KR101970702B1 - 생물전환 기술을 이용한 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

생물전환 기술을 이용한 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진세노사이드의 전환 방법 및 특정 진세노사이드를 다량 함유하는 발효 삼의 제조방법을 제공하며, 본 발명은 생물전환(bio-conversion) 기술을 이용함으로써 간단한 공정으로 특정 진세노사이드가 다량 함유된 발효 삼을 용이하게 제조할 수 있는 이점이 있다.

Description

생물전환 기술을 이용한 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법{Fermented ginseng composite using bio-conversion and method thereof}
본 발명은 삼에서 유래한 진세노사이드를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물전환 기술을 이용함으로써 삼으로부터 유래한 다당체 및 진세노사이드 함량이 증가된 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여 년 전부터 사용되어 온 생약으로, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장 시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 항암 작용, 면역기능 조절 작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진 작용, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 작용 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996).
인삼의 대표적인 약리성분인 사포닌(ginsenoside)은 백삼에 22가지, 홍삼에 30가지 정도가 밝혀져 있으며 (Ryu, 2003), 특히 panaxatriol은 백삼에는 없고 홍삼에만 존재하는 특이한 성분이다 (Kitagawa, 1983). 또한 인삼을 찌고 말리는 과정을 반복한 홍삼의 제조과정에서 발생되는 열에 의해 인삼에는 존재하지 않는 홍삼만의 특유 성분인 non-polar ginsenoside Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, Rg5, Rk1와 polar ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg, Rg1, Re 등의 사포닌 성분이 새로이 생성되며, 이러한 홍삼 특유의 사포닌은 혈압강하작용 (Jeon et al., 1999), 뇌신경세포 보호 및 학습능력 개선작용 (Kim et al.,, 2004; Petkov and Mosharrof, 1987), 항혈전 작용 (Jung et al., 1998), 항산화 작용 (Bae and Kim, 1998) 등이 있다고 보고되고 있다.
일반적으로 인삼은 그 가공방법에 따라 여러 가지로 분류할 수 있는데, 크게 수삼, 홍삼, 백삼, 태극삼으로 나눌 수 있다. 여기서 수삼은 경작지에서 재배한 인삼을 가공하지 않은 상태의 것을 말하며, 수삼을 쪄서 건조시킨 것을 홍삼, 수삼을 익히지 아니하고 건조시킨 것을 백삼, 수삼을 열수에 찌거나 데친 다음 건조시킨 것을 태극삼이라 한다.
홍삼은 수삼을 물로 깨끗하게 씻고, 일정한 용기에 넣어 가열된 수증기를 이용하여, 크기에 따라 일정시간 증삼(蒸蔘)을 한 후 1차 열풍건조 후부터는 태양열을 이용하거나 기타 방법으로 수분이 12.5∼13.5% 정도 될 때까지 건조하여 제조하게 된다.
백삼은 통상 4∼6년근의 수삼을 박피하거나 혹은 박피하지 않은 상태에서 자연 건조시키거나 또는 60℃ 이하로 열풍건조시켜 수분함량이 14% 이하가 되도록 한 것으로서, 박피한 것을 백삼이라고 하고 박피하지 않은 상태의 것을 피부백삼이라고 한다. 백삼은 건조시킨 형태에 따라 직삼, 반곡삼, 곡삼 등으로 구분되고, 제품의 색은 유백색이나 연노랑색을 나타내는데, 이러한 백삼을 원료로 하여 제조되는 제품으로는 인삼 엑스제, 인삼차, 인삼엑스 과립제, 인삼 드링크제, 인삼 비누 등과 같은 식품, 약품, 화장품 등이 있다.
대한민국 특허등록 제10-1616104호는 생물전환 기술을 이용한 발효 홍삼의 제조방법을 개시하고 있다. 대한민국 특허등록 제10-1285681호는 사포닌 생물전환능을 갖는 신규의 락토바실러스속 균주 및 이를 이용한 발효 인삼의 제조방법을 개시하고 있다.
또한, 대한민국 특허등록 제10-0997998호는 사포닌 생물전환능을 갖는 신규의 락토바실러스속 균주 및 이를 이용한 인삼 발효물의 제조방법을 개시하고 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
특허문헌 1 : KR 10-1616104 B1 (2016.04.21) 특허문헌 2 : KR 10-1285681 B1 (2013.07.04) 특허문헌 3 : KR 10-0997998 B1 (2010.11.26)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 항암, 신경보호, 항비만 및 진통 등의 효능을 갖는 다양한 진세노사이드의 함량을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인삼, 홍삼 또는 백삼에 곰팡이, 효소 또는 유산균 균주를 접종하여 배양하고 배양물을 열처리하는 단계를 반복하면 인삼, 홍삼 또는 백삼 고유의 진세노사이드가 인체에 유용한 형태의 진세노사이드로 전환됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 진세노사이드 함량이 증가된 생물전환 삼 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 삼 원재료에 함유된 유효 성분의 효능을 극대화할 수 있는 생물전환 삼 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명은 곰팡이 또는 효소 또는 유산균으로 발효시켜 진세노사이드의 함량이 증가된 삼 발효 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 중 '삼' 또는 '인삼'은 제한되지 않으나, 바람직하게 인삼, 홍삼, 수삼, 백삼, 태극삼, 흑삼으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 삼을 포함하는 것으로 사용된다.
본 발명에서 곰팡이 균주는 아스퍼질러스 나이거 KACC40280(Aspergillus niger KACC 40280), 아스퍼질러스 오리제 KACC44823(Aspergillus oryzae KACC 44823), 푸자리움 베르티실리오이드 KCTC 6065(Fusarium verticillioides KCTC 6065), 패실로미세스 바리오티 KCTC 6529(Paecilomyces variotii KCTC 6529), 브라키박테이움 진센지솔리 KCTC 29226(Brachybacterium ginsengisoli KCTC 29226)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 곰팡이를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 푸자리움 베르티실리오이드 KCTC 6065(Fusarium verticillioides KCTC 6065), 패실로미세스 바리오티 KCTC 6529(Paecilomyces variotii KCTC 6529), 브라키박테이움 진센지솔리 KCTC 29226( Brachybacterium ginsengisoli KCTC 29226)을 사용할 수 있으며 더욱 바람직하게는 패실로미세스 바리오티 KCTC 6529(Paecilomyces variotii KCTC 6529)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 효소는 비스코자임(viscozyme), 로하멘트(rohament), 플랜테이즈(plantase), 서마이자임(sumyzyme), 셀루클라스트(celluclast), 노보자임(novozyme), 펙티넥스(pectinex)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효소를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 플랜테이즈(plantase) 또는 셀루클라스트(celluclast)를 사용할 수 있으며 더욱 바람직하게는 플랜테이즈(plantase)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 유산균은 락토바실러스 커베터(Lactobacillus curvatus), 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 및 류코노스톡 아제리움(Leuconostoc argentimum)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 및 류코노스톡 아제리움(Leuconostoc argentimum)를 사용할 수 있으며 더욱 바람직하게는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria)를 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경피 투여 또는 주사 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 인삼 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인삼 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 인삼 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상술한 인삼 추출물 이외에, 그 작용(피부염 및 가려움증의 억제)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 피부염 치료제 또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 추출의 방식은 열수추출, 유기용매추출, 증류추출을 이용할 수 있다. 유기용매 추출물은 (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르, 또는 (i) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "증류추출" 방식은 한약재를 물(바람직하게는, 증류수)에 섞고, 이를 가열 등의 방식으로 기화시켜 유효성분을 수득하는 추출방식을 의미한다.
본 발명에서 상기 발효 삼 조성물의 제조방법은 상기 배양 후 얻어진 배양액을 80 내지 95℃에서 12 내지 48시간 동안 숙성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 발효 삼 조성물의 제조방법은 상기 숙성 단계를 수행하여 얻어진 숙성액 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 진세노사이드의 전환 방법 및 특정 진세노사이드를 다량 함유하는 발효 삼의 제조방법을 제공하며, 본 발명은 생물전환(bio-conversion) 기술을 이용함으로써 간단한 공정으로 특정 진세노사이드가 다량 함유된 발효 삼을 용이하게 제조할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 (A)Paecilomyces variotii KCTC6529 균주를 이용하여 발효한 인삼 배양액의 PPD 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량, (B)Paecilomyces variotii KCTC6529 균주를 이용하여 발효한 인삼 배양액의 PPT 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량을 각각 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 (A)효소 plantase를 이용하여 인삼발효 후 생산된 PPD 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량, (B)효소 plantase를 이용하여 인삼발효 후 생산된 PPT 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량을 각각 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 (A)유산균 Weissella cibaria를 이용하여 인삼발효 후 생산된 PPD 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량, (B)유산균 Weissella cibaria를 이용하여 인삼발효 후 생산된 PPT 계열의 진세노사이드의 분포 및 생산량을 각각 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
1. 인삼 추출물의 생물 전환 가능 곰팡이 균주를 이용한 생물전환
(1) 시약 및 재료
인삼은 금산군 소재 수삼 센터에서 구매를 하여 냉장 컨테이너에 담아서 실험실로 이송을 하였다. 실험을 수행하기 전에 수삼을 세척한 후에 건조를 하여 백삼을 제조하였다. 제조된 백삼은 실험 전까지 포장하여 상온에서 보관을 하였다. 실험에 사용된 발효 균주의 분리를 위하여 식품점에서 구입한 발효 김치들을 아이스박스를 이용하여 실험실로 옮기고 실험을 수행하기 전까지 냉장고에 보관하였다. 분석을 위한 시약들인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd, Rg1, Rg3, Rh1, Rh2들은 Sigma Aldrich Co.(USA)에서 구입하였다. 곰팡이 균주는 Aspergillus niger KACC40280. Aspergillus oryzae KACC44823은 농업유전자원정보센터에서 분양받았으며 Fusarium verticillioides KCTC6065, Paecilomyces variotii KCTC 6529. Brachybacterium ginsengisoli KCTC29226은 생물자원센터에서 분양받았다.
(2) 인삼 추출물 제조
인삼 추출물 제조는 건조 인삼 분말 200g를 부직포에 담아 5000mL 추출용 둥근 플라스크에 넣고 2000mL 정제수를 넣어 내용물이 완전히 잠기게 한 후에 환류 추출하였다. 인삼 추출액은 불순물을 제거한 후에 진공농축기를 이용하여 농축기의 압력은 약 600mmHg를 유지하였다. 온도는 보정 압력에서 용매의 boiling point를 감안하여 80℃에서 수행을 하여 최종 농축액이 약 50 Brix 까지 농축하였다. 실험에 사용된 추출물은 농축액을 20 Brix까지 희석하여 수행하였다.
(3) 인삼 추출물 곰팡이 발효 배지
인삼 발효 균주의 증식 및 배양을 위하여 Fusarium verticillioides KCTC 29226 균주는 Potato Dextrose agar(PDA; Difco)배지를 사용하였으며, PDA 배지에 10%의 인삼추출물을 혼합한 배지는 PDA10WG 라고 칭하였다. Paecilomyces variotii KCTC 6065, Aspergillus oryzae KACC 44823, Aspergillus niger KACC 40280 균주는 맥아배지(Malt Extract Agar) Malt extract 20g, peptone 5g, agar 20g, 증류수 1000ml 조성으로 제조하였으며, 10%의 인삼추출물을 혼합한 배지는 MEA10WG 라고 칭하였다. 마지막으로 Brachybacterium ginsengisoli KCTC 6529 균주는 Tryptic soy agar(TSA; Difco) 배지를 사용하였으며 이의 조성은 pancreatic digest of casein 17g, papaic digested soybean 3g, dextrose 2.5g, sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g, agar 15g, 증류수 1000ml에 10%의 인삼추출물을 혼합한 배지는 TSA10WG 라고 칭하였다.
(4) 인삼 추출물을 이용한 곰팡이 발효
유산균의 발효 최적 조건을 구하기 위해서 PDA10WG, MEA10WG, TSA10WG에 pH meter(model 720P, Istek Co., Korea)를 이용하여 20% HCl과 20% NaOH로 pH를 7로 조정한 각각의 배지 50ml를 250ml 배양 플라스크에 옮겨 autoclave(JS-AC-60, Johnsam Co., Korea)에서 121℃로 15분간 멸균시켰다. 먼저 발효 최적 온도 조건을 찾기 위해서는 무균작업대에서 멸균된 배지에 전날 계대 배양하여 균주가 활성화 된 배양액 2%를 옮겨 진탕 배양기를 이용하여 30℃조건에서 100 rpm으로 72시간 배양하였다. 인삼 추출물 최적 조건에서의 발효는 각 배지를 3L 제조하여 L 발효기에 넣고 autoclave에서 121℃에서 30분간 멸균을 하고 전날 미리 계대배양을 한 200 ml의 Fusarium verticillioides 배양액을 접종하였다. pH 5.5～6.5로 100 rpm에서 12시간 배양을 한 후에 20%(w/v) 인삼 농축액 1ml/min 속도로 1L를 공급하였다. 총 72시간 동안 배양하였고 시료는 12시간마다 채취하였다. 진세노사이드는 TLC를 이용하여 분석하였으며, spectrophotometer를 이용하여 660nm에서 균체량을 측정하였다.
(5) 곰팡이 배양 상등액을 이용한 발효
10L 용량의 삼각플라스크에 potato dextrose broth(PDB, Difco) 24g, 인삼 10ml 그리고 1,000ml의 증류수를 넣어 제조하였다. 제조된 PDB10WG배지는 autoclave를 이용하여 121℃, 15min 조건에서 멸균하였으며, 멸균된 배지 1,000ml에 Fusarium verticillioides KCTC 29226을 2% 접종하여 100rpm, 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 취하여 원심분리기(high speed refrigerated centrifuge 22k, Hanil)를 사용하여 20℃에서 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액은 멸균된 bottle에 보관하여 생물전환을 위한 조효소로서 실험에 사용되었다.
조효소 실험은 상등액 9ml와 PDB 0.24g 그리고 인삼 1ml을 혼합하여 멸균하였으며 100 rpm, 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양된 배양액은 24시간 별로 250m 배양액을 취하여 TLC로 분석하였다.
(6) 각 곰팡이 균주의 휴지 세포를 이용한 발효
① 생물전환 실험
10L 용량의 삼각플라스크에 potato dextrose broth(PDB, Difco) 24g, 인삼 10ml 그리고 1,000ml의 증류수를 넣어 제조하였다. 제조된 PDB10WG배지는 autoclave를 이용하여 121℃, 15min 조건에서 멸균하였으며, 멸균된 배지 1,000ml에 Fusarium verticillioides KCTC 29226을 2% 접종하여 100 rpm, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 배양액을 취하여 원심분리기(high speed refrigerated centrifuge 22k, Hanil)를 사용하여 20℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액은 폐기하였으며, cell은 멸균된 bottle에 모아 resting cell을 제조하였으며, 이는 생물전환 실험에 사용하였다.
② 최적 발효 온도 조건 확립실험
곰팡이 배양 균체를 이용한 최적 발효 온도 조건을 구하기 위해서 멸균된 pH 7, 0.1 M phosphate buffer용액 4ml에 원심 분리한 Fusarium verticillioides KCTC 6065 곰팡이 0.5ml를 혼합한 균체액에 기질원인 50 brix 인삼농축액을 0.5ml씩 넣어 혼합하였다. 온도는 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃로 설정하였으며 incubator를 이용하여, 20시간 동안 반응하였다.
최적 pH 조건을 구하기 위해서는 pH를 설정하기 위하여 0.1M phosphate buffer용액을 제조하였다. KH2PO4와 K2HPO4를 각각 0.1M로 500ml를 메스플라스크를 이용하여 제조하여, 제조된 두 시약을 혼합하면서 pH meter기를 이용하여 0.1M Phosphate buffer용액 pH 5.4, 6, 7, 8, 8.6을 각 50씩 제조하였다. Phosphate buffer용액이 완성되면 실험에 사용될 test tube와 함께 autoclave에서 121℃, 15분간 멸균하였다. 멸균 후 test tube에 Fusarium verticillioides KCTC 6065 곰팡이의 균체액 0.5ml, 0.1M phosphate buffer용액 4ml, 50 brix 인삼농축액 0.5ml를 혼합하여 incubator 30℃, 40℃에서 48시간 동안 반응하였다.
(7) Paecilomyces variotii KCTC 6529를 이용한 인삼 발효 진세노사이드의 분포
인삼 발효물을 이용한 생물전환 실험으로 분석의 타겟은 PPD 계열의 진세노사이드 Rg3와 Rh2이다. 그 외에도 인삼과 발효인삼의 생물전환 분포를 확인하고 발효에 따른 변화를 확인하고자 HPLC를 분석하였으며, 도 1에서 kinetics를 확인하였다.
도 1(A)에 나타낸 바와 같이, 발효 전 인삼 농축액은 PPD 계열에서 Rb와 Rc가 높게 분포되어 있음을 확인하였다. Paecilomyces variotii KCTC6529를 이용한 인삼 발효액의 경우 PPD 계열에서 Rb와 Rc는 현저히 줄었으며, Rd와 Rg5 그리고 Rh2가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 발효하지 않은 인삼 농축액에서 Rg3와 Rh2의 합이 6.29mg/g 이었으나, Paecilomyces variotii KCTC6529를 이용하여 인삼 발효한 시료에서 11.44mg/g로서 양이 증가하였으며, 특히 Rh2의 경우 약 3배가 증가하였음을 확인하였다.
도 1(B)에 나타낸 바와 같이, PPT 계열을 확인한 결과 인삼 농축액의 경우 Rg2와 Rh1의 분포가 높게 나타났으며 상대적으로 Rg1과 Re의 분포가 낮게 나타났다. 하지만 Paecilomyces variotii KCTC6529 균주를 이용하여 발효한 인삼액의 경우 Rf, Rg2, Rh1의 분포가 줄었으며 Rg1의 경우 2 mg/g에서 8.39 mg/g 으로 4배 이상 증가하였으며, Re 또한 1.71 mg/g에서 5.33 mg/g으로 3배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.
따라서 Paecilomyces variotii KCTC6529 균주를 이용하여 생물전환을 할 경우 PPD 계열에서 Rg3보다는 Rh2의 생물전환율이 매우 높음을 확인하였으며, 이는 본 발명에서 타겟으로 하는 Rh2로의 생물전환에 사용될 균주로 매우 적합함을 확인하였다.
2. 인삼 추출물의 효소를 이용한 생물전환
(1) 시약 및 재료
분석을 위한 시약들인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd, Rg1, Rg3, Rh1, Rh2들은 Sigma Aldrich Co.(USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 효소 Viscozyme, Rohament, Plantase, Sumyzyme, Celluclast, Novozyme, Pectinex 7종은 모두 대종상사(seoul)에서 구입하였으며 sumyzyme AC는 분말로 제공되고, sumyzyme AC를 제외한 다른 효소 6종은 액상으로 공급되었다.
(2) 인삼 추출물의 생물전환 효소 선별
효소 viscozyme, rohament, plantase, sumyzyme, celluclast, novozyme, pectinex 7종을 이용하여 생물전환에 사용하였다. 효소의 제조를 위하여 베타글루칸네이즈 100mg을 15ml 펠콘 튜브 들어 있는 pH 7.0 완충용액 0.1M K2HPO4 10ml에 용해하였다.
효소 반응을 위하여 제조된 효소 용액을 이용하여 효소 반응 실험을 하였다. 인삼 1ml와 0.1M phosphate buffer 8ml 그리고 효소 viscozyme, rohament, plantase, sumyzyme, celluclast, novozyme, pectinex 7종을 각각 1ml을 넣고 50℃에서 24, 48, 72시간 반응을 시켰다. 대조구(positve)는 0.1M phosphate buffer 9ml 인삼농축액(WG) 1ml를 넣어 제조하였다. 대조구(negative)의 경우 0.1M phosphate buffer 9ml 그리고 각각의 효소 1ml를 넣어 제조하였다.
(3) plantase 및 celluclast에 의한 Rb1의 생물전환
1) 0.1% Rb1 용액 제조
진세노사이드 Rb1의 효소에 의한 구조 변환을 알기 위해서 표준물질 Rb1의 제조는 Rb1 10mg을 15ml 펠콘 튜브 들어 있는 pH 7.0 완충용액 0.1M K2HPO4 10ml에 용해하였다.
2) 효소 용액 제조 및 반응
Rb1 가수분해 효소반응은 0.1% Rb1 표준용액 1ml를 2ml 용량의 뚜껑이 있는 유리병에 담고 효소 plantase TCL 100ul, celluclast 100ul 씩 넣고 50℃에서 18, 24시간 반응을 시켜주었다.
3) plantase 및 celluclast에 의한 인삼 추출물의 생물전환
최종으로 선택된 plantase와 celluclast의 생물전환 실험을 위해 인삼 10ml와 0.1M phosphate buffer 80ml 그리고 plantase 및 celluclast 효소를 각각 1ml 넣고 50℃에서 72시간까지 반응시켰다. 대조구(positve)는 0.1M phosphate buffer 90ml 인삼농축액(WG) 1ml를 넣어 제조하였다. 대조구(negative)의 경우 0.1M phosphate buffer 90ml 그리고 각각의 효소 10ml를 넣어 제조하였다.
(4) 발효 시간별 plantase 효소를 사용하여 발효 한 인삼의 진세노사이드 함량 결과
　 진세노사이드 2시간 발효 24시간 발효 48시간 발효
1 Rg1 678.290 450.873 450.778
2 Re 756.158 560.307 707.783
3 Rg2 71.621 132.810 132.816
4 Rb1 771.999 1165.641 892.479
5 Rc 833.063 1048.689 1071.659
6 Rb2 460.922 571.750 617.249
7 Rb3 89.957 104.916 106.902
8 Rd 549.658 569.736 754.319
9 Rg2(20S) 5.481 89.614 82.696
10 Rg3(20R) 1.099 48.874 49.327
합　 4218.246 4743.21 4866.008
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, Plantase 효소를 이용하여 발효한 결과 발효 시간이 길어질수록 특정 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가하였다. 그러나 공정상 24시간에서 48시간 발효 시간 대비 Rg3의 함량 증가는 미미한 수준으로 24시간 발효를 시키는 것이 우수함을 확인하였다. 이 조건을 토대로 최적 공정개발에 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
(5) 효소 plantase를 이용한 인삼 발효물의 진세노사이드 분포
인삼 발효물을 이용한 생물전환 실험으로 분석의 타겟은 PPD 계열의 Rg3와 Rh2이다. 그 외에도 인삼과 발효인삼의 생물전환 분포를 확인하고 발효에 따른 변화를 확인하고자 HPLC를 분석하였으며, 도 2에서 kinetics를 확인하였다.
도 2(A)에 나타낸 바와 같이, 발효 전 인삼 농축액은 PPD 계열에서 Rb와 Rc가 높게 분포되어 있음을 확인하였다. Plantase를 이용한 인삼 발효액의 경우 PPD 계열에서 Rb와 Rc는 현저히 줄었으며, Rg3, Rk1, Rg5 그리고 Rh2가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 발효하지 않은 인삼 농축액에서 Rg3와 Rh2의 합이 6.29mg/g 이었으나, plantase를 이용하여 인삼 발효한 시료에서 21.32mg/g로서 양이 약 3.4배 증가하였으며, 본 발명에서 타깃으로 하는 Rg3의 양은 5.7 mg/g에서 19.1 mg/g으로 약 3.3배로 양이 크게 증가하였으며, Rh2의 양은 0.60 mg/g에서 2.35 mg/g으로 약 4배 이상 생물전환 되었음을 확인하였다.
도 2(B)에 나타낸 바와 같이, PPT 계열을 확인한 결과 인삼 농축액의 경우 Rg2와 Rh1의 분포가 높게 나타났으며 상대적으로 Rg1, Re, Rf의 분포가 낮게 나타났다. 하지만 plantase를 이용하여 발효한 인삼 배양액의 경우 Rh1의 분포가 줄었으며 Rg1의 경우 2 mg/g에서 6.18 mg/g 으로 약 3배 이상 증가하였다. Re 또한 약 3배 이상 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, Rf와 Rh4의 양 또한 약 3배씩 증가함을 확인하였다.
따라서 plantase를 사용할 경우 PPD 계열에서 Rg3와 Rh2의 생물전환율이 높음을 확인하였으며, 이는 본 발명에서 타겟으로 하는 Rg3, Rh2로의 생물전환에 사용될 균주로 매우 적합함을 확인하였다. 또한, 앞의 결과에서 나타내듯 가장 효과적으로 생물전환 된 Fusarium verticillioides KCTC 6065과 비슷한 양상으로 생물전환 되고 있음을 알 수 있었다.
3. 전통 발효 식품으로부터 분리한 프로바이오틱 균주를 이용한 인삼 추출물의 생물 전환
(1) 균주 선정
한국 전통발효 식품 중 시중에 판매되고 있는 김치 3종으로부터 균주 9종을 분리하였다. 그 중 생물전환 균주로 선별된 균주를 동정하기 위하여 최종적으로 선택된 균주를 MMYA2S5WG 배지, 30℃, 24시간 동안 배양하여 콜로니를 성장시킨 후 균주를 분리하였다. 그리고 동정하기 위해 균주의 계통학적 위치결정을 위한 sequencing을 수행한 결과 1483bp, 1456bp, 1508bp의 염기서열로 구성되어 있고, Leuconostoc type과 Lactobacillus type 그리고 Weissella type에 속하는 균주로 확인되었다. 분리된 유산균 중 실험에 사용할 균주 3종은 연속적인 계대배양을 통하여 순수 분리를 했으며, 순수 분리된 유산균은 보존을 위하여 10% 글리세린을 이용하여 suspension 후 -40℃에서 동결하였다.
(2) 전형적인 유산균 배지에서 증식
설탕을 탄소원으로 올리고당 발효 생산 균주들 중에서 대표적인 균주는 Leuconostoc 속이다. 이는 pH4.8 이하에서는 생장이 잘 안 되는 균이다. 세포의 크기는 0.9~1.2u 로서 생육 적정 온도는 21~25℃이다. 특히 설탕 용액에서는 덱스트란으로 된 점층으로 싸여 있는 것이 특징이다. Leuconostoc 속의 균주는 글루코스, 과당, 갈락토스, 마노스, 자일로스 아라비노스 등을 발효한다.
최종적으로 선택된 균주는 전형적인 유산균 증식 배지인 MRS에서 전형적인 협막 생산을 보여주었다. 이 협막은 sucrose 배지로 덱스트란으로 추정하였다 하지만 sucrose를 첨가하지 않은 배지에서는 협막의 생산을 보여주지 않고 전형적인 콜로니의 집합을 보여주었다.
(3) 탄소원으로서 슈크로오스와 인삼농축액 발효
발효 전과 발효 후의 발효액을 이용하여 TLC로 진세노사이드를 분리하여 발효 패턴을 비교하여 분석을 하였다. 진세노사이드 표준물질은 Rg3, Rg1, Rh1, Rh2이었다. 발효에 사용된 농축액의 진세노사이드 분포는 표준물질을 비교해볼 때 모두 포함이 되어있지는 않았다. 하지만 Weissella cibaria , Leuconostoc argentimum에서 발효된 발효액에서 일부 Rg3로 생물전환 되었음을 확인되었다. 상기 결과를 토대로 인삼농축액은 액내 발효 배양에서 균주의 증식 및 발효 중 생물전환의 가능성이 있는 균주로 확인하였으며, 스팟이 정확하게 나온 Weissella cibaria 균주를 생물전환 발효균주로 확정하였다.
정확한 분석을 위하여 수포화부탄올을 이용하여 샘플 정제를 하였으며, 정제된 샘플은 다시 필터(PURADISC NYL25 FILTER, 25mm 0.2㎛ 50units)를 이용하여 필터링하였다. 그 결과 더욱 정확하고 선명한 TLC 결과를 확보하였으며, Rg3로 생물전환 됨을 다시 확인하였다.
(4) Weissella cibaria를 이용한 인삼 발효 진세노사이드의 분포
Weissella cibaria를 이용한 인삼 발효물을 이용한 생물전환 실험으로, 분석의 타겟은 PPD계열의 Rg3와 Rh2이었다. 그 외에도 인삼과 발효인삼의 생물전환 분포를 확인하고 발효에 따른 변화를 확인하고자 HPLC를 분석하였으며, 도 3에서 kinetics을 확인하였다.
도 3(A)에 나타낸 바와 같이, 발효 전 즉 인삼 농축액은 중요한 프로토파낙스디올(PPD) 계열 중 Rb계열과 Rc가 높게 분석되었으나, Weissella cibaria를 이용한 인삼 발효 후의 결과 프로토파낙스디올(PPD) 계열의 경우 Rg3와 Rg5의 양이 증가하였음을 확인하였다.
Weissella cibaria를 이용한 인삼 발효 후 생물전환 분석을 한 결과 프로토파낙스디올(PPD) 계열의 주요 진세노사이드들인 Rg3와 Rh2의 합은 10.91 mg/g이었다. 발효 전의 경우 Rg3와 Rh2의 합이 6.3 mg/g 이었으며, 이는 1.7배 증가함을 확인하였다.
도 3(B)에 나타낸 바와 같이, 프로토파낙스트리올(PPT) 계열은 발효 전과 발효 후 모두 약 18 mg/g으로 총 양은 비슷하였으나 발효 후 Rg1의 양이 약 2배 증가하였으며, Rf와 Rg2가 현저히 줄어들었음을 확인하였다. 특히 PPT 계열의 주요 진세노사이드인 Rg2(미량), Rh1, Rh4의 합은 9.47mg/g 이었다.
4. 진세노사이드 분석방법
(1) 진세노사이드 TLC 분석방법
샘플 추출물 제조를 위하여 샘플 분말 5g과 70% MeOH 150ml (증류수 45 ml + MeOH 105 ml)를 250ml의 삼각 플라스크에 취한 후 환류냉각기를 부착하여 heating mantle (Misung S&I. Korea) 설치하고 60℃에서 3시간 추출한 다음 AIR Compress를 사용하여 vacuum을 걸어 Whatman No. 1 여과지로 여과하여 그 여액을 모았다. 농축기는 asprator (TOKYO RIKKIAI. CO. LRD. Japan)를 부착하여 vacuum를 걸어 농축기(Sunil instrument. Korea)를 사용하여 MeOH를 날려 보냈다. 샘플 추출물에서 분리한 샘플 여액을 수포화 부탄올 150ml 가하여 잘 흔들어주어 섞이게 한 다음 층 분리를 시킨 후 부탄올층만을 걸러내었다. 이 과정을 한 번 더 반복한 다음 분리시킨 부탄올층만을 모아서 70℃에서 400mHg로 감압농축을 하여 BuOH을 증발시켰다. 완전히 농축을 행한 후 50ml MeOH에 녹였다.
전개장치(TLC Chamber, 27×7×24, w/cover) 내부를 항상 포화 상태로 유지하기 위해서 전개 장치 안쪽 면에 전개용매를 흡수할 여지를 넣었다. 전개용매는 BuOH : Ethyl acetate : Water(5 : 5 : 4, v/v, upper layer)를 사용하였으며 spot에서부터 상단 0.5cm 아래의 상한선에 도달하면 plate를 꺼내어 드라이기를 이용하여 건조시켰다.
TLC plate는 (Sillica gel 60F 254, Merck, USA) aluminium sheets를 사용하였으며 전개용매에 전개하기 전에 30℃ Dry oven에서 5분 정도 건조한 다음 사용하였으며 TLC Plate의 하단으로부터 약 1.5cm 위에 연필로 평행선을 표시하고 1cm 간격으로 점적하였으며 용매이동거리는 10cm로 하였다. End of development는 상단 0.5cm에 연필로 평행선을 표시하였다.
TLC Plate는 Merck KGaA Sillica gel 60F254 (USA)를 사용하였으며 20×20을 일정하게 14×10cm 또는 10×10cm로 등분하였다. 샘플을 loading 하는 위치는 TLC Plate의 하단으로부터 약 1.5cm 위에 연필로 평행선을 표시하고 Micro-pipette으로 효소 용액은 1μl씩 loading하고 standard 용액은 2μl씩 loading하였다. 1.0cm 간격으로 점적하였다. 상승식 전개법을 사용하여 점적한 TLC Plate를 전개장치 내에 거의 수직으로 세워두었다. 전개장치의 내부를 항상 포화 (saturation)로 유지하기위하여 전개 장치 안쪽 면에 전개용매를 충분히 흡수할 여지를 넣었다. 전개용매가 Spot에서부터 상단 0.5cm (end of development) 아래의 경계선에 도달하면 plate를 꺼내 드라이기를 이용하여 건조시켰다. 건조된 TLC plate는 5% H2SO4 α-naphthol+ MeOH 발색용매를 스프레이를 이용해 분사시키고 105℃ dry oven에서 10분간 가온 발색시켰다. 진세노사이드의 정량은 TLC 플레이트에 있는 진세노사이드 반점들을 EPSON의 scanner를 이용하여 스캔한 다음 image analysis software인 Scion Image Program(Scion Image, Scion Corp., Maryland, USA)을 이용하여 disital image를 분석하였다. 이러한 분석 방법에 의하여 ginsenosides TLC 분석 validation을 위한 linearity, precision (repeatability and reproducibility), accuracy (recovery) 를 수행하였다.
진세노사이드 분석 시료의 조제는 메탄올 1ml에 Rb, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg3, Rg5, Rk1, Rh1, Rh2를 1㎕를 넣어 혼합한 후 필터(PURADISC NYL25 FILTER, 25mm 0.2㎛ 50units)로 여과하였다. HPLC기기는 Agilent 1200(Agilent Technologies Inc., Philadelphia, USA)사 HPLC의 UV Detector를 사용하였고, Column 은 YMC Pro C18RS (YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan) 사용하였다. Inject volume은 10㎕로 분석하였으며, 이동상은 (A)water 와 (B)acetonitrile을 사용하였고, 용매 기울기는 0분 17%A, 55분 30%A, 80분 40%A, 135분 60%A, 140분 17%로 하였다. Column 온도는 30℃, 유속은 0.8ml/min으로, 자외선 검출기로 203nm로 검출하였다.
(2) 진세노사이드 정량평가를 위한 HPLC 분석
진세노사이드를 정량평가하기 위하여 진세노사이드 표준샘플 10종을 standard로 하여 함량을 확인하였다. 시료 6개는 모두 1.5mL tube에 0.5mL 정도 액체상태에서 12000 rpm으로 원심분리를 통해 미립자를 가라앉힌 뒤, 상층액만 취해 시료로 사용하였다.
HPLC 방법으로 Column : ACE 5 C18 (250X4.6)mm with Guard column, Eluent : 18% ACN ~100% ACN gradient (인삼분석 method 이용), UV : 203nm
Flow rate : 1.0ml/min, Column Temp. : 40℃, Injection Vol : 30㎕를 사용하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 플랜테이즈(plantase) 효소로 삼을 발효하는 단계;
    상기 삼 발효액을 50℃에서 24시간 동안 숙성시키는 단계; 및
    상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 함량이 증가된 삼 발효 조성물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 진세노사이드의 함량이 증가된 삼 발효 화장료 조성물.
  5. 제 1 항의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 진세노사이드의 함량이 증가된 삼 발효 식품 조성물.
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