KR20180032493A - 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 및 이의 이용 - Google Patents
신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 및 이의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인삼 발효용 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 이의 배양액, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물, 이들을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는 인삼 발효액 제조방법 및 이에 의하여 제조된 인삼 발효액에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 적당한 환경에서 산양삼과 홍삼 농축액을 발효시켜 마이너 사포닌인 화합물 K (compound K)를 효과적으로 생성시키는바, 다양한 기능의 생체유효성이 높은 화합물 K의 함량이 강화된 프로바이오틱스 건강기능식품 또는 식품소재로써 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 이의 배양액, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물, 이들을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는 인삼 발효액 제조방법 및 이에 의하여 제조된 인삼 발효액에 관한 것이다.
산양삼은 고려인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)의 일종으로 산에서 경작한 삼을 말한다. 산양삼은 항산화, 항암, 비만 예방 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 진세노사이드는 인삼에만 있는 유효성분에 해당한다.
진세노사이드는 다양한 생리활성을 가진 것으로 알려져있지만, 생체흡수율은 매우 낮은 편으로, 진세노사이드 Rb1, Rd, Rg3, Rg1 및 Re의 생체 흡수율은 각각 1.18 %, 2.36 %, 2.63 %, 6.06 %, 및 7.06 %로 나타난다. 이때, 흡수되지 못한 대부분의 진세노사이드는 그냥 배출된다. 반면, 화합물 K (compound K)와 같은 마이너 (minor) 사포닌은 생체흡수율이 34 % 정도로 높게 나타나며, 이는, major 사포닌이 열, 산 또는 미생물 처리로 인하여 탄수화물 가수분해가 되기 때문으로 알려져 있다.
최근 약용식물의 미생물을 이용한 발효 방법에 많은 연구가 진행되고 있으며, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum)과 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus)를 이용하면, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 통해 생체 흡수율이 좋은 compound K를 생산할 수 있다는 보고가 있다.
화합물 K (Compound K)는 항암 작용 및 면역력 증가에 도움이 되는 것으로 알려져 있으며, 발효는 약용식물의 독성 성분이나 농약 성분을 줄인다는 연구도 발표되었다. 다만, 유산균이라고 하더라도 모든 유산균이 삼을 발효하는데 적합한 것은 아니며, 또한 삼의 항균 작용에 의해 미생물이 잘 생육하지 못하는 경우도 있는바, 발효하기에도 적합하며, 삼과 함께 배양하여도 잘 생육할 수 있는 균주에 대한 연구가 시급한 실정이다(국내등록특허 KR10-1409761 참조).
본 발명자들은 발효하기에도 적합하며, 삼과 함께 배양하여도 잘 생육할 수 있는 균주를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주에 식약처 기준에 준하는 프로바이오틱스 특성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 균주(KCTC 18488P) 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주(KCTC 18489P) 및 이의 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 배양액을 함유하는 인삼 발효용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 또는 배양액을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는 인삼 발효액 제조방법 및 이에 의하여 제조된 인삼 발효액을 포함하는 인삼 발효 음료를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 균주(수탁번호 KCTC 18488P) 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주(수탁번호 KCTC 18489P) 및 이의 배양액을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 서열번호 2의 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주 또는 배양액을 함유하는 인삼 발효용 건강기능식품 조성물, 상기 균주 또는 배양액을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는 인삼 발효액 제조방법 및 이에 의하여 제조된 인삼 발효액을 포함하는 인삼 발효 음료를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 화합물 K (Compound K)의 함량이 강화된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 적당한 환경에서 산양삼과 홍삼 농축액을 발효시켜 마이너 사포닌인 화합물 K (compound K)를 효과적으로 생성시키는 것을 실험적으로 확인하였는바, 다양한 기능의 생체유효성이 높은 화합물 K의 함량이 강화된 프로바이오틱스 건강기능식품 또는 식품소재로써 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자(rDNA)의 염기서열을 공지 균주와 비교하여 계통분류학적 모식도로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 최적 온도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 최적 pH를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 베타-글루코시다아제 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 (a) 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 (b) 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 산양삼의 발효에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 (a) 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 (b) 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 홍삼 농축액의 발효에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 프로바이오틱스 적합성 실험결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 최적 온도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 최적 pH를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 베타-글루코시다아제 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 (a) 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 (b) 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 산양삼의 발효에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 (a) 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 (b) 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 홍삼 농축액의 발효에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 프로바이오틱스 적합성 실험결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주(KCTC 18488P) 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주(KCTC 18489P) 및 이의 배양액을 제공한다.
상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자 (rDNA)의 서열은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 공시 균주인 Lactobacillus plantarum subsp . plantarum ATCC 14917T 와 100% 유사성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-06 균주로 명명하고, 2016년 08월 05일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18488P를 부여 받았다.
또한, 상기 서열번호 2의 염기서열은 공시 균주인 Lactobacillus rhamnosus JCM 1136T 와 100% 유사성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주로 명명하고, 2016년 08월 05일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 수탁번호 KCTC 18489P를 부여 받았다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 적당한 배지에서 배양하고, 얻어진 배양액에 각종 첨가제를 첨가하여, 발효 식품, 음료, 사료, 사료 첨가제 등의 제조에 사용될 수 있다. 이때 이용 가능한 배지에는 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주를 증식시킬 수 있는 것인 한 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 증류수에 맥아, 미강 및 해조류를 침지하여 얻어진 상층액에 포도당 및 효모추출물을 배합하여 멸균 냉각한 배지를 이용할 수 있다. 배양조건 및 배양기간 역시 특별한 제한은 없으나, 예를 들어 약 25 내지 40 ℃, 특히 30 내지 35 ℃의 온도에서 2 내지 5 일간, 특히 3 일간 배양한다. 얻어진 배양액은 필요한 경우 살균수를 가하여 희석하고 당분, 향료, 과즙 등을 가한 후 용기에 충전하며, 일부 제품은 가열살균한 후 충전한다. 발효 후에 살균공정을 거치지 않은 제품은 유산균이 살아있는 채로 함유되어 있으므로, 음용 후 장(腸) 내에서 정장작용을 하며, 살균한 후에 충전한 제품도 함유되어 있는 유산의 효과를 기대할 수 있다. 유산균을 함유하는 제품은 균수(菌數)가 1 ml 내에 100만개 이상 있어야 한다.
본 발명에서 “인삼”은 두릅나무과에 속하는 다년생 초본식물로, 특히 우리나라에서는 백삼 (白蔘: 생 것), 홍삼 (紅蔘: 찐 것), 미삼 (尾蔘: 가는 뿌리)으로 구분하기도 하나, 일부에서는 야생삼 (산삼)도 장뇌와 산삼으로 구별하여 사용하며, 상기 모든 종류 삼을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주가 산양삼 또는 홍삼 등 인삼 추출액을 발효시켜 진세노사이드, 특히 마이너 사포닌인 화합물 K (Compound K)를 보다 효과적으로 생성시키는 효과가 있음을 확인하였다 (실시예 5 참조).
따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 적당한 환경에서 인삼 추출액을 발효시켜 다양한 기능의 생체유효성이 높은 화합물 K를 효과적으로 생성시키는 바, 화합물 K의 함량의 강화가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명은 상기 균주 또는 배양액을 함유하는 인삼 발효용 건강기능식품 조성물, 상기 균주 또는 배양액을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는 인삼 발효액 제조방법 및 이에 의하여 제조된 인삼 발효액을 포함하는 인삼 발효 음료를 제공한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강음료용 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 샘플 준비
빼재농장 (거창)에서 수확한 10년근 산양삼과 고려인삼연구(주)에서 제조한 6년근 홍삼 농축액을 이용하여 실험하였다. 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 상촌식품 (용인)의 어육장에서 분리한 균주이다. 초기에 29개의 균주가 어육장에서 분리되었고 그 중 10개의 샘플이 MRS 배지 (BD, 미국)에서 탄소원인 덱스트로스를 제외하고 산양삼 분말을 넣은 배지에서 생장하였다. 이후 베타 글루코시다아제 활성을 가진 균을 선별하기 위해 에스큘린 배지를 이용하였다.
실시예
2. 미생물 동정
미생물 동정을 위한 16S rRNA 시퀀스 분석은 솔젠트에서 실시하였으며, ABI 9700 PCR (Applied Biosystems, Foster City, 캘리포니아, 미국) 및 ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, 캘리포니아, 미국)를 사용하였다. 16S rRNA 유전자 서열 (gene sequences)은 MEGA ver. 6.06을 이용한 Clustal W 프로그램을 이용하여 Ez-Taxon 분석 기반으로 하였다. 계통발생분석 (Phylogenetic analysis)은 Jukes 및 Cantor 알고리즘을 이용하여 근연접합법 (neighbor-joining, NJ)으로 분석하였다. 계통수 (phylogenetic tree)는 결정의 안정성을 위해 Mega version 6.06 이용하여 1,000회 샘플링 하여 부스트랩 분석하였다.
분리한 균주들은 각각 1427 bp와 1419 bp로 기존에 보고된 공시 균주인 Lactobacillus plantarum subsp . plantarum ATCC 14917T 또는 Lactobacillus rhamnosus JCM 1136T 100% 유사성을 가지는 것으로 확인하였다. 상기 균주들은 각각 플랜타럼 또는 람너서스 종에 속하는 신규한 균주로 인정받아, 이를 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-06 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원에 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 18488P, KCTC 18489P). 또한 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-06 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자 (rDNA)의 염기서열을 확인하였다.
실시예
3. 최적 온도 및 pH 확인
락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주를 5 ml MRS 배지에 37 ℃에서 24 시간 배양 후, 배양된 샘플들의 0.1 ml를 25 ml MRS 배지에 접종하여 실험하였다. 최적 온도 측정을 위해 접종된 pH 6.5의 배지를 각 25, 30, 37, 및 45 ℃에서 48 시간 동안 측정하였고, 최적 pH는 각 pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 37 ℃에서 48 시간 측정하였다. 최적 온도와 pH는 매 6시간 마다 측정하였고, 흡광도는 600 nm로 분광광도계 (Optizen 3220UV, Mecasys, 대전)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 균주의 최적 온도는 두 균주 모두 30 ℃ 였으며, 최적 pH는 6-7 임을 확인하였다.
실시예
4. 베타-글루코시다아제 (β-
Glucosidase
) 활성 확인
베타-글루코시다아제 (β-Glucosidase)는 변형된 Peralta 방법을 사용하여 측정하였다. 5 mM의 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (Sigma-Aldrich)를 50 mM 포타슘포스페이트 버퍼 (potassium phosphate buffer, pH 7.0) 1 ml에 넣고, 여기에 하루동안 배양한 MRS 배지의 상등액만 0.2 ml 취하여 버퍼에 넣어주었다. 배양액을 첨가한 버퍼를 30 분간 37 ℃에서 반응시킨 후 2 ml의 1 M 탄산나트륨 용액 (sodium carbonate solution)으로 정치 시킨 후, 흡광도를 405 nm (Optizen 3220UV, Mecasys, 대전)에서 측정하였으며, 이때, p-니트로페놀 (p-nitrophenol)을 표준물질로 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주는 28.36 U (효소활성 1U은 반응시간 분당 생성되는 p-nitrophenol 1μM을 생성하는 효소의 양으로 정의)이었으며, 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 16.65 U임을 확인하였다.
실시예 5. 진세노사이드 변화량 측정
1 g의 산양삼 분말 또는 5 g의 홍삼 농축액을 100 ml의 MRS 배지에 넣고 멸균 후 미리 배양한 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주 또는 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주를 접종하여 37 ℃에서 30 일간 발효하였다. 다음으로, R2-6 및 R2-15를 5 ml의 MRS 배지에 24 시간동안 혐기 배양한 후 0.1 ml를 산양삼 또는 홍삼 농축액이 포함된 배지에 접종한 후, 발효를 하는 동안 매 5 일마다 진세노사이드 함량을 측정하였다. 10 ml의 발효된 샘플을 50 ml의 70 % 메탄올로 70-80 ℃에서 1 시간 동안 추출하고, 샘플을 식힌 후 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리 후 상등액을 감압농축플라스크에 옮기고 이 추출과정을 1회 더 반복하였다.
이후, 상기 방법으로 모은 샘플을 감압농축기로 60 ℃에서 농축하고, 농축된 샘플을 5 ml의 HPLC용 증류수 (HPLC-grade distilled water)에 녹인 후 활성화된 Sep-pak C18 cartridge (Waters Inc., Milford, 메사추세츠, 미국)에 주입하였다. 이때, 상기 Sep-pak cartridge는 5 ml의 HPLC용 메탄올 (HPLC-grade MeOH)을 주입하고 5 ml HPLC용 증류수 (HPLC-grade distilled water)를 또 주입하는 방법을 2회 반복 실시하여 활성화하였다.
한편, 샘플을 주입한 카트리지를 5 ml HPLC용 증류수 (HPLC-grade distilled water)로 2회 세척 후, HPLC용 메탄올 (HPLC-grade MeOH)로 용출 (elution)시켰다. 용출된 샘플은 0.45-μm 멤브레인 필터로 필터링하여 HPLC 분석에 사용하였다. 이때, 홍삼 농축액이 포함된 발효 샘플의 농축액은 카트리지를 사용하지 않고 0.45-μm 멤브레인 필터로 필터링만 하여 HPLC 분석에 이용하였다.
상기 진세노사이드 분석에 이용한 HPLC는 Shimadzu 10 Avp HPLC system (도쿄, 일본)을 이용하였고, UV detector (SPD-10Avp, Shimadzu, Tokyo, Japan) 및 gradient pump를 이용하여 측정하였다. 측정 흡광도는 203 nm였으며, 칼럼은 Gracesmart column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Grace, Columbia, 메릴랜드, 미국)을 40 ℃ 조건에서 측정하였고, 10 μl씩 주입하였다. 그리고 이동상은 물 (solvent A) 및 아세토니트릴 (solvent B)을 구배 (gradient) 조건으로 사용하였다. 기울기 용리 (gradient elution) 비율은 010 min, 20% B; 1042 min, 2030% B; 4267 min, 3040% B; 6770 min, 4047% B; 7080 min, 4780% B; 8093 min, 80% B; 9395 min, 8020% B; 95115 min, 20% B 였다. Solvents A 및 B의 유속은 1.2 mL·min-1 였으며, 16 가지의 진세노사이드 (Rg1, Re, Rf, Rg2(S), Rb1, Rh1(S), Rg2(R), Rc, Rb2, Rb3, Rd, 20(S)-ginsenoside Rg3, 20(R)-ginsenoside Rg3, Rg5, Rk1, 및 Compound-K)를 표준물질로 사용하였다. 표준물질은Chromadex (Irvine, 캘리포니아, 미국)의 제품을 사용하였다.
진세노사이드 분석 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 산양삼은 발효 30일 후, 발효된 산양삼의 최종 compound K의 양이 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주는 0.7 mg/g, 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 0.49mg/g 이었으며(도 5), 홍삼 농축액은 발효 30일 후, 발효된 홍삼 농축액의 최종 compound K의 양이 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주는 0.27 mg/g, 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 0.29mg/g 으로(도 6), 다른 표준물질과 비교할 때, 발효시간-의존적으로 생성이 꾸준히 증가됨을 확인하였다.
실시예 6. 프로바이오틱스 효과 확인
프로바이오틱스 시험법은 식품의약안전처의 건강기능식품 시험법에 준하여 실시하였으며, 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 두 균주 모두 식약처의 기준에 적합한 팹신과 담즙산을 포함한 배지에서 배양 후에도 108 이상의 균수를 유지함을 확인하였다.
상기 실시예를 종합한 결과, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 (Lactobacillus plantarum) SI-6 균주는 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는, 삼의 항균 작용에 의해 생육이 방해받지 않고, 발효하기에도 적합하며, 나아가, 화합물 K (Compound K)의 생성을 증가시키는 효과가 있는 바, 화합물 K의 함량의 강화가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<212> RNA
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<400> 1
acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga gtggcgaact 60
ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga aacagatgct 120
aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagcttga aagatggctt cggctatcac 180
ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac catggcaatg 240
atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga 420
gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 540
caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 600
actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 720
ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg 780
aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc 840
gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact 960
atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta 1080
tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt 1260
tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt 1380
tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttagaaccag ccgccta 1427
<210> 2
<211> 1419
<212> RNA
<213> Lactobacillus rhamnosus SI-15 16S rRN
<400> 2
tgcagtcgaa cgagttctga ttattgaaag gtgcttgcat cttgatttaa ttttgaacga 60
gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat aacatttgga 120
aacagatgct aataccgcat aaatccaaga accgcatggt tcttggctga aagatggcgt 180
aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcaatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga 420
atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag 600
tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720
gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc 780
gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat 840
taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc 1260
cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccc 1419
Claims (8)
- 인삼 발효용 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주(수탁번호 KCTC 18489P).
- 제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주는 서열번호 2의 16S rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 균주(수탁번호 KCTC 18489P).
- 인삼 발효용 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주(수탁번호 KCTC 18489P) 배양액.
- 제1항에 따른 균주 또는 제3항에 따른 배양액을 함유하는 인삼 발효용 건강기능식품 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 화합물 K (Compound K)의 함량이 강화된 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 따른 균주 또는 제3항에 따른 배양액을 인삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 인삼 발효액 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 방법은 화합물 K (Compound K)의 함량이 강화된 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제6항의 제조방법에 의하여 제조된 인삼 발효액을 포함하는, 인삼 발효 음료.
Priority Applications (1)
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| KR1020170110084A KR20180032493A (ko) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 및 이의 이용 |
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| KR1020170110084A KR20180032493A (ko) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | 신규한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) SI-6 및 락토바실러스 람너서스 (Lactobacillus rhamnosus) SI-15 균주, 및 이의 이용 |
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| KR (1) | KR20180032493A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116042474A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-02 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种鼠李糖乳杆菌及其应用 |
-
2017
- 2017-08-30 KR KR1020170110084A patent/KR20180032493A/ko not_active Application Discontinuation
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