CN105695538A - 一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法 - Google Patents

一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法，是纳豆菌NT-6菌株为出发菌株，以Landy为培养基，在28～32℃，160r/min条件下培养36～48h，所述特定组分是含有质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物组成的Iturins和含有质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物组成的Surfactins。采用本发明所述方法可以通过控制发酵培养基和发酵条件对芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分进行定向积累，生产出具有不同特定同系物组分及其特定比例的脂肽产品，从而提高脂肽产品的功效，扩大其使用范围。

Description

一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，更具体地，涉及一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法。
背景技术
抗菌脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物，目前发现和研究的抗菌脂肽主要集中在表面活性素（surfactin）、芬荠素（fengycin）和伊枯草菌素（iturin）等。这些脂肽的分子是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类化合物具有表面活性、发泡性、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗原虫、抗肿瘤等重要的生物活性，其显示出广阔的市场开发价值，在医药、农业、食品、化妆品、生防控制、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景，已引起广泛的关注。
芽孢杆菌抗菌脂肽一般是由1～3种脂肽物质组成的混合物，每一种脂肽又都由多种同系物及同分异构体组成。不同结构的抗菌脂肽具有各自独特的化学性质和生物活性，例如surfactin对细菌具有很强的抑制作用，Iturin则对真菌的控制作用比较明显，Fengycin主要针对霉菌起作用。正是多组分的完美组合，使得芽孢杆菌抗菌脂肽具有卓越的抗菌活性和广泛的抗菌谱。因此，抗菌脂肽混合物的组成不同必然也会引起产物的抗菌谱不同，其它的生理活性也会不同。
多项研究表明，芽孢杆菌抗菌脂肽的合成是由多个模块的非核糖体肽合成酶通过一种称为“多载体硫模板机制”的方式来合成的。而合成酶的每个模块又包含多个功能结构域，正是这种多组分复合酶体系合成机制决定了脂肽产生菌株可以产生包含多组分及其多种同系物的脂肽类物质，而这种复合酶体系参与的合成过程必然极易受到菌株周围环境条件的影响，使得不同条件下合成的脂肽的种类、数量和各同系物组分的比例会有显著差异。由于脂肽的组分组成不同，其抗菌谱及其生理活性也必然不同。多数抗菌脂肽生产方法研究主要是针对脂肽的产量进行的，很少考虑生成的脂肽的同系物的组成，使得生产的脂肽产品功能相对单一。在某些发酵条件下，菌株产生脂肽的总产量虽然高，但生成的脂肽的组分相对比较单一，使得产物的抗菌谱相对较窄，影响了脂肽功效的充分发挥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法。
本发明的第二个目的是提供上述方法获得的上述方法获得的具有特定同系物组分及其特定比例的芽孢杆菌抗菌脂肽。
本发明的第三个目的是提供上述芽孢杆菌抗菌脂肽的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法，是纳豆菌NT-6菌株为出发菌株，以Landy培养基，在28～32℃，160～200r/min条件下培养36～48h，所述特定同系物组分是含有脂肽Iturins的质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物和含有脂肽Surfactins的质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物。
不同的菌株产生的抗菌肽的种类和数量不同，同时，抗菌脂肽的组成和产量受环境条件如温度、发酵时间、溶氧和培养时间、培养基的组成等影响很大，因此针对某种特殊的菌株，其发酵条件的研究十分重要，本发明选用纳豆菌NT-6菌株，该菌株分离于中国传统发酵食品纳豆；保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.8121；同时探索了各个发酵条件对其发酵产生的抗菌脂肽的组成和含量，最终获得一种定向积累纳豆菌NT-6特定组分的方法。
发明人还发现，通过向培养基中添加某些物质，能够显著的刺激抗菌脂肽的总产量，且Surfactins的比例有一定的提高，因此，优选地，所述方法还包括向Landy培养基添加0.6%～0.8%的活性炭粉末或0.4～0.8%凹凸棒粉末。
优选地，脂肽Iturins占特定同系物组分总质量的15～85%，其中质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物在脂肽Iturins中占比分别为2～29%、3～50%、24～94%。
脂肽Surfactins占特定同系物组分总质量的85～15%，其中质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物在脂肽Surfactins中占比分别为1～41%、6～28%、23～61%、9～32%。
本发明还提供所述方法获得的抗菌脂肽；同时也提供所获得的抗菌脂肽的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法，是纳豆菌NT-6菌株为出发菌株，以Landy培养基，在28～32℃，160～200r/min条件下培养36～48h，所述特定同系物组分是含有脂肽Iturins的质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物和含有脂肽Surfactins的质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物。采用本发明所述方法可以通过控制发酵培养基和发酵条件对芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分进行定向积累，生产出具有不同特定同系物组分及特定比例的脂肽产品，从而提高脂肽产品的功效，扩大其使用范围。
附图说明
图1为实施例4所获得的脂肽质谱图。
图2为实施例5所获得的脂肽质谱图。
图3为实施例6所获得的脂肽质谱图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
纳豆菌NT-6菌株，分离于中国传统发酵食品纳豆；保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.8121。
所用的培养基如下：
BPY培养基：牛肉浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl5.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2。
营养肉汤（NB）：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL，pH7.2。
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，NaCl10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
Landy培养基：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，MgSO40.5g，KCl0.5g，KH2PO41.0g，FeSO40.15mg，MnSO45.0mg，CuSO40.16mg，蒸馏水1000mL，pH7.2。
马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：马铃薯300g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。
发酵提取液的检测方法为：以7：3的乙腈/水（0.1%甲酸）溶液为溶剂将发酵提取液按照一定倍数进行稀释溶解，用0.22μm的细菌过滤器过滤至进样小瓶中，上样测定。所用的检测条件如下：标准品Surfactin和Iturin，98%，sigma，America；采用LC-MS/MS液相色谱-质谱/质谱联用仪（TSQQuantumAccess，Thermo，America）进行测定。液相条件为：色谱柱：VenusilXBPCN（100mm×2.1mm,5μ）；进样量：10μL；进样速度：8.0μL·s-1；淋洗体积：1500μL；淋洗速度：100.00μL·s-1；冲洗体积：1500μL；进样速度：100.0μL·min-1；流动相：A、乙腈B：5mmolL-1乙酸铵溶液（0.1%甲酸），洗脱速度：300μL·min-1；质谱条件为：在ESI正离子模式下，采用选择性离子扫描SIR模式，喷雾电压：4500V；鞘气压力：40arb；辅助气压力：15au；毛细管温度：270℃；扫描宽度：0.01s；扫描时间：0.02s；分辨率：0.70。
实施例1
以BPY培养基作为种子培养基，培养18～24h制得种子液。液态发酵，按5%（v/v）将种子液接入Landy培养基中，装液量80mL/250mL三角瓶，28℃，在摇床转速为160r/min时，培养48h，将发酵液于10,000rpm条件下离心15min，取上清液，以盐酸调pH至2，静置过夜，10000rpm离心20min，取沉淀，用甲醇溶解，调pH至7.0，10000rpm离心20min，取上清液用旋转蒸发仪在60℃条件下浓缩，甲醇抽提3次，浓缩结束后样品置于4℃冰箱中备用，即得发酵提取液。
经检测后获得的脂肽的产量723.82mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的84.10%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为3.19%、4.12%、92.69%。而Surfactin组分含量占15.90%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为40.45%、15.78%、34.46%和9.31%。
实施例2
接种量同实施例1，采用Landy培养基，30℃，在摇床转速为160r/min时，培养48h，脂肽的产量763.20mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的74.32%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为2.40%、3.67%、93.93%。而Surfactin组分含量占25.68%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为28.57%、23.53%、32.05%和15.85%。
实施例3
接种量同实施例1，采用Landy培养基，32℃，在摇床转速为160r/min时，培养48h，脂肽的产量872.01mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的71.46%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为4.92%、9.59%、85.49%。而Surfactin组分含量占28.54%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为31.28%、22.05%、30.54%和16.13%。
实施例4
接种量同实施例1，采用Landy培养基，培养基加入0.6%活性炭粉末，28℃，在摇床转速为160r/min时，培养36h，脂肽的总产量932.72mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的15.55%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为23.64%、40.96%、35.40%。而Surfactin组分含量占84.45%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为1.47%、15.11%、51.53%和31.89%（见图1）。
实施例5
接种量同实施例1，采用Landy培养基，28℃，在摇床转速为160r/min时，培养36h，脂肽的产量657.23mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的44.00%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为26.53%、48.66%、24.81%。而Surfactin组分含量占56.00%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为1.60%、14.03%、53.68%和30.69%（见图2）。
实施例6
接种量同实施例1，采用Landy培养基，培养基加入0.8%活性炭粉末，28℃，在摇床转速为200r/min时，培养36h，脂肽的产量1025.76mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的43.59%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为19.77%、38.47%、41.76%。而Surfactin组分含量占56.41%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为1.16%、6.57%、60.45%和31.82%（见图3）。
实施例7
接种量同实施例1，采用Landy培养基，28℃，在摇床转速为200r/min时，培养时间36h，脂肽的总产量659.02mg·L-1，产生的Iturin组分占比50.30%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，占比分别为2.36%、4.90%、92.74%。而Surfactin组分含量占49.70%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，分别占30.59%、27.18%、30.08%和12.15%。
实施例8
采用Landy培养基，50ml/250ml三角瓶中加入0.5%凹凸棒粉末，28℃，在摇床转速为160r·min-1时，培养36h，脂肽的产量1215.65mg·L-1，产生的Iturin组分占总质量的66.22%，Iturin主要由质核比为1044.30、1057.20和1071.20的同系物组分组成，各同系物在Iturin组分中占比分别为28.27%、23.29%、48.44%。而Surfactin组分含量占33.78%，主要由质核比为995.20、1008.20、1022.30和1058.20的同系物组成，各同系物在Surfactin组分中占比分别为14.06%、18.98%、23.45%和43.51%。

Claims (6)

1.一种芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法，其特征在于，是纳豆菌NT-6菌株为出发菌株，以Landy培养基，在28～32℃，160～200r/min条件下培养36～48h，所述特定同系物组分是含有脂肽Iturins的质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物和含有脂肽Surfactins的质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物。
2.根据权利要求1所述芽孢杆菌抗菌脂肽同系物特定组分定向积累的方法，其特征在于，还包括向Landy培养基添加0.6%～0.8%的活性炭粉末或0.4～0.8%凹凸棒粉末。
3.根据权利要求1所述芽孢杆菌抗菌脂肽同系物特定组分定向积累的方法，其特征在于，脂肽Iturins占特定同系物组分总质量的15～85%，其中质核比为1044.30、1057.20、1071.20的同系物在脂肽Iturins中占比分别为2～29%、3～50%、24～94%。
4.根据权利要求1所述芽孢杆菌抗菌脂肽特定同系物组分定向积累的方法，其特征在于，脂肽Surfactins占特定同系物组分总质量的85～15%，其中质核比为995.20、1008.20、1022.30、1058.20的同系物在脂肽Surfactins中占比分别为1～41%、6～28%、23～61%、9～32%。
5.权利要求1至4任一项所述方法获得的抗菌脂肽。
6.权利要求5所述抗菌脂肽的应用。
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