗菌肽如Nisin、天蚕素、爪蟾素(magainins)等，其抗菌谱和pH适应范围相对较窄，使用范围受到一定限制。而本发明的复合抗菌肽抗菌谱广（对多株革兰氏阴性、阳性细菌和霉菌有明显的抑制作用，其中包括食源性致病菌、食品腐败菌、植物病原菌和动物病原菌等。），在pH 2-12活性不丧失，因此，其适应范围较现使用的抗菌肽广。该抗菌肽能耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，在动物消化道内仍能保持活性；且在100℃条件下加热30min活性不丧失，显示了能耐受食品加工及饲料制粒的高温处理的优越性。
2. 纳豆芽孢杆菌来源于食品，且其产生的抗菌肽经小鼠口服毒性试验证实无毒，因此，在实际使用中具有极高的安全性。目前科学家经过实验证实，抗菌肽作为一种新型的食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产及对环境友好的要求。
3. 本发明采用纳豆菌生产抗菌肽，可大规模工业化生产， 生产周期短， 且不受季节和气候变化等外在环境的影响，相对于动物来源的抗菌肽具有明显优势。
4. 本发明方法简便，成本低。
附图说明
图1 NT-6菌株发酵提取物的LC-MS离子流谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
通过种子的扩大培养，再于发酵罐28～35℃，进行液体深层发酵30～48h，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心，沉淀用3-5倍甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例2
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵罐在上述液体发酵培养基中进行液体深层发酵28～35℃，积累抗菌代谢产物30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例3
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵罐在上述液体发酵培养基中进行液体深层发酵28～35℃，积累抗菌代谢产物30～48h，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、3-5倍甲醇提取、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于500g/kg。
实施例4
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子的扩大培养，5-10%接种于固体发酵培养基，经28～37℃的培养2～4天后，经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。
实施例5
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子的扩大培养，5-10%接种于固体发酵培养基，经28～37℃的培养2～4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于5g/kg，可用于动物饲料添加剂。
Claims (3)
1.纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于：该复合抗菌肽是由iturins、fengycins和surfactins三类抗菌脂肽同系物的混合物组成，它们的比例分别是10~20%、25~35%和50~60%；其中iturins同系物分子量分别为：10432、1057.2、1071.0、1071.0；Fengycins同系物分子量分别为：1491.7、1492.5、1505.7、1519.7；Surfactins同系物分子量分别为：994.3、1009.0、1008.8、1009.9、1008.7、1022.7、1022.6、1036.8、1036.5、1036.6、1051.8、1050.6、1051.2、1051.6、1065.8、1080.2道尔顿（Da），该复合抗菌肽为黄色粘稠物，水溶性好；能耐受100℃ 30min的加热；在pH 2~12活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；能抑制多种革兰氏阳性、阴性致病或腐败细菌，尤其对霉菌具有良好的抑制作用。
2.纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽的生产方法，其特征在于: 该方法采用的生产菌株为纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NT-6菌株，16SrRNA 基因序列 GenBank 登录号为JN180628；
所用培养基的组成为：
1）种子培养基(g/L): 胰蛋白胨8.0~12.0g， 酵母膏3.0~8.0g， NaCl 3.0~7.0g，水1000mL，pH7.0~7.5；
2) 液体发酵培养基：培养基-1: 葡萄糖8.0~12.0g，谷氨酸钠3.0~7.0g，MgSO4 0.3~0.7g， KCl 0.3~0.7g，KH2PO4 0.8~1.2g，FeSO4 0.10~0.20mg，MnSO4 3.0~7.0mg，CuSO4 0.15~0.18mg，水1000mL，pH6.5~7.0；或培养基-2: 葡萄糖8~12g，土豆80~120g，水1000mL；
3）固体发酵培养基：稻壳或甘蔗渣50~80g， 麸皮15~25g，谷氨酸钠3~7g， 葡萄糖3~7g，水150mL；
方法一：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl 调整pH到2，静置后离心，沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法二：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；
方法三：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，28～35℃，在液体培养基中进行液体深层发酵30～48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法四：将纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，将5-10%接种于固体发酵培养基，在28～37℃的条件下培养2～4天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混匀，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。
3.根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于：所述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120118 |