CN109223835A - 一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法 - Google Patents

一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法及应用。采用的技术方案包括：中药固体发酵培养基制备，液体培养基制备，液体母种培养，共发酵转化，发酵物干燥、超微粉碎。以本发明的技术方案培养的菌质含有黄芪或三七、中国被毛孢及蝙蝠蛾拟青霉的所有活性成分，在共发酵过程，中药材能激活沉默的真菌次级代谢生物合成基因簇的表达，既模拟天然冬虫夏草的形成过程，又对黄芪和三七进行了转化，因此以本发明的技术方案培养的菌质高效、稳定，共发酵物具很好的免疫增强作用，疗效好，远优于简单的配伍复方组合。

Description

一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法
技术领域
本发明涉及微生物培养与转化领域，具体涉及一种冬虫夏草相关真菌共发酵转化生产黄芪三七菌质的方法。
背景技术
冬虫夏草是我国特有的传统名贵滋补中药材，形成机制复杂。天然冬虫夏草周围环境(菌膜、周围土壤)微生物多样性非常丰富，构成一个复杂的微生态系统，其中中国被毛孢是冬虫夏草的无性型，蝙蝠蛾拟青霉是天然冬虫夏草形成的重要伴生真菌，在冬虫夏草品质形成中起着重要作用，二者在冬虫夏草成熟过程中相互竞争，在不同时期发生着动态变化。蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢菌丝体发酵物均显示广泛的药理活性，如降血脂、止咳祛痰、镇静、解痉等，发酵菌丝体均与冬虫夏草有相似的化学成分和药理作用。但中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱均不能与冬虫夏草的成分完全重叠，与中国被毛孢相比，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与野生冬虫夏草的指纹谱更相似。
天然的冬虫夏草仅分布于我国西藏及邻近省份海拔约4000-5000米的高寒地带和雪山草原，具有严格的寄生性和特殊的生长地理环境，产量有限，药源紧缺，为满足市场需求，多以液体深层发酵生产菌丝体替代野生冬虫夏草，但目前，市场上冬虫夏草相关保健品大部分是由单一菌种蝙蝠蛾拟青霉发酵所得，或者由冬虫夏草本身或其菌丝体与其他中药材进行简单的混合制得。
利用药用真菌发酵中药材获得菌物药是创制新药的重要途径之一，也是中药炮制的新思路和研究热点。在发酵过程中，药用真菌分泌的酶类将使中药材的有效成分得到分解、转化、催化及结构修饰，产生新的活性成分，达到增加药效、产生新的药味性能、减少原药材的毒性等作用。中药材自身蕴含的丰富活性成分，亦能激活真菌沉默次级代谢生物合成基因簇的表达，产生结构新颖、活性独特的先导化合物，很多发酵后的药物在临床取得了较好的疗效。
目前，市面上还没有以黄芪、三七等中药材作为固体发酵基质，以中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉两种真菌进行共培养发酵的方法来制得相关中药菌物药的方法。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种冬虫夏草相关真菌共发酵转化生产黄芪三七菌质的方法，包括以下步骤，
S01、中药固体发酵培养基的制备：称取燕麦10～15g、黄芪5～10g、三七5～10g、蜂蛹粉2～5g、大豆粉6～10g、玉米粉3～5g和麸皮2～6g，将上述原料混合后用粉碎机粉碎，过10目筛后，置于干净的容器中，加入60～75ml水，放入高压灭菌锅121℃，灭菌30min，取出后静置，冷却得到中药固体发酵培养基待用；
S02、共发酵转化：先以斑点式接种法将由液体培养基培养好的中国被毛孢液体母种接种到到制备好的中药固体发酵培养基，于15℃蓝光定时照射，单独培养至少30天，期间定期进行固体发酵干扰，当中国被毛孢的菌丝生长范围处于45～55％培养基时，再以斑点式接种法将由液体培养基培养好的蝙蝠蛾拟青霉母种接种到所述中国被毛孢的菌丝生长范围约为45～55％的培养基中，15℃蓝光定时照射，共发酵培养，定期进行固体发酵干扰，至整个中药固体发酵培养基上布满菌丝体，且在中药固体发酵培养基底部出现黄色液体后，即完成共发酵培养过程，最后将培养器皿内所有物质作为共发酵产物进行进一步处理即得到所需菌质产品。
相比于目前市面上流行的单一菌种发酵或冬虫夏草等相关药材的简单拼配混合，本发明具有如下有益效果：⑴两种菌种的共同发酵能够模拟天然冬虫夏草的形成过程，使所得菌质产品的有效活性成分与天然冬虫夏草更接近，而在两种菌种的共培养过程中加入中药成分后，能激活中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉次级代谢生物沉默的合成基因簇的表达，使得菌质产品的药效比普通野生的冬虫夏草更好；⑵在发酵过程中，两菌种分泌的各种酶类可使黄芪、三七的有效成分得到分解与转化，并得到新的活性成分以产生新的药味性能，使得药效进一步增强。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创新特征、达成目的与作用更加清楚及易于了解，下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述：
本发明提供了一种冬虫夏草相关真菌共发酵转化生产黄芪三七菌质的方法，步骤如下:
1.配置中药固体发酵培养基：燕麦10～15g、黄芪5～10g、三七5～10g、蜂蛹粉2～5g、大豆粉6～10g、玉米粉3～5g和麸皮2～6g，将上述原料混合后用粉碎机粉碎，过10目筛后，置于干净的1000mL烧杯中，加入60～75ml水，高压灭菌锅121℃灭菌30min，取出后静置，冷却得到中药固体发酵培养基待用；培养基配方中中药成分的加入使真菌能够在繁殖发酵过程中对中药进行生物转化，具体有益效果会在步骤4中写明。
2.配置液体培养基：称取蛋白胨3～3.3g、酵母膏2～2.2g、葡萄糖16～19g，磷酸二氢钾1.8～2.2g，硫酸镁0.2～0.4g置于干净的烧杯中，加1000mL纯化水，用玻璃棒搅拌至上述全物质溶解完全；调节溶液pH6.8～7.2；取数个洁净的250mL锥形瓶中，每个锥形瓶倒入100mL培养液，将装好的锥形瓶放入高压灭菌锅121℃灭菌30min，取出后静置，冷却得到液体培养基待用；
3.液体母种培养：取在15℃下培养60～90天的中国被毛孢菌落，用手术刀切成中国被毛孢菌落小块，将3～8g中国被毛孢菌落小块移入盛有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，于15℃低速振荡培养至少21天，得中国被毛孢的液体母种；取在25℃下培养25～30天的蝙蝠蛾拟青霉菌落，用手术刀切成蝙蝠蛾拟青霉菌落小块，将3～8g蝙蝠蛾拟青霉菌落小块移入盛有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，于25℃低速振荡培养至少10天，得蝙蝠蛾拟青霉液体母种。中国被毛孢需要低温培养，蝙蝠蛾拟青霉常温培养即可，为保证液体母种的质量，将二者分开进行不同温度下的培养，低速震荡的方法在不干扰菌种繁殖的情况下加速了菌种与液体培养基的混合，使菌种繁殖更快，缩短液体母种培养时间。
4.共发酵转化：先以斑点式接种法将由液体培养基培养好的中国被毛孢液体母种接种到制备好的中药固体发酵培养基，于15℃蓝光定时照射，单独培养至少30天，期间定期进行固体发酵干扰，当中国被毛孢的菌丝生长范围处于45～55％培养基时，再以斑点式接种法将由液体培养基培养好的蝙蝠蛾拟青霉母种接种到到所述中国被毛孢的菌丝生长范围约为45～55％的培养基中，15℃蓝光定时照射，共发酵培养，定期进行固体发酵干扰，至整个中药固体发酵培养基上布满菌丝体，且在中药固体发酵培养基底部出现黄色液体后，即完成共发酵培养过程，最后将培养器皿内所有物质作为共发酵产物进行进一步处理即得到所需菌质产品。
此步为本发明的关键步骤，既模拟天然冬虫夏草的形成过程，又利用真菌对中药进行生物转化，对天然冬虫夏草的形成过程进行模拟，使所得菌质产品的有效活性成分与天然冬虫夏草更接近，而培养基中的中药成分能激活两菌种次级代谢生物沉默的合成基因簇的表达，使得所得菌质产品的药效比普通野生的冬虫夏草更好，同时，在发酵过程中，两菌种分泌的酶类可使黄芪、三七的有效成分得到分解与转化，减少原药材的毒性，并得到新的活性成分以产生新的药味性能，使得药效进一步增强。
5.发酵物干燥粉碎：将上一步得到的共发酵产物于真空低温干燥，再精细超微粉碎，达到1000目，压片机压片或灌装胶囊，得到最终的破壁菌质产品。
以上所有相关工作均在无菌条件下展开，保证了冬虫夏草相关菌种的生存环境无其他杂菌干扰，最终发酵产物不含任何杂菌污染。
本发明所提供的中药固体发酵培养基配方的5个具体实施例参见表1、其中质量单位为g，体积单位为mL。
表1：中药固体发酵培养基配方
组分 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
燕麦 10 15 12 13 14
黄芪 5 10 7 6 2
三七 7 2 5 6 10
蜂蛹粉 3 5 4 3 2
玉米粉 3 5 4 4 5
大豆粉 10 6 7 8 9
麸皮 2 6 3 4 5
蒸馏水 60 75 63 66 70
共发酵转化及发酵物干燥粉碎步骤中的具体参数分别参见表2、表3：
表2：中国被毛孢菌落、蝙蝠蛾菌落的处理
内容 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
A<sub>1</sub> 60 90 75 80 85
A<sub>2</sub> 3 8 5 6 7
A<sub>3</sub> 21 35 25 28 32
B<sub>1</sub> 28 25 30 26 29
B<sub>2</sub> 3 8 5 6 7
B<sub>3</sub> 10 25 15 18 21
其中，记中国被毛孢菌落在15℃下培养的天数为A1天，用手术刀切成小块的中国被毛孢菌落质量为A2g，中国被毛孢菌落小块移入液体培养基后于15℃低速振荡培养的天数为A3天；记在25℃下蝙蝠蛾拟青霉菌落的培养天数为B1天，用手术刀切成小块的蝙蝠蛾拟青霉菌落质量为B2g，蝙蝠蛾拟青霉菌落小块移入液体培养基后于25℃低速振荡培养的天数为B3天。
表3：中国被毛孢液体母种接种至中药固体发酵培养基的后处理
其中，记中国被毛孢液体母种接种到制备好的中药固体发酵培养基后，于15℃蓝光培养C天，记中国被毛孢的菌丝生长范围处于D％培养基时接种蝙蝠蛾拟青霉液体母种；
记共发酵产物于真空低温干燥E小时得最终菌质产品。低温控制在-10～4℃。
上述实施例1～5所得的最终菌质产品重量参见表4，其中重量单位为g：
表4：最终菌质产品重量
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
35 55 50 53 39
成分含量分析实验
将三七、黄芪和天然冬虫夏草混合后按照一定比例打碎成粉，制成对照组1～5，天然冬虫夏草为对照组6，对照组1～5中每份样品的总质量与对应实施例相同，且每份样品中三七、黄芪的质量与其对应实施例中加入的三七、黄芪的质量相同，分别将对照组1～6与实施例1～5的有效成分及其重量的百分比含量进行检测分析，得到结果参照表5，其中各数值结果均为每20份样品的均值，表中氨基酸的种类数显示最低值：
表5：实施例与对照组对比表
组名 虫草酸 虫草多糖 氨基酸 人参皂苷Rd 黄酮类
对照组6 7.2483 3.1750 17 0.0000 0.0000
实施例1 7.5268 3.4869 16 0.1428 0.0652
对照组1 7.1052 3.0943 17 0.1208 0.0482
实施例2 7.4148 3.3016 15 0.1517 0.0735
对照组2 7.1533 2.9998 17 0.1365 0.0511
实施例3 7.5812 3.4573 16 0.1460 0.0620
对照组3 7.0649 3.1305 17 0.1295 0.0425
实施例4 7.3089 3.4234 17 0.1673 0.0741
对照组4 7.1156 2.9985 17 0.1394 0.0592
实施例5 7.4592 3.5892 16 0.1505 0.0703
对照组5 7.1253 3.0861 17 0.1302 0.0552
从上表可以看出，虫草酸、虫草多糖含量为：实施例1～5＞对照组6＞对照组1～5，说明以本发明的技术方案制得的样品具有冬虫夏草的有效成分且含量均远高于天然冬虫夏草，而仅以物理方法将天然冬虫夏草与中药混合打碎将使得冬虫夏草的有效成分的含量一部分被中药成分取代，故对照组1～5的虫草酸及虫草多糖含量最低；
皂苷、黄酮类化合物含量为：实施例1～5＞对照组2、4、5＞对照组1、3＞对照组6，黄芪、三七中均含有大量皂苷、黄酮类化合物，此结果说明本发明的技术方案中，中国被毛孢与蝙蝠蛾拟青霉在发酵过程中的确对培养基中的中药成分进行了生物转化并极大地提高了中药中有效成分的含量。使原三七化合物种类组成发生变化，显著提高了人参皂苷Rd的含量，并产生了新的化合物，总黄酮量显著增加。
下面通过动物实验说明本发明得到的冬虫夏草相关真菌共发酵生产的黄芪三七菌质的稳定性、有效性及安全性。
一、毒理实验
1、急性经口毒性实验
实验材料：上述实施例5得到的菌质产品。
实验组：SD成年大鼠
给药方式：灌胃
实验过程：给药量为15g/KgBW，即为成年人推荐量的450倍。
实验数据：10只成年大鼠均未死亡，体重正常。
实验结论：实验材料为无毒。
2、遗传毒性实验
2.1骨髓细胞微核
实验材料：上述实施例5得到的菌质产品。
实验组：SPF小鼠
空白对照组：生理盐水；灌胃
阳性对照组：环磷酰胺，灌胃；给药浓度，0.04g/KgBW
实验组给药方式：灌胃
实验过程：将实验组按照高剂量、中剂量、低剂量进行分组，做成悬浮液，高剂量给药浓度为15g/KgBW，中剂量给药浓度为10g/KgBW、低剂量给药浓度为5g/KgBW。按照表6分组给药，实验材料的给药方式为灌胃。实验结束后，取样-染色制备-观察计数，在观察计数时，嗜多染红细胞(PCE)，成熟红细胞(RBC)，其中微核率‰＝含微核细胞个数/检查细胞个数×1000。实验结果参照表6。
表6：骨髓细胞微核试验
实验结论：阳性对照组的微核率远远高于实验组的微核率，空白对照组的微核率与实验组的微核率几乎一致，说明实验材料对小鼠的微核形成并没有影响。同时同性别间的剂量变化与微核率之间也没有必然的联系，说明10g/KGBW的实验材料对小鼠细胞内微核的形成也没有影响。
2.2精子畸形
实验组：SPF雄性小鼠
空白对照组：生理盐水、灌胃
阳性对照组：环磷酰胺，灌胃，给药浓度，0.04g/KgBW
实验组给药方式：灌胃
实验过程：将实验组按照高剂量、中剂量、低剂量进行分组，高剂量给药浓度为15g/KgBW，中剂量给药浓度为10g/KgBW、低剂量给药浓度为5g/KgBW。按照表7分组给药，实验材料的给药方式为灌胃。实验结束后，致死取样-染色制备-观察计数。
表7：致精子畸形试验
(注：精子畸形的种类包括无钩、香蕉型、无定型、胖头、尾折、双头)
实验结论：阳性对照组的微核率远远高于实验组的微核率，空白对照组的微核率与实验组的微核率几乎一致，说明实验材料对小鼠的微核形成并没有影响。同时同性别间的剂量变化与微核率之间也没有必然的联系，说明10g/KGBW的实验材料对小鼠细胞内微核的形成也没有影响。
2.3鼠伤寒沙门氏菌实验
实验材料：上述实施例5得到的菌质产品。
实验过程：按下表所示制备培养基，准备菌株，加入所需剂量实验材料，按规定培养，实验数据见表8
表8鼠伤寒沙门氏菌实验
实验结论：如表8所示，加入实验材料的实验组，和空白对照组数值基本一致，实验材料的实验组不是空白对照的两倍。而且加入的剂量和数值间也没有必然的联系，所以实验材料在上述剂量内未发生诱变反应。
3、小鼠体重试验
实验材料：上述实施例5得到的菌质产品，
推荐量为成年人每天2g，理论值为每天0.03g/Kg。
实验组：SD雄性大鼠
空白对照组：SD雄性大鼠
给药方式：灌胃
实验过程：按照成年人每天推荐量，大鼠的平均体重，按照成年人每天推荐量的30倍、60倍、100倍即0.9g/KgBW、1.8g/KgBW、3.0g/KgBW分成三个给药组。将实验材料配置成溶液，灌胃给药；空白对照组每天灌胃生理盐水。
实验数据：(1)每天记录大鼠活动情况，记录每天体重变化情况；实验前大鼠体重和实验后大鼠体重，见表9。
表9：大鼠体重影响试验
组别 动物只数 实验前平均体重(g) 实验后体重(g)
0.9g/KgBW 5 56 298±2.1<sup>a</sup>
1.8g/KgBW 5 57 294±1.2<sup>a</sup>
3.0g/KgBW 5 55 295±1.1<sup>a</sup>
空白对照组 5 56 297±1.5<sup>a</sup>
实验结论：高、中、低剂量组合对照组相比，体重没有显著差异，说明黄芪、三七菌质对小鼠体重没有影响。
二、小鼠抗疲劳试验
实验材料：上述实施例5得到的菌质产品，
推荐量为成年人每天2g，理论值为每天0.03g/Kg。
实验组：SD雌雄大鼠
空白对照组：SD雄性大鼠
给药方式：灌胃
实验过程：按照成年人每天推荐量，大鼠的平均体重，按照成年人每天推荐量的30倍、60倍、100倍即0.9g/KgBW、1.8g/KgBW、3.0g/KgBW分成三个给药组，并喂食小鼠基础饲料。将实验材料配置成溶液，灌胃给药；空白对照组每天灌胃生理盐水。28d后，饲喂的50只小鼠末次灌胃后禁食12h后，在水深(35±1)cm、直径20cm、水温(29±1)℃的塑料桶中游泳，进行抗疲劳实验，记录小鼠从放入水中开始直至鼻孔完全没入水中8s不能浮出水面的游泳时间。
表10：小鼠抗疲劳试验
表10为小鼠连续灌胃4周后，进行竭力游泳实验的结果。与空白组相比，高剂量组小鼠的力竭游泳时间最长，且具有显著差异性(P&lt;0.05)，力竭游泳时间比空白组增加了73.47％；低剂量组与空白组比较，小鼠的力竭游泳时间增加了18.54％，差异性不显著；中剂量组比正常组小鼠的力竭游泳时间增加了54.40％，差异性显著(P&lt;0.05)。3个剂量组都延长了小鼠的力竭游泳时间，并与灌胃剂量呈正相关。说明发酵物可以延长小鼠运动时间，具有抗疲劳的作用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法，其特征在于，包括以下步骤，
S01、中药固体发酵培养基的制备：称取燕麦10～15g、黄芪5～10g、三七5～10g、蜂蛹粉2～5g、大豆粉6～10g、玉米粉3～5g和麸皮2～6g，将上述原料混合后用粉碎机粉碎，过10目筛后，置于干净的容器中，加入60～75ml水，放入高压灭菌锅121℃，灭菌30min，取出后静置，冷却得到中药固体发酵培养基待用；
S02、共发酵转化：先以斑点式接种法将由液体培养基培养好的中国被毛孢液体母种接种到制备好的中药固体发酵培养基，于15℃蓝光定时照射，单独培养至少30天，期间定期进行固体发酵干扰，当中国被毛孢的菌丝生长范围处于45～55％培养基时，再以斑点式接种法将由液体培养基培养好的蝙蝠蛾拟青霉母种接种到所述中国被毛孢的菌丝生长范围约为45～55％的培养基中，15℃蓝光定时照射，共发酵培养，定期进行固体发酵干扰，至整个中药固体发酵培养基上布满菌丝体，且在中药固体发酵培养基底部出现黄色液体后，即完成共发酵培养过程，最后将培养器皿内所有物质作为共发酵产物进行进一步处理即得到所需菌质产品。
2.如权利要求1所述的一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法，其特征在于，还包括在所述S02步骤之前的制备中国被毛孢及蝙蝠蛾拟青霉的液体母种步骤，其具体过程为：
液体培养基的制备：称取蛋白胨3～3.3g、酵母膏2～2.2g、葡萄糖16～19g，磷酸二氢钾1.8～2.2g，硫酸镁0.2～0.4g置于干净的烧杯中，加1000mL纯化水，用玻璃棒搅拌至上述全物质溶解完全；调节溶液pH6.8～7.2；取数个洁净的250mL锥形瓶中，每个锥形瓶倒入100mL培养液，将装好的锥形瓶放入高压灭菌锅121℃灭菌30min，取出后静置，冷却得到液体培养基待用；
液体母种培养：取在15℃下培养60～90天的中国被毛孢菌落，用手术刀切成中国被毛孢菌落小块，将3～8g中国被毛孢菌落小块移入盛有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，于15℃低速振荡培养至少21天，得中国被毛孢的液体母种；取在25℃下培养25～30天的蝙蝠蛾拟青霉菌落，用手术刀切成蝙蝠蛾拟青霉菌落小块，将3～8g蝙蝠蛾拟青霉菌落小块移入盛有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，于25℃低速振荡培养至少10天，得蝙蝠蛾拟青霉液体母种。
3.如权利要求1所述的一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法，其特征在于，所述共发酵产物的具体处理过程为：将所述制好待用的共发酵产物于真空低温干燥3～5小时，再精细超微粉碎，达到1000目，压片机压片或灌装胶囊，得到最终的破壁菌质产品。
4.如权利要求1所述的一种冬虫夏草相关真菌共发酵生产黄芪三七菌质的方法，其特征在于，所有相关工作均是基于药用真菌对药食同源药材的转化作用。
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