CN113151362B - 一种三七固体发酵产物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七固体发酵产物的制备方法，该方法步骤主要包括：(1)三七固体培养基的制备；(2)粉被虫草液体菌种的制备、接种及发酵培养；(3)三七固体发酵及发酵产物皂苷单体成分含量检测；使用本发明所提出的粉被虫草发酵三七的方法，以三七原药材作为发酵底物，通过一次发酵，使得三七原药材中皂苷的含量发生明显变化，多种皂苷单体含量明显提高，为三七的深度开发利用提供了一条途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种三七固体发酵技术及改变三七发酵产物中皂苷的含量的方法。
背景技术
三七（学名：Panax notoginseng(Burkill) F. H. Chen ex C. H.）为五加科人参属多年生直立草本植物，高可达60cm；主根肉质，呈纺锤形，茎暗绿色，茎基部绿色或紫色，指状复叶，轮生茎顶；叶柄具条纹，叶片膜质，伞形花序单生于茎顶，有花100朵左右；总花梗有条纹，苞片多数簇生于花梗基部，卵状披针形；花梗纤细，小苞片多数，花小，淡黄绿色；花萼杯形，稍扁，花丝与花瓣等长；子房下位，果扁球状肾形，种子白色，三角状卵形，7-9月开花，10-12月结果。三七主产于云南文山，主要活性成分为三七总皂苷(Panax notoginsengsaponins，PNS)。目前为止，已从三七中分离出150余种皂苷单体，均属达玛烷型四环三萜皂苷。按其皂苷元类型又可细分为两类：20(S)-原人参二醇型（20(S)-protopanaxadiol）和20(S)-原人参三醇型（20(S)-protopanaxatriol），其中原人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3、C-K、PPD等；原人参三醇型皂苷包括R1、Rg1、Re、Rh1、F1、PPT等；三七根部皂苷含量较高的是R1、Rg1、Rb1、Rc、Re；含量较少或不含的稀有皂苷为Rd、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、F1、F2、PPD、PPT、C-K等。稀有皂苷在治疗心脑血管疾病、抗肿瘤方面表现出较好的药理活性，例如，人参皂苷Rd对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特，有可能成为治疗脑卒中、癌症的新型临床治疗药物。人参皂苷Rd在植物中含量少，主要从三七、人参等原植物的根、茎、叶中提取，效率低，成本高。稀有皂苷在三七药材中不含或含量甚微，可在体外通过化学法和生物法进行转化获得，且生物法效率高、无污染，具有较好的应用前景。
粉被虫草 Cordyceps pruinosa Petch 是一种在食品、医药领域有广泛应用的虫草资源，其无性型为粉被玛利娅霉 Mariannaea pruinosa Liang。研究表明粉被虫草具有多种生物学活性，如增强免疫功能、抗菌、抗血小板凝结、对辐射伤害有良好的保护效应和镇痛等作用，是一种是集医药保健、化妆品和生物防治多项开发潜力于一身的生物资源。
三七的主要功效成分是三七总皂苷，其在人体胃肠道中吸收较差，皂苷在胃液作用下只发生轻微的水解反应，代谢产物在肠液中酶或菌的作用下，糖苷键逐步断裂，降解成小分子皂苷才真正发挥药理作用，这不但增加了胃肠负担，而且降低了生物利用度。
发明内容
本发明提供了一种三七固体发酵产物的制备方法，该方法是一种粉被虫草对三七原药材进行生物转化获得活性成分的方法，该方法利用药用真菌粉被虫草发酵三七主根、剪口及须根，提高了三七原药材多种皂苷的含量，特别是一些稀有皂苷的含量，为三七的深度开发利用提供了条件。
本发明方法的操作步骤如下：
（1）在三七主根粗粉、三七剪口粗粉、三七须根粗粉中的一种或几种中添加洋芋粉、蚕蛹粉、葡萄糖、纯水，经121℃灭菌30～40min后，制得三七固体培养基；
所述蚕蛹粉为常规市售产品；
三七主根粗粉是将三七主根进行粉碎，然后采用20目筛、40目筛和60目筛分别制得粒度小于等于20目的粉末、粒度小于等于40目的粉末、粒度小于等于60目的粉末，将不同粒度的粉末按质量比0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5的比例混匀制得；三七剪口粗粉、三七须根粗粉的制备方法同三七主根粗粉；
三七粗粉与蚕蛹粉质量比为100:1.5～6；三七粗粉与洋芋粉质量比为100:1.5～6；三七粗粉与葡萄糖质量比为100:1.5～4.5；三七粗粉与纯水质量比为100:135～180；
（2）将粉被虫草（Cordyceps pruinosa）接种至PDA斜面培养基中，于25～30℃下恒温培养至菌落直径达到1.8～2.2cm；挑取菌落至PDA液体培养基中，120r/min下摇床培养4～7天，获得粉被虫草液体菌种，将粉被虫草液体菌种接种至步骤（1）三七固体培养基中，在20～35℃下经暗培养、光照培养后获得三七经粉被虫草发酵的固体菌质；
所述暗培养是在20～35℃下避光培养15～45天；光照培养是在20～35℃、光照强度100～300Lux下培养10～40天；
所述粉被虫草为常规市售菌株，购买自中国微生物菌种网，编号为bio-81798；
（3）采用高效液相色谱法检测步骤（2）获得的固体菌质中的皂苷单体含量
将步骤（2）中获得的固体菌质于60℃烘干，打粉，过80目筛，备用；精密称取样品0.5000g，将其置于12mL的离心管中，准确加入8.0mL色谱纯甲醇至离心管中，混匀，超声提取30min，4000r/min离心10min，将上清液转至25mL的容量瓶中，下层固体沉底物按上述方法重复提取2次，合并上清液，用色谱纯甲醇定容至25mL，然后用0.45µm滤膜过滤，采用HPLC检测滤液中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rk3、Rh4、20(R)-Rg3和Rh2等皂苷单体的含量。
本发明的关键点在于：使用粉被虫草对三七原药材进行生物转化，通过一次固体发酵，能同时提高三七原药材中多种皂苷的含量，操作简单，能耗低，无污染，该发酵技术具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径所得到；
实施例1：本三七固体发酵产物的制备方法，发酵对象选取三七主根，具体操作如下：
（1）选取三年生三七主根采用粉碎机进行粉碎，然后采用20目筛、40目筛和60目筛分别制得粒度小于等于20目的粉末、粒度小于等于40目的粉末、粒度小于等于60目的粉末，将不同粒度的粉末按质量比1:1:1的比例混匀制得三七主根粗粉；
称取三七主根粗粉35g、洋芋粉1.0g、蚕蛹粉1.0g、葡萄糖0.8g、纯水55g，置于培养瓶中，使用透气塑料盖密封，一共称取6瓶，经121℃灭菌35min后，制得三七主根固体培养基；
（2）粉被虫草液体菌种的制备、接种及发酵培养
将粉被虫草接种至PDA斜面培养基中，于25℃下恒温培养至菌落直径达到约2cm；挑取0.5cm2的菌落至PDA液体培养基中，120r/min摇床培养5天，获得粉被虫草液体菌种；将粉被虫草液体菌种和PDA液体培养基分别接种至步骤（1）制得的三七主根固体培养基中，于28℃下避光培养40天，然后在28℃、光照强度150Lux下培25天获得固体菌质，发酵菌质于60℃下烘干；
（3）采用高效液相色谱法检测步骤（2）获得的固体菌质中的皂苷单体含量
将步骤（2）烘干的固体菌质打粉，过80目筛，备用；精密称取样品0.5000g，将其置于12mL的离心管中，准确加入8.0mL色谱纯甲醇至离心管中，混匀，超声提取30min，4000r/min离心10min，将上清液转至25mL的容量瓶中，沉于离心管底部的固体菌质按上述方法重复提取2次，合并上清液，用色谱纯甲醇定容至25mL，然后用0.45µm滤膜过滤，采用HPLC检测滤液中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rk3、Rh4、20(R)-Rg3、Rh2等皂苷单体的含量，每个样品重复测定3次，取3个样品的平均值作为该样品中皂苷的含量；三七主根中14种单体皂苷，除了人参皂苷Rb1降低以外，其余13种皂苷含量均明显升高，总含量提高率为94.763%，详见表1；
上升率a=（发酵后样品皂苷含量-空白培养样品皂苷含量）/空白培养样品皂苷含量×100%
下降率b=（空白培养样品皂苷含量-发酵后样品皂苷含量）/发酵后样品皂苷含量×100%
表1三七主根经粉被虫草发酵前后皂苷成分含量的变化
实施例2：本三七固体发酵产物的制备方法，发酵对象选取三七剪口，具体操作如下：
（1）选取三年生三七剪口，采用粉碎机进行粉碎，采用20目筛、40目筛和60目筛分别制得粒度小于等于20目的粉末、粒度小于等于40目的粉末、粒度小于等于60目的粉末，将三种不同粒度大小的三七剪口粉末按照1.5:1.0:0.5的比例进行混合，得到三七剪口粗粉；称取三七剪口粗粉40g、洋芋粉0.8g、蚕蛹粉0.8g、葡萄糖1.0g、纯水60g，置于培养瓶中，使用透气塑料盖密封，一共称取6瓶，经121℃灭菌40min后，制得三七剪口固体培养基；
（2）粉被虫草液体菌种的制备、接种及发酵培养
将粉被虫草接种至PDA斜面培养基中，于28℃下恒温培养至菌落直径达到1.8～2cm；挑取0.5cm2的菌落至PDA液体培养基中，120r/min摇床培养4天，获得粉被虫草液体菌种；将粉被虫草液体菌种和PDA液体培养基分别接种步骤（1）三七剪口固体培养基中，于25℃下避光培养35天，然后光照培养30天，光照强度为100Lux，发酵菌质于60℃下烘干；
（3）采用高效液相色谱法检测步骤（2）获得的固体菌质中的皂苷单体含量
将步骤（2）烘干的固体菌质打粉，过80目筛，备用；精密称取样品0.5000g，将其置于12mL的离心管中，准确加入8.0mL色谱纯甲醇至离心管中，混匀，超声提取30min，4000r/min离心10min，将上清液转至25mL的容量瓶中，沉于离心管底部的固体菌质按上述方法重复提取2次，合并上清液，用色谱纯甲醇定容至25mL，然后用0.45µm滤膜过滤，采用HPLC检测滤液中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rk3、Rh4、20(R)-Rg3、和Rh2等皂苷单体的含量，每个样品重复测定3次，取3个样品的平均值作为该样品中皂苷的含量。三七剪口中14种单体皂苷，除了人参皂苷Rb1降低以外，其余13种皂苷含量均明显升高，总含量提高率为58.425%，详见表2；
表2三七剪口经粉被虫草发酵前后皂苷成分含量的变化
实施例3：本三七固体发酵产物的制备方法，发酵对象选取三七须根，具体操作如下：
（1）选取三年生三七须根，采用粉碎机进行粉碎，采用20目筛、40目筛和60目筛分别制得粒度小于等于20目的粉末、粒度小于等于40目的粉末、粒度小于等于60目的粉末，将三种不同粒度大小的三七须根粉末按照0.5:1.0:1.5的比例进行混合，得到三七须根粗粉；称取三七须根粗粉45g、洋芋粉2.0g、蚕蛹粉2.0g、葡萄糖1.5g、纯水65g，置于培养瓶中，使用透气塑料盖密封，一共称取6瓶，经121℃灭菌30min后，制得三七须根固体培养基；
（2）粉被虫草液体菌种的制备、接种及发酵培养
将粉被虫草接种至PDA斜面培养基中，于30℃恒温培养，至菌落直径达到约2cm；挑取0.5cm2的菌落至PDA液体培养基中，120r/min摇床培养7天，获得粉被虫草液体菌种；将粉被虫草液体菌种和PDA液体培养基分别接种步骤（1）制得的三七须根固体培养基中，于33℃下避光培养25天，然后光照培养15天，光照强度为260Lux，发酵菌质于60℃下烘干。
（3）采用高效液相色谱法检测步骤（2）获得的固体菌质中的皂苷单体含量
将步骤（2）烘干的固体菌质打粉，过80目筛，备用，精密称取样品0.5000g，将其置于12mL的离心管中，准确加入8.0mL色谱纯甲醇至离心管中，混匀，超声提取30min，4000r/min离心10min，将上清液转至25mL的容量瓶中，沉于离心管底部的固体菌质按上述方法重复提取2次，合并上清液，用色谱纯甲醇定容至25mL，然后用0.45µm滤膜过滤，采用HPLC检测滤液中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rk3、Rh4、20(R)-Rg3和Rh2等皂苷单体的含量，每个样品重复测定3次，取3个样品的平均值作为该样品中皂苷的含量，三七须根中14种单体皂苷，除了人参皂苷Rb1降低以外，其余13种皂苷含量均明显升高，总含量提高率为85.864%，详见3；
表3三七须根经粉被虫草发酵前后皂苷成分含量的变化
以上实验结果表明：粉被虫草发酵三七不同部位得到的固体菌质中，除了人参皂苷Rb1显著降低以外，其余13中皂苷成分均有较明显的提高，14中皂苷单体的总量较发酵前明显提高，特别是一些稀有皂苷提高明显，例如人参皂苷Rd、Rb3、F2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh4，本发明为三七的深度开发利用提供了一条途径。
Claims (5)
1.一种三七固体发酵产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在三七主根粗粉、三七剪口粗粉、三七须根粗粉中的一种或几种中添加洋芋粉、蚕蛹粉、葡萄糖、纯水，经121℃灭菌30～40min后，制得三七固体培养基；
（2）将粉被虫草接种至PDA斜面培养基中，于25～30℃下恒温培养至菌落直径达到1.8～2.2cm；挑取菌落至PDA液体培养基中，120r/min下摇床培养4～7天，获得粉被虫草液体菌种，将粉被虫草液体菌种接种至步骤（1）三七固体培养基中，在20～35℃下经暗培养、光照培养后获得三七经粉被虫草发酵的固体菌质。
2.根据权利要求1所述的三七固体发酵产物的制备方法，其特征在于：三七主根粗粉是将三七主根进行粉碎，然后采用20目筛、40目筛和60目筛分别制得粒度小于等于20目的粉末、粒度小于等于40目的粉末、粒度小于等于60目的粉末，将不同粒度的粉末按质量比0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5的比例混匀制得；三七剪口粗粉、三七须根粗粉的制备方法与三七主根粗粉相同。
3.根据权利要求1所述的三七固体发酵产物的制备方法，其特征在于：三七粗粉与蚕蛹粉质量比为100:1.5～6；三七粗粉与洋芋粉质量比为100:1.5～6；三七粗粉与葡萄糖质量比为100:1.5～4.5；三七粗粉与纯水质量比为100:135～180。
4.根据权利要求1所述的三七固体发酵产物的制备方法，其特征在于：暗培养是在20～35℃下避光培养15～45天。
5.根据权利要求4所述的三七固体发酵产物的制备方法，其特征在于：光照培养是在20～35℃、光照强度100～300Lux下培养10～40天。
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| GR01 | Patent grant | ||
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