CN116042474A - 一种鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌及其应用，本发明自行筛选得到的鼠李糖乳杆菌对无患子进行发酵能够缩短发酵周期，提高批次间产品的稳定性，所得无患子发酵产物活性物质含量高、纯度高、刺激性低，具有良好的抗氧化和清洁功效，符合化妆品原料的要求，在化妆品中有很好的应用前景。

Description

一种鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus)，还涉及该鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus)在制备发酵产品尤其是在制备无患子发酵产品中的应用，还涉及一种发酵得到的无患子发酵提取液及其在化妆品中的应用，属于生物发酵技术领域。
技术背景
无患子（拉丁学名：Sapindus saponaria Linnaeus）是无患子科无患子属植物，别名：木患子（本草纲目）、油患子（四川）、苦患树（海南）、黄目树、目浪树（中国台湾）、香患子、洗手果，其他地方名：搓目子、假龙眼等。木材质软，可做箱板和木梳等；核果球形，熟时黄色或棕黄色；种子球形，黑色，坚硬。
无患子果皮中含丰富的皂苷（含量约24.2%），还含有还原糖，脂肪酸，油脂，油酸，类胡萝卜素，菸酸，核黄素，蛋白质，维生素C、维生素A、维生素B及赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和组氨酸等物质成分。其中皂苷的主要类型为三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，已被证实是一种天然非离子表面活性剂，具有良好的起泡性能。同时，还有文献报道，其作用于人体皮肤有抗菌、杀菌、消炎和祛屑止痒功效。
无患子提取物的制备方法主要包括水提醇沉法、正丁醇萃取法以及微生物发酵法等。近年来，微生物发酵法应用十分广泛，其主要是利用微生物的生长，将许多杂质分离出去，而保留皂苷等活性成分。然而，现有技术中无患子提取物有活性物含量和纯度不高、杂质有刺激等不良副作用的不足。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明筛选得到了一株性能优异的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，该菌株具有较好的活性，发酵周期短、发酵过程容易控制、发酵产物批次稳定性好。使用该菌株对无患子进行发酵，能够在较短时间内得到稳定的产品，且所得发酵产物中无患子的活性物质含量高，纯度高，性能好，刺激性小。
本发明鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus)命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1，其在无患子鲜果表皮中得到，已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221549，保藏日期为2022年10月10日。
进一步的，本发明提供了一种菌剂，该菌剂中包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1。该菌剂中可以仅含有鼠李糖乳杆菌( Lactobacillusrhamnosus) 1-X-1这一种微生物，还可将所述鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus)1-X-1与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。
进一步的，所述菌剂可为用于发酵无患子的菌剂，既可以为固体制剂，也可以为液体制剂。
上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以是培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
术语“菌剂”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“菌剂”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。所述（传代）培养物发酵无患子的能力与本发明的菌株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1基本上相同。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1或者上述菌剂在制备发酵产品中的应用。该应用中，一般是将鼠李糖乳杆菌( Lactobacillusrhamnosus) 1-X-1或者上述菌剂加入底物中进行发酵，得到发酵产品。
在现有技术中公开了鼠李糖乳杆菌在多种领域的发酵用途，本发明鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1在这些现有公开的领域中均可以使用，用于替换现有的鼠李糖乳杆菌得到发酵产物。
优选的，本发明鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1或者上述菌剂用于制备无患子发酵产品。所述无患子发酵产品是由含有无患子的底物发酵得到的产品。
进一步的，本发明所述的无患子，指的是干燥的无患子果皮。
本发明提供了一种无患子发酵提取液的制备方法，该方法包括采用上述鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1对含无患子的培养液（也称为无患子培养液，下同）进行发酵的步骤。所述无患子为干燥的无患子果皮。
进一步的，所述无患子果皮以粉末的形式加入无患子培养液中。无患子粉末以整个干燥的无患子果皮为原料，在粉碎之前，可以进行烘干处理，烘干后的无患子可以采用常规料理机和破壁机等设备进行粉碎。优选的，粉碎后的无患子粉末先酶解再配成无患子培养液，以使无患子中的有效成分充分的溶出。无患子酶解所用的酶可以为纤维素酶和果胶酶中的一种或两种，优选为纤维素酶和果胶酶的混合物。当所用酶为这两种的混合物时，纤维素酶和果胶酶的质量比可以随意选择，优选的，果胶酶和纤维素酶的质量比优选为1：1-1:4，具体可为1：1、1：2、1：3、1：4。
优选的，纤维素酶的酶活为1-2万U/g，果胶酶的酶活为5-7万U/g。
进一步的，无患子酶解时，将无患子粉末与水混合，然后加入酶，控制酶解条件进行酶解。无患子酶解的条件为：酶解pH为5.0~5.5，酶解温度为55-65℃，酶的用量为无患子质量的0.05-0.2wt%。酶解时，无患子粉末与水的比例可以随意调控，无特殊要求，以不影响酶解为原则，例如无患子粉末与水的质量比可以为1:2-20。一般酶解1-2h左右能够实现无患子有效成分的较好溶出。
在本发明某一具体实施方式中，所述酶解pH可为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5；酶解温度可为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；酶的用量可为无患子质量0.05 wt%、0.06 wt%、0.07 wt%、0.08 wt%、0.09 wt%、0.10 wt%、0.11 wt%、0.12wt%、0.13 wt%、0.14 wt%、0.15 wt%、0.16 wt%、0.17 wt%、0.18 wt%、0.19 wt%、0.2 wt%。
进一步的，无患子培养液中除了含有未经酶解或经过酶解的无患子和水外，还含有氮源和无机盐。氮源和无机盐可以从现有技术中进行选择。例如，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆肽粉等，所述无机盐为无水乙酸钠、磷酸氢二钾等。
进一步的，发酵用的无患子培养液中，无患子与水的质量比为1：2~20，氮源在无患子培养液中的质量百分含量为0.1-2.5wt%，无机盐在无患子培养液中的质量百分含量为0.02-0.8wt%。
在本发明某一具体实施方式中，氮源在无患子培养液中的质量百分含量可以为0.1 wt%、0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%、0.5 wt%、0.6 wt%、0.7 wt%、0.8 wt%、0.9 wt%、1.0wt%、1.1 wt%、1.2 wt%、1.3 wt%、1.4 wt%、1.5 wt%、1.6 wt%、1.7 wt%、1.8 wt%、1.9 wt%、2.0 wt%、2.1 wt%、2.2 wt%、2.3 wt%、2.4 wt%、2.5 wt%；无机盐在无患子培养液中的质量百分含量可以为0.02 wt%、0.05 wt%、0.1 wt%、0.15 wt%、0.2 wt%、0.25 wt%、0.3 wt%、0.35 wt%、0.4 wt%、0.45 wt%、0.5 wt%、0.55 wt%、0.6 wt%、0.65 wt%、0.7 wt%、0.75 wt%、0.8wt%。
进一步的，发酵时，鼠李糖乳杆菌1-X-1在无患子培养液中的接种量为1-3wt%。该鼠李糖乳杆菌1-X-1在使用时，可以通过培养基进行扩大培养，以得到所需数量的菌种，其最佳培养温度为30℃-37℃。例如，鼠李糖乳杆菌1-X-1可以通过液体的种子培养基进行扩大培养，扩大培养后离心去除上清液，得到鼠李糖乳杆菌1-X-1菌种。优选的，种子培养基的配方为：氮源1.5-2.5wt %、碳源1.5-2.5wt %、无机盐0.2-0.7wt %，水余量。所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉等，所述碳源为微生物培养常用碳源，如葡萄糖、果糖、乳糖等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸锰等。
进一步的，发酵时，发酵温度为30-37℃，发酵时摇床转速为60~100rpm，发酵至pH不变时停止发酵，具体地，发酵温度可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。
进一步的，上述方法具体包括以下步骤：
（1）将干燥的无患子果皮粉碎，得到无患子粉末，无患子粉末与水混合均匀，得到混悬液，备用；或者将无患子粉末与水混合均匀得到混悬液，调节混悬液pH至5.0~5.5，加入酶进行酶解；
（2）将上述未经酶解的无患子混悬液或者酶解后的无患子混悬液与氮源和无机盐混合，如果需要的话还可以加入水，配成含无患子的培养液；
（3）将鼠李糖乳杆菌1-X-1加入上述含无患子的培养液中，发酵至pH不再变化，得发酵液；
（4）将发酵液除杂、除菌，得到无患子发酵提取液。
进一步的，步骤（1）中，无患子粉末与水的比例可以随意调控，无特殊要求，以不影响酶解为原则。混悬液的pH可以通过常规的碱调整至5.0~5.5。
进一步的，步骤（1）中，酶的添加量为无患子质量的0.05-0.2 wt%。
进一步的，步骤（2）中，未经酶解的无患子混悬液或者酶解后的无患子混悬液进一步与氮源和无机盐等进行混合，配成用于鼠李糖乳杆菌1-X-1发酵的含无患子的培养液。无患子培养液中的无患子混悬液或酶解后的无患子混悬液、氮源和无机盐的混合顺序随意。优选的，将氮源和无机盐加入未经酶解的无患子混悬液或酶解后的无患子混悬液中，混合均匀后灭菌。这样能使酶解过程中加入的酶充分灭活，稳定产品质量。灭菌可以采用现有技术中报道的各种可行的灭菌方式，例如湿热灭菌等。
进一步的，步骤（3）中，发酵在30-37℃下进行，采用普通的摇床发酵即可，发酵至pH不变时停止发酵，摇床转速为60-100rpm。一般发酵时间为60~72h，例如，发酵时间可以为60 h、61 h、62 h、63 h、64 h、65 h、66 h、67 h、68 h、69 h、70 h、71 h、72 h。
进一步的，步骤（4）中，发酵所得发酵液通过过滤、离心等方式除杂、除菌。
本发明自行筛选得到了鼠李糖乳杆菌1-X-1，其对无患子进行发酵能够缩短发酵周期，提高批次间产品的稳定性，所得发酵产物活性物质含量高、纯度高、刺激性低，具有良好的抗氧化、去污和清洁功效，符合化妆品原料的要求，在化妆品中有广泛的应用前景。因此，按照该方法得到的无患子发酵提取液及其在化妆品中的应用也在本发明保护范围之内。
进一步的，所述化妆品优选为清洁产品，所述无患子发酵提取液作为清洁、抗氧化成分。
进一步的，本申请还提供了一种组合物，其包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1或上述菌剂或上述无患子发酵提取液。
本发明具有以下优点：
本发明自行筛选得到了鼠李糖乳杆菌1-X-1，相对于其它真菌发酵无患子，能够缩短发酵周期，提高批次间产品的稳定性。本发明所得发酵产物活性物质含量高、安全健康，纯度高，杂质少，刺激性低，具有良好的抗氧化、去污和清洁等功效，并且能显著降低其红细胞溶血性，符合化妆品原料的要求，在化妆品中有很好的应用前景。
保藏信息
本发明所述鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221549 ，保藏日期为2022年10月10日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
下述实施例和对比例用到的纤维素酶的活力为1.7万U/mL，果胶酶的活力为6万U/mL，纤维素酶和果胶酶均为市购。
下述实施例和对比例中，所提到的无患子果壳指的是干燥的无患子果皮。
如无特别说明，下述浓度均为质量百分浓度。
实施例1 鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1的获取以及确定过程
以老面团、酸菜、市售无患子鲜果表皮细胞为原料，分别将其用100质量倍无菌水分散，用涂布器均匀涂布在含0.04%溴甲基酚紫的MRS平板上，于37℃培养箱中静置培养1~2d，挑选周围培养基颜色变为黄色的单菌落，分别接种于MRS试管斜面上，于37℃培养箱中静置培养1~2d，菌体长好后，于4℃冰箱保藏，共获得菌株6株，分别为L-S-1.88、L-DL-1，L-PY-9、L-PY-6、1-X-1、1-AZBB。
将无患子果壳粉碎后，过300目筛，收集筛下无患子粉末，将水加入过筛后的无患子粉末中，粉末与水的质量比为1：20，搅拌充分溶解后，用40%NaOH溶液调节无患子混悬液pH至5.0~5.5，加入纤维素酶和果胶酶（纤维素酶和果胶酶的添加量分别为无患子粉末质量的0.05%），65℃酶解1h，适当条件离心获得无患子酶解液。
向无患子酶解液中加入蛋白胨、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成无患子培养液。其中蛋白胨含量1wt%，磷酸氢二钾含量0.1wt%，无水乙酸钠含量0.5wt%。
上述获得的6株菌株分别接入MRS培养基中，37℃静置10~14h，离心收集菌体后接入无患子培养液中，接种量为2wt%，37℃，80rpm发酵60h后至pH不再变化，发酵结束，获得发酵液。MRS培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH6.2~6.6，116℃灭菌20min。
发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得无患子发酵提取液，所得无患子发酵提取液皂苷含量见表1，其中菌种1-X-1发酵后皂苷含量最高，经鉴定确认得到菌株1-X-1为鼠李糖乳杆菌。
该鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221549 ，保藏日期为2022年10月10日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，该菌株的16SrDNA基因序列测定结果如SEQ IDNO：1所示。
实施例2
1、将无患子果壳粉碎后，过300目筛，收集筛下无患子粉末，将水加入过筛后的无患子粉末中，粉末与水的质量比为1：4，搅拌充分溶解后，用40%NaOH溶液调节无患子混悬液pH至5.0~5.5，加入果胶酶（添加量为无患子粉末质量的0.05wt%），65℃酶解1h，适当条件离心获得无患子酶解液。
2、向无患子酶解液中加入蛋白胨、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成无患子培养液。其中蛋白胨含量1wt%，磷酸氢二钾含量0.1wt%，无水乙酸钠含量0.5wt%。
3、将鼠李糖乳杆菌1-X-1接入MRS培养基（同实施例1）中，37℃静置10~14h，离心收集菌体后接入无患子培养液中，接种量为2wt%，37℃，80rpm发酵60h后至pH不再变化，发酵结束，获得发酵液。
4、发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得无患子发酵提取液S1。
实施例3-7
按照实施例2中的方法制备无患子发酵提取液，不同的是：步骤1中所用的酶及其含量如表2所示。
实施例8
1、将无患子果壳粉碎后，过300目筛，收集筛下无患子粉末，将水加入过筛后的无患子粉末中，粉末与水的质量比为1：20，搅拌充分溶解后，用40%NaOH溶液调节无患子混悬液pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为无患子粉末质量的0.05wt%）和纤维素酶（纤维素酶为无患子粉末质量的0.15wt%），65℃酶解1h，适当条件离心获得无患子酶解液。
2、向无患子酶解液然后中然后加入蛋白胨、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成无患子培养液。其中蛋白胨含量为1wt%，磷酸氢二钾含量为0.1wt%，无水乙酸钠含量为0.5wt%。
3、将鼠李糖乳杆菌1-X-1接入MRS培养基（同实施例1）中，37℃静置10~14h，离心收集菌体后接入无患子培养液中，接种量为2wt%， 37℃、80rpm发酵60h后至pH不再变化，发酵结束，获得发酵液。
4、发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得无患子发酵提取液S7。
实施例9
1、将无患子果壳粉碎后，过300目筛，收集筛下无患子粉末，将水加入过筛后的无患子粉末中，粉末与水的质量比为1：2，搅拌充分溶解后，用40%NaOH溶液调节无患子混悬液pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为无患子粉末质量的0.05wt%）和纤维素酶（纤维素酶为无患子粉末质量的0.15wt%），65℃酶解1h，适当条件离心获得无患子酶解液。
2、向无患子酶解液中然后加入蛋白胨、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成无患子培养液。其中蛋白胨含量为1wt%，磷酸氢二钾含量为0.1wt%，无水乙酸钠含量为0.5wt%。
3、将鼠李糖乳杆菌1-X-1菌种接入MRS培养基（同实施例1）中，37℃静置10~14h，离心收集菌体后接入无患子培养液中，接种量为2wt%， 37℃、80rpm发酵60h后至pH不再变化，发酵结束，获得发酵液。
4、发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得无患子发酵提取液S8。
对比例1
步骤同实施例7，不同在于：将鼠李糖乳杆菌1-X-1替换为米曲霉菌ASP-1。所得无患子发酵提取液记为C1。
对比例2
步骤同实施例7，不同在于：将鼠李糖乳杆菌1-X-1替换为酵母菌CGMCC NO.2.3854。所得无患子发酵提取液记为C2。
对比例3
步骤同实施例7，不同在于：将鼠李糖乳杆菌1-X-1替换为植物乳杆菌4-3-A（保藏号为CCTCC NO:M 2021186）。所得无患子发酵提取液记为C3。
对比例4（未发酵的）
将无患子果壳粉碎后，过300目筛，收集筛下无患子粉末，将水加入过筛后的无患子粉末中，粉末与水的质量比为1：4，搅拌充分溶解后，用40%NaOH溶液调节无患子混悬液pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为无患子混悬液中无患子质量的0.05wt%）和纤维素酶（纤维素酶为无患子混悬液中无患子质量的0.15wt%），65℃酶解1h，适当条件离心获得无患子酶解液，116℃灭菌20min，酶解液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得无患子提取液C4。
试验例1 皂苷含量和纯度
1. 皂苷含量的测定
采用香草醛-冰醋酸法对无患子发酵提取液皂苷含量进行监测，具体实施方式如下：
 （1）标准曲线的制作：
精密称取烘干至恒重的无患子皂苷对照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加纯化水使其溶解，定容、摇匀，配制成 1 mg/mL无患子标准溶液，冷藏备用。 取干燥洁净的试管，分别加入 0uL、30uL、60uL、90uL、120uL和150uL无患子标准溶液，置于50℃水浴烘干水分后，加入0.2 mL 5% (wt%)香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液作为显色剂，振荡混匀。在70℃水浴加热20 min，冰水浴中冷却3 min，加入5 mL冰醋酸为溶剂，摇匀，以未加入样品的试剂作空白，用分光光度计测定其吸光度。 以吸光度（A) 为横坐标，皂苷质量浓度（c)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。
（2）样品溶液的测定：
实施例和对比例得到的样品稀释10~50倍后，用移液枪吸取100uL于具塞试管中，加入0.2 mL 5% (wt%)香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液作为显色剂，振荡混匀。在70℃水浴加热20 min，冰水浴中冷却3 min，加入5 mL冰醋酸为溶剂，摇匀，用分光光度计测定其吸光度。将吸光度带入回归方程，计算得到皂苷含量。
（3）总皂苷含量如下表所示：
2、无患子皂苷提取液纯度的测定：
固形物含量监测：取干净玻璃平皿，置105℃烘箱中烘干至恒重，记录平皿重量，向平皿中加入样品（无患子发酵提取液），记录样品重量后，将平皿放置于105℃烘箱中高温至恒重，再次称量平皿重量。
无患子皂苷提取液固形物含量=（加入样品烘干后平皿重量-空平皿重量）/样品重×100%。
无患子皂苷提取液纯度=无患子皂苷含量/固形物含量×100%。
从上表数据中可以看出，经不同菌种发酵后，无患子皂苷纯度都有所提高，但是本发明所用鼠李糖乳杆菌1-X-1得到的发酵液中皂苷纯度提升最多，纯度由未经发酵的29.29%提升至81.03%。
试验例2 发泡能力检测：
泡沫性是表面活性剂很重要的一个性质。利用冲击搅拌产生泡沫的原理，可以对一定质量分数的表面活性剂或合成洗涤剂溶液，以相同力度、同一方向摇晃溶液，使其产生泡沫，测量泡沫的高度，即可快速测定、比较多种表面活性剂或合成洗涤剂的泡沫性能。泡沫高度=泡沫下边缘与泡沫顶点的平均高度（mm），并在5min末再读取第二次读数。用新的试液重复以上试验至少3次以上，每次试验前必须用试液润洗管壁。结果以起始或5min末的泡沫高度表示，取至少3次误差在允许范围内的结果的平均值作为最后结果。
（1）150mg/L硬水的配制：称取无水硫酸镁0.74g，氯化钙1g，溶解于1000mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。
（2）试液的配制：称取1.0g各实施例和对比例的提取液试样于烧杯中，加硬水至100.0g，用玻璃棒小心搅拌混匀。
（3）泡沫性的测定：用润洗过的移液管小心移取25.0mL试液于比色管中，盖好塞子，用食指按住塞子，用力上下摇晃比色管10次，产生泡沫后用尺子量泡沫高度并记录结果。
注意：每次都必须要同一人、同一只手摇动比色管，摇动的每一下都必须要有停顿，以保证用的最大力度。
试验例3 抗氧化功效评价
清除DPPH自由基试验
0.1mM DPPH溶液配制：精密称取4.0mg DPPH置100mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容。
不同浓度样品溶液配制：以纯化水作为稀释液，分别将实施例7中的发酵液样品S6及对比例中的发酵液样品C1-C4配制成体积浓度为0.01~1％的溶液。
分别精密量取0.1mM DPPH溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。DPPH清除率计算方法如下：
结果如表6所示。
由表中数据可知，在添加0.01%-1%的浓度梯度下，经鼠李糖乳杆菌1-X-1发酵后，具有了较高的对DPPH自由基清除的能力，而不经发酵的无患子提取液，DPPH自由基清除能力低于经菌种发酵后的DPPH自由基清除能力，说明DPPH自由基的清除能力发酵后有了大幅度的提高。
试验例4 红细胞溶血实验（评价皂苷刺激性）：
制备红细胞悬浊液：取新鲜兔血红细胞，等比例加入生理盐水，1000rpm离心5min，弃上清，重复上述操作，直至上清澄清为止。血细胞沉淀中加入一定倍数的生理盐水重新混匀成悬浊液，使用血球计数板在显微镜下观察，使得细胞个数大于等于5×108个细胞/ml。
配制表面活性剂溶液：
1. 用生理盐水配制SDS系列浓度溶液。
2. 用各浓度SDS孵育红细胞混悬液，一定条件下进行反应，使得红细胞裂解，得裂解液。
3. 测定裂解程度：裂解液离心，取上清，紫外分光光度计检测其吸光值。
主要观察指标：红细胞50％溶血率时的样品浓度L（HC50）、蛋白质变性指数（DI）、L（HC50）与蛋白质变性指数 DI 的比值。
溶血率L（HC50） =（样品 A560 nm / 阳性 A560 nm）×100%。
其中阳性对照为：100mg/mL的SDS溶液。
蛋白质变性指数DI = R样品/R阳性对照×100%，其中R = A575 nm /A540 nm，根据L（HC50）/DI的值可以判断样品的刺激性。刺激性判断标准见下表7。
各样品的刺激性结果见下表8：
从上表结果可以看出，经鼠李糖乳杆菌1-X-1发酵后，无患子发酵提取液基本上没有刺激性。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1，其特征是：CCTCC NO：M20221549 。
2.一种菌剂，其特征是：包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌( Lactobacillusrhamnosus) 1-X-1。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1或权利要求2所述的菌剂在制备发酵产品中的应用；优选的，所述发酵产品为无患子发酵产品。
4.一种无患子发酵提取液的制备方法，其特征是：包括采用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌( Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1对含无患子的培养液进行发酵的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：无患子果皮粉碎后或无患子果皮粉碎、酶解后配成含无患子的培养液；优选的，无患子果皮酶解所用的酶为纤维素酶和果胶酶中的一种或两种；优选的，纤维素酶的酶活为1-2万U/g、果胶酶的酶活为5-7万U/g。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：无患子果皮酶解时，酶解pH为5.0~5.5，酶解温度为55-65℃，酶的用量为无患子质量的0.05-0.2wt%。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：发酵条件为：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 1-X-1在含无患子的培养液中的接种量为1-3wt%，发酵温度为30-37℃，发酵至pH不变时停止发酵；
优选的，含无患子的培养液中，除了无患子果皮外，还含有氮源和无机盐；优选的，无患子果皮与水的质量比为1：2~20，氮源在含无患子的培养液中的质量百分含量为0.1-2.5wt%，无机盐在含无患子的培养液中的质量百分含量为0.02-0.8wt%。
8.按照权利要求4-7中任一项所述的无患子发酵提取液的制备方法制得的无患子发酵提取液。
9.权利要求8所述的无患子发酵提取液在制备化妆品中的应用。
10.一种组合物，其特征是：包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌( Lactobacillusrhamnosus) 1-X-1或权利要求2所述的菌剂或权利要求8所述的无患子发酵提取液。
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