KR20230000126A - 락토바실러스 속 미생물을 이용한 복합발효물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 속 미생물을 이용한 복합발효물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물 Download PDF

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손영옥
이동선
민윤희
김다혜
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Abstract

본 발명의 락토바실러스 조성물은 간 기능 개선 및 증진의 효과가 있어 지방간의 예방, 개선 및 치료제로 사용될 수 있으며, 콜레스테롤 감소 및 면역증진 효과가 있어 비만 예방, 개선 및 치료제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 조성물을 건강기능식품, 사료 및 약제 시장 전반에 이용될 수 있다.

Description

락토바실러스 속 미생물을 이용한 복합발효물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물{Composition of complex fermentation products as an active ingredient using microorganisms in Lactobacillus genus for the improving liver function}
본 발명은 락토바실러스 속 미생물을 이용한 복합발효물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
지방간은 말 그대로 지방질, 그 중에서도 특히 중성지방(트리글리세라이드, Triglyceride, TG)이 간세포에 축적되어 간 무게의 5% 이상을 차지하고 있는 질병을 일컫는다. 간은 인체에서 여러 가지 역할을 담당하고 있는 장기로 음식물 등을 통하여 섭취한 지방질을 원활하게 처리하지 못하면 지방간이 발생한다. 지방간은 특별한 증상이 있는 것이 아니기 때문에 증상만으로는 지방간을 알 수 없다. 간질환의 일반적인 증상인 피로감이나 식욕부진, 무기력감 등이 나타날 수 있고 오른쪽 갈비뼈 아래쪽에 불쾌감이나 둔통을 느끼기도 한다. 대부분 우연히 혈액검사와 복부 초음파 소견에서 진단된다. 따라서 평소 예방을 위해 힘쓰는 것이 좋다.
한편, 비만(Obesity) 또는 비만증(Adipositas)은 체내에 지방이 비정상적으로 많이 축적되는 것으로 질병에 분류하고 있다. 단순히 운동 등에 의한 근육 때문에 체중이 높은 것은 비만이라 하지 않고 외견상으로 말라보이고 체중이 정상이어도 체지방률이 정상보다 높게 나오면 의학적으로는 비만, 마른비만으로 진단된다. 비만에도 여러가지 단계가 있는데, 일단 정상적인 체중 이상이라면 크게 과체중과 비만으로 나뉘며, 비만은 그냥 비만과 고도비만으로 나뉜다. 고도비만은 남자는 체지방이 체중의 25％, 여자는 체중의 30％ 이상일 때, 임상적으로는 BMI(Body Mass Index : 체질량지수)가 40 초과인 경우, 현재 체중이 이상체중을 20％ 초과하는 경우로 정의된다. 익히 알려진 바와 같이 비만 자체로의 문제보다는 합병증의 문제가 크다. 따라서, 이 또한 관리와 예방이 중요하다.
최근 화학적으로 제조된 약품을 대체할 수 있는 천연물로 만들어진 약품 시장이 대두되고 있다. 이러한 시장 속에서 락토바실러스는 장내 유익균의 하나로 프로바이오틱스로 많은 연구가 이루어지고 있다. 이러한 락토바실러스를 이용하여 본 발명에서는 간질환과 비만에 효과가 있는 조성물을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1388918호
본 발명은 지방간 또는 비만에 예방, 개선 및 치료의 효과가 있는 락토바실러스 속 미생물을 이용한 복합발효물 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대해 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 장내 환경 개선 효과를 가진 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈액 요소 질소(BUN) 농도를 감소시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 콜레스테롤 수치를 감소시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 알칼리 포스파타제(ALP) 및 감마 글루타밀 트랜스퍼라제(GGT) 수치를 감소시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역 증진 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 사료 조성물에 대해 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대해 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물에 대해 제공하는 것이다.
본 발명의 락토바실러스 조성물은 간 기능 개선 및 증진의 효과가 있어 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 콜레스테롤 감소 및 면역증진 효과가 있어 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로도 사용될 수 있다.
도 1은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 결장조직에 대한 도이다(a: 염색한 결장 조직 사진, b: 융모길이 비교 그래프, c: 융모 높이와 Crypt 깊이 비교 그래프)
도 2는 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 등심근 종·횡단면 현미경 사진이다.
도 3은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 등심근에서 근육분화 또는 증식에 관련된 인자인 MyoD, Pax7, Myf5·6, MyBPH의 mRNA 발현량, PCR 결과 및 단백질량을 나타낸 도이다(a~e: RTq-PCR, f: PCR, g: 웨스턴 블롯).
도 4는 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방조직 현미경 사진이다.
도 5는 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방세포에서 아디포카인(Adipokine) Adiponectin, Chemerin 및 Visfatin의 mRNA 발현량, PCR 결과 및 단백질량을 나타낸 도이다(a~c: RTq-PCR, d: PCR, e: 웨스턴 블롯).
도 6은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방세포에서 PPAR 패밀리의 mRNA 발현량, PCR 결과 및 단백질량을 나타낸 도이다(a~c: RTq-PCR, d: PCR).
도 7은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방세포에서 면역관련 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, Il-6 및 IFN-γ의 mRNA 발현량, PCR 결과를 나타낸 도이다(a~d: RTq-PCR, e: PCR).
도 8은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 간 조직 현미경 사진이다.
도 9는 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 화학적 분석 결과를 나타낸 도이다(a: 포도당, b: 크레아틴, c: 혈액 요소 질소(BUN), d: 혈액 요소 질소/크레아틴, e: 무기인산염, f: 칼슘, g: 총 단백질, h: 알부민, i: 글로불린, j: 알부민/글로불린, k: 알라닌 아미노 트랜스퍼라제, l: 알칼리 포스파타제, m: 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, n: 아밀라제, o: 리파제).
도 10은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 전혈을 분석한 결과를 나타낸 도이다(a: 적혈구, b: 헤마토크릿, c: 헤모글로빈, d: 평균 적혈구 용적, e: 평균 헤모글로빈 용적, f: 평균 혈구 내 혈색소 농도, g: 백혈구, h: 호중구, i: 림프구, j: 단핵구, k: 호산구, l: 호염기구, m: 혈소판).
도 11은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 급이 전, 후 글로불린 G(IgG) 수치를 나타낸 도이다.
도 12는 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 간세포에서 면역관련 인자 TLR4, NOD1·2 및 MYD88의 mRNA 발현량, PCR 결과 및 단백질량를 나타낸 도이다(a~d: RTq-PCR, e: PCR, f: 웨스턴 블롯).
도 13은 일반사료 급이군 및 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 간세포에서 면역관련 사이토카인인 IL-1β, TNF-α, Il-6 및 IFN-γ의 mRNA 발현량, PCR 결과 및 단백질량을 나타낸 도이다(a~d: RTq-PCR, e: PCR, f: 웨스턴 블롯).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w)%, 고체/액체는(w/v)%, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예 또는 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예 또는 실험예들에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예 또는 실험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대해 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대해 제공하는 것이다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 사료 조성물에 대해 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물에 대해 제공하는 것이다.
본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하는 바, 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일예로서 곡류분말, 고기분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 제공하는 것이다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01~5,000 ㎍/mL의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/mL 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/mL를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
각 그림의 모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차로 표시된다. 두 그룹의 차이는 스튜던트 t 검정(Student's t-test)을 사용하여 통계적으로 분석되었다. 일반 사료 급이군(대조군)과 락토바실러스를 첨가한 사료를 급이한 그룹 사이의 중요한 차이는 *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001로 표시된다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS Statistics 24(International Business Machines Corporation, NY, USA)를 사용하여 수행되었다.
<실시예 1> 근위 결장 조직 분석
(1) 현미경분석
3개월 급이 후 돼지를 도축했다. 도축 직후에 근위 결장 샘플을 채취하였다. 각 샘플을 카세트에 넣고 지정된 등급의 에탄올을 사용하여 자일렌으로 탈수하여, 표준 조직학 프로토콜에 따라 파라핀 블록에 내장하였다. 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin; Dako North America, Inc., CA, USA) 및 에오신(Eosin Y; Sigma-Aldrich) 염색을 위해 블롯(Blot)을 5 μm 두께로 절단하고 처리하였다.
헤마톡실린과 에오신을 사용하여 락토바실러스 첨가군 및 미첨가군의 근위 결장을 비교하였다. 락토바실러스 첨가 사료를 급이한 제주 토종 돼지의 근위 결장 조직의 조직학적 분석한 것으로 결장조직을 수집하여 4% 파라포름알데히드에 보존했다. 조직을 고정하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 나타낸 것이다. 도 1a는 헤마톡실린 및 에오신 염색 결장 조직의 현미경 사진이고, 도 1b는 두 사료 급이군의 융모 길이를 비교한 것이고, 도 1c는 두 사료 급이군의 융모 깊이(Villus height)와 Crypt의 깊이(Depth)를 비교한 것이다. 스케일 바는 50 μm이다. 현미경 분석에 따르면 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 돼지의 근위 결장 조직은 대조군에 비해 융모 길이와 높이/융모 높이와 Crypt 깊이가 증가하는 경향을 띠었다(도 1).
<실시예 2> 근 조직 분석
(1) 현미경분석
도 2는 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료를 급이군 제주 토종 돼지로부터 채취한 등심근의 종·횡단면의 현미경 사진이다. 락토바실러스 첨가 사료군과 미첨가 사료군의 근육의 겉보기 형태에 대해서 확인하기 위해 급이한 두 군의 제주 토종 돼지의 근육 조직을 수집하여 4% 파라포름알데히드에 보존하였고, 현미경으로 관찰 직전에 조직의 길이 및 횡단면을 고정하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 형태적으로는 락토바실러스 첨가 사료 급이군과 등심(Longissimus dorsi) 근육 조직의 근육 섬유가 일반사료 급이군의 유의한 차이는 없었다.
(2) mRNA 및 단백질 발현 측정
도 3은 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료 급이군 제주 토종 돼지의 등심에서 근 형성에 관련한 인자의 활성을 나타낸 것이다. RT-PCR, PCR 및 웨스턴 블롯을 사용하여 근 형성 관련 인자인 Myogenic 마커 MyoD, Pax7, Myf5, Myf6 및 MyBPH의 mRNA 발현량 및 단백질량을 분석했다. 도 3a~e는 RT-PCR한 것이고, 도 3f는 PCR한 것에 대한 것이며, 도 3g는 웨스턴 블롯한 것에 대해 나타낸 것이다. RT-PCR결과 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 일반사료 급이군 보다 MyoD, Pax7, Myf5 및 MyBPH에서 mRNA 발현량이 높았고, 특히, Myf5의 mRNA 발현량이 두드러지게 높은 발현량을 보였다. 반면, Myf6의 mRNA 발현량은 일반사료 급이군이 미미한 수준으로 높았다. PCR과 웨스턴 블롯의 결과는 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 단백질 발현량이 유사한 것으로 나타났다. 실험 결과 일부 근 형성 관련 인자의 발현량을 증가시키는 것으로 나타났다.
<실시예 3> 지방 조직 분석 - 지방간 및 비만 개선 효과 확인
(1) 현미경분석
3개월 급이 후 돼지를 도축한 뒤 지방 조직을 채취하였다. 상기와 마찬가지로 두 군의 샘플을 카세트에 넣고 지정된 등급의 에탄올을 사용하여 자일렌으로 탈수한 뒤, 표준 조직학 프로토콜에 따라 파라핀 블록에 내장하였다. 수집된 조직을 4℃에서 하루 동안 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)에 고정하였다. 도 4는 프로토콜에 따라 파라핀 블록에 내장된 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료를 급이군 제주 토종 돼지의 지방 조직 현미경 사진이다(스케일 바: 50 μm). 사료 급이 3개월 후의 지방조직을 채취하여 마찬가지로 4% 파라포름알데히드에 보존하였다. 조직을 고정하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색했다. 지방 조직에서는 세포질 지질과 정상 핵을 덮고 있는 얇은 세포막이 발견되었고, 지질 모서리에 의해 한쪽으로 밀려 있는 형태를 띠었다. 또한, 지방 세포에서 정상적 격막이 관찰되었다. 액적(Droplet)의 크기는 대조군에 비해 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
(2) 등지방 두께 및 사료효율
평균 체중(BW)이 32.69±3.37 kg인 3개월의 암컷 돼지(Sus scrofa domestica)를 사용하여 락토바실러스 첨가시 효과를 평가했다. 일반사료, 락토바실러스가 첨가된 사료[1% 프로바이오틱 락토바실러스를 첨가한 사료(Lactobacillus buchneri NLRI-1201; 1.2×108 CFU/g, Lactobacillus plantarum NLRI-101; 1.6×108 CFU/g)), Lactobacillus casei DK128; 1.4×108 CFU/g with oligosaccharide))의 2가지 방법의 비교를 위해 무작위로 두 그룹(n=9, 각 그룹)으로 3개월 동안 급이 하였다. 일반사료(대조군)는 옥수수, 밀, 대두박 및 밀기울을 기반으로 제조되었으며, 영양요구사항을 충분히 충족하도록 구성하였다. 일반사료의 구성물에 대해 나타낸 것이 표 1이다. 표 1의 비타민 프리믹스는 kg당 비타민 A, 12,000 IU; 비타민 D3, 2,000 IU; 비타민 E, 100 IU; 비타민 K3, 4.5 mg; 비타민 B1, 2 mg; 비타민 B2, 7 mg; 비타민 B3, 45 mg; 판토텐산, 30 mg; 비타민 B6, 4.5 mg; 비오틴, 0.5 mg; 엽산, 3.5 mg; 비타민 B12, 0.03 mg; 항산화제, 6.6 mg으로 이루어진 것이다. 또한, 미네랄 프리믹스는 kg당 Fe, 150 mg; Zn, 85 mg; Mn, 37 mg; Cu, 11 mg; Co, 2 mg; 3 mg; Se, 0.15 mg으로 이루어진 것이다.
Basal diet
성분(Ingredients, g/kg)
옥수수(Corn) 392.5
밀(Wheat) 200.0
대두박(Soybean meal) 137.3
밀기울(Wheat bran) 104.0
대두껍질(Soybean hull) 54.1
쌀겨(Rice bran) 40.0
섬유소원(Fiberfeed) 20.0
석회(Limestone) 15.6
우지(Tallow) 10.0
일인산석회(Mondicalcium phosphate) 9.0
염화나트륨(Sodium chloride, NaCl) 5.0
염화콜린(Choline chloride) 2.2
산미제(Acidifier) 2.0
트립토판(Tryptophan) 2.0
리신(Lysine) 1.8
독소결합제(Toxin-binder) 0.5
비타민 프리믹스
(Vitamine premix)		 2.0
미네랄 프리믹스
(Mineral premix)		 2.0
Total 1,000.0
조영양소 및 열량
수분(Moisture, %) 12.98
조단백질(Crude protein, %) 15.65
조지방(Crude fat, %) 3.58
조회분(Crude ash, %) 2.83
조섬유(Crude fiber, %) 5.64
열량(Kcal/kg) 3,836.00
동물은 스테인리스 스틸(2,000W×2,000D×1,300H mm)로 만든 우리와 환기가 잘되는 우리에 개별적으로 보관되었으며, 지속적인 조명 아래에서 실험 중에 물을 자유롭게 마실 수 있도록 환경을 조성하였다. 실험이 시작되기 전에 어떤 돼지에서도 설사나 다른 질병의 임상적 징후는 관찰되지 않았다.
두 그룹의 성장 성능을 평가하기 위해 실험 기간 동안 돼지의 체중을 매월 측정하였고, 등지방 두께는 초음파 프로브(Anyscan BF; SENGKANG GLC, Korea)를 사용하여 스캔 부위를 정확하게 확인하기 위해 물리적 촉진으로 등 중간 위치에서 약 20 cm 떨어진 곳에서 측정하였다. 되도록 실험동물이 스트레스를 받을 환경은 피하고, 편안한 자세에서 스캔하도록 하였다. 초음파 젤은 탐침과 피부 사이의 보다 나은 접촉성을 위해 전도 물질로 사용하였다.
하기 표 2는 일반사료 공급군과 락토바실러스 첨가 사료 공급군의 3개월 동안 체중, 일일 평균 체증량, 사료섭이량, 사료효율 및 등지방 두께를 급이 전, 후로 비교하여 나타낸 것이다. 섭식 기간 동안 일반사료를 섭이한 군은 32.75 kg에서 60.38 kg, 락토바실러스를 첨가한 사료를 섭이한 군에서는 32.63 kg에서 56.50 kg으로 두 군 모두에서 체중이 증가하였다. 동물은 매달 체중을 측정하고, 실험 내내 09:00에 동일한 양의 식사를 두 번 급이 하였다. 평균 체증량은 한 달을 30일을 기준으로 하여 평균을 계산하였다. 참고로 사료효율은 사료 급이량/증체량으로 계산된 것이다.
일반 사료
(대조군)		 락토바실러스
첨가 사료		 SEM P값
체중
(kg)		 급이 전 32.75 32.63 2.57 0.96
급이 후 60.38 56.50 3.47 0.31
평균 체증량(g/d) 306.94 265.28 37.38 0.31
사료 섭이량(g/d) 1.60 1.60 - -
사료효율 191.84 164.16 23.27 0.28
등지방 두께
(mm)		 급이 전 7.75 8.75 0.89 0.30
급이 후 14.00 14.75 1.03 0.49
급이 결과 평균 체증량의 증가, 두 그룹 간 사료효율 및 등지방 두께의 형태학적 차이는 유의하지 않았다. 3개월 동안 일일 평균 체증량은 일반사료 및 락토바실러스 첨가된 사료 급이 그룹에서 각각 306.94 g/d 및 265.28 g/d로 나타났다. 동일하게 급이하여 사료 섭이량(g/d)은 같다. 3개월 동안 사료효율은 일반사료를 섭이한 군의 경우 191.84, 락토바실러스가 첨가된 사료 그룹의 경우 164.16로 사료효율 또한 두 군간의 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
등지방 두께는 일반 사료 급이군의 경우 7.75에서 14.00 mm로, 락토바실러스가 첨가된 사료 급이군의 경우 8.75에서 14.75 mm로 증가하였다. 즉, 일반 사료 급이군은 6.25 mm 등지방 두께가 증가한 반면, 락토바실러스 첨가 사료군은 6 mm의 등지방 두께가 증가되었다. 이러한 결과는 락토바실러스 속에 의한 장내 미생물의 조절로 제주 흑돼지의 체중량 또는 지방 손실을 초래하는 것으로 보여진다.
(3) mRNA 및 단백질 발현 측정
정확한 조직의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 분석하기 위해 샘플을 액체질소에서 급속 냉동하고 -80℃에 보관하였다. Total RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 등심(Longissimus dorsi muscle), 지방, 간 및 근위 결장 조직에서 추출하였다. RNA는 적절한 양의 0.1% 디에틸피로카보네이트 처리수(Sigma-Aldrich, Inc., MO, USA)에서 용출되었고 total RNA 농도는 NanoDrop™ 2000 분광광도계(Thermo Scientific, Waltham, MA, 미국)로 측정하였다. cDNA 준비를 위해 ImProm-II™ Reverse Transcriptase 시약(Promega, USA)을 사용하여 total RNA를 역전사시켰다. 제주대학교 바이오헬스 연구센터(Bio-Health Materials Core-Facility)에서 표적 mRNA의 발현 수준을 SYBR 프리믹스 ExTaq 시약(TaKaRa Bio, Mountain View, CA, USA) 및 CFX96™ Real-Time System(BIO-RAD, Hercules, CA, USA)을 사용하여 증폭하였다. 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
Primer name Primer sequence(5´→3´)
pGAPDH F ATCACTGCCACCCAGAAGAC
pGAPDH R AGCCCCAGCATCAAAGGTAG
mAdiponectin F GGA ACT TGT GCA GGT TGG AT
mAdiponectin R CTT GCC AGT GCT GTT GTC AT
mChemerin F TAC AGG TGG CTC TGG AGG AG
mChemerin R GGC AAA CTG TCC AGG TAG GA
pVisfatin F AGT TAC ATG ACT TTG GTT ACA
pVisfatin R TGA TAT CCA CGC CAT CTC CTT G
pTLR4 F GGC AGT GTG CTG AGG AGA GA
pTLR4 R CGA GGA ATC ATC CTG GCA TT
pNOD1 F TTC TTC GTC TTC GTG CTC CA
pNOD1 R GCT CAC TGG ATC GGT GTT GA
pNOD2 F TCT GCC TGG AGG AGA ACC AT
pNOD2 R GAG GTG ACG TGG TTG TTG GA
pMyD88 F CTG CGT CTG GTC CAT TGC TA
pMyD88 R TGG AGA GAG GCT GAG TGC AA
pIL-1B F GTGTTCTGCATGAGCTTTGTG
pIL-1B R GGCTTTCCTTAGGGAGAGAGG
pTNF-α F CAGCTGGAGAAGGATGATCGA
pTNF-α R CCAAAATAGACCTGCCCAGATT
pIL-6 F GACCTGCTTGCTGAGAATCACC
pIL-6 R ATCCACTCGTTCTGTGACTGC
pINF-γ F GAGCCAAATTGTCTCCTTCTAC
pINF-γ R CGAAGTCATTCAGTTTCCCAG
pMyoD F GTCACCCAGGAGCACAAAT
pMyoD R CCTGAGCAAAGTCAACGAG
pPax7 F CCA TGG CTG TGT CTC CAA GA
pPax7 R CGG ATG GAC CCG GTC TCT
pMyBPH F AGTGCAGAAGGCAGACAAA
pMyBPH R AAGACCCGGAAGGAGTAAGA
mPPARα F TGCAAACTTGGACTTGAACG
mPPARα R AATCCCCTCCTGCAACTTCT
mPPARβ F TTGAGCCCAAGTTCGAGTTTGCTG
mPPARβ R ATTCTAGAGCCCGCAGAATGGTGT
mPPARγ F CTG GCC TCC CTG ATG AAT AA
mPPARγ R CAC GTG CTC TGT GAC GAT CT
유전자 발현 수준은 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산되었다. 테스트된 유전자의 mRNA 수준은 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 mRNA 수준으로 정량화하였다.
각 조직의 단백질 함량은 BCA 분석을 사용해 측정하였고, 각 샘플에서 20 μg의 단백질을 10-12% Bis-Tris 젤(Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)에서 분리했다. 그 후 단백질을 니트로셀룰로오스 블로팅막(GE Healthcare, NJ, USA)으로 옮기고 5% 탈지유(BD Difco, USA)로 차단하고 GAPDH, Adiponectin, Chemerin, and TNF-α(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), Nampt(Invitrogen); TLR4, MYD88, IL-1β, IL-6, and IF-γ(Cell Signaling Technology, Inc., MA USA); and NOD1 and NOD2(Abcam, Cambridge, UK)를 1차 항체를 사용하여 4℃에서 하루 동안 배양하였다. 배양 후 블롯(Blot)을 Horseradish peroxidase-labeled secondary antibodies(Solarbio Life Sciences & Technology Co., Ltd., China)로 실온에서 60분 동안 조사하고, SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 시각화하였다. 면역 반응 밴드의 강도는 화학 발광 이미징 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 검출하였다. 제주 흑돼지 지방 조직에서 아디포카인의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 RTq PCR, PCR 및 웨스턴 블롯을 했다(도 5). 지방 조직에서 아디포카인인 Adiponectin, Chemerin 및 Visfatin의 mRNA 발현량과 단백질량 측정시 mRNA 발현량은 프라이머와 SYBR Green-based PCR 키트를 사용하였다. 도 5a, b, c는 RTq-PCR로 아디포카인의 발현량을 측정한 것이고, 도 5d는 아디포카인을 PCR로 확인한 것이며, 도 5e는 아디포카인 발현량을 웨스턴 블롯한 것을 나타낸 것이다. 일반사료 급이군과 비교하여 평균±평균의 표준 오차(n=9)로 표시하였다. RTq-PCR 결과 지방 조직에서 Adiponectin(P<0.05), Chemerin(P<0.05), Visfatin의 mRNA 발현은 일반사료 급이군에 비해 락토바실러스 첨가 급이군에서 감소되는 것으로 나타났다.
또한, 웨스턴 블롯한 결과 Adiponectin, Chemerin 및 Visfatin의 단백질량은 일반사료 급이군에 비해 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 감소한 것으로 나타났다. 이러한 아디포카인 발현 패턴은 등지방 두께 결과와 일치하였다.
도 6은 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)의 지방세포에서 활성에 대해 확인한 것을 나타낸 것이다. PPAR은 Adiponectin, Chemerin 및 Visfatin을 포함한 아디포카인(Adipokine)과 밀접한 관련이 있는 인자에 해당된다. 도 6c는 모든 유형의 지방 조직에서 가장 중요한 지방 세포 발달의 전사 조절 인자인 PPAR-γ의 발현량을 나타낸 것으로 일반사료 급이군보다 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방조직에서 감소되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 조성물은 지방세포을 감소시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
도 7은 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료의 지방세포에서 면역 사이토카인 활성을 측정한 것이다. 지방세포에서 IL-1β, TNF-α 및 IL-6의 활성도는 일반사료 급이군의 활성도가 약간 높았다. 그러나, 면역에 관련한 사이토카인인 IFN-γ의 활성도가 락토바실러스 첨가 사료의 지방세포에서 유의하게 높은 수치를 나타냈다. 이는 락토바실러스 조성물을 섭이한 군의 지방세포에서 면역력이 증대 되었다는 것을 시사한다.
<실시예 4> 간 조직 분석 - 지방간 및 비만 개선 효과 확인
(1) 현미경분석
3개월 급이 후 돼지를 도축한 뒤에 간 조직을 채취하였다. 현미경 관찰을 위해 헤마톡실린과 에오신으로 상기에 기재된 방법을 사용하여 염색하였다. 도 8는 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료를 급이군 제주 토종 돼지의 간 조직의 현미경사진이다. 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 지방 세포에서 특이한 변화는 발견되지 않았다. 손상되지 않은 간세포, 중심 정맥, 두드러진 핵 및 굴모세혈관의 정상적인 조직이 두 그룹 모두에서 관찰되었다.
보다 자세한 분석을 위해 실험기간 동안 매월 경정맥을 통해 혈액을 수집하였다. 혈액 수집 튜브(BD Vacutainer; BD Biosciences, Franklin Lakes, USA)를 사용하여 혈장 및 전혈을 수집하였다. 채혈 후, 혈액 샘플을 실온에서 1 시간 동안 배양하고 1,700 ×g로 30분 동안 원심분리하여 전혈샘플에서 혈장과 혈액세포를 분리하였다. Catalyst DX×Chemistry Analyzer 및 Chem 17 클립(IDEXX Laboratories, Inc., USA)을 사용하여 혈장을 분석하였다. 제조업체의 지침에 따라 ProCyte DX Hematology Analyzer(IDEXX Laboratories, Inc.)를 사용하여 전체 혈구수를 측정하였다. 혈장 면역글로불린 G(IgG) 수준은 돼지 면역글로불린 G(IgG) 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트(Solarbio Life Sciences & Technology Co., Ltd., China)를 사용하여 정량화하였다.
실험의 시작과 끝에서 건강과 영양 상태를 확인하기 위해 혈액 매개변수를 조사하였다. 혈장 생화학적 분석 결과는 하기의 표 4 및 도 9에 나타내었다.
급이 전 급이 후
일반사료 락토바실러스 속 첨가 사료 SEM P값 일반사료 락토바실러스 속 첨가 사료 SEM P값
포도당
(mg/dL)		 112.0 116.3 3.97 0.33 102.5 96.0 11.87 0.60
크레아틴
(mg/dL)		 0.9 0.8 0.04 0.03 1.2 1.1 0.16 0.31
혈액 요소 질소
(mg/dL)		 10.3 11.8 1.06 0.21 20.0 14.5 2.60 0.08
혈액 요소 질소/크레아틴 11.0 14.5 1.44 0.05 17.0 14.3 3.47 0.46
무기 인산염
(mg/dL)		 9.4 9.1 0.49 0.50 8.2 7.5 0.37 0.11
칼슘
(mg/dL)		 11.2 10.7 0.20 0.06 10.6 10.4 0.25 0.52
총 단백질
(g/dL)		 7.6 8.0 0.27 0.13 8.2 9.1 0.44 0.08
알부민
(g/dL)		 3.4 3.6 0.13 0.19 4.0 4.1 0.10 0.35
글로불린
(g/dL)		 4.2 4.5 0.16 0.14 4.1 5.0 0.45 0.11
알부민/
글로불린		 0.8 0.8 0.03 0.36 1.0 0.9 0.07 0.19
알라닌 아미노 트랜스퍼라제
(ALT, U/L)		 79.3 84.5 18.61 0.79 51.0 65.5 16.74 0.42
알칼리 포스파타제
(ALP, U/L)		 154.5 144.5 40.20 0.81 102.0 59.8 20.50 0.08
감마 글루타밀 트랜스퍼라제
(GGT, U/L)		 28.3 28.0 4.99 0.96 91.0 40.0 24.40 0.08
총 빌리루빈
(mg/dL)		 0.1 0.2 0.05 0.36 0.3 0.6 0.11 0.03
콜레스테롤
(mg/dL)		 73.5 69.8 10.67 0.74 94.5 71.5 7.48 0.02
아밀라제 (U/L) 563.8 540.5 114.68 0.85 699.3 602.0 165.07 0.58
리파제
(U/L)		 11.0 14.5 4.61 0.48 67.5 46.0 30.93 0.51
본 발명의 도 9는 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료 급이군 제주 토종 돼지의 혈액 분석에 대해 나타낸 것이다. 실험 기간 동안 전혈 샘플을 매월 수집하고 혈액 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양하고 1,700 ×g에서 30분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 수집된 혈액은 당일에 화학분석을 시행하였다. 도 9a는 포도당, 도 9b는 크레아틴(CREA), 도 9c는 혈액 요소 질소(BUN), 도 9d는 혈액 요소 질소/크레아틴, 도 9e는 무기 인산염, 도 9f는 칼슘, 도 9g는 총 단백질, 도 9h는 알부민(ALB), 도 9i는 글로불린(GLOB), 도 9j는 알부민/글로불린, 도 9k는 알라닌 아미노 트랜스퍼라제, 도 9l은 알칼리 포스파타제, 도 9m은 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, 도 9n은 아밀라제 및 도 9o는 리파제 함유량을 나타낸다.
급이 전 급이 후
일반사료 락토바실러스 첨가 사료 SEM P값 일반사료 락토바실러스 첨가 사료 SEM P값
적혈구
(M/μl)		 8.15 7.10 0.34 0.02 8.20 8.65 0.33 0.22
혈액 내 적혈구 비중
(%)		 41.88 36.48 2.07 0.04 46.25 48.90 1.81 0.19
헤모글로빈
(g/dL)		 12.60 10.95 0.52 0.02 14.20 15.15 0.52 0.11
평균 적혈구 용적
(fL)		 51.50 51.33 1.42 0.91 56.48 56.50 1.13 0.98
평균 헤모글로빈 용적
(pg)		 15.50 15.38 0.38 0.75 17.38 17.50 0.27 0.66
평균 혈구내 혈색소 농도
(g/dL)		 30.10 30.03 0.45 0.87 30.73 30.98 0.50 0.63
백혈구
(K/μl)		 24.95 25.63 3.33 0.85 18.48 20.73 1.87 0.27
호중구
(K/μl)		 9.80 13.55 2.79 0.23 5.48 8.68 1.46 0.07
림프구
(K/μl)		 12.90 10.53 2.28 0.34 11.53 10.65 1.56 0.60
단핵구
(K/μl)		 1.45 1.30 0.28 0.61 0.73 0.75 0.13 0.85
호산구
(K/μl)		 0.83 0.48 0.18 0.10 0.73 0.68 0.19 0.81
혈소판
(K/μl)		 239.25 184.75 81.34 0.53 315.25 313.25 35.27 0.96
두 그룹 모두 실험의 시작과 끝에서 혈장 포도당, 크레아티닌, 무기 인산염 및 칼슘 농도에 차이가 없었다. 혈액 요소 질소(BUN) 농도는 일반사료 급이군 보다 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 보다 낮은 수치를 나타냈다(P<0.08). 총 단백질(P<0.08) 및 총 빌리루빈(P<0.03) 농도는 일반사료 급이군 보다 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 더 높은 수치를 나타낸 반면, 콜레스테롤 수치(P<0.02)와 알칼리 포스파타제(ALP)(P<0.08) 및 감마 글루타밀 트랜스퍼라제(GGT)(P<0.08) 활동은 일반사료 급이군에 비해 락토바실러스 첨가 사료 급이군에서 낮은 수치를 나타내었다. 다른 혈장 생화학적 매개변수는 두 그룹간의 차이가 없었다. 혈액학적 분석을 통해 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 호중구 수가 일반사료 급이군 보다 많았다(P<0.07) (표 5 및 도 10h).
(2) 혈액분석
도 10은 일반사료 급이군과 락토바실러스 첨가 사료 급이군 제주 토종 돼지의 전혈을 분석한 것이다. 실험 기간 동안 매월 전혈 샘플을 수집하고, 수집 당일에 전체 혈구 수를 분석했다. 도 10a는 적혈구, 도 10b는 헤마토크릿, 도 10c는 헤모글로빈, 도 10d는 평균 적혈구 용적, 도 10e는 평균 헤모글로빈 용적, 도 10f는 평균 혈구내 혈색소 농도, 도 10g는 백혈구, 도 10h는 호중구, 도 10i는 림프구, 도 10j는 단핵구, 도 10k는 호산구, 도 10l은 호염기구 및 도 10m은 혈소판에 대해 나타낸 것이다.
항체는 면역계의 주요 구성요소이다. 면역글로불린 G(IgG)는 혈액과 세포외액에 있는 주요 항체이다. 면역글로불린 G(IgG)는 수많은 병원체, 예를 들면 바이러스나 세균, 진균 등과 결합하여 신체 조직이 감염되지 않도록 한다. 면역글로불린 G(IgG)가 병원체에 결합하면 병원체는 이동하는 능력이 떨어지고 서로 응집된다. 면역글로불린 G(IgG)가 병원체 표면을 둘러싸면 포식성 면역 세포가 그것을 인지하고 병원체를 제거한다.
도 11은 면역글로불린 G(IgG) 수치를 측정하여 두가지 사료 급이군의 비교하여 나타냈다. 실험 돼지의 혈장에서 면역글로불린 G(IgG) 수준은 ELISA 키트를 사용하여 정량화하였다. 데이터는 평균±평균의 표준 오차(n=9)로 표시된다. 락토바실러스 첨가한 사료 급이 제주 토종 돼지의 혈중 면역글로불린 G(IgG) 수치가 증가하였다. 따라서, 락토바실러스가 첨가된 사료 급이군이 면역력이 증가한 것으로 판단된다. 상기의 결과를 종합해보면, 락토바실러스 조성물이 콜레스테롤과 간 대사 및 면역 반응을 변화시킬 수 있음을 시사한다.
(3) mRNA 및 단백질 발현 측정
채취한 간 조직에서 면역과 밀접한 인자인 TLR4와 NOD(Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein) 1·2 및 MYD88의 mRNA 및 단백질 발현을 측정하여 나타낸 것이 도 12이다. 간의 면역 활성화 관련 사이토카인도 마찬가지로 RTq-PCR, PCR 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 도 12a, b, c, d는 RTq_PCR, 도 12e는 PCR 도 12f는 웨스턴 블롯한 것의 결과이다. TLR4 및 MYD88 mRNA 발현은 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 돼지 간에서 일반사료 급이군에 비해 증가하는 것으로 나타났다. 간에서 NOD1과 NOD2의 mRNA 발현량은 일반사료를 공급한 군보다 락토바실러스 첨가 사료를 먹인 돼지에서 증가하는 것으로 나타나긴 하였으나 유의한 차이라고 간주되기에는 어려운 정도였다. 웨스턴 블롯의 결과에서도 간 조직의 TLR4 및 MYD88 단백질 발현량이 락토바실러스 첨가한 사료를 급이군에서 보다 증가한 것으로 나타났다.
도 13은 간 조직에서 면역 활성화와 관련한 사이토카인 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 INF-γ의 발현량을 측정하여 나타낸 것이다. 도 12e의 결과와 같이 NOD1의 mRNA 발현량을 측정하였을 때도 상향조절 되는 것으로 나타났다. 그러나 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 돼지 간에서는 일반사료 급이군에 비해 유의하게 증가된 것이라고 하기에 어렵다. 다만, 웨스턴 블롯 결과에서는 NOD1의 발현은 일반사료 급이군에 비해 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 돼지 간 보다 명확하게 발현량이 증가되었다. 또한, 일반사료 급이군과 비교했을 때, 락토바실러스 첨가 사료 급이군의 간 조직에서 면역반응 관련 사이토카인 IL-1β, TNF-α는 P<0.001, IL-6, IFN-γ에서는 P<0.001의 정도로 mRNA와 단백질량이 보다 높았다. 간 면역이 증진에 관련된 TNF-α/IFN-γ의 TLR4 신호전달 발현량이 락토바실러스 첨가 사료 섭이시 증가되는 것으로 나타났다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 장내 환경 개선 효과를 가진, 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈액 요소 질소(BUN) 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 콜레스테롤 수치를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 알칼리 포스파타제(ALP) 및 감마 글루타밀 트랜스퍼라제(GGT) 수치를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 면역 증진 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  8. 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 락토바실러스 부크너리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 플랜타늄(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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