CN107513514A - 一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法 - Google Patents

一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种供生产用的链霉菌摇瓶种液制备、保藏及使用方法，向菌丝体培养液加入体积浓度为40％～50％的甘油溶液并混匀，得到链霉菌摇瓶种液，并在‑70～‑80℃条件下进行保藏。该技术方案可以将链霉菌种液单瓶大批量的培养，生产中批次减少，批量增大，减少了备种的工作量，降低了多摇瓶并瓶染杂菌的风险，可以对同批生产的链霉菌进行长期、稳定的保藏。同时流程简单，污染风险小，可大规模的应用于医药工业领域，具有重大的经济价值。

Description

一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法
技术领域
本发明涉及菌种保藏领域，特别涉及一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存及其使用方法。
背景技术
链霉菌，为放线菌目的一科。基内菌丝不断裂，气生菌丝通常发育良好，形成长(有时短)的孢子丝。孢子不能运动，外鞘上常有疣、刺或毛发等状饰物。分6属。其中链霉菌属的基内菌丝多分枝，常产生各种水溶性或脂溶性色素，本属种数最多，因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名(如链霉素等)。此外，孢囊放线菌属等，亦为链霉菌。没有成型的细胞核，故为原核生物。
链霉菌是一类极其重要的微生物资源。链霉菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的很多抗生素是各种链霉菌所产生。一些种类的链霉菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸等。此外，链霉菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数链霉菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，链霉菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
目前供生产用的链霉菌种液多为孢子悬液和多摇瓶并瓶的菌丝悬液。使用孢子悬液存在着前期筛选工作密度高，收集孢子工作量大，收集孢子过程污染风险高，获得的单株高产菌孢子悬液量少，使用时间短，更换菌号频繁生产水平不稳定。使用多摇瓶并瓶存在接种及并瓶操作麻烦，污染风险高的问题。
发明内容
为此，需要提供操作简单、污染风险低的供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法。
为实现上述目的，发明人提供了一种供生产用的链霉菌摇瓶种液制备方法，所述方法包括步骤：
将所述链霉菌孢子悬液接种至液体培养基中，培养至链霉菌菌丝呈分枝丝状，得菌丝体培养液；
向所述菌丝体培养液加入体积浓度为40％～50％的甘油溶液并混匀，得到链霉菌摇瓶种液。
优选的，所述链霉菌孢子悬液的制备方法包括以下步骤：
将链霉菌接种于斜面培养基中，培养至斜面的孢子呈灰白色，得到成熟的孢子；
用体积浓度为20％～25％的甘油溶液将所述成熟的孢子洗入灭菌的容器中，得到含孢子的溶液；
将所述含孢子的溶液混合均匀，得到所述链霉菌孢子悬液。
优选的，所述链霉菌孢子悬液的培养或链霉菌孢子悬液的制备所用的培养温度为26℃～30℃。
优选的，所述菌丝体培养液与所述体积浓度为40％～50％的甘油溶液的体积比为1:1.2至1.2:1。
优选的，所述方法进一步包括将所述链霉菌摇瓶种液按生产需要量进行分装。
发明人还提供了一种供生产用的链霉菌摇瓶种液，所述链霉菌摇瓶种液包括呈分枝丝状的链霉菌菌丝和体积分数为40％～50％的甘油溶液。
优选的，所述链霉菌摇瓶种液分装量为满足生产需要的用量。
发明人还提供了一种供生产用的链霉菌摇瓶种液的保藏方法，将上述链霉菌摇瓶种液在-70～-80℃条件下进行保藏。
发明人还提供了一种供生产用的链霉菌摇瓶种液的使用方法，将上述链霉菌摇瓶种液接入培养基中进行发酵生产。
区别于现有技术，上述技术方案提供了操作简单、污染风险低的供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法。制备时又可以单瓶大批量的培养，生产中批次减少，批量增大，减少了备种的工作量，降低了多摇瓶并瓶染杂菌的风险，可以对同批生产的链霉菌进行长期、稳定的保藏。同时流程简单，污染风险小，可大规模的应用于医药工业领域，具有重大的经济价值。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
实施例1：高产螺旋霉素的生二素链霉菌
1、孢子悬液的制备：
1)将高产螺旋霉素的生二素链霉菌接种于试管斜面培养基中，于28℃培养15天，斜面的孢子呈灰白色，得到成熟的孢子；
2)用5mL浓度为25％的甘油溶液将步骤1)中的成熟孢子洗入灭菌锥形瓶中，得到含孢子的溶液；
3)将步骤2)中得到的孢子溶液于转速200转/分钟条件下震荡30分钟，得到孢子悬液。
2、生产种液的制备、保藏
1)将孢子悬液按0.1％的接种量接种至500mL液体培养基中，于28℃条件下培养约40小时，即培养至链霉菌菌丝呈分枝丝状，得菌丝体培养液；
2)向菌丝体培养液中加入500mL浓度为40％的甘油溶液，混匀，得到生产种液；
3)将生产种液分装至15mL规格的螺口带盖离心管中，分装量为每管10mL，将离心管置于-70～-80℃条件下保存；
3、生产种液长期稳定性的测定
1)分别取出保存时间为0、3、6、12个月的种液，于室温条件解冻；
2)将解冻的10mL生产种液接入装有1000mL液体培养基的摇瓶中，于28℃培养48小时后转接发酵瓶，发酵培养7天，得到发酵液；
3)依据中国药典抗生素微生物检测法二剂量法测定发酵液螺旋霉素的效价，结果如表1。
表1：含螺旋霉素发酵液长期稳定性试验结果
从表1中可以看出，一年之内，随着保藏时间的延长，所保藏的链霉菌产螺旋霉素的能力保持相对稳定，因此，采用该菌种保藏方法具有保藏量大、污染风险小、保藏时间长等优点。
实施例2：高产中生菌素的淡紫灰链霉菌
1、孢子悬液的制备：
1)将高产中生菌素的淡紫灰链霉菌接种于试管斜面培养基中，于28℃培养12天，得到成熟的孢子；
2)用5mL浓度为20％的甘油溶液将步骤1)中的成熟孢子洗入灭菌烧杯中，得到含孢子的溶液；
3)将步骤2)中得到的孢子溶液于转速100转/分钟条件下震荡60分钟，得到孢子悬液。
2、生产种液的制备
1)将步骤1中得到的孢子悬液按0.06％的接种量接种至500mL液体培养基中，于28℃条件下培养约48小时，即培养至链霉菌菌丝呈分枝丝状，得菌丝体培养液；
2)向菌丝体培养液中加入500mL浓度为40％的甘油溶液，混匀，得到生产种液；
3)将生产种液分装至15mL规格的螺口带盖离心管中，分装量为每管10mL，将离心管置于-70～-80℃条件下保存；
3、生产种液长期稳定性的测定
1)分别取出保存时间为0、3、6、12个月的种液，于室温条件解冻；
2)将解冻的10mL种液全部接入1000mL液体培养基中，于28℃培养48小时后转接发酵瓶，培养5天，得到发酵液；
3)依据中国药典抗生素微生物检测法二剂量法测定发酵液中生菌素的效价，结果如表2。
表2含中生菌素的发酵液长期稳定性结果
从表2中可以看出，一年之内，随着保藏时间的延长，所保藏的链霉菌产中生菌素的能力保持相稳定，因此，采用该菌种保藏方法具有保藏量大、污染风险小、保藏时间长等优点。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.一种供生产用的链霉菌摇瓶种液制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
将所述链霉菌孢子悬液接种至液体培养基中，培养至链霉菌菌丝呈分枝丝状，得菌丝体培养液；
向所述菌丝体培养液加入体积浓度为40％～50％的甘油溶液并混匀，得到链霉菌摇瓶种液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述链霉菌孢子悬液的制备方法包括以下步骤：
将链霉菌接种于斜面培养基中，培养至斜面的孢子呈灰白色，得到成熟的孢子；
用体积浓度为20％～25％的甘油溶液将所述成熟的孢子洗入灭菌的容器中，得到含孢子的溶液；
将所述含孢子的溶液混合均匀，得到所述链霉菌孢子悬液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述链霉菌孢子悬液的培养或链霉菌孢子悬液的制备所用的培养温度为26℃～30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌丝体培养液与所述体积浓度为40％～50％的甘油溶液的体积比为1:1.2至1.2:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将所述链霉菌摇瓶种液按生产需要量进行分装。
6.一种供生产用的链霉菌摇瓶种液，其特征在于，所述链霉菌摇瓶种液包括呈分枝丝状的链霉菌菌丝和体积分数为40％～50％的甘油溶液。
7.根据权利要求6所述的链霉菌摇瓶种液，其特征在于，所述链霉菌摇瓶种液分装量为满足生产需要的用量。
8.一种供生产用的链霉菌摇瓶种液的保藏方法，其特征在于，将权利要求6或7所述的链霉菌摇瓶种液在-70～-80℃条件下进行保藏。
9.一种供生产用的链霉菌摇瓶种液的使用方法，其特征在于，将权利要求6或7所述的链霉菌摇瓶种液接入培养基中进行发酵生产。
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