KR102043841B1 - 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물 - Google Patents
저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) 조직배양한 산삼배양근을 동결건조하고 분쇄하여 산삼배양근 동결건조 분말을 얻는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말을 에탄올로 추출하고 농축하여 농축액을 얻는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 혼합한 후 에탄올을 가하여 분획하여 에탄올 분획물을 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물에 물을 혼합한 후 열처리하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 열처리된 에탄올 분획물을 발효하는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물에 관한 것이다.
산삼(山蔘)은 고려인삼의 시조로서 두릅나무과(Araliaceae), 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 음지성 초본식물로서, 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)이 야생상태에서 자연 발아하여 성장한 삼(蔘)을 일컬으며 우리나라에서는 오래전부터 약용으로 사용되어 왔다. 특히 천연산삼은 발견되는 것이 더욱 희박해지고 있으며, 소수의 심마니들에 의해서 발견되는 신비의 양약으로 알려져있다. 산삼은 천종, 지종, 인종, 장뇌삼의 4가지로 분류되는데 천종, 지종, 인종은 야생 삼으로 조류가 종자를 먹은 뒤 산 속에 배설하여 자생한 것을 말한다. 장뇌산삼은 산삼의 종자를 야생에서 인위적으로 재배한 것을 말한다.
산삼은 사포닌(saponin), 항산화물질, 펩타이드, 다당류, 지방산, 알콜, 비타민 등을 함유하고 있으며, 이 중 트리테르페노이드(tripenoid) 계열의 화합물인 진세노사이드(ginsenoside)는 주요 생리활성물질로 보고되었다. 트리테르페노이드는 올레아난(oleanane) 계열과 다마란(dammarane) 계 사포닌으로 구분되며, 진세노사이드의 대부분은 다마란계 사포닌으로써 구조적 특징으로 구분되는데, 3, 12 및 20번 탄소에 수산기(hydroxyl group)가 있는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol, PPD) 타입의 사포닌과 6, 12 및 20번 탄소에 수산기가 있는 프로토파낙사트리올(portpanaxatriol, PPT) 타입의 사포닌으로 구분된다. 프로토파낙사디올(PPD)계 진세노사이드로는 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등이 있고, 프로토파낙사트리올(PPT)계 진세노사이드로는 Rh1, Rg2, Rg1 및 Re 등이 있으며, PPD계는 중추신경 진정에 효과가 있고, PPT계는 혈중 콜레스테롤 수치 감소에 효과가 있는 것으로 알려져있다. 이외에도 산삼은 항암, 항산화, 방사선 장해 방어작용, 항당뇨, 갱년기 장해 개선, 항스트레스, 항피로 작용, 항염증 작용 등에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다.
그러나 진세노사이드는, 삼에 함유된 채로 존재하는 상태에서는 당이 진세노사이드 기본골격에 붙어 있어서 다당류의 형태를 취하고, 이는 곧바로 체내 흡수가 되기 어려우며, 장내에서 다당류가 단당류로 가수분해된 후, 즉 고분자에서 저분자로 전환된 후에 비로소 흡수된다. 대표적인 저분자 진세노사이드로는 Rg3, Rk1, Rg5, Compound K 등이 있으며, Rg3는 혈압저하, 항암 효과를 지니며 Rk1 및 Rg5는 치매 예방, 아토피, 골다공증 예방 등의 효과가 보고되었으며, Compound K는 항염 및 간보호 효과 등이 보고되었다. 따라서, 체내의 흡수율을 높이기 위해서는, 진세노사이드의 저분자화가 선행될 필요가 있음이 알려져 있다.
최근에는 첨단 생명공학기술을 응용하여 산삼을 실험실에서 조직배양하는 기술이 국내 연구자들에 의해 개발되었다. 생물배양기(bioreactor)를 이용하여 병충해, 계절변화, 토지조성 등에 영향을 받지 않으면서 재배가 어려운 약용식물의 조직이나 세포를 연중 안정적으로 생산할 수 있고, 유용성분의 표준화가 가능하다는 큰 장점이 있다. 산삼배양근은 야생산삼의 조직 일부를 떼어내어 무균상태로 기내도입하여 식물의 전형성능(totipotency)에 의해 형성되는 부정근(adventitious root)을 말한다.
한편, 한국등록특허 제1564487호에는 발효효소와 알코올발효균주를 이용한 '저분자 진세노사이드의 제조방법'이 기재되어 있고, 한국등록특허 제1467522호에는 '감압 재순환 고속 증숙 공정장치를 이용한 인삼의 저분자 진세노사이드 함량 증진 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 산삼배양근 추출물의 분획물에 열처리하고, 상기 열처리된 산삼배양근 분획물을 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주로 발효시킨 후 산삼배양근 추출물의 발효물 내의 진세노사이드 함량을 분석한 결과, 열처리 및 발효처리 하지 않은 산삼배양근 추출물에 비해 고분자 진세노사이드 함량은 감소하고 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 조직배양한 산삼배양근을 동결건조하고 분쇄하여 산삼배양근 동결건조 분말을 얻는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말을 에탄올로 추출하고 농축하여 농축액을 얻는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 혼합한 후 에탄올을 가하여 분획하여 에탄올 분획물을 얻는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물에 물을 혼합한 후 열처리하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 열처리된 에탄올 분획물을 발효하는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물을 제공한다.
본 발명에 따른 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은 간단한 공정을 통해 체내 흡수율이 높은 저분자 진세노사이드 함량을 증가시킬 수 있으며, 무균상태에서 조직 배양한 산삼배양근을 사용함으로써 건강식품 소재로 적용함에 있어 안정성이 높다.
도 1은 산삼배양근 추출물의 물, 30% 에탄올 및 60% 에탄올 분획물 내의 진세노사이드 함량을 나타내는 HPLC(high performance liquid chromatography) 크로마토그램이다.
도 2는 열처리 시간에 따른 산삼배양근 추출물의 분획물 내의 진세노사이드 함량을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법의 공정도이다.
도 2는 열처리 시간에 따른 산삼배양근 추출물의 분획물 내의 진세노사이드 함량을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법의 공정도이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 조직배양한 산삼배양근을 동결건조하고 분쇄하여 산삼배양근 동결건조 분말을 얻는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말을 에탄올로 추출하고 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 혼합한 후 에탄올을 가하여 분획하여 에탄올 분획물을 얻는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물에 물을 혼합한 후 열처리하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 열처리된 에탄올 분획물을 발효하는 단계;를 포함하는, 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 (e) 단계의 발효는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 이용하여 발효하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기탁균주는 한국등록특허공보 제1816596호에 개시된 균주이다.
또한, 본 발명의 상기 제조방법에 있어서, 상기 저분자 진세노사이드는 Rg2, Rg3, Rg5, Rg6, Rh1, Rh4 및 Rk1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은 구체적으로는,
(a) 조직배양한 산삼배양근을 동결건조하고 분쇄하여 산삼배양근 동결건조 분말을 얻는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말에 65~75%(v/v) 에탄올을 첨가하여 45~55℃에서 7~9시간씩 2~3회 반복 추출한 후 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 동량으로 첨가하여 혼합한 후 55~65%(v/v) 에탄올을 가하여 분획하여 에탄올 분획물을 얻는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물에 물을 첨가하여 혼합한 혼합액을 115~125℃에서 25~125분 동안 열처리하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 열처리된 혼합액에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하여 28~32℃에서 22~26시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는,
(a) 조직배양한 산삼배양근을 -40℃에서 동결건조한 후, 건조된 산삼배양근 1 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하여 분말을 얻는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말에 70%(v/v) 에탄올을 10배(v/w) 첨가하여 50℃에서 8시간씩 3회 반복 추출한 후, 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 동량으로 첨가하여 50 brix 현탁액을 제조한 후, 60%(v/v) 에탄올을 가하여 에탄올 분획물을 얻는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물의 동결건조 분말에 물을 20배(v/w) 혼합하여 5 brix 현탁액을 제조한 후, 120℃에서 120분 동안 열처리하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 열처리된 현탁액에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP) 배양액을 5%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법은, 상기 (e) 단계의 발효 종료 후 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물을 제공한다.
본 발명의 산삼배양근 추출물의 발효물은 산삼배양근 추출물의 분획물을 열처리하고 상기 열처리된 산삼배양근 분획물을 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주로 발효시켜 대조구(산삼배양근 추출물)에 비해 저분자 진세노사이드 함량이 증가된 발효물로, 저분자 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rg5, Rg6, Rh1, Rh4 및 Rk1의 함량이 증가된 발효물이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
실험에 사용된 산삼배양근은 2017년 10월 주식회사 화진바이오코스메틱 생명공학연구소에서 배양한 것으로, 양구군에서 채취한 35년근 이상으로 추정되는 야생산삼을 기내도입하여 배양한 것이다. 산삼배양근의 배양에 사용된 배지는 SH(Schenk and Hildebrandt Medium) 47.25 g과 수크로오스 450 g을 정제수 15 L에 혼합한 후, pH 5.75로 보정하고 18L 생물반응기(Bio-reactor)에 투입하여 제조하였다. 이후 고온·고압(127℃, 60분, 0.15 mPa)에서 멸균한 후 냉각시키고, 전배양(pre-incubation)된 산삼 세포 중 우량한 세포주를 선별하여 30 g을 접종하고 온도 25.0±0.5℃, 습도 40.0±5.0%에서 8~9주간 배양하여 사용하였다.
2. 공시균주
균주는 농업유전자원정보센터(KACC)에 기탁한 그람 양성균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702(기탁번호: KACC81017BP)를 사용하였다.
균주 배양에 사용된 배지는 MRS(Man-Rogosa-Sharpe) 55.25 g을 정제수 1 L에 혼합한 후, pH 6.2로 보정하였다. 이후 고온·고압(121℃, 15분, 0.12 mPa)에서 멸균한 후 냉각시키고, 초저온 냉장고에 보관중인 스타터 유산균 분말 페디오코커스 펜토사세우스 HLJG0702 10 g을 MRS 배지 100 ㎖과 혼합하여 30℃에서 48시간 동안 배양하여 사용하였다.
3. 시약 및 기기
분석시약은 물(HPLC grade, JT Baker, 미국), 아세토나이트릴(HPLC grade, acetonitrile; JT Baker), 에탄올(HPLC grade, JT Baker)을 사용하였고, 표준품은 진세노사이드 Rg1, Re, Rb2, Rb3, Rh1, Rd, Rg6, Rh4, Rg3, Rk1, Rg5, Rh2 및 Rh3(Sigma-aldrich, 미국); Rg2(Ambo institute, 한국); Rb1(HWI ANALYTIK GmbH, 독일); 및 화합물 K(Compound K) 및 Rc(Chemfaces, 중국)를 사용하였다.
HPLC-UVD(High Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet Detector)는 Ultimate 3000 series(Thermo, 미국)를 사용하였으며, 그 외에도 회전감압농축기(rotary vacuum evaporator, Eyela, 일본), 저울(balance, Mettler toledo, 스위스), 초음파분해(sonication, Jeio tech, 한국), 교반기(vortex mixer, Scientific Industries, 미국) 등을 사용하였다.
4. 산삼배양근 추출 조건별 시료 준비
8~9주 동안 배양한 산삼배양근 100 kg을 동결건조(-40℃)한 후, 실험에 사용하였다.
4-1. 추출용매 조건별 시료 준비
건조된 산삼배양근 1 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 분말에 물, 20% 에탄올, 40% 에탄올, 60% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올 및 100% 에탄올을 10배(v/w)씩 각각 혼합한 후 2시간 동안 진탕 추출하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후 농축하여 동결건조하였다.
4-2. 추출시간 조건별 시료 준비
건조된 산삼배양근 1 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 분말에 70% 에탄올을 10배(v/w) 혼합하여 2, 4, 6, 8, 16 및 32시간 동안 각각 추출하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후 농축하여 동결건조하였다.
4-3. 추출온도 조건별 시료 준비
건조된 산삼배양근 1 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 분말에 70% 에탄올을 10배(v/w) 혼합하여 30, 40, 50, 60, 70 및 80℃에서 2시간 동안 각각 추출하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후 농축하여 동결건조하였다.
4-4. 추출횟수 조건별 시료 준비
건조된 산삼배양근 1 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 분말에 70% 에탄올을 10배(v/w) 혼합하여 50℃에서 2시간 동안 각각 1, 2, 3, 4회 반복 추출하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후 농축하여 동결건조하였다.
5. HP-20 칼럼 크로마토그래피를 이용한 산삼배양근 추출물의 분획물 제조
건조된 산삼배양근 2 kg을 100 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 분말에 70% 에탄올을 10배(v/w) 혼합하고 50℃에서 8시간 동안 3회 반복 추출한 후 농축하여 동결건조하였으며, 상기 동결건조 분말에 정제수를 1:1(v/w) 비율로 혼합하여 50 brix 현탁액 1 L를 제조하였다. 상기 현탁액의 정제를 위해 Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피를 이용하였으며 물, 30% 에탄올 및 60% 에탄올을 순차적으로 20배(v/v) 용출(elution)시켜 3개의 분획물을 수득한 후 농축 및 동결건조하였다.
6. 산삼배양근 추출물의 분획물에 대한 열처리
상기 분획물 중 진세노사이드 함량이 높은 60% 에탄올 분획물에 정제수를 20배(v/w) 혼합하여 제조된 5 brix 혼합액을 120℃에서 각각 30, 60 및 120분 동안 열처리하였다.
7. 열처리된 산삼배양근 분획물의 발효
스타터 유산균 분말 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주 10 g을 MRS 배지 100 ㎖에 혼합하여 30℃에서 48시간 동안 전배양한 후 2,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 통해 수득한 유산균 펠렛을 정제수와 혼합한 후 열처리한 산삼배양근 추출물의 분획물에 5%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 동안 발효하였고, 발효가 끝난 후 5 ㎛ 카트리지 필터로 여과하고 고형분 60%로 농축하였다.
8. 수율 측정
수율은 초기 투입한 시료의 무게 대비 최종 제조된 시료의 무게를 하기 계산식에 대입하여 계산하였다.
수율(%) = B / A x 100
(A : 초기 사용된 시료의 무게, B : 최종 제조된 시료의 무게)
9. 총 진세노사이드 함량 분석
시료 약 2 g을 50 ㎖ 부피의 플라스크에 취하고 증류수를 표선까지 채운 후 완전하게 용해시켜 시린지 필터(syringe filter, 0.45 μm)로 여과하였다.
총 진세노사이드는 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 분석으로 실시하였다. 컬럼은 Capcell pak C18 column(Shiseido, 5 μm, 250ｘ4.6 mm), 이동상은 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 사용하였다. 시료 주입량은 10 ㎕, 유속은 1.0 ㎖/분, 온도는 30℃, UV 검출기는 203 nm에서 하기 표 1과 같은 이동상 조건으로 측정하였다.
| 시간 (분) | A : 물 | B : 아세토나이트릴 |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 80 | 20 |
| 20 | 77 | 23 |
| 25 | 70 | 30 |
| 30 | 60 | 40 |
| 35 | 50 | 50 |
| 60 | 15 | 85 |
| 65 | 15 | 85 |
| 66 | 80 | 20 |
| 75 | 80 | 20 |
시험물질의 정량값은 측정값의 피크면적을 검량선 (y = ax + b) 식에 대입한 후 아래의 계산식에 의해 산출하였다. 또한 검량선은 x축에 농도를 y축에 피크면적을 적용하여 최소자승법으로 계산하였다.
정량값 (mg/g) = C x (a x b)/S x 1/1,000
(C : 시험 용액 중 개별 진세노사이드 농도(㎍/㎖),
a : 시험 용액의 전량 (㎖), b : 희석배수
S : 시료 채취량 (g), 1/1,000 : 단위 환산 계수)
실시예 1. 추출 조건별 수율 및 총 진세노사이드 함량 분석
1-1. 추출 용매별 비교
산삼배양근의 용매별 수율 및 총 진세노사이드 함량을 측정한 결과, 수율은 물 및 에탄올(20%, 40%, 60%, 70%, 80% 및 100%)의 전 구간에서 1.4% 이상인 것으로 확인되었고, 특히 70% 에탄올로 추출하였을 때 2.794±0.163%로 가장 높은 수율을 나타내었다.
또한, 총 진세노사이드 함량은 물 추출에서 26.28 mg/g이었고, 에탄올 농도가 증가할수록 총 진세노사이드 함량이 각각 30.46 mg/g, 35.39 mg/g, 48.38 mg/g, 48.08 mg/g, 55.96 mg/g, 66.83 mg/g으로 증가하였다. 모든 추출 용매별 조건에서 저분자 진세노사이드인 Rh4, Rg3, Rk1, Rg5 및 화합물 K(compound K)는 검출되지 않았지만, 20% 에탄올 추출부터 에탄올 농도가 증가할수록 Rb1, Rb2, Rd 함량이 증가하여 총 진세노사이드 함량이 증가된 것을 알 수 있었다(표 2).
1-2. 추출 시간별 비교
산삼배양근의 추출 시간별 수율 및 총 진세노사이드 함량을 측정한 결과, 수율은 2시간 추출에서 2.270±0.094%로 가장 낮았고, 추출 시간이 증가할수록 수율도 증가하여 32시간 추출에서 3.018±0.037%로 가장 높았다. 이는 추출 시간이 증가할수록 용출되는 양이 증가하기 때문인 것으로 사료되었다.
또한, 총 진세노사이드 함량은 6시간 추출에서 52.38 mg/g로 가장 낮았고 8시간 추출에서 60.56 mg/g로 가장 높았으며, 총 진세노사이드 함량은 추출 수율(용출되는 양)과 관련이 없는 것으로 판단되었다(표 3).
1-3. 추출 온도별 비교
산삼배양근의 추출 온도별 수율 및 총 진세노사이드 함량을 측정한 결과, 수율은 온도가 높아질수록 점점 증가하다가 70℃에서 3.906±0.077%로 가장 높은 수율을 보였으며, 80℃에서는 감소하는 것으로 확인되었다.
또한, 총 진세노사이드 함량은 50℃에서 62.43 mg/g로 가장 높았으며, Rg1, Rb1 및 Rb2가 각각 12.26 mg/g, 19.26 mg/g 및 17.02 mg/g로 함유되어 있어 전체의 77%를 차지하는 것으로 확인되었다. 70℃에서는 총 진세노사이드 함량은 58.78 mg/g을 나타내었지만, 50℃에서 함량이 높았던 Rb1, Rb2가 감소하였고 50℃ 이하의 온도에서 검출되지 않았던 저분자 진세노사이드인 Rg2, Rh1, Rh4 및 Rk1이 검출되었다(표 4). 상기 결과를 통해, 고온의 추출 조건에 의해 고분자 진세노사이드가 저분자화됨을 유추할 수 있었다.
1-4. 추출 횟수별 비교
산삼배양근의 추출 횟수별 수율 및 총 진세노사이드 함량을 측정한 결과, 수율은 추출 횟수가 증가할수록 감소하였고, 총 진세노사이드 함량은 47.95~52.57 mg/g의 범위 내에서 비슷한 수준으로 관찰되었으며, 특히 3회 추출에서 가장 높은 것으로 확인되었다.
각각의 진세노사이드 함량을 비교해보면, 1회 추출과 2~4회 추출에서 서로 다른 경향을 보여주었는데, 진세노사이드 Rg1 및 Re의 함량은 추출 횟수가 증가할수록 감소하였고 Rb2는 3회 추출까지 증가하였으며, Rd 및 Rg6는 매회 증가하였고, 4회 추출에서는 이전에 검출되지 않았던 Rk1 및 Rg5가 각각 0.73 mg/g, 1.22 mg/g로 검출되었다(표 5). 이러한 결과는, 추출 횟수 증가에 따라 반복적인 고온 조건(50℃)이 가해짐에 따라 1회 추출에서 용출된 고분자 진세노사이드가 저분자화된 것으로 사료되었다.
실시예 2. 산삼배양근 추출물의 분획물 내의 진세노사이드 함량 및 수율 분석
산삼배양근 추출물의 Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피를 통해 수득된 물, 30% 에탄올 및 60% 에탄올 분획물의 수율은 각각 60.231±1.512%, 24.374±1.451%, 15.395±0.942%로 확인되었으나, 총 진세노사이드 함량은 물, 30% 에탄올 및 60% 에탄올 분획물이 각각 1.52±0.03 mg/g, 4.57±0.05 mg/g, 372.63±3.11 mg/g인 것으로 나타나, 60% 에탄올 분획물에서 총 진세노사이드 함량이 가장 높은 것을 확인하였다(표 6 및 도 1).
실시예 3. 산삼배양근 분획물의 열처리에 따른 진세노사이드 함량 분석
산삼배양근 추출물의 60% 에탄올 분획물을 120℃에서 30분, 60분, 120분동안 각각 열처리하여 총 진세노사이드 함량을 분석한 결과, 각각 196.38±2.19 mg/g, 298.85±5.10 mg/g, 269.81±3.75 mg/g로 검출되었다(표 7 및 도 2).
특히, 120℃에서 120분 동안 열처리했을 경우 저분자 진세노사이드인 Rg2, Rh1, Rg6, Rh4, Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량이 열처리하지 않은 조건(표 6 참고)에 비해 현저히 증가한 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 열처리된 산삼배양근 분획물의 발효물 내 진세노사이드 함량 분석
산삼배양근 분획물을 120℃에서 120분 동안 열처리하고, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 발효시킨 후 진세노사이드 함량을 분석하였다.
그 결과, 발효 단계를 거치지 않은 열처리된 산삼배양근 분획물(표 7)에 비해 열처리된 산삼배양근 분획물의 발효물 내의 고분자 진세노사이드(Rg1, Re, Rb2)의 함량이 감소한 반면, 저분자 진세노사이드 중 특히 Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량은 현저하게 증가된 것으로 확인되었다(표 8). 특히, 열처리 및 발효 단계 전의 산삼배양근 에탄올 추출물에 비해 저분자 진세노사이드 Rg2, Rh1, Rg6, Rh4, Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량이 현저히 증가된 것을 알 수 있었다(표 8).
상기 결과를 통해, 본 발명의 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법은 열처리 및 발효 단계에 의해 진세노사이드의 저분자화를 유도하는 것으로 판단할 수 있었다.
Claims (5)
- (a) 조직배양한 산삼배양근을 동결건조하고 분쇄하여 산삼배양근 동결건조 분말을 얻는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 산삼배양근 동결건조 분말에 65~75%(v/v) 에탄올을 첨가하여 45~55℃에서 7~9시간씩 2~3회 반복 추출한 후 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 농축액에 물을 동량으로 첨가하여 혼합한 후 55~65%(v/v) 에탄올을 가하여 분획하여 에탄올 분획물을 얻는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 에탄올 분획물에 물을 첨가하여 혼합한 혼합액을 115~125℃에서 25~125분 동안 열처리하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 열처리된 혼합액에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) HLJG0702 균주(기탁번호: KACC81017BP)를 접종하여 28~32℃에서 22~26시간 동안 발효하는 단계를 포함하는, 저분자 진세노사이드인 Rg2, Rg3, Rg5, Rg6, Rh1, Rh4 및 Rk1의 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 방법에 의해 제조된 저분자 진세노사이드인 Rg2, Rg3, Rg5, Rg6, Rh1, Rh4 및 Rk1의 함량이 증가된 산삼배양근 추출물의 발효물.
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