KR20130131968A

KR20130131968A - 인체에서 유래한 유산균 락토바실러스 람노서스 ｈｋ-9 및 그를 이용한 발효물과 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20130131968A
Application number: KR1020120055971A
Authority: KR
Inventors: 이현용; 최운용; 서용창; 김지선; 이춘근; 송치호; 윤창순; 임혜원
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 주식회사 세바바이오텍; 서원대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2013-12-04
Also published as: KR101388918B1

Abstract

본 발명은 인체에서 유래한 유산균 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 및 그 활용 방안에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물 발효를 통해 생리활성 증진 활성을 가질 뿐 아니라 미백 효과 및 노화방지와 관련된 항산화 효능까지 갖는 유산균 락토바실러스 람노서스 HK-9와 그를 이용한 발효물 및 화장제품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유산균은 일반 식품이 아닌 인체에서 유래한 균주이기 때문에 식품 발효뿐만 아니라 미백 등의 활성에 매우 효과적이다. 이를 통해 기존의 천연물에서 용출되지 않거나 매우 적은 양이 용출되어 발효 효율이 떨어지는 문제점을 극복하여 유효물질을 효과적으로 용출할 수 있고, 화장품의 원료로서의 효과까지 거둘 수 있다.

Description

인체에서 유래한 유산균 락토바실러스 람노서스 ＨＫ-9 및 그를 이용한 발효물과 화장료 조성물{Lactobacillus rhamnosus HK-9 derived from human body, and fermented material and cosmetic composition using it}

본 발명은 인체에서 유래한 유산균 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 및 그 활용 방안에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물 발효를 통해 생리활성 증진 활성을 가질 뿐 아니라 미백 효과 및 노화방지와 관련된 항산화 효과를 갖는 유산균 락토바실러스 람노서스 HK-9와 그를 이용한 발효물 및 화장제품에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유산균은 일반 식품이 아닌 인체에서 유래한 균주이기 때문에 식품 발효뿐만 아니라 미백 등 활성에 매우 효과적이다. 이를 통해 기존의 천연물에서 용출되지 않거나 매우 적은 양이 용출되어 발효 효율이 떨어지는 문제점을 극복하여 유효물질을 효과적으로 용출할 수 있고, 화장품의 원료로서의 효과까지 거둘 수 있다.

유산균(Lactobacillus)은 치즈, 발효유 및 유산균 음료 등의 발효 유제품을 비롯하여 각종 발효 식품의 제조에 전 세계적으로 광범위하게 응용되고 있는 중요한 미생물이다.

유산균은 식품 산업의 발효 및 장질환에 대한 치료와 예방의 정장 효과를 목적으로 오랫동안 사용되어 발전을 거듭하였다. 유산균의 활용에 대한 보고로는 여러 편이 나와 있다. 그 예로서, 유아기 설사 증상에 유산균을 투여하여 치료 효과를 보았다는 보고(R.O. Clock, J.A.M.A. Vol. 61, P.164, 1913)가 있은 이래, 설사 증세로 고통 받는 환자의 70%를 치료하였다는 보고(L.M. Gornpertz, et al., J.A.M.A. Vol. 80, P.90, 1923), 장내 유해균의 증식을 저해하고 유익한 균의 생장에 좋은 조건을 만들어 주어 식중독의 방지, 장내 부패방지, 변비예방, 면역력의 증가, 발암 억제 등의 여러 가지 생리적 기능을 가진다는 내용 등이 밝혀지고 있다.

이러한 유산균을 이용한 발효물은 요구르트나 치즈와 같은 형태로 제품화되거나 김치, 청국장과 같은 식품산업에 크게 영향을 미치고 있다.

한편 일반 유산균을 이용하여 제품을 발효시킬 경우 발효 제품의 풍미 및 발효 중에 생산되는 각종 생리활성 물질의 생산에 한계가 있는 것이 사실이다. 또한 유산균의 종류에 따라서 천연물 발효 시 발효 수율이 달라질 수 있으며, 어떤 것은 식품에 사용하고 향장 활성을 띠는 것은 화장품의 원료 활용하기도 하는 등, 유산균 종류에 따라 발효에 대한 활성과 쓰임새가 다른 것 또한 사실이다. 그런데 이러한 기능성을 보유한 발효물을 생산하기 위해 사용되는 유산균은 그 대부분의 발효균주를 외국에서 수입하고 있으며, 유산균의 출처도 치즈 등의 발효된 유제품에서 분리한 균주이다.

따라서 발효 능력이 뛰어난 신규한 유산균의 확보는 경제적으로 매우 큰 파급효과를 가질 수 있다 할 것인바, 본 발명진은 음식은 사람의 손맛이라는 말과 여자 손에 유산균이 많이 존재한다는 점에 착안하여[실제로 여자 손에 유산균이 많이 존재한다는 보고가 있다(The influence of sex handedness and washing on the diversity of hand surface bacteria, PNAS 105(46) 17994-17999)] 여자 손에 많이 존재하는 균들을 동정하여 생리 활성 실험을 실시하였으며, 그중 Lactobacillus 속의 균을 분리하여 신규한 발효 유산균인 락토바실러스 람노서스 HK-9를 분리해 냈다.

본 발명진이 분리해낸 유산균 락토바실러스 람노서스 HK-9는 여자 손이 남자 손보다 곱다는 점에 착안하여 여자 손에서 분리해낸 유산균으로, 검사 결과 남자 손에서는 발견되지 않고 여자 손에서만 발견이 되었다. 위 균주는 유산균 본연의 기능인 발효 능력 외에도 미백 등의 활성 능력까지 갖는다는 점을 검증하였는데, 이는 여자 손에서만 검출되는 현상과 관련이 있는 것으로 보인다.

보통의 유산균은 식품에서 얻어낸 균주가 대부분이기 때문에 식품 발효에 많이 사용하지만 본 발명자가 동정해낸 균주는 식품 및 화장품에 모두 적용할 수 있다.

위에서 기재한 바에 의하여 충분히 시사되었지만, 본 발명의 목적은 천연물 발효와 화장품에 모두 이용할 수 있는 신규한 미생물을 제공하는 데 있다.

발명자들은 위 목적에 부합하는 균주를 분리하고 이를 이용하여 천연물 발효를 통한 유효 생리활성의 증가 및 발효 수율의 향상을 확인하고 미백 효과까지 검증하였다.

상기와 같은 본 발명은 인체에서 분리한 유산균 락토바실러스 람노서스 HK-9(기탁번호: KCCM11254P)인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 유산균으로 발효한 발효물인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 유산균으로부터 추출한 액(유산균 자체의 추출액)을 함유하는 화장료 조성물인 것을 특징으로 한다. 이때 상기 유산균 자체의 추출액은, MRS 배지에서 배양된 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주(기탁번호: KCCM11254P)를 원심분리하여 균주를 확보하고, 그 얻어진 균주를 초음파 처리하여 파쇄한 후, 이를 열수 추출 하여 얻어진 것임을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 전술한 발효물을 함유하는 화장료 조성물 또는 식품인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 여자 손으로부터 분리해낸 락토바실러스 람노서스 HK-9에 관한 것으로, 기존의 일반 유산균보다 천연물 발효를 통한 유효 생리활성 물질의 생산이 증대되어 발효 효과가 뛰어나고 미백 효과 및 노화방지와 관련된 항산화 효능까지 가지므로, 식품 및 화장품 소재의 원료로 공급되어 경제적으로 큰 파급 효과를 가질 수 있다.

도 1은 한국미생물보존센터에서 검사한 락토바실러스 람노서스 HK-9의 분석 결과로서, 위 균주의 16S rDNA 염기서열이다.
도 2는 락토바실러스 람노서스 HK-9의 계통분류학적 위치를 나타낸 도면이다.
도 3은 락토바실러스 람노서스 HK-9의 SEM 사진을 찍어 유산균의 형태학적 모습을 나타낸 도면이다.
도 4는 MRS 배지를 이용한 락토바실러스 람노서스 HK-9의 시간에 따른 균체 농도를 나타낸 도면이다.
도 5는 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주 및 다른 일반 균주의 발효에 따른 인삼의 진세노사이드 함량을 나타낸 도면이다.
도 6은 락토바실러스 람노서스 HK-9를 이용하여 발효한 더덕에서 새로운 물질이 생성된 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 상기 발효 더덕의 발효 전후의 DPPH 활성 결과를 나타낸 도면이다.
도 8과 9는 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주 자체의 미백 관련 효능 실험을 나타낸 결과로, 도 8은 멜라닌 합성 저해능(Melanin synthesis inhibition activity) 실험, 도 9는 티로시네이즈 저해(Tyrosinase inhibition) 실험 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1. 유산균 분리 방법

신규한 유산균의 분리를 위해 20~40대 남여 40명에게 실험실시 약 7일 전에 참여하도록 요청하였으며, 실험을 실시하기 전 실험에 참여할 참가자들이 따로 세척 및 처리를 하지 않도록 불특정일에 실험을 실시하였다.

미리 제작한 MRS Agar 배지에 실험 참자가의 손바닥을 찍어서 초기 미생물을 접종하였다. 접종된 초기 샘플은 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 얻어진 미생물 콜로니를 다시 MRS Agar 배지에 2차 접종을 하여 균주를 얻어냈다. 2차 접종에서 얻어진 콜로니별로 발효를 한 결과 가장 활성이 뛰어난 미생물을 선택하였다.

상기의 방법으로 얻어진 미생물을 한국미생물보존센터에 의뢰하여, PCR을 이용하여 유산균을 식별하였으며 그 결과를 도 1(16S rDNA의 염기서열, 서열은 서열목록 1로 첨부)과 도 2(계통분류학적 위치)에 나타내었다.

한국 미생물보존센터의 결과로 본 발명에서 얻어진 균주는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속의 균주인 것을 확인할 수 있었다. 발명자들은 위 균주를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9라 명명하였으며, 이 균주를 2012. 2. 17. 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁번호 KCCM11254P로 기탁하였다.

신규 균주 락토바실러스 람노서스 HK-9의 SEM 사진을 통해 확인한 유산균의 형태는 도 3에 나타내었다.

실시예 2. 유산균 배양 방법

실시예 1을 통해 분리된 유산균을 MRS 배지에 배양하여, 균주의 특성에 맞는 최적 배양 시간을 정하였다. 배양 방법은 일반적인 유산균 배양 방법으로 55%의 MRS 배지와 0.5%의 L-Cysteine hydrochloride를 첨가하여 배지를 제작하였으며, 배양 온도는 36℃로 하였고, 발효 균주 특성상 밀봉된 형태로 혐기성 조건에서 실험을 하여야 하기 때문에 최소한의 교반속도(50~60rpm)로 배양하여 72시간 동안 1L의 플라스크에서 400ml의 부피로 실험을 하였다.

상기의 방법으로 배양한 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 시간에 따른 균체 농도를 나타낸 결과를 도 4에 나타내었다. 결과에 따르면 12시간까지 배양하였을 때 균체의 농도가 약 644 x 10⁶의 양으로 존재하지만, 12시간이 지나 24시간까지 배양하였을 경우 최고 농도인 3255 x 10⁶의 양으로 증가되고, 48시간까지 균체 농도가 유지되며, 48시간이 지난 이후 균체가 서서히 감소하는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 최적 배양 시간을 48시간으로 결정하였다.

실시예 3. 천연물의 발효를 통한 유효 생리활성 증진 검증

1) 파삼 발효물의 진세노사이드 함량 분석

상기의 분리해낸 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 이용하여 파삼을 발효하였다. 발효 방법으로서, 2L 플라스크에 100g의 파삼을 파우더 형태로 갈아서 첨가한 후, 1L의 배양 배지를 만든 후 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 5% 접종하여 48시간 동안 발효시켰다.

또한, 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주와 함께 Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus Plantarum + Bifidobacterium lactis Longum 균주를 대조군으로 하여 상기의 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주와 같은 방법으로 배양하였다.

진세노사이드 분석을 위해 발효물을 파우더 형태로 만든 후, 부탄올 추출법을 이용하여 토탈 사포닌 함량(Rg3+Rg2+Rh2+CK+Rg1+Rb1+Rb2+Rc+Re+Rd)을 측정하였다.

도 5의 유산균 종류에 따른 파삼 발효 시 진세노사이드 함량 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주에서 가장 많은 양의 진세노사이드가 검출된 것을 확인할 수 있었으며, 보통의 유산균보다 최대 200%까지 높은 효율을 보이는 것을 알 수 있었다.

2) 황금 발효물의 항산화 활성 실험

황금의 발효물은 파삼의 발효와 같은 방법으로 하였다. 2L 플라스크에 100g의 황금을 파우더 형태로 갈아서 첨가한 후, 1L의 배양 배지를 만든 후 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 5% 접종하여 48시간 동안 발효를 하였다.

또한, 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주와 함께 Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei 균주를 대조군으로 하여 상기의 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주와 같은 방법으로 배양하였다.

향장활성 실험을 위해 발효액을 동결건조한 후 파우더 형태로 만들어서 측정 하였으며, 각각 DPPH 소거 활성 측정, 환원력 측정, 총 페놀 함량 측정 실험을 하였다. 그 결과는 표 1과 같다.

상기의 표 1.의 황금의 항산화 활성 실험을 통해 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 항산화 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

특히, 항산화 활성 중 총 페놀 함량의 결과는 다른 유산균을 통해 발효한 황금보다 2~4배 정도 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 유산균인 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 향장 활성(노화방지와 관련 있는 항산화 활성)이 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 여자 손으로부터 분리를 한 것과도 관련이 있는 것으로 보인다.

이러한 결과로 보아 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 통해 발효를 할 경우 다른 유산균에 비해 발효에 따른 유용생리활성의 용출이 용이하며 향장활성도 뛰어난 것을 알 수 있다.

3) 더덕의 발효에 따른 새로운 물질의 생성

발명자들은 본 발명에 따른 균주를 이용해 더덕의 발효 전후의 생리활성 물질의 변화를 측정해 보았다.

발효 전 더덕은 생더덕을 열풍건조기를 이용하여 40℃의 온도에서 24시간 동안 건조한 후, 볼밀을 이용하여 2~3mm의 크기로 분쇄한 후 70% 에탄올로 추출한 것을 이용하였다.

또한, 발효 더덕은 상기의 파삼의 발효와 같은 방법으로 발효하여 건조한 더덕 100g을 파우더 형태로 갈아서 2L 플라스크에 첨가한 후, 1L의 배양 배지를 만든 후 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 5% 접종하여 48시간 동안 발효를 하였다.

상기의 방법을 통해 준비한 더덕의 HPLC 분석 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과로 보아 발효 전의 더덕에는 2.7분경의 피크 하나만 검출되나 발효 후에는 2.7분경에 검출된 피크와 함께 3.1분에 신규한 피크가 더 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 신규한 피크의 물질은 새로운 생리 활성을 나타내는 물질로서, 발효 전 더덕과 발효 후 더덕의 DPPH 활성을 나타낸 도 7에서 볼 수 있듯이 발효를 통해 더덕의 DPPH 활성이 높아진 것을 확인할 수 있으며, 이로써 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 발효를 통해서 생긴 신규한 물질이 DPPH 활성에 영향을 주는 것을 확인할 수 있다.

4) 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주 자체에 따른 향장 활성 능력 측정

락토바실러스 람노서스 HK-9 균주 자체에서 나오는 향장활성 물질의 효능을 측정하기 위해 멜라닌 합성 저해능(Melanin synthesis inhibition activity) 실험과 티로시네이즈 저해(Tyrosinase inhibition) 실험을 하였다.

먼저 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 파쇄하기 위해 기존 MRS 배지에서 배양된 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주를 원심분리하여 총 100ml의 균주를 확보하였다. 그 후, 균주를 20~50분 동안 초음파 처리하여 균주를 파쇄하였다. 파쇄된 균주와 그 액을 60℃에서 열수 추출을 하여 균주 추출액을 얻어서 향장활성 실험을 하였다.

도 8은 멜라닌 합성 저해능(Melanin synthesis inhibition activity)을 나타낸 결과이다. 멜라노사이트(melanocyte)인 Clon-M3 세포를 이용하여 시료 투여 시 멜라닌 생합성과 세포 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 농도별로 처리하고 24 시간이 지난 후 멜라닌 생성 저해율을 측정하였다. 측정 결과 12.5 mg/ml에서 100mg/ml로 갈수록 저해율이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 최종적으로 약 40%에 달하는 저해율을 보였다. 이러한 결과는 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주의 균주 자체의 성분에서 멜라닌 생성을 감소시키는 효과가 있다는 것을 보여준다.

또한, 도 9는 티로시네이즈 저해(Tyrosinase inhibition)를 측정한 결과이다. 티로시네이즈는 피부 멜라닌 색소의 생성을 촉진시키는 효소로 티로시네이즈의 저해활성을 측정함으로써 미백 효과를 알아볼 수 있다. 도 9의 결과로 최종적으로 약 22%의 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 일반적인 천연물을 이용한 멜라닌 저해율보다는 낮은 수치지만 균주 자체에서 향장활성을 가지는 성분이 함유되어 있다는 결정적인 실험 결과로서, 이를 통해 비싼 천연물을 이용하여 향장 제품을 생산하는 것보다 상대적으로 생산이 쉬운 발효 균주를 이용함으로써 더욱 경쟁력 있게 화장품 관련 원료 및 제품을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11254P

20120217

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation SheBahBiotech Inc. <120> Lactobacillus rhamnosus HK-9 derived from human body, and fermented material and cosmetic composition using it <130> ula-1202 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1435 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus HK-9 <400> 1 cgagttctga ttattgaaag gtgcttgcat cttgatttaa ttttgaacga gtggcggacg 60 ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat aacaattgga aacagatgct 120 aataccgcat aaatccaaga accgcatggt tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc 180 ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaatg 240 atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga atggtcggca 420 gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 540 caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag tgcatcggaa 600 actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660 agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 720 ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg 780 aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc 840 gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900 ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt 960 ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt 1020 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga 1080 ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140 gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200 gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt 1260 tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320 cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt 1380 tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct tttagggagc gagccgtcta agctg 1435

Claims

인체에서 분리한 유산균 락토바실러스 람노서스 HK-9(기탁번호: KCCM11254P).
제1항의 유산균으로 발효한 발효물.
제1항의 유산균 자체의 추출액을 함유하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 유산균 자체의 추출액은, MRS 배지에서 배양된 락토바실러스 람노서스 HK-9 균주(기탁번호: KCCM11254P)를 원심분리하여 균주를 확보하고, 그 얻어진 균주를 초음파 처리하여 파쇄한 후, 이를 열수 추출 하여 얻어진 것임을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제2항의 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
제2항의 발효물을 함유하는 식품.