CN102936608B - 一种发酵生产阿维拉霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵生产阿维拉霉素的方法，包括以下步骤：制备,产绿链霉菌的带孢子斜面，将斜面孢子接种子瓶培养得到种子液，种子液在液氮下保存；将冻存种子液接种到种子培养基中进行种子培养得到种子液；按5wt%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵后的发酵液进一步处理得到阿维拉霉素的晶体。本方法简单易行，省去了繁琐的制种过程，减少了菌种衰退，降低了染菌风险；接种量容易控制，重复性好，发酵结果稳定，生产成本低。发酵结果比传统工艺有所提高，阿维拉霉素产量可以达到6500μg/ml以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产阿维拉霉素的方法，属于工业生物技术，发酵工程领域。
背景技术
阿维拉霉素又称卑霉素、阿美拉霉素，是一种新型消化促进剂或代谢调节剂，是由产绿链霉菌（Streptomyces viridocbromogene）发酵产生的Orthosomycin（寡糖类）抗生素二氯异扁枝衣酸酯，通过与细菌核糖体结合来抑制蛋白质的合成，是一种特殊的蛋白质合成抑制剂。阿维拉霉素为中性，呈无色针状结晶，熔点为181～182℃，微溶于水，易溶于丙酮、丙醇、乙酸乙酯、苯和乙醚等有机溶剂中。阿维拉霉素约有A、A′、B、C、D1、D2、E、F、G、H、I、J、K等十多个组分，其中A组分活性最高。
阿维拉霉素主要抑制革兰阳性菌，对革兰阴性菌效果较差，具有稳定而良好的促生长和预防动物疾病的双重效果，安全性高、残留极低、无交叉耐药性、对环境无影响等优点，能够提高猪和肉鸡的平均日增重。众多的国家和地区如拉丁美洲、亚洲和欧洲均允许将阿维拉霉素作为一种抗菌促生长剂添加于猪鸡饲料中。
目前，阿维拉霉素主要采用传统的斜面培养，接种环挖块接种摇瓶，摇瓶再接种子罐工艺，制种工艺繁琐，菌种容易退化，发酵结果不稳定，稳定性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产阿维拉霉素的方法，通过对传统工艺改进，优化制种工艺，用液氮保存种子液，可以大量的保存一株高产菌种，省去了不断制种过程，节约了成本，而且发酵稳定性高，生产成本低，使阿维拉霉素产量高，效价可达到6500μg/ml以上，且30天后效价保持更稳定，效价活力较优。
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.2-0.8×107个孢子，培养温度28℃，培养时间24-36h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的20-30%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的20-30%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度28℃，培养周期6-8天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.0-7.2；培养温度28℃，通气量1:1-1:1.1vvm，转速150-200rpm，培养时间24-36h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0g/l，葡萄糖20.0g/l，黄豆饼粉10.0 g/l， CaCl2 2.0 g/l，CaCO3 4.0 g/l，NaCl 1.0 g/l，pH7.2-7.4；培养温度27.5-28.5℃，通气比1:0.5-1:1.1vvm，罐压0.05-0.10MPa，转速80-150rpm培养200-240h。
MCCC1A01659-产绿色链霉菌的信息来自于：http://www.mum800.com/p_32/p_36632.html。
具体信息如下：
菌株保藏编号* (2) 1A01659
中文名称(3) 产绿色链霉菌
属名* (4) Streptomyces
种名加词(5) viridochromogenes
原产国(10) 中国
模式菌株*(12) 非模式菌株
主要用途*(13) 分类,研究
生物危害程度*(16) 不清楚
培养基编号* (23） 0012
培养温度* (24) 28℃
机构名称* (28) 中国海洋微生物菌种保藏管理中心
机构名称缩写(29) MCCC
隶属单位名称* (30) 国家海洋局第三海洋研究所
资源保藏类型* (31) 培养物
保存方法* (32) 液氮超低温冻结法,-80℃冰箱冻结法,真空冷冻干燥法。
本方法简单易行，一次制备菌种，可长期使用，并且减少了染菌风险；接种量容易控制，发酵结果稳定，大幅度提高了阿维拉霉素的生产水平，降低了生产成本；种子液在液氮中冷冻保存，降低了种子变异几率，不用在频繁的进行菌种分纯复壮；生产过程绿色环保，产品生物活性高，无交叉耐药性，无残留，可有效的促进动物生长和预防动物疾病。
具体实施方式：
实施例1：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.2×107个孢子，培养温度28℃，培养时间24h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的20%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的20%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH7.0；培养温度28℃，培养周期6天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.0；培养温度28℃，通气量1:1vvm，转速150rpm，培养时间24h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0， CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH7.2；培养温度27.5℃，通气比1:0.5vvm，罐压0.05MPa，转速80rpm培养200h。
实施例2：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.5×107个孢子，培养温度28℃，培养时间30h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的25%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的25%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH7.1；培养温度28℃，培养周期7天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.1；培养温度28℃，通气量1:1.05vvm，转速175rpm，培养时间30h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0， CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH7.3；培养温度28.0℃，通气比1:0.8vvm，罐压0.07MPa，转速120rpm培养220h。
实施例3：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.8×107个孢子，培养温度28℃，培养时间36h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的30%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的30%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH7.2；培养温度28℃，培养周期8天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.2；培养温度28℃，通气量1:1.1vvm，转速200rpm，培养时间36h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0， CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH7.4；培养温度28.5℃，通气比1:1.1vvm，罐压0.10MPa，转速150rpm培养240h。
实施例4：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.3×107个孢子，培养温度28℃，培养时间20h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的28%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的22%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉18.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.4，CaCl2 1.5，琼脂25.0，培养基pH6.8；培养温度25℃，培养周期5天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉13.0，酵母粉 20.0，葡萄糖 4.0，糊精 18.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH6.8；培养温度25℃，通气量1:0.8vvm，转速130rpm，培养时间20h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉38.0，葡萄糖18.0，黄豆饼粉10.0，CaCl2 2.0 g/l，CaCO3 4.0 g/l，NaCl 1.0 g/l，pH7.0；培养温度27℃，通气比1:0.3vvm，罐压0.03MPa，转速50rpm培养180h。
实施例5：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.6×107个孢子，培养温度28℃，培养时间38h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的27%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的25%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉25.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.8，CaCl2 2.5，琼脂35.0，培养基pH7.3；培养温度30℃，培养周期9天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉18.0，酵母粉 28.0，葡萄糖 6.0，糊精 25.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.3培养温度28℃，通气量1:1.3vvm，转速220rpm，培养时间38h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉43.0，葡萄糖23.0，黄豆饼粉12.0，CaCl2 2.5，CaCO3 5.0，NaCl 1.0，pH7.5；培养温度30℃，通气比1:1.3vvm，罐压0.15MPa，转速180rpm培养250h。
实施例6：
一种发酵生产阿维拉霉素的方法，技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100ml种子培养基中，接种量为0.5×107个孢子，培养温度28℃，培养时间28h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的24%V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，待用；
（3）种子培养：将种子液按0.02%V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的28%V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体。
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH7.0；培养温度28℃，培养周期7天。
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH7.2；培养温度28℃，通气量1:1.1vvm，转速160rpm，培养时间32h。
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0， CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH7.3；培养温度27.5℃，通气比1:0.8vvm，罐压0.07MPa，转速100rpm培养230h。
实施例7：
MCCC1A01659-产绿色链霉菌的信息来自于：http://www.mum800.com/p_32/p_36632.html。
具体信息如下：
菌株保藏编号* (2) 1A01659
中文名称(3) 产绿色链霉菌
属名* (4) Streptomyces
种名加词(5) viridochromogenes
原产国(10) 中国
模式菌株*(12) 非模式菌株
主要用途*(13) 分类,研究
生物危害程度*(16) 不清楚
培养基编号* (23） 0012
培养温度* (24) 28℃
机构名称* (28) 中国海洋微生物菌种保藏管理中心
机构名称缩写(29) MCCC
隶属单位名称* (30) 国家海洋局第三海洋研究所
资源保藏类型* (31) 培养物
保存方法* (32) 液氮超低温冻结法,-80℃冰箱冻结法,真空冷冻干燥法。
实施例1-6得到的发酵液用HPLC方法检测，检测条件如下：
色谱柱：5 μm, 250×4.6 mm Hypersil GOLD C18；
进样量：20 ul；
流动相：乙腈:0.2%（g/ml）磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至3.0）=51:49；
检测波长：214 nm；
温度：35℃；
流速：1 ml/min；
理论板数按阿维拉霉素A峰计算应不低于2500，阿维拉霉素A峰和B峰的分离度应大于6.0，阿维拉霉素A峰的拖尾因子应小于1.4；
标准溶液的配制：取60℃真空干燥3小时的阿维拉霉素标准品适量（约相当于阿维拉霉素40mg），置100ml容量瓶中，加丙酮10ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。
样品的处理：量取5ml发酵液置于25ml容量瓶中，加入10ml丙酮，超声处理25分钟，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤进样。
检测结果如下表所示：
从上表可以看出，本发明制得阿维拉霉素的效价较高，尤其是实施例2的效价最优，明显高于在本发明工艺外的实施例4、5和未液氮保存的实施例6,且本发明的阿维拉霉素30天后效价跌落较少，更稳定，因此本发明制得阿维拉霉素产率高，大幅度提高了阿维拉霉素的生产水平，一次制备菌种，可长期使用。
Claims (1)
1.一种发酵生产阿维拉霉素的方法，其特征为：技术方案如下：
（1）制备斜面孢子
将在北京北纳创联生物技术研究院购买的MCCC1A01659-产绿色链霉菌，菌株保藏编号为1A01659，接种到斜面培养基中，进行斜面培养得到斜面孢子，斜面表面充满灰白色至微灰色孢子；
（2）制备冻存种子液：
a、将上述斜面孢子接种到100 ml种子培养基中，接种量为0.5×107个孢子，培养温度28℃，培养时间30 h，得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的25% V/V；
b、在上述得到的种子液中加入等体积质量分数为40%的甘油水溶液，混匀制成甘油种子液，分装在冻存管中在液氮中保存、待用；
（3）种子培养：将冻存种子液按0.02% V/V接到种子培养基中，培养得到种子液，种子液中固形物占种子液总量的25% V/V；
（4）发酵培养：按5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
发酵完毕，将发酵液过滤，菌丝体用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉晶体；
其中，斜面培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0，培养基pH 7.1；培养温度28℃，培养周期7天；
其中，种子培养基的培养条件及成分为g/L：黄豆饼粉15.0，酵母粉 25.0，葡萄糖 5.0，糊精 20.0，CaCl2 2.0，CaCO3 1.0，pH 7.1；培养温度28℃，通气量1:1.05 vvm，转速175 rpm，培养时间30 h；
其中，发酵培养基的培养条件及成分为g/L：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0， CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.3；培养温度28.0℃，通气比1:0.8 vvm，罐压0.07 MPa，转速120 rpm培养220 h。
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