KR101330864B1 - 펙티나아제를 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 인삼 또는 홍삼에 미량으로 존재하는 진세노사이드 Rd를 간편하고, 경제적으로 구조전환시킬 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 함량에는 감소 없이 펙티나아제를 이용하여 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 소련의 과학자 C.A.Meyer가 1843년에 만병을 치료한다는 의미로 학명을 "Panax ginseng C.A. Meyer"로 명명된 식물학적으로는 오가과(Araliaceae) 인삼속(Panax)에 속하는 식물로 뿌리를 약용으로 이용하고 있다. 이러한 인삼은 자연 건강식품으로 널리 이용되고 있으며, 약리 효능의 과학적 입증과 임상을 근거로 인식과 신뢰가 높으며, 의약품 및 기능성 식품으로 그 수요가 증가하고 있다.
이러한 인삼의 효능은 주로 인삼 사포닌인 진세노사이드가 관여하는데, 현재인삼 진세노사이드는 약 30종이 화학 구조가 밝혀져 있으며, 현재 알려져 있는 주요 진세노사이드는 13가지 기본 진세노사이드와 전환된 진세노사이드 11가지 형태로 34종의 진세노사이드가 알려져 있다. 인삼에는 Rg1, Rb1, Rb2, Rc, Re 등의 진세노사이드가 주를 이루고 있으며, 이를 찌고 말리는 과정을 반복한 홍삼의 경우 인삼에는 거의 존재하지 않는 Rg3, Rh1, Rh2, Compound K의 함량이 증가하는 것으로 나타나 있다.
그러나 상기 사포닌은 장내 미생물에 의해 분해 및 전환이 이루어져 체내로 흡수된다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과 사람에 따라 사포닌의 흡수 정도가 다른 것으로 규명되어 있다. 예를 들어, 2004년도 한국 식품영양학회 국제학술대회Ham et al. 에 따르면 사포닌을 흡수할 수 있는 그룹을 제외하고 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, 이하 'PPD'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 20.3%, 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol, 이하 'PPT'라 칭한다.)계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 12.5%, 아예 사포닌 흡수를 못하는 그룹이 4.7%로 사람마다 흡수율의 차이가 두드러지고 있는 것이다.
이에, 사포닌의 체내 흡수율을 증가시키기 위해 유용한 미생물을 이용하여 수삼을 발효하고, 미생물의 당분해효소 등을 이용하여 배당체 구조인 인삼사포닌(ginsenoside)의 성분전환을 유도하여 영양학적, 기능적 가치를 높이고자 하는 인삼 발효 미생물의 선별에 관한 연구가 진행되고(Kim et al., 2007) 있다. 그 일 예로 유산균을 이용한 발효인삼제조에 가장 적합한 유산 균주 및 최적공정을 확립하여 차후 건강기능성 식품소재로서의 유산균 발효 인삼제품화 가능성을 조사한 연구가 수행되고(Park et al., 2006) 있으며, 백삼, 홍삼과 대비하여 발효인삼의 일반성분에 대한 성분 특성에 대한 연구가 보고된 바 있다(Kong et al., 2008).
또한, 인삼을 비롯한 다양한 소재들을 활용하여 발효하거나 또는 첨가하여 식품의 기능성 강화, 관능적 품질을 향상시켜 발효식품으로서 개발하려는 연구가 시도되고 있으며(Kim and Han, 2005), 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하고 체내 유익균의 성장을 촉진하는 생균활성제(probiotics)로서 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균인 락토바실리(Lactobacilli) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 유산균이 보고된 바 있다(Goldin,1998).
한국등록특허 제10-0884252호 "Lactobacillus plantarum NUC-JiKCCM10582로 제조한 발효홍삼 및 그 제조"에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NUC-J1 KCCM 10852P를 이용하여 진세노사이드(ginsenoside) Rg3 및 Rh2, Compound K를 함유하는 발효홍삼을 제조하는 방법이 제공되어 있다.
일반적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 포함하는 유산균을 활용한 발효 홍삼은 사포닌 배당체가 유산균에 의해 생성되는 유기산성분에 의해 당가수분해되어 생성된 진세노사이드 Rg3가 고농도로 함유하게 되는 것이 대부분이다.
또한, 산업현장에서 출시되는 발효홍삼 역시 진세노사이드 Rg3나 Compound K의 함량이 높은 것을 발효 홍삼의 특징으로 내세우고 있다.
그러나 진세노사이드 Rg3나 Compound K는 세포독성 작용 등이 알려져 있어 고농도로 함유될 경우 부작용을 초래할 수 있는 문제점이 우려되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 지속하던 중, 진세노사이드 Rb1이나 Rc 등을 진세노사이드 Rg3나 Rg5로 전환시키는 것이 아니라 진세노사이드 Rd로 전환시킴으로써 다량의 진세노사이드 Rd를 생산시킬 수 있는 새로운 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 함량에는 감소가 없으며, 펙티나아제를 이용하여 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 발효인삼 또는 발효홍삼을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 또는 홍삼에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 상기 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소발효하는 단계; 상기 효소발효액을 살균한 후 냉각하는 단계; 상기 냉각된 인삼, 홍삼 또는 이들의 추출 혼합물 배양액에 식물성 프로바이오틱 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 인삼 사포닌은 진세노사이드를 말한다.
본 발명의 진세노사이드 Rd는 PPD계 진세노사이드의 일종으로, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가지는 화합물이다.
[화학식 1]
상기 진세노사이드 Rd는 인삼 또는 홍삼에 1% 미만으로 미량 존재하며 산업적으로 잘 이용되지 않아 왔으나, 관절염 개선, 연골 재생, 콜라겐 형성 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 유용사포닌인 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼 의 제조방법으로 인삼 또는 홍삼에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 상기 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출액에 효소를 첨가하여 효소발효하는 단계; 상기 효소발효액을 살균한 후 냉각하는 단계; 상기 냉각된 인삼, 홍삼 또는 이들의 추출 혼합물 배양액에 식물성 프로바이오틱 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법을 제공한다. 도 1을 참조한다.
상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 80 내지 100℃에서 5 내지 20분 동안 살균할 수 있다.
상기 제조방법은 발효 후 통상적인 방법에 따라 진공농축, 스프레이 드라이 또는 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서 50 내지 70℃에서 감압농축 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 수삼, 백삼, 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium) 및 히말라야삼(Panax pseudoginseng)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인삼일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 수삼은 밭에서 캐낸 후 가공하지 아니한 상태의 생삼을 말하며, 백삼은 주로 4∼6년근 수삼을 원료로 하여 표피를 제거하거나 제거하지 않고 건조, 가공한 것을 말한다.
본 발명에 있어서 홍삼은 4 내지 6년근 수삼을 엄격히 선별하여 표피를 제거하지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색 인삼을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼 및 홍삼의 형태는 추출물 또는 엑기스 형태일 수 있으며 바람직하게는 열수추출법, 주정(酒精)추출법 또는 혼합추출법에 의해 제조된 추출물 형태인 것을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출물의 추출은 추출에 앞서 추출효율을 높이기 위하여 분쇄 또는 분말화할 수 있으며, 당업계에 공지된 통상적인 추출법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 물 추출법, 알코올 추출법, 유기용매 추출법 및 초임계 추출법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 추출법을 이용하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알코올 추출법에 있어 사용되는 추출용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올,이소프로판올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 등을 사용할 수 있으며. 상기 유기용매 추출법의 추출용매로는 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산, 시클로헥산 및 석유에테르 등의 유기용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
추출시 첨가되는 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 인삼 또는 홍삼 건조 중량)에 대하여 추출용매를 2배 내지 20배(중량기준)로 사용할 수 있다. 추출효율을 증가시키기 위해서는 바람직하게는, 인삼 또는 홍삼에 대하여 추출용매 5배 내지 15배(중량기준)를 사용하여 2회 이상 수회 반복할 수 있다.
추출온도는 50 내지 110℃가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 70 내지 100℃이다. 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 2시간 내지 8시간 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.
상기 엑기스는 감압증류법이나 박막증류법으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출물은 감압농축하여 고형분의 함량이 3 내지 20 브릭스(Brix)인 것을 사용할 수 있다.
상기 고형분의 함량을 3 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하지 않으면 농도가 너무 진해서 발효가 잘되지 않고 겔화되기 때문에, 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출물의 고형분 함량을 3 내지 20 브릭스(Brix)로 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 효소발효 단계는 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출물의 중량에 0.1 내지 15 중량% 정도가 되도록, 바람직하게는 10 중량% 정도가 되도록 효소를 첨가하고 20 내지 60℃의 반응기에서 2 내지 5일 동안 효소발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 50℃에서 3일 정도 배양하는 것이 바람직하다.
이때 상기 첨가한 효소에 의하여 발효가 가속화되어 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다.
본 발명의 상기 효소발효 단계에서 효소로서 펙티나아제를 이용하며, 바람직하게 펙티나아제는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear), α-허브자임(α-herbzym), 노보자임 33095(Novozym 33095)이며, 더욱 바람직하게는 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear) 또는 노보자임 33095(Novozym 33095)인 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는, 상기 4가지 효소는 모두 PPD계열 사포닌에 작용하는 효소로서 PPT계열 사포닌의 함량에는 크게 영향을 미치지 않아 진세노사이드 Rg1 및 Rb1 함량을 감소시키지 않고 PPD계열 사포닌의 함량을 강화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소발효액의 살균 단계는 80 내지 100℃에서 5 내지 30분 동안 살균하며, 바람직하게는 95℃에서 10분 동안 가열하는 것이 바람직하다. 이때 가열에 의하여 상기 첨가된 효소의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소발효액을 살균한 후 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 냉각시킨다.
본 발명의 발효인삼 또는 발효홍삼은 식물성 프로바이오틱 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 사용하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는 본 발명의 식물성 프로바이오틱 유산균은 인삼 또는 홍삼의 추출물에서 배양/발효시 진세노사이드 Rb1이나 Rc 등을 진세노사이드 Rg3나 Rg5로전환시키는 것이 아니라 진세노사이드 Rd로 전환시킴으로써 다량의 진세노사이드 Rd를 생산시킬 수 있게 한다.
본 발명에 따른 식물성 프로바이오틱 유산균은 통상적인 유산균의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 사포닌이 포함된 추출물 또는 조추출물이 첨가된 배지를 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 유산균 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 30℃ 내지 40℃, 바람직하게는 34℃ 내지 38℃에서 0.5일 내지 7일, 바람직하게는 3일 내지 5일 배양할 수 있다. 더욱 바람직하게는 37℃에서 2일 정도 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 균주발효는 3 내지 5일 동안 pH 6.5 내지 8.5에서 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5일 동안 35 내지 38℃의 온도에서 pH 7 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발효인삼 또는 발효홍삼은 인삼 또는 홍삼 추출물의 초기 사포닌함량에 따라 달라질 수 있으나, 상기 식물성 프로바이오틱 유산균 발효에 의해 0.5㎎/g 내지 100 ㎎/g의 진세노사이드 Rd가 함유된 발효인삼으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 발효인삼은 상기 제조방법에 따른 발효에 의해 3 ㎎/g 내지 50 ㎎/g의 진세노사이드 Rd가 함유된 발효인삼으로 제조될 수 있으며, 발효홍삼은 0.5 ㎎/g 내지 30 ㎎/g의 진세노사이드 Rd가 함유된 발효홍삼으로 제조될 수 있다
더욱 상세하게는 인삼 추출물에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 활용하여 37℃, pH 7의 조건하에서 5일을 배양/발효시킴으로써 6배 이상의 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 홍삼 추출물에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 활용하여 37℃, pH 7 조건하에서 5일을 배양/발효시킴으로써 6배 이상의 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었고, pH 8의 조건하에서 5일을 배양/발효시킴으로써 11배 이상의 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼을 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 상기 방법에 따라 제조된 발효인삼 또는 발효홍삼을 제공한다.
더욱 바람직하게는 상기 발효인삼 또는 발효홍삼은 효소를 첨가하여 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주에 의해 생성되는 0.5 ㎎/g 내지 150㎎/g의 진세노사이드 Rd를 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 발효인삼 또는 발효홍삼은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1 함량 변화 없이 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시킬 수 있으며, 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킬 수 있다. 또한, pH 중성 내지 약 알카리성 조건 하에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 활용하여 배양/발효시킴으로써 세포독성이 없고, 몸에 흡수가 뛰어나고 기능적 활성을 가진 진세노사이드 Rd로 더 많은 구조전환을 시킬 수 있어 기존의 인삼 또는 홍삼과 차별성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법은 인삼 또는 홍삼에 미량으로 존재하는 진세노사이드 Rd를 간편하고, 경제적으로 구조전환시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1 함량 변화 없이 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시킬 수 있으며, 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점을 가지고 있다.
또한, 본 발명은 인삼 또는 홍삼을 pH 중성 내지 약알카리성 조건 하에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 활용하여 배양/발효시킴으로써 세포독성이 없고, 몸에 흡수가 뛰어나고 기능적 활성을 가진 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼을 제조할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조
방법의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 효소별 진세노사이드 Rd 강화 조사포닌의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 효소별 진세노사이드 Rd 강화 인삼농축액의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 효소발효 후 인삼 농축액의 온도 및 농도별 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 홍삼 농축액 12 Brix에서 효소 농도에 따른 시간별 진세노사이드 Rd의 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 추출물 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 효소를 첨가하고 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum)으로 제조한 발효홍삼의 진세노사이드 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조한 진세노사이드 Rd 강화 발효홍삼의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
방법의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 효소별 진세노사이드 Rd 강화 조사포닌의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 효소별 진세노사이드 Rd 강화 인삼농축액의 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 효소발효 후 인삼 농축액의 온도 및 농도별 사포닌 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 홍삼 농축액 12 Brix에서 효소 농도에 따른 시간별 진세노사이드 Rd의 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 추출물 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 효소를 첨가하고 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum)으로 제조한 발효홍삼의 진세노사이드 함량을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조한 진세노사이드 Rd 강화 발효홍삼의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 효소를 이용한 인삼추출물 또는 홍삼추출물의 효소발효
조사포닌((주)위디아), 인삼추출물((주)성신BST), 홍삼((주)우신산업)을 구입하여 사용하였다. 홍삼은 80% 에탄올로 환류 추출하여 추출액을 얻었고, 인삼 또는 홍삼 추출물은 동결건조하여 사용하였다. 효소는 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)는 Novozymes(Denmark)에서 α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 한국효소원 (한국)에서 구입하였다.
진세노사이드 함량 분석을 위하여, 추출액에 수포화 n-부탄올 1:1을 넣고 충분히 혼합한 후 원심분리하여 수포화 n-부탄올 층을 회수하는 것을 2회 더 반복하였다. 회수된 수포화 n-부탄올 층에 증류수 3mL로 세척한 후 원심분리하여 부탄올 층만을 회수하여 70℃ 수욕조에서 농축하여 분석을 위한 사포닌 성분을 회수하였다.
진세노사이드 함량분석은 Waters-PDA(Waters 1525, detector 2998, USA)를 활용하여 물(A액)과 ACN (B액)을 하기 표 1 및 표 2 같은 용매 조건으로 flow rate 1.0 ml/min으로 하여 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석하였다.
(1) 효소에 따른 진세노사이드 함량 분석
상기 조사포닌, 인삼추출물, 홍삼추출물 각각 5 mg을 증류수 2 mL에 완전히 녹이고, 효소액은 1% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 50℃ Shaking Incubator에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다.
울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1), 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2), 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3), α-허브자임(α-herbzym)(E4)을 조사포닌, 인삼농축액 및 홍삼농축액에 1% (v/v)가 되도록 첨가한 후 50℃에서 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켜 진세노사이드 함량을 분석하였다.
상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 조사포닌 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 3, 표 4 및 도 2에 나타내었다.
상기 4가지 효소에 의한 효소발효 후 인삼추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 5, 표 6 및 도 3에 나타내었다.
상기 표 3 내지 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 4가지 효소 모두 PPT계열 사포닌의 함량에는 크게 영향을 미치지 않았으나 PPD계열 사포닌의 함량변화에는 영향을 미쳐 PPD계열 사포닌에 작용하는 효소로 판단되었다.
상기 표 3 및 표 4와 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rd 함량을 선택적으로 가장 높이는 효소는 4가지 효소 중 E3인 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)로 나타났다. 울트라자임 AFP(Ultrazyme AFP)(E1)과 α-허브자임(α-herbzym)(E4)은 진세노사이드 Rd 함량을 높이나 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)보다 진세노사이드 Rd의 절대함량이 떨어졌고, 펙티넥스 울트라 AFP(Pectinex Ultra AFP)(E2)는 반응이 매우 빠르게 진행되어 같은 시간에 진세노사이드 Rd를 거쳐 F2와 Compound K 생성량이 많아 F2와 Compound K를 최종산물로 할 경우 유용한 효소로 판단되었다. 진세노사이드 Rd 생성은 정도의 차이는 있었으나 조사포닌과 인삼추출물에서 모두 반응 1 내지 6시간에 가장 높은 진세노사이드 Rd 수치를 나타 내는 것으로 확인되었다.
(2) 추출물 농도 및 온도에 따른
진세노사이드
함량 분석
인삼 또는 홍삼농축액은 증류수로 3, 6, 12 Brix로 희석시켜 사용하였다. 추출액 2 mL에 효소액(E2, E3)은 10% (v/v)로 하여 0.5 mL씩 넣어 2.5 mL로 맞추었다. 온도는 각각 37℃, 50℃로 설정하여 Shaking Incubator에서 120 RPM으로 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응시켰다. 무처리군은 효소 대신 증류수를 가하여 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.
펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)를 37℃와 50℃ 온도 조건에서, 인삼추출물의 농도를 3 Brix, 6 Brix, 12 Brix로 조절하여 추출물 농도 및 온도에 대한 실험을 수행하고, 진세노사이드 함량을 조사하여 하기 표 7, 표 8 및 도 4에 나타내었다.
상기 표 7 및 표 8과 도 4에 나타낸 바와 같이, 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)에 의한 진세노사이드 Rd 함량을 높이는 온도 조건은 같은 추출물 조건에서 37℃ 보다 50℃가 훨씬 더 높은 진세노사이드 Rd 전환율을 보였고, 50℃ 온도조건에서는 추출물 농도가 낮을 때 진세노사이드 Rd의 전환이 빠르게 나타났고, 추출물 농도를 높일 경우 반응 시간 연장 및 효소 농도 조정이 필요한 것으로 나타났다. 그러나 추출물의 농도가 낮을 경우 농축 등의 시간적 경제적 비용이 높아지므로 경제적인 생산 방법은 추출물 농도를 높이고 반응시간을 다소 연장하는 것이 좋을 것으로 판단되었다. 따라서 본 실험을 통하여 진세노사이드 Rd 함량을 높이기 위한 최적 효소 온도는 50℃이고, 추출물 농도는 12 Brix로 결정하되 반응 시간 및 효소 농도를 조정하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
(3) 효소 농도 및 시간에 따른
진세노사이드
함량 분석
홍삼농축액을 증류수로 희석시켜 12 Brix (550 mg에 2.5 mL 증류수)으로 조정한 후 효소액(노보자임 33095(Novozym 33095) (E5))을 10% 또는 15% (w/w)를 넣고 50℃ shaking incubator에서 RPM은 120으로 하여 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일 동안 반응시켰다. 효소반응물은 95℃에서 10분간 처리하여 반응을 중지시켰다.
효소는 기존 실험에서 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear)(E3)로 결정되었으나 연내 판매보류로 같은 종류의 현재 시판중인 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)로 효소를 변경하여 사용하였다. 12 Brix로 조정한 홍삼추출물에 효소 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 각각 10%와 15%가 되게 넣고 50℃에서 1일, 2일, 3일, 4일간 반응시킨 후 진세노사이드 함량을 분석하여 하기 표 9 및 도 5에 나타내었다.
상기 표 9 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 함량을 분석한 결과 시간이 증가할수록 진세노사이드 Rd의 함량이 증가하였으나 2일 이후부터는 큰 폭으로 증가하는 경향을 보이지 않았고, 효소 10%와 15%간에 현격한 차이가 나타나지 않음을 관찰하였다. 따라서 12 Brix의 인삼 추출물에 노보자임 33095(Novozym 33095) (E5)를 10% 정도로 넣고 50℃에서 3일간 반응하였을 때 인삼·홍삼 지표성분인 Rg1과 Rb1의 합이 크게 줄지 않으면서도 진세노사이드 Rd 수준이 크게 증가한 효소반응물을 얻을 수 있음을 확인하였다.
[
실시예
2]
Lactobacillus
plantarum
발효를 이용한 발효인삼 또는
발효홍삼
의 제조
인삼농축액((주)성신BST), 홍삼농축액(금산덕원인삼약초영농조합)을 구입하여 사용하였다. 발효에 사용한 균주는 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum (KACC 11451)를 농촌진흥청 농업유전자원정보센터에서 분양받아 사용하였다.
인삼 또는 홍삼 농축액의 농도는 당도계(Master-M, Atago, Japan)를 이용하여 6 Brix, 12 Brix으로 맞춘 후 95℃에서 10분간 Autoclave(JSAC-60, DHIHAN SCIENTIFIC, Korea)에서 살균 후 실온에서 식힌 다음 활성화된 균주을 4%(w/v)씩 접종하여 발효기(LiFlus GX 5L, HANIL, Korea)를 이용하여 온도는 37℃, DO 100, RPM 100으로 조절하여 1N NaOH(Sodium hydroxide acid, SAMCHUN, Korea), 1N HCl(Hydrochloric acid, SAMCHUN, Korea)로 pH 7로 조절하여 인삼추출액은 3, 5일 동안 배양하였고, 홍삼추출액은 3일, 5일, 7일, 9일 동안 배양하였다. 배양액은 95℃에서 10분간 살균한 후 서서히 식힌 다음 여과지(Whatman No 2.)로 여과하고 2차로 원심분리기(Combi-514R, HANIL, Korea)로 여과시켰다. 여과시킨 여액을 냉동고에 하루 동안 넣어 두었다가 freeze dryer(FD5508, Ilshin BioBase)에 넣고 동결건조하여 사용하였다.
추출물의 농도에 따른 Lactobacillus plantarum에 의한 홍삼 발효물의 진세노사이드 함량을 분석하여 하기 표 10 및 도 6에 나타내었다.
발효를 위한 기존의 추출물 농도 3 Brix는 사업화했을 경우 묽어 추출물의 절대량에 비해 부피가 많아 1회 수용량이 적어지고, 발효물 농축액을 만들 때 농축을 많이 해야 하므로 시간적, 경제적인 비용이 높아질 수 있다. 따라서 본 연구진은 시간과 비용을 줄이기 위한 방편으로 추출물 농도를 높여 한번에 다량의 추출물을 발효할 수 있는 방안을 찾고자 추출물 농도를 6 Brix과 12 Brix로 높여 발효를 하였다. 3 Brix에는 5일 발효에 진세노사이드 Rd의 함량이 5배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 표 10 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 추출물 농도를 6 Brix으로 하였을 경우에는 9일 정도가 소요되었고, 12 Brix으로 하였을 경우에는 9일에도 3배가량 늘어나는 정도에 그쳤다. 그러나 37℃에서의 미생물 발효를 7일 이상 오래할 경우 시간적 경제적 비용이 높아지고, 오염의 염려가 있기 때문에 시간을 단축하여 발효할 필요가 있다. 따라서 본 연구진은 추출물 농도를 12 Brix으로 높인 상태에서 발효시간을 단축시키는 방안으로 효소를 첨가하여 발효하거나 접종 미생물의 량을 증가시킬 필요성을 확인하였다.
[
실시예
3] 본 발명에 따른
진세노사이드
Rd
강화 발효인삼 또는
발효홍삼
제조
홍삼농축액은 금산덕원인삼약초영농조합으로부터 구입하여 사용하였다. 효소는 노보자임 33095(Novozym 33095)(Pectin lyase;식약청 등록효소, 상품명;Novozin 33095, Denmark)를 사용하였고, 식품에서 분리하여 식용으로 널리 이용되고 있는 L. plantarum을 발효 균주로 사용하였다.
진세노사이드 Rd 강화 scale up 공정은 현행 건강기능식품법에 위배되지 않아 상용 가능한 공정으로 최적화하였다.
홍삼농축액 440 g을 2 L의 증류수에 녹여 12 Brix으로 조정한 후 발효의 가속화를 위해 10% 효소(w/w)를 넣고 50℃ 발효기(LiFlus GX 5L, HANIL, Korea)에서 3일 동안 배양시킨 후, 효소 불활성화를 위하여 95℃에서 10분간 가열하였다. 37℃로 식힌 홍삼액에 미리 활성화시킨 L. plantarum 균주를 접종하여 37℃에서 2일간 배양한 후 95℃에서 10분간 살균한 후 발효물을 60℃에서 감압농축하였다. 최종산물을 제외한 모든 단계의 발효물은 각종 분석을 위하여 freeze dryer(FD5508, Ilshin BioBase)에서 동결건조한 후 사용하였다.
본 발명에 따른 효소를 첨가하여 제조한 발효홍삼의 진세노사이드 함량을 분석하여 하기 표 11, 도 7 및 도 8에 나타내었다.
홍삼추출액 농도를 12 Brix하였을 경우 미생물 단독 발효로는 시간이 너무 많이 소요되어 발효의 가속화를 위해 효소를 넣고 발효하는 방법을 채택하였다. 홍삼추출액 12 Brix에 효소 10%를 넣고 3일간 배양한 후에 미생물을 접종하여 2일 더 배양하여 배양기간은 총 5일이 소요되게 하였고, 농축과정에서의 변화양상을 확인하기 위하여 발효물을 60℃에서 감압농축하였다.
상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 성분변화 양상을 각 단계별로 확인하기 위하여 진세노사이드 함량변화를 측정한 결과 효소를 첨가하여 배양 3일 후에 진세노사이드 Rd 함량이 8배가량 증가하였고, 미생물 접종 2일, 즉 총발효 5일째에는 10배가량 증가하였으나 감압농축 후에는 약간 감소하여 최종적으로 9배가량 진세노사이드 Rd가 증가한 발효물을 획득할 수 있었다. 홍삼추출물의 지표성분인 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 합은 발효 전에 10.5 mg/g이었으나 발효 후 최종 농축물은 9.4 mg/g으로 분석되어 다소 감소되었으나 현행법에서 요구되는 지표성분의 함량에도 크게 영향을 미치지 않았다.
본 발명의 제조방법에 따른 발효인삼 또는 발효홍삼은 현행 건강기능식품법에서의 지표성분(진세노사이드 Rg1 및 Rb1) 함량 변화 없이 진세노사이드 Rd의 함량이 10배가량 증가하였으며, 식품첨가물용 효소를 첨가함으로써 발효시간을 단축시켜 경제적이며, pH 등 조절을 위한 첨가제를 별도로 넣지 않고도 진세노사이드 Rd를 강화시킨 장점을 가지고 있다.
Claims (7)
- 인삼 또는 홍삼의 중량을 기준으로 5배 내지 15배의 추출용매를 가하여 70 내지 100℃ 온도 범위에서 2시간 내지 8시간 동안 2회 이상 반복하여 추출하는 단계;
상기 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출액 중량에 1 내지 15 중량%로 펙티넥스 울트라 클리어(Pectinex Ultra clear) 또는 노보자임 33095(Novozym 33095) 효소를 첨가하여 20 내지 60℃의 반응기에서 2 내지 5일 동안 효소발효하는 단계;
상기 효소발효액을 80 내지 100℃에서 5 내지 30분 동안 살균한 후 30 내지 40℃로 냉각하는 단계; 및
상기 냉각된 인삼, 홍삼 또는 이들의 추출 혼합물 발효액에 식물성 프로바이오틱 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) KACC 11451 균주를 접종하여 3 내지 5일 동안 pH 6.5 내지 8.5 조건에서 발효시키는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 추출물은 고형분의 함량이 3 내지 20 브릭스(Brix)의 인삼, 홍삼 또는 이들의 혼합 추출물인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 균주 발효단계 후, 진공농축, 스프레이 드라이 또는 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법. - 제 1 항, 제 3 항 또는 제 6 항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130036041A KR101330864B1 (ko) | 2013-04-02 | 2013-04-02 | 펙티나아제를 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130036041A KR101330864B1 (ko) | 2013-04-02 | 2013-04-02 | 펙티나아제를 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법 |
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| KR1020130036041A KR101330864B1 (ko) | 2013-04-02 | 2013-04-02 | 펙티나아제를 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법 |
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2013
- 2013-04-02 KR KR1020130036041A patent/KR101330864B1/ko active IP Right Grant
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