KR102097509B1 - 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법 - Google Patents
신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일 구체예는 신규 유산균, 고구마 배지의 신규 유산균 발효물, 상기 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 및 항비만 효능이 있는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 유산균 발효물은, 체내에서 α-아밀라아제, α-글루코시다아제 및 리파아제 중 적어도 하나의 활성을 저해하는 효과가 있고, 지방 전구세포에서 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, FABP4와 같은 지방 세포 분화에 관여하는 인자를 억제시키고 Glut4의 활성을 증가시켜 세포 내 포도당 유입을 증가시킬 수 있는 효과가 있다. 따라서, 상기 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 비만 또는 당뇨를 예방 또는 치료하는 효과가 있는 약학적 조성물 또는 비만 또는 당뇨를 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 유산균, 고구마를 상기 유산균으로 발효시켜 수득한 항비만 및 항당뇨 효능이 있는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유산균은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균이다. 이는 농산물이나 식품, 사람이나 동물의 체내 등 자연계에 널리 분포하고 있다. 치즈, 발효유, 김치, 제빵 등의 발효에 많이 이용된다. 일반적으로 유산균을 섭취하면, 장내 미생물들 중 유해균이 억제될 뿐 아니라, 음식물의 소화, 흡수, 분해하는 것을 돕는 유익균이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 유산균을 섭취하면, 혈중 콜레스테롤 감소, 면역력 증진, 내인성 감염 억제, 간경화 개선, 항암 효과 등의 다양한 효능이 있다는 점이 보고되어 있다. 그뿐 아니라, 최근 유산균으로 발효된 천연물의 효능 증대에 대한 연구도 이루어지고 있다.
한편, 고구마는 메꽃과의 한해살이 뿌리 채소로, 주로 전분이 많고 단 맛이 나는 혹 줄기를 가진 재배용 작물이다. 고구마에서 주로 먹는 부분은 뿌리이며, 고구마는 뿌리에 영양분이 축적되어 둥그렇고 크기가 크다. 고구마는 다량의 섬유질을 함유하는 알칼리성 식품이다. 즉, 고구마는 식물성 섬유소가 풍부하므로 변비와 혈중 콜레스테롤의 균형을 돕고 이 외에도 혈압조절, 노화방지, 항암작용 및 피부미용에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 고구마는 수분을 제외한 대부분이 에너지 공급원인 탄수화물로 열량이 높은 식품이면서 비타민 C와 카로티노이드, 안토시아닌, 폴리페놀, 무기질, 식이섬유 등의 함량이 높아 훌륭한 식량자원으로 평가되고 있다.
최근에는 이러한 고구마의 효능에 주목하여 고구마를 이용한 다양한 가공식품이 개발 및 시판되고 있으나, 여기에 유산균을 접목시켜 기능성을 증진시킨 소재에 대한 연구는 미미한 실정이다.
본 발명의 일 실시예는 현대 사회의 주요 질병인 비만과 당뇨의 예방과 치료를 위해 발명된 것으로서, 고구마를 인변에서 분리한 신규 유산균 이용하여 발효시킴으로써 항비만 및 항당뇨 효능을 가지는 유산균 발효물, 이를 포함하는 약학적 조성물, 건강기능식품 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 일 구현예는, 기탁번호 KCTC 13517BP로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 제공할 수 있다.
또한, 본발명의 다른 구현예는 상기 균주로 발효된 유산균 발효물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예는 상기 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는 상기 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예는 고구마에 기탁번호 KCTC 13517BP로 기탁된 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하는 단계를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 고구마의 신규 유산균 발효물은, 체내에서 α-아밀라아제, α-글루코시다아제 및 리파아제 중 적어도 하나의 활성을 저해하는 효과가 있다. 또한, 지방 전구세포에서 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, FABP4와 같은 지방 세포 분화에 관여하는 인자를 억제시키고 Glut4의 활성을 증가시켜 세포 내 포도당 유입을 증가시킬 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 비만 또는 당뇨를 예방 또는 치료하는 효과가 있는 약학적 조성물 또는 비만 또는 당뇨를 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고구마 배지를 사용한 유산균 발효물과 대조군 YG배지, 탈지분유 배지의 발효물의 동결건조 후 유산균의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고구마 배지를 사용한 유산균 발효물과 대조군 YG배지 발효물의 총폴리페놀함량을 보여주는 그래프이다.
도 3은 지방전구세포 3T3-L1세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 지방전구세포 3T3-L1세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 비교한 사진이다.
도 8은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 9는 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포 분화 인자를 단백질 단계에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 11은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 12는 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포 분화 인자를 단백질 단계에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 13은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 Glucose analog인 2-NBDG를 처리하여 Glucose uptake를 비교한 그래프이다.
도 14는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 군과 처리하지 않은 군, 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 대해 포도당 전사인자 Glut4의 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 유산균 발효물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 Glucose analog인 2-NBDG를 처리하여 Glucose uptake를 비교한 그래프이다.
도 16은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 유산균 발효물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 대해 포도당 전사인자 Glut4의 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고구마 배지를 사용한 유산균 발효물과 대조군 YG배지 발효물의 총폴리페놀함량을 보여주는 그래프이다.
도 3은 지방전구세포 3T3-L1세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 지방전구세포 3T3-L1세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 농도별 및 시간별로 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 비교한 사진이다.
도 8은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 9는 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포 분화 인자를 단백질 단계에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 11은 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 발효물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포의 분포를 Oil Red O 염색을 통해 흡광도를 비교한 그래프이다.
도 12는 지방전구세포 3T3-L1세포주를 지방세포로 분화시킬 때 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 군과 처리한 군의 지방세포 분화 인자를 단백질 단계에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 13은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 Glucose analog인 2-NBDG를 처리하여 Glucose uptake를 비교한 그래프이다.
도 14는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 군과 처리하지 않은 군, 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 대해 포도당 전사인자 Glut4의 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 유산균 발효물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 Glucose analog인 2-NBDG를 처리하여 Glucose uptake를 비교한 그래프이다.
도 16은 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화시킨 세포주에 본 발명의 일 실시예에 따른 멸균한 유산균 유산균 발효물을 처리한 군, 처리하지 않은 군과 양성대조군인 인슐린을 처리한 군에 대해 포도당 전사인자 Glut4의 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 신규한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 제공할 수 있다.
구체적으로, 상기 락토바실러스 람노서스균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2018년 4월 27일자로 기탁되었으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 13517BP를 부여받았다.
상기 균주는 사람의 분변으로부터 분리한 것으로서, 염기서열을 통한 계통 분류 결과를 바탕으로 락토바실러스 람노서스에 속하는 새로운 균주로 분류될 수 있다.
본 발명자들은 상기 신규한 유산균 균주를 분리 동정하였다. 특히, 이 균주로 고구마를 발효시킨 발효물이 항당뇨 및 항비만 효능이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본원에서 사용되는 용어 “비만”은 체내에 체지방이 과도하게 축적되는 것을 의미한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "당뇨"는 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종을 의미한다.
즉, 본 발명의 다른 측면은, 고구마를 사용하여 상기 균주로 발효된 유산균 발효물을 제공할 수 있다. 상기 고구마는 고구마 다이스, 이의 분쇄물, 고구마 페이스트, 고구마 배지 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 고구마는 자색고구마, 호박고구마, 꿀고구마, 황색고구마, 밤고구마, 물고구마, 맛젤고구마로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 바람직하게는 밤고구마일 수 있다.
또한, 상기 유산균 발효물은 고구마 배지를 발효시킨 것일 수 있으며, 상기 고구마 배지는 고구마 원료와 물을 2 : 1 내지 1 : 2의 중량비로 포함할 수 있다. 아울러, 포함된 물의 1 내지 3배의 물을 더 첨가한 후 발효시킬 수 있다.
또한, 상기 유산균을 YG 배지, 탈지분유 배지 및 고구마 배지를 발효시킨 후에 발효물을 동결건조 후 건조물 내 유산균의 생존율을 측정한 결과, 고구마 배지의 생존율이 7 배 내지 1.4 배 높았다. 즉, 고구마는 상기 유산균 발효물을 동결건조시키는 경우 유산균의 보존성을 향상시키는 효과가 있는 바, 고구마가 상기 유산균의 동결건조 보존제로 사용될 수 있다.
또한, 상기 유산균 발효물의 폴리페놀 함량은 발효 전 고구마, 예를 들어 고구마 배지의 폴리페놀 함량의 1.5 배 내지 4 배일 수 있다. 폴리페놀은 하이드록시기를 2개 이상 갖고 있는 물질로, 유해산소를 제거하는 항산화 작용 및 항염증 작용이 있을 뿐만 아니라, 혈당과 체내지질대사를 조절하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질이다. 본 발명의 신규 유산균 균주로 고구마 배지를 발효시킴으로써, 고구마를 포함하는 조성물의 폴리페놀의 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
한편, 상기 유산균 발효물은 α-아밀라아제, α-글루코시다아제 및 리파아제 중 적어도 하나의 활성을 저해할 수 있다.
α-아밀라아제 또는 α-글루코시다아제는 생체 내 탄수화물 분해효소이며, 리파아제는 지방 분해효소이다. 당뇨병 또는 비만의 병증이 있는 환자의 혈당 조절과 지질 대사 개선을 위해 이러한 효소들의 활성을 저해하는 약제가 개발되고 있으나, 각종 부작용과 합성의 어려움으로 인해 유사 활성을 갖는 천연물에 대한 요구가 있어 왔다. 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 유산균 발효물은 상기 효소들의 활성을 저해하는 효과가 있는바, 탄수화물과 지방의 분해를 직접적으로 억제함으로써 당뇨병 및 비만의 예방, 치료, 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 유산균 발효물은 C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding protein α), C/EBPβ(CCAAT-enhancer-binding protein β), PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ), 아디포넥틴(Adiponectin) 및 FABP4(fatty acid binding protein 4) 중 적어도 하나의 발현을 억제하고, GLUT4(Glucose transporter type 4)의 발현을 증가시키는 효과가 있다.
지방세포분화는 형태, 호르몬 민감성 및 유전자 발현에서의 변화가 수반되는 복잡한 과정이다. 몇몇 전사 인자는 지방세포분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 지방세포의 형성과정에 관여하는 주요 전사인자로는 C/EBPα와 PPARγ가 있다. 또한, PPARγ는 아디포넥틴 또는 FABP4등의 지방분화 마커 유전자들의 발현을 증가시킨다.
아울러, GULT4는 인슐린 수송로로서, 인슐린에 의한 자극이 오면 세포 내 GULT4는 원형질막으로 이동하여 포도당 수송을 촉진한다. 따라서, GLUT4는 혈중 글루코오스의 세포 내 유입을 원활하게 하여 혈당을 낮추는 역할을 한다. 즉, 글루코오스 수송에 관여하는 GLUT4의 활성 및 발현이 증가할수록 항당뇨 효과가 증가한다.
또한, 상기 유산균 발효물은 동결건조된 것일 수 있으며, 동결건조된 발효물을 분말화하여 기능성 식품 등 여러가지 제제의 원료로 활용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 유산균 발효물 뿐만 아니라 본 명세서에 기술되거나 기재되지 않은 영양또는 약제학적 용도에 유용한 임의의 추가 또는 선택 성분을 포함할 수 있다. 이러한 다수의 선택 성분은 경구투여에 안전하고 효과적이며 본 발명의 조성물의 필수 및 다른 선택 성분과 상용성이 있다면, 본 발명의 조성물에도 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제, 방부제, 산화방지제, 완충제, 다른 약제학적 활성제, 감미료, 착색제, 향미료, 향미료 증강제, 증점제 및 안정화제, 유화제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 선택 성분들과 함께 제형화되어 조제될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 전술한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
상기 건강기능식품은 수득된 유산균 발효물을 직접 섭취가 가능하도록 포장하여 제품화될 수 있고, 또는 동결건조된 유산균 발효물을 식품의 보조원료로 첨가하여 기능성 식품으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균 발효물을 음료형태로 가공하거나, 캡술 형태로 가공하거나, 정제 형태로 가공하여 제품화할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은, 고구마, 예를 들어 고구마 배지를 포함하는 조성물에 기탁번호 KCTC 13517BP로 기탁된 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하는 단계 및 상기 조성물을 발효시키는 단계를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법을 제공할 수 있다. 특히, 발효를 위해 질소원 및/또는 탄소원을 더 첨가할 수 있다. 예를 들어, 효모 추출물 및/또는 당분을 첨가할 수 있다.
예를 들어, 상기 접종하는 단계는, 1) 고구마를 포함하는 조성물을 준비하는 단계, 2) 상기 조성물에 효모 추출물을 첨가 후 멸균하는 단계, 3) 멸균된 조성물에 글루코오스를 포함하는 조성물을 첨가한 후, KCTC 13517BP 균주를 접종하는 단계를 포함하는 유산균 발효물의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 고구마를 포함하는 조성물은 다양한 종류의 고구마를 분쇄하고 물과 균질화시켜 제조한 고구마 배지일 수 있고, 상기 고구마 조성물 100 중량부 대비 고구마 원료를 10 내지 40 중량부, 15 내지 35 중량부, 20 내지 30 중량부 또는 25 내지 28 중량부로 포함할 수 있다.
또한, 상기 고구마를 포함하는 조성물에 질소원으로서 효모 추출물을 첨가할 수 있고, 이때 전체 조성물 중 효모 추출물이 2.5 g/L 내지 20 g/L, 5 g/L 내지 15 g/L 또는 7 g/L 내지 12 g/L의 농도가 되도록 첨가할 수 있다. 아울러, 효모 추출물을 첨가한 후, 조성물의 pH 값을 5 내지 8, 5.5 내지 7.5 또는 6 내지 7 정도로 조절하는 것이 유기산 생산량 측면에서 가장 바람직하다. 아울러, 효모 추출물을 첨가한 후 100℃ 내지 130℃의 온도로 10 분 내지 30 분간 멸균시킬 수 있다.
이렇게 멸균된 고구마 배지 조성물에, 멸균된 글루코오스 또는 수크로오스 등의 당분을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있고, 이때 전체 조성물 중 당분을 포함하는 조성물이 10 g/L 내지 40 g/L, 15 g/L 내지 30 g/L 또는 18 g/L 내지 25 g/L의 농도가 되도록 첨가할 수 있다.
또한, 상기 발효시키는 단계에서, 20℃ 내지 40℃, 35℃ 내지 39℃, 또는 36℃ 내지 38℃의 온도에서 발효시키는 전발효를 수행할 수 있다. 상기 전발효는 20 내지 100 시간, 40 내지 90 시간, 50 시간 내지 80 시간, 또는 65 시간 내지 75 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 전발효 과정을 거친 후, 1℃ 내지 10℃, 3℃ 내지 7℃ 또는 4℃ 내지 5℃의 온도에서 발효시키는 후발효 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 후발효는 50 내지 150 시간, 70 시간 내지 120 시간, 또는 95 시간 내지 105 시간 동안 수행될 수 있다.
이와 같이 상이한 조건의 전발효 및 후발효의 두가지 공정의 발효를 수행함으로써, 당뇨와 비만과 관련된 효소의 활성을 억제하는 성분의 함량을 증가시킬 수 있어, 보다 효과적으로 관련 질병을 예방 및 치료할 수 있는 효능을 갖는 유산균 발효물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 발효균주의 분리
무작위로 선정한 20명의 인변 샘플을 멸균한 PBS에 10진법으로 희석하여 준비하였다. 이를 MRS agar 배지에 도말한 뒤 37℃에서 혐기적인 조건으로 24 내지 48시간 배양하였다. 배양 후 가장 큰 콜로니를 선별하여 MRS broth에 접종하여 37℃에서 혐기적인 조건으로 24시간 정치 배양한 후, 600 nm에서 OD 1.0이상 자란 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 skim milk 배지에 접종하여 커드(curd) 형성이 원활한 균주들을 다시 한 번 선별하였다. Skim milk 배지에 자란 유산균을 다시 도말한 후 단일 콜로니를 선별하여 유산균 고구마 발효물의 제조에 이용하였다.
제조예
2. 고구마 배지의 제조
밤고구마, 호박고구마, 맛젤고구마 등 국내에서 생산되는 고구마를 세척 후 껍질을 제거하여 절단한 후 고구마 중량과 동량의 물을 넣어 곱게 갈아 준비하였다. 준비한 고구마 페이스트와 이의 1 내지 3배의 물을 혼합하여 호모게나이저를 이용하여 10,000rpm에서 10분간 곱게 갈았다. 여기에 2.5 내지 20 g/L의 효모 추출물을 혼합하였다. 이후, 1M HCl을 이용하여 pH를 6.5 내지 8.0으로 조절하였다. 이를 121℃에서 15분간 멸균한 뒤 10 내지 40 g/L의 글루코오스가 포함되도록 멸균한 글루코오스 용액을 첨가한 배지에 분리한 유산균(Lactobacillus rhamnosus(BST.L-601) KCTC 13517BP) 약 1
106 CFU를 10%의 부피가 되도록 접종하였다. 37℃에서 1 내지 4일간 발효 후, 4℃에서 3 내지 4일간 후발효하여 발효액을 제조하였다.
제조예 3. 유산균 발효액의 건조
제조예 2에서 제조한 고구마 배지를 사용하여 유산균을 발효시킨 유산균 발효액의 pH를 5N NaOH 용액을 이용하여 pH 7.0으로 조절하였다. 이후, 동량의 물을 혼합하여 2시간동안 교반 후 8,000 rpm에서 1 시간동안 원심분리하였다. 이의 상등액을 분리하여 -70℃에서 7일간 동결건조하여 동결건조분말을 제조하였다.
제조예
4. 유산균
발효물의
멸균
제조예 2에서 제조한 고구마 배지를 사용하여 유산균을 발효시킨 유산균 발효액의 pH를 5N NaOH 용액을 이용하여 pH 7.0으로 조절하였다. 이후, 동량의 물을 혼합하여 2시간동안 교반 후 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 멸균된 유산균 발효물을 제조하였다.
실험예
1. 유산균의 동정
제조예 1에서 분리한 균주의 중 BST.L-601의 생리학적 특성과 16s rDNA 서열을 분석하여 균주의 종을 확인하였다. 구체적으로, 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 확인하기 위하여 API kit(API CHL)를 이용하였고, 당 발효 시험으로 분석하여 그 결과를 표 1에 나타내었다(표 1에서 (+)는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 의미하고 (-)는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 의미함).
| No. | Substrate | BST.L-601 | No. | Substrate | BST.L-601 |
| 0 | Control | - | 25 | Esculine | + |
| 1 | Glycerol | - | 26 | Salicine | + |
| 2 | Ertythritol | - | 27 | Cellobiose | + |
| 3 | D-Arabinose | - | 28 | Maltose | - |
| 4 | L-Arabinose | - | 29 | Lactose | + |
| 5 | Ribose | + | 30 | Melibiose | - |
| 6 | D-Xylose | - | 31 | Saccharose | - |
| 7 | L-Xylose | - | 32 | Terhalose | + |
| 8 | Adonitol | - | 33 | Inuline | - |
| 9 | β methyl-xyloside | - | 34 | Melezitose | + |
| 10 | Galactose | + | 35 | D-Raffinose | - |
| 11 | D-Glucose | + | 36 | Amidon | - |
| 12 | D-Fructose | + | 37 | Glycogene | - |
| 13 | D-Mannose | + | 38 | Xylitol | - |
| 14 | L-Sorbose | + | 39 | β gentiobiose | - |
| 15 | Rhamnose | + | 40 | D-Turanose | + |
| 16 | Dulcitol | - | 41 | D-Lyxose | - |
| 17 | Inositol | - | 42 | D-Tagatose | + |
| 18 | Mannitol | + | 43 | D-Fucose | - |
| 19 | Sorbitol | + | 44 | L-Fucose | - |
| 20 | α Methyl-D-mannoside | - | 45 | D-Arabitol | - |
| 21 | α Methyl-D-glucoside | + | 46 | L-Arabitol | - |
| 22 | N Acetyl glucosamine | + | 47 | Gluconate | - |
| 23 | Amygdaline | + | 48 | 2 ceto-gluconate | - |
| 24 | Arbutine | + | 49 | 5 ceto-gluconate | - |
또한 BST.L_601의 화학분류학적 특성으로 16s rDNA 분석을 한국미생물보존센터에서 의뢰한 결과, L.rhamnosus와 99% 상동성을 보였다.
실험예
2. 고구마 배지에 적합한 유산균 확인
실험예
2.1. 유산균
발효물의
pH 측정
제조예 2와 동일한 방법으로 고구마 배지를 사용하여 유산균을 발효시킨 유산균 발효액의 pH를 비교하여 표 2에 나타내었다. pH 측정은 pH meter를 이용하여 측정하였다. BST.L-601, L.acidophilus, S.thermophilus 및 김치유산균 균주를 각각 접종하여 생산한 고구마 발효물의 pH를 비교하였다. 그 결과, L,acidophilus와 S.tehrmophilus를 접종한 군에 비해 BST.L-601과 김치유산균을 접종한 군의 pH가 더 많이 감소하는 것을 확인하였다.
| 접종된 균주 | pH |
| - (고구마 배지) | 6.34 |
| BST.L_601(제조예 2) | 3.54 |
| L. acidophilus | 3.83 |
| S. thermophilus | 6.01 |
| 김치유산균 | 3.51 |
실험예 2.2. 유산균 생균수 측정
실험예 2.2.1. 유산균 발효물의 생균수 측정
생균수 측정은 발효액에 존재하는 균체수를 확인하기 위하여 멸균 식염수에 희석한 발효액을 MRS 한천 배지에 도말한 후 37℃에서 2일간 배양하여 생성된 콜로니의 개수를 통해 균체수를 확인하였으며, 동결건조한 유산균 발효물 전체를 pH 7.0으로 조절하여 무균적으로 동결건조 후에 유산균 발효물 건조물을 약 1g을 달아 식염수에 희석하여 MRS한천배지에 도말한 후 37℃에서 2일간 배양하여 생성된 콜로니의 개수를 통해 균체수를 확인하였다.
제조예 2와 동일한 방법으로 효모 추출물을 5 g/L 첨가하고, pH는 7.0로 조절한 고구마 배지에 글루코오스 10 g/L를 가하고, 상기 4가지 유산균을 1Х106 내지 1Х107 CFU/ml 로 고구마 배지에 10% 접종하였다. 이를 37℃에서 3일간 발효 후 4℃에서 3일간 숙성과정을 거친 후 생균수를 측정하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다. BST.L-601는 약 87.23%의 생존율을 나타내어, 고구마 배지에 가장 적합한 유산균 균주로 확인되었다.
| 접종된 균주명 | 전발효 생균수(CFU/g) |
후발효 생균수(CFU/g) |
생존율(%) |
| BST.L_601(제조예 2) | 4.7x1011 | 4.1x1011 | 87.23 |
| L. acidophilus | 1.1x108 | 6.3x105 | 0.57 |
| S. thermophilus | 5.5x107 | 1.5x107 | 27.27 |
| 김치유산균 | 2.9x109 | 1.1x109 | 37.93 |
실험예 2.2.2. 유산균 발효물를 동결건조한 후 생균수 측정
제조예 2와 동일한 방법으로 YG(효모추출물 5%와 포도당 10%)배지, 탈지분유배지(탈지분유 10%와 포도당 10%) 그리고 고구마배지(효모 추출물을 5 g/L 첨가하고, pH는 7.0로 조절한 고구마 배지에 글루코오스 10g/L를 첨가)를 제조한 후에, 신규 유산균(BST.L-601)을 1Х106 내지 1Х107 CFU/ml 로 각각의 배지에 10% 접종하였다. 이를 37℃에서 3일간 발효 후 4℃에서 3일간 숙성과정을 거친 후 동결건조 후에 생균수를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 동결건조 후 유산균의 생존율은 고구마 배지는 약 79%의 생존율을 나타내어, 탈지분유 배지는 58% 그리고 YG 배지는 11%로 낮았다. 따라서 고구마배지를 사용하여 발효 후 동결건조시 고구마 배지가 동결건조 보존제의 역할을 할 수 있을 확인 할 수 있었다.
실험예
2.3. 유산균
발효물의
특성
실험예 2.3.1. 유산균 발효물의 유기산의 측정
고구마 배지의 제조 중 효모 추출물을 2.5 g/L 첨가한 것을 제외하고는 실험예 2.2.와 동일하게 4 종의 고구마 배지를 준비하였다.
가스 크로마토그래피(Gas chromatography, GC)를 통해 발효액 내에 존재하는 유기산의 양을 측정하였다. 분석 시 CP-Sil 5 CB (25x0.53x0.7) 컬럼을 이용하였으며, Split ratio 10:1로 하였다. Flow rate은 carrier gas(N2) 3ml/min, H2 65ml/min, Air 450ml/min, Makeup Flow 30ml/min으로 조절하였다. 또한, Injector 225℃, column 40℃(rate 1min), 10℃/min, 180℃, FID Detector 250℃의 조건에서 락트산의 함량을 분석하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 신규 균주인 BST.L_601에서 락트산의 농도가 월등하게 높게 생산되었다.
| 접종된 균주 | Lactic acid (mg/ml) |
| L. acidophilus | 13.361 |
| BST.L-601 | 38.417 |
| S. thermophilus | 10.74 |
| Kimch | 11.675 |
실험예
2.3.2. 유산균
발효물의
α-아밀라아제 저해활성의 측정
발효물의 α-아밀라아제 저해활성은 0.02M 인산완충용액 (pH 6.9)에 13 Unit/ml로 희석한 표준 α-아밀라아제 효소액 250 ㎕과 시료 또는 대조군(1mM Acarbose), 공시험(증류수) 250 ㎕를 2ml tube에 넣었다. 이를 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이후, 1% 전분용액 250 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액에 500 ㎕의 DNS 시약을 넣어 100℃에서 5분간 끓였다. 식힌 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 저해활성을 계산하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Ctrl: 대조군 (1mM Acarbose) 반응액의 흡광도 (520 nm)
SPL: 시료 반응액의 흡광도 (520 nm)
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, BST.L_601의 α-아밀라아제 저해활성이 가장 높았다.
| 시료 | α-amylase 저해활성 (%) | |
| 대조군 | 1mM acarbose | 71.774 |
| 유산균 종 | L. acidophilus | 11.507 |
| BST.L-601 | 24.940 | |
| S. thermophilus | 20.534 | |
| Kimch | 6.739 |
실험예
2.3.3. 유산균
발효물의
α-글루코시다아제 저해활성의 측정
유산균 발효물의 α-글루코시다아제 저해활성을 측정하기 위해, 0.05 M 인산완충용액 (pH 6.8)에 1 Unit/ml로 희석한 표준 α-글루코시다아제 효소액 10 ㎕와 시료 또는 대조군(1mM Acarbose), 공시험(증류수) 20 ㎕와 완충용액 50 ㎕를 96well의 microplate에 넣었다. 이를 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이후, 1 mM의 PNPG용액 20 ㎕를 혼합하여 37℃에서 30분간 효소반응 시켰다. 또한, 1 M의 탄산나트륨용액 50 ㎕를 가하여 반응을 종료시켰다. 이를 405 nm에서 흡광도를 측정하였고, 다음과 같이 저해활성을 계산하여 표 6에 나타내었다.
공시험: 공시험 반응액의 흡광도 (405 nm)
시료: 시료 반응액의 흡광도 (405 nm)
| 시료 | α-glucosidase 저해활성 (%) | |
| 대조군 | 1mM acarbose | 57.417 |
| 유산균 종 | L. acidophilus | 8.572 |
| BST.L-601 | 26.447 | |
| S. thermophilus | 16.931 | |
| Kimch | 6.849 |
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, BST.L_601의 α-글루코시다아제 저해활성이 가장 높았다.
상기 실험예 2의 결과를 기초로, BST.L_601 유산균이 가장 우수한 발효물을 생산하는 균주임을 확인하였다.
실험예 3. 유산균 발효물의 효능 증대를 위한 발효 조건 탐색
실험예 3.1. 고구마 배지의 농도에 따른 유산균 발효물의 활성 확인
고구마 배지의 농도에 따른 유산균 발효물의 활성 변화를 확인하기 위해, 고구마 배지의 원액을 1.5배 내지 3배 희석하였다. 이후, 2.5g/L의 효모 추출물을 첨가하고 pH 7.0으로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 포도당을 10g/L가 되도록 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하여 37℃에서 3일간 발효 후 3일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 7 내지 표 9에 나타내었다. 대조군으로는 1mM acarbose를 사용하였다.
| 고구마 배제 (희석 배수) |
Lactic acid (mg/ml) |
| 1 | 20.861 |
| 1.5 | 28.319 |
| 2 | 18.104 |
| 2.5 | 18.684 |
| 3 | 17.296 |
| 고구마 배지 (희석 배수) |
α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| 1 | 9.790 |
| 1.5 | 24.221 |
| 2 | 25.429 |
| 2.5 | 14.113 |
| 3 | 17.143 |
| 고구마 배지 (희석 배수) |
α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| 1 | 16.784 |
| 1.5 | 29.373 |
| 2 | 24.694 |
| 2.5 | 13.458 |
| 3 | 9.857 |
표 7에 나타난 바와 같이, 1.5배로 희석한 고구마 배지를 이용하였을 때 28mg/ml로 가장 많은 락트산이 생산된 것을 알 수 있다. 또한, 표 8, 표 9에서도 1.5배 희석한 고구마 배지를 이용하였을 때 α-amylase, α-glucosidase의 저해활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3.2. 발효(전발효) 기간에 따른 유산균 발효물의 활성 확인
고구마 배지의 원액을 1.5배 희석하였다. 이후, 2.5g/L의 효모 추출물을 첨가하고 pH7.0으로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 포도당을 10g/L가 되도록 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하였다. 그리고 각각 37℃에서 1일, 2일, 3일 및 4일간 발효시켜 4개의 실험군을 설계하였다. 이후, 3일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 10 내지 표 12에 나타내었다. 이때, 대조군으로 1mM acarbose를 사용하였다.
| 발효기간 (day) | Lactic acid (mg/ml) |
| 1 | 23.081 |
| 2 | 21.662 |
| 3 | 22.185 |
| 4 | 22.101 |
| 발효기간 (day) | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| 1 | 17.484 |
| 2 | 18.297 |
| 3 | 23.774 |
| 4 | 24.006 |
| 발효기간 (day) | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| 1 | 22.096 |
| 2 | 22.488 |
| 3 | 33.544 |
| 4 | 25.867 |
표 10에 나타난 바와 같이, 락트산 생산량은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 표 11을 참고하면 3일 이상 발효시킨 경우 α-amylase의 저해활성이 유의하게 높아지는 것을 알 수 있다. 또한, 표 12를 살펴보면, 3일간 발효하였을 경우 33.54%로 4일간 발효하였을 경우(25.84%) 보다 높은 α-glucosidase 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 3.3. 숙성(후발효) 기간에 따른 유산균 발효물의 활성 확인
고구마 배지의 원액을 1.5배 희석하였다. 이후, 2.5g/L의 효모 추출물을 첨가하고 pH7.0으로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 포도당을 10g/L가 되도록 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하였다. 그리고 37℃에서 3일간 발효시켰다. 이후, 각각 3일, 4일 및 5일간 4℃에서 숙성시켜 3개의 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 13 내지 표 15에 나타내었다. 이때, 대조군으로 1mM acarbose를 사용하였다.
| 실험군 | No. | 숙성기간 (day) | Lactic acid (mg/ml) |
| 숙성기간 (day) | 1 | 3 | 23.386 |
| 2 | 4 | 28.461 | |
| 3 | 5 | 28.461 |
| 숙성기간 (day) | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| 3 | 25.429 |
| 4 | 37.042 |
| 5 | 36.173 |
| 숙성기간 (day) | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| 3 | 29.373 |
| 4 | 34.712 |
| 5 | 34.770 |
표 13에 나타난 바와 같이, 락트산 생산량은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 표 14 및 표 15를 참고하면, 4일 이상 숙성시킬 경우에 α-amylase, α-glucosidase의 저해활성이 높은 것을 알 수 있다.
실험예
3.4. 고구마 종에 따른 유산균
발효물의
활성 확인
밤고구마, 호박고구마, 맛젤 고구마 및 이의 혼합물을 이용하여 4 종의 고구마 배지를 준비하였다. 이를 1.5배 희석하였다. 이후, 2.5g/L의 효모 추출물을 첨가하고 pH 7.0으로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 포도당을 10g/L가 되도록 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하였다. 그리고 37℃에서 3일간 발효시킨 후, 4일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 16 내지 표 18에 나타내었다.
| 고구마 종류 | Lactic acid (mg/ml) |
| 밤고구마 | 21.189 |
| 호박고구마 | 20.399 |
| 맛젤고구마 | 18.394 |
| 혼합 | 21.711 |
| 시료 | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| 밤고구마 | 19.986 |
| 호박고구마 | 14.858 |
| 맛젤고구마 | 9.140 |
| 혼합 | 14.018 |
| 시료 | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| 밤고구마 | 33.312 |
| 호박고구마 | 32.529 |
| 맛젤고구마 | 23.294 |
| 혼합 | 26.586 |
표 16을 살펴보면, 맛젤고구마만을 사용하였을 때가 18.39 mg/ml로 가장 적은 양의 lactic acid를 생산하였으며, 고구마를 혼합하여 사용하였을 때와 밤고구마를 사용하였을 때가 약 21 mg/ml로 가장 높은 양의 lactic acid를 생산하였다.
또한, 표 17에 나타난 바와 같이, α-amylase 저해활성은 밤고구마를 사용하였을 때가 19.98%로 가장 높았다. 아울러, 표 18에 나타난 바와 같이, α-glucosidase의 저해활성의 경우 밤고구마와 호박고구마를 사용하였을 때 각각 33.31%, 32.53%로 가장 높은 저해활성도를 나타냈다.
실험예
3.5. 질소원 첨가량에 따른 유산균
발효물의
활성 확인
고구마 배지의 원액을 1.5배 희석하였다. 여기에, 각각 2.5 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L의 효모 추출물을 첨가하여 4종의 실험군을 설계하였다. 이후, 이의 pH를 7.0로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 포도당을 10g/L가 되도록 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하여 37℃에서 3일간 발효 후 4일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 19 내지 표 21에 나타내었다.
| 질소원 | Lactic acid (mg/ml) |
| Non nitrogen source | 20.813 |
| 2.5 g/L Yeast | 19.375 |
| 5 g/L Yeast | 21.233 |
| 10 g/L Yeast | 23.754 |
| 20 g/L Yeast | 22.407 |
| 질소원 | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| Non nitrogen source | 23.037 |
| 2.5 g/L Yeast | 23.938 |
| 5 g/L Yeast | 23.466 |
| 10 g/L Yeast | 19.648 |
| 20 g/L Yeast | 20.077 |
| 질소원 | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| Non nitrogen source | 34.489 |
| 2.5 g/L Yeast | 34.489 |
| 5 g/L Yeast | 35.152 |
| 10 g/L Yeast | 39.907 |
| 20 g/L Yeast | 38.981 |
표 19를 살펴보면, 10 g/L의 yeast extract를 첨가하였을 때 23.75 mg/ml로 가장 많은 양의 유기산을 생산한 것을 알 수 있다. 또한, 표 20에 나타난 바와 같이, 근소한 차이이기는 하나 5 g/L의 Yeast를 첨가하였을 때 약 23.5%의 가장 높은 α-amylase 저해활성을 나타내었다. 또한 표 21에서와 같이 α-glucosidase 저해활성을 측정한 결과 10 g/L의 yeast를 첨가하여 발효하였을 때 약 39%로 가장 높은 저해활성도를 나타냈다.
실험예
3.6.
탄소원의
종류 및 첨가량에 따른 유산균
발효물의
활성 확인
고구마 배지의 원액을 1.5배 희석하였다. 여기에 10 g/L의 효모 추출물을 첨가하고, pH를 7.0로 조절하였다. 이 조성물을 멸균한 뒤 멸균한 glucose 또는 sucrose를 각각 5 g/L, 10 g/L 및 20g/L로 6개의 실험군을 설계하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하여 37℃에서 3일간 발효 후 4일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 22 내지 표 24에 나타내었다
| 탄소원 | Lactic acid (mg/ml) |
| Non carbon source | 17.901 |
| 5 g/L glucose | 20.398 |
| 10 g/L glucose | 22.42 |
| 20 g/L glucose | 27.222 |
| 5 g/L Sucrose | 19.126 |
| 10 g/L Sucrose | 19.898 |
| 20 g/L Sucrose | 20.771 |
| 탄소원 | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| Non carbon source | 20.979 |
| 5 g/L glucose | 21.266 |
| 10 g/L glucose | 20.318 |
| 20 g/L glucose | 16.435 |
| 5 g/L Sucrose | 23.141 |
| 10 g/L Sucrose | 23.186 |
| 20 g/L Sucrose | 23.715 |
| 탄소원 | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| Non carbon source | 22.573 |
| 5 g/L glucose | 33.576 |
| 10 g/L glucose | 36.590 |
| 20 g/L glucose | 41.635 |
| 5 g/L Sucrose | 29.775 |
| 10 g/L Sucrose | 23.679 |
| 20 g/L Sucrose | 32.319 |
표 22를 살펴보면, 20 g/L의 glucose를 첨가하였을 때 27 mg/ml의 가장 많은 유기산을 생산하였다. 또한, 표 23에 나타난 바와 같이, α-amylase 저해활성의 경우 탄소원을 넣은 발효물과 넣지 않은 발효물간의 차이가 크지 않았다. 그러나, 표 24에 나타난 바와 같이, 20 g/L의 glucose를 넣은 고구마배지의 유산균 발효물에서 41.6%로 가장 높은 저해활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
실험예
3.7. 초기 pH에 따른 유산균
발효물의
활성 확인
고구마 배지의 원액을 1.5배 희석하였다. 여기에 10 g/L의 효모 추출물을 첨가하였다. 이후, pH를 조절하지 않은 고구마 배지와 5N NaOH를 이용하여 pH를 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0으로 조절한 고구마 배지를 준비하였다. 각각의 배지를 멸균한 뒤 멸균한 glucose 20g/L를 첨가하였다. 여기에, 선별한 유산균 BST.L-601을 접종하여 37℃에서 3일간 발효 후 4일간 4℃에서 숙성하여 유산균 발효물을 제조하였다. 이의 락트산의 함량과 α-아밀라아제, α-글루코시다아제의 저해활성을 실험예 2에 기재한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 각각 표 25 내지 표 27에 나타내었다.
| 멸균 전 pH | Lactic acid (mg/ml) |
| Not control to pH | 30.134 |
| pH 6.5 | 30.952 |
| pH 7.0 | 27.56 |
| pH 7.5 | 26.461 |
| pH 8.0 | 25.363 |
| 멸균 전 pH | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 71.774 |
| Not control to pH | 21.96 |
| pH 6.5 | 25.33 |
| pH 7.0 | 26.46 |
| pH 7.5 | 19.14 |
| pH 8.0 | 8.87 |
| 멸균 전 pH | α-glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM acarbose | 57.417 |
| Not control to pH | 55.17 |
| pH 6.5 | 53.62 |
| pH 7.0 | 50.87 |
| pH 7.5 | 50.67 |
| pH 8.0 | 49.38 |
그 결과, 표 25와 같이 pH 6.5 이하에서 유기산의 함량이 30 mg/ml이상으로 가장 높았다. 또한, 표 26 및 표 27에서 α-amylase 및 α-glucosidase 저해활성도 pH 6.5에서 각각 약 25%, 53%로 가장 높은 것을 확인하였다.
실험예 4. 건조 후 유산균 발효물의 특성 확인
실험예
4.1. 유산균
발효물의
동결건조 및 배양 단계에 따른 유산균
발효물의
효능 확인
실험예
4.1.1. α-amylase 저해활성 확인
고구마 배지를 넣지 않은 10g/L의 효모 추출물과 20g/L의 glucose만을 넣어 YG 배지를 제조하였다. 또한, YG 배지, 여기에 고구마 배지가 첨가된 경우, 및 이를 동결건조시킨 세가지 실험군을 설정하였다. 또한, 이를 모두 BST.L_601 접종 전, 접종 후 3일간 37℃의 전발효 후, 이후 4일간 4℃에서 후발효까지 진행한 후에 α-amylase 저해활성을 측정하였다. 유기산의 영향을 확인하기 위하여 40mg/ml의 lactic acid의 α-amylase 저해활성도 함께 측정하였다. 그 결과를 표 28에 나타내었다.
| 시료 | α-amylase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM Acarbose | 67.69 |
| YG - control | 0.94 |
| YG - 전발효 | 4.88 |
| YG - 후발효 | 1.78 |
| 유산균 발효물 - control | 6.52 |
| 유산균 발효물 - 전발효 | 11.59 |
| 유산균 발효물 - 후발효 | 16.52 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - control | 2.21 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - 전발효 | 5.19 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - 후발효 | 23.82 |
| 40mg/ml Lactic acid pH 7.0 | 0.65 |
표 28에 나타난 바와 같이, YG에서는 후발효까지 진행되어도 α-amylase 저해활성이 나타나지 않았다. lactic acid 또한 마찬가지로 α-amylase 저해활성이 없었다. 그러나 유산균 발효물의 경우 BST.L_601 접종 전에 비해 접종하여 후발효까지 진행되었을 때 α-amylase 저해활성이 약 16.52%로 나타났으며, 동결건조 후에도 α-amylase 저해활성의 차이는 거의 없는 것을 확인하였다.
실험예
4.1.2. α-
glucosidase
저해활성 확인
고구마 배지를 넣지 않은 10 g/L의 효모 추출물과 20 g/L의 glucose만을 넣어 YG 배지를 제조하였다. 또한, YG 배지, 여기에 고구마 배지가 첨가된 경우, 및 이를 동결건조시킨 세가지 실험군을 설정하였다. 또한, 이를 모두 BST.L_601 접종 전, 접종 후 3일간 37℃의 전발효 후, 이후 4일간 4℃에서 후발효까지 진행한 후의 α-glucosidase 저해활성을 모두 측정하였다. 유기산의 영향을 확인하기 위하여 40 mg/ml의 lactic acid의 α-glucosidase 저해활성도 함께 측정하였다. 그 결과를 표 29에 나타내었다.
| 시료 | α-Glucosidase 저해활성 (%) |
| 대조군: 1mM Acarbose | 69.44 |
| YG - control | 2.75 |
| YG - 전발효 | 0.35 |
| YG - 후발효 | 8.15 |
| 유산균 발효물 control | 26.17 |
| 유산균 발효물 전발효 | 30.74 |
| 유산균 발효물 후발효 | 51.18 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - control | 42.98 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - 전발효 | 41.11 |
| 유산균 발효물의 동결건조물 - 후발효 | 54.81 |
| 40mg/ml Lactic acid pH 7.0 | 5.54 |
표 29에 나타난 바와 같이, YG 배지에 BST.L_601을 접종하여 배양하였을 경우에는 α-Glucosidase 저해활성이 후발효를 하면서 약 8%로 증가되기는 하나 효과가 미미한 것을 알 수 있다. 또한, 유산균 발효물의 경우 BST.L-601을 접종하지 않은 고구마 배지의 경우에도 약 25%의 α-Glucosidase 저해활성을 가지지만, 후발효까지 진행되면 α-Glucosidase 저해활성이 약 51%로 20% 정도 증가하는 것을 확인하였다.
실험예
5. 유산균
발효물의
총 폴리페놀 함량의 측정
총 폴리페놀 함량의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 15 ml conical tube에 시료 0.1 ml씩 준비하고, 각 tube에 7% Na2CO3 용액 2 ml을 첨가하고 실온에서 3분간 반응시켰다. 이후, 1N의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 0.1 ml 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 750 nm에서 흡광도를 측정하여 표준물질로 작성한 검량선에 대입하여 총 폴리페놀의 함량을 측정하였다. 이때, 총 폴리페놀 함량의 표준물질로는 gallic acid를 사용하였다. BST.L-601을 YG 배지와 제조예 2와 동일한 조성물에 접종하여 전발효(37℃에서 3일간 발효)와 후발효(전발효를 한 후에 4℃에서 4일간 발효)시킨 후 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, YG 배지의 경우 함량이 전반적으로 낮으나 후발효물에서 접종전(control)과 전발효에 비해 총 폴리페놀 함량이 약 2배 가량 증가하는 것을 보였다. 또한, 고구마 배지에 BST.L-601의 접종전(control)과 전발효, 후발효 후의 발효물의 총 폴리페놀 함량을 비교한 결과, 고구마 배지 자체에 약 1,000 ㎍/ml의 총폴리페놀을 함유하고 있으며 전발효까지는 총 폴리페놀 함량이 유사한 것을 확인하였다. 한편, 후발효까지 진행되면 총 폴리페놀 함량이 약 2,500 ㎍/ml로 약 2.5배 정도 증가되는 것을 확인하였다.
실험예 6. 유산균 발효물의 리파아제 저해활성 측정
유산균 발효물의 리파아제 저해활성은 다음과 같은 방법으로 측정할 수 있다. 먼저, 리파아제 원액을 0.1 mM 칼륨완충용액 (pH 6.0)에 1000배 희석하여 준비한 효소액 10 ㎕와 증류수에 100 ㎎/ml으로 용해한 시료와 대조군(100 ㎍/ml orlistat), 공시험(증류수) 50 ㎕와 0.1 mM 칼륨완충용액 (pH7.2, containing 0.1% tween 80) 30 ㎕를 96well microplate에 넣어 30℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 다음으로, 10 mM p-NPC(para-nitrophenyl caprylate) 용액 10 ㎕를 혼합하여 30℃에서 5분간 효소 반응시킨다. 이후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하여 다음과 같이 저해활성을 계산하였다. 그 결과를 표 30에 나타내었다.
공시험: 공시험 반응액의 흡광도 (405 nm)
시료: 시료 반응액의 흡광도 (405 nm)
| 시료 | Lipase 저해활성 (%) |
| Orlistat (100㎍/ml) | 36.657 |
| YG (원액) | 0 |
| 유산균 발효물 (100mg/ml) | 34.778 |
유산균 고구마 발효물의 lipase 저해활성을 측정한 결과 대조군으로 사용한 100㎍/ml의 Orlistat은 약 36.65%의 lipase 저해활성을 나타냈으며, YG 배지에 후발효까지 진행한 경우 원액으로 측정하였음에도 불구하고 lipase 저해활성이 없었다. 그러나 100mg/ml의 유산균 발효물은 약 34.77%의 lipase 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 대조군인 100㎍/ml의 Orlistat과 유사한 lipase저해활성을 가지는 바, 지방의 소화를 억제하여 비만의 발생을 억제하는 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
실험예
7. 유산균
발효물
상등액 건조물 및
발효물의
지방전구세포에
대한 세포 독성 확인
실험예
7.1. 유산균
발효물
상등액 건조물의 분화 전
지방전구세포에
대한 세포 독성 확인
3T3-L1 지방전구세포를 10% Fetal bovine serum (FBS)와 1% Penicillin-streptomycin(P/S)가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건의 incubator에서 배양하였다. 이후, 3T3-L1 지방전구세포를 96 well plate에 1
103 cell/well로 분주하였다. 제조예 3의 유산균 발효물 상등액 건조물을 상기의 동일한 배지에 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 mg/ml로 용해하여 0.22㎛ filter로 여과하였다. 24, 48, 72시간 동안 처리한 뒤, MTT assay를 통해 세포 독성을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3서 볼 수 있 듯이, 분화되지 않은 3T3-L1 지방전구세포에서는 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리 24시간 후 25 mg/ml부터 독성이 나타나기 시작하였으며, 48시간 이후로는 1.56 mg/ml에서도 약 20%의 세포 사멸을 보여 농도, 시간의존적으로 세포 독성을 나타내었다.
실험예
7.2. 유산균
발효물
상등액 건조물의 분화 후
지방전구세포에
대한 세포 독성 확인
지방세포로 분화한 3T3-L1에서의 세포독성을 확인하기 위하여 3T3-L1 세포를 96 well plate에 각 1
103 cell/well로 분주하였다. 2일 후 배지를 교환하여 1-2일간 배양하여 세포가 완전히 융합되어 자랐을 때, 10% FBS와 MDI solution (0.5mM 3-iso butyl-1-methylxanthine, 1μM dexamethasone, 5 ㎍/㎖ insulin)을 포함하는 DMEM 배지로 배지를 교환하여 분화 유도를 시작하였다. 분화 유도 시작 2일 후 10% FBS와 insulin이 포함된 DMEM 배지를 2일 간격으로 배지를 교환하였다. 이후, 6일간 더 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 지방세포로 분화한 3T3-L1 세포에 유산균 발효물 상등액 건조물을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 mg/ml로 24, 48, 72시간동안 처리하였다. MTT assay를 통해 세포 독성을 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서와 같이 분화되지 않은 3T3-L1세포와 유사하게 24시간 후 25mg/ml부터 독성이 나타나기 시작하였다. 농도 의존적으로 세포 독성이 나타나지만, 48시간 이후 세포 독성은 더 이상 증가되지 않고 72시간까지 처리하여도 25mg/ml의 농도에서 51.15%의 세포 생존율을 나타내는 것을 보였다.
실험예
7.3. 멸균된 유산균
발효물의
분화 전
지방전구세포에
대한 세포 독성 확인
제조예 4에서 제조한 멸균한 유산균 발효물을 DMEM 배지에 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.25 mg/ml로 용해하였다. 이를 3T3-L1 지방전구세포에 24시간 처리하여 실험예 7.1과 동일한 방법으로 각 세포에 대한 독성을 확인하였다. 그 결과는 도 5에 도시하였다.
발효하지 않은 고구마 배지의 경우 5 mg/ml이하로 처리하게 되면 세포 독성을 나타내지 않으며, 유산균 발효물의 경우 전발효물과 후발효물에서 1 mg/ml 이하 처리하였을 때 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
실험예
7.4. 멸균된 유산균
발효물의
분화 후
지방전구세포에
대한 세포 독성 확인
제조예 4에서 제조한 멸균한 유산균 발효물을 DMEM배지에 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.25 mg/ml로 용해하였다. 이를 분화된 3T3-L1 지방전구세포에 24시간 처리하여 실험예 7-2와 동일한 방법으로 각 세포에 대한 독성을 확인하였다. 그 결과는 도 6에 도시하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 발효하지 않은 고구마 배지와 전발효물과 후발효물을 처리하였을 때 10mg/ml 이하로 처리하여야 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
8. 유산균
발효물
상등액 건조물(
제조예
3) 및 멸균된 유산균
발효물(제조예 4)의
항비만 효과 확인
실험예 7의 결과를 바탕으로 유산균 발효물의 지방 형성의 효과 확인 시험을 수행하였다.
실험예
8.1. Oil Red O staining을 통한 유산균
발효물
상등액 건조물의 지방세포 분화 억제능 확인(현미경)
제조예 3에서 동결건조한 유산균 발효물의 상등액 분말을 12.5 mg/ml로 DMEM배지에 녹여 세포의 분화 시 함께 처리하여 분화시켰다. 분화를 유도한 3T3-L1에서 배양액을 제거하고, PBS로 2회 세척하였다. 다음으로, 실온에서 4% 파라포름알하이드를 60분간 처리하여 세포를 고정시켰다. 세포의 고정이 끝난 후, 파라포름알하이드를 제거한 후 다시 PBS로 3회 세척하였다. 60% 이소프로판올에 0.5%로 용해한 Oil red O solution을 처리하였다. 이를 37℃에서 1시간 처리하여 세포를 염색한 후, 다시 PBS로 3회 세척한 뒤 현미경으로 관찰하였다.
유산균 발효물을 처리하지 않은 세포와 처리한 세포를 현미경으로 100배 확대하여 관찰한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리하지 않은 세포는 대체적으로 분화가 많이 되었으나, 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 세포의 경우 그에 비해 분화된 세포의 수가 상대적으로 적은 것을 확인 할 수 있었다.
실험예
8.2. Oil Red O staining을 통한 유산균
발효물
상등액 건조물의 지방세포 분화
억제능
확인(흡광도)
또한, 실험예 8.1에서 현미경 관찰 후, 100% 이소프로판올을 처리하여 세포를 용해하였다. 이의 500 nm에서 흡광도를 비교하여, 지방세포 분화 억제능을 도 8에 나타내었다.
그 결과, 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리한 지방세포가 약 30% 정도 적게 분화된 것으로 보아, 유산균 발효물 상등액 건조물이 지방 세포의 형성을 억제하며 이는 항비만 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
실험예
8.3. 유산균
발효물
상등액 건조물의 지방 형성 인자 발현 억제 효과 확인
실험예 8.1.에서 분화를 유도하여 배양한 지방세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이후, 세포를 모두 회수하여 RIPA buffer에 세포를 현탁하였다. 30분간 용출시킨 뒤, 15,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 Bradford assay를 통해 정량하여 30㎍씩 동량을 로딩하였다. SDS PAGE에서 전기영동 웨스턴 블랏을 통해 C/EBPα, C/EBP
, PPARγ, FABP4의 발현을 비교하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 유산균 발효물 상등액을 처리하였을 때, 지방 세포 분화 인자인 C/EBPα, C/EBP
, PPAR
, FABP4 등의 발현 억제를 확인할 수 있었다. 이는 유산균 발효물 상등액이 지방세포의 분화를 억제함으로써 궁극적으로 항비만 효과를 나타낼 수 있는 것을 확인한 것이다.
실험예
8.4. Oil Red O staining을 통한 멸균한 유산균
발효물의
지방세포 분화
억제능
확인(현미경)
제조예 4에서 제조한 멸균한 유산균 발효물을 0.5 mg/ml 및 0.25 mg/ml로 DMEM배지에 녹인 것을 제외하고는 실험예 8.1과 동일한 방법으로 수행하였다. 유산균 발효물을 0.5 mg/ml으로 처리한 세포를 현미경으로 관찰하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 멸균한 유산균 발효물을 처리하지 않은 세포는 대체적으로 분화가 많이 되었으나, 멸균한 유산균 발효물을 처리한 세포의 경우 그에 비해 분화된 세포의 수가 상대적으로 적은 것을 확인 할 수 있었다.
실험예
8.5. Oil Red O staining을 통한 멸균한 유산균
발효물의
지방세포 분화
억제능
확인(흡광도)
또한, 실험예 8.4에서 현미경 관찰 후, 100% 이소프로판올을 처리하여 세포를 용해하였다. 이의 500 nm에서 흡광도를 비교하여, 지방세포 분화 억제능을 도 11에 나타내었다.
그 결과, 0.5 mg/ml의 멸균한 유산균 발효물을 처리하여 분화시킨 세포가 처리하지 않은 세포에 비해 약 29% 지방세포의 분화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 0.25 mg/ml의 멸균한 유산균 발효물을 처리하여 분화시킨 세포의 경우에도 약 15%의 지방세포 분화 억제능을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예
8.6. 유산균
발효물의
지방 형성 인자 발현 억제 효과 확인
실험예 8.4에서 분화를 유도하여 배양한 지방세포에 대하여 실험예 8.3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 진행하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 제조예 3의 유산균 발효물 상등액을 처리하였을 때, 지방 세포 분화 인자인 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, FABP4 등의 발현 억제를 확인할 수 있었다. 이는 유산균 발효물 상등액과 마찬가지로, 제조예 4의 멸균한 유산균 발효물 즉, 유산균 발효물 전체를 처리한 경우에도 동일하게 지방세포의 분화를 억제하는 것을 알 수 있다.
실험예
9. 유산균
발효물
상등액 건조물(
제조예
3) 및 멸균된 유산균
발효물(제조예 4)의
항당뇨
효과 확인
실험예 7의 결과를 바탕으로 유산균 발효물의 항당뇨 효과의 확인 시험을 수행하였다.
실험예
9.1. Glucose uptake를 통한 유산균
발효물
상등액 건조물의
항당뇨
효과 확인
3T3-L1 지방전구세포를 10% Fetal bovine serum (FBS)와 1% Penicillin-streptomycin(P/S)가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건의 incubator에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하기 위하여 세포를 96 well plate에 각 1
103 cell/well로 분주하였다. 2일 후 배지를 교환하여 1-2일간 배양하여 세포가 완전히 융합되어 자랐을 때, 10% FBS와 MDI solution (0.5mM 3-iso butyl-1-methylxanthine, 1μM dexamethasone, 5 ㎍/㎖ insulin)을 포함하는 DMEM 배지로 배지를 교환하여 분화 유도를 시작하였다. 분화 유도 시작 2일 후 10% FBS와 insulin이 포함된 DMEM 배지를 2일간격으로 배지를 교환하여 6일간 더 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다.
분화된 지방세포에 glucose가 포함되어있지 않은 DMEM배지로 배지를 교체하여 4시간 배양하였다. 여기에, 유산균 발효물 상등액 건조물을 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml로 각각 혼합하였다. glucose가 포함되어있지 않은 DMEM배지에 처리하여 14시간동안 처리하였다. 대조군으로 100 uM의 인슐린을 30분간 처리하였다. 각각의 세포를 PBS로 2회 세척 후 50 uM의 2-NBDG를 100 ㎕/well 넣었다. 이후, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 30분간 배양 후, 차가운 PBS로 3회 세척해주었다. 1% triton X100을 포함하는 0.1M 인산칼륨 완충용액 (pH 10) 70 ㎕를 각 well에 넣어 10분간 반응시켰다. 다음으로, DMSO 30 ㎕를 가하여 파이펫팅을 통해 세포를 분해하였다. 
ex=460 nm, 
em=530 nm에서 형광도를 측정(2-NBDG)하여 glucose uptake를 도 12에 나타내었다.
도 13에서 볼 수 있듯이, 25 mg/ml 유산균 발효물 상등액 건조물을 처리 후 14시간에 평균 약 210% 정도로 나타나는 것을 알 수 있다. 이는 대조군(인슐린)의 경우 약 198.6%의 glucose uptake되는 것과 유사한 효과를 나타낸 것이다. 24시간 후에 약 270% 정도 glucose uptake되어 상대적으로 높은 항당뇨 효과를 가지는 것을 확인 하였다.
실험예
9.2.
Glut4
발현의 차이를 통한 유산균
발효물
상등액 건조물의
항당뇨
효과 확인
분화를 유도하여 배양한 지방세포에 25 mg/ml의 유산균 발효물 상등액 건조물을 24시간 세포에 처리하였다. PBS로 1회 세척 후, 세포를 모두 회수하여 RIPA buffer에 세포를 현탁하였다. 30분간 용출시킨 뒤, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 브래드포드 에세이를 통해 정량하였다. 30 ㎍씩 동량을 SDS PAGE에서 전기영동 웨스턴 블랏을 통해 GLUT4의 발현을 비교하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 일반 분화된 세포에 비해 Glut4가 높게 발현되었다. 이는 대조군으로 처리한 인슐린에 비해서도 많은 양의 Glut4가 발현된 것으로, 유산균 발효물 상등액 건조물의 항당뇨 효과를 재확인하였다.
실험예
9.3. Glucose uptake를 통한 멸균한 유산균
발효물의
항당뇨
효과 확인
제조예 4에서 제조한 멸균한 유산균 발효물을 DMEM 배지에 10, 5, 1 mg/ml로 각각 혼합하여 분화를 유도한 3T3-L1 지방세포인 것을 제외하고는 실험예 9.1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 10 mg/ml의 멸균된 유산균 발효물을 처리하였을 때 14시간 후 평균 약 230% glucose uptake 되었으며, 24시간후 250%까지 glucose uptake되되는 것을 확인할 수 있었다. 5 mg/ml, 1 mg/ml로 처리하였을 경우 14시간까지는 glucose uptake가 크게 보이지 않으나, 24시간 후 약 170-200%까지 glucose uptake 되는 것을 볼 수 있었다. 이는 대조군으로 사용한 100 nM insulin을 30분 처리하였을 때 약 250% uptake 되는것과 유사한 효과인 것으로, 상대적으로 높은 항당뇨 효과를 가지는 것을 확인하였다.
실험예
9.4.
Glut4
발현의 차이를 통한 멸균된 유산균
발효물의
항당뇨
효과 확인
10mg/ml의 멸균한 유산균 발효물을 24시간 처리한 것을 제외하고는 실험예 9.4와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 포도당 수송 인자인 Glut4의 발현을 비교한 결과, 일반 분화된 세포에 비해 Glut4가 높게 발현되었다. 즉, 대조군으로 처리한 인슐린과 유사한 양의 Glut4가 발현되는 것을 확인함으로써 멸균한 유산균 발효물의 항당뇨 효과를 재확인하였다.
Claims (17)
- 삭제
- 기탁번호 KCTC 13517BP로 기탁된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주로 발효된 유산균 발효물로서,
상기 유산균 발효물은 고구마를 발효시킨 것인 유산균 발효물.
- 삭제
- 제2항에 있어서,
상기 고구마는 동결건조시 유산균의 보존성을 향상시키는 것인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물의 폴리페놀 함량은 발효 전 고구마의 폴리페놀 함량의 1.5 배 내지 4 배인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물은 α-아밀라아제, α-글루코시다아제 및 리파아제 중 적어도 하나의 활성을 저해하는 것인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물은 C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding protein α), C/EBPβ(CCAAT-enhancer-binding protein β), PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ), 아디포넥틴(Adiponectin) 및 FABP4(fatty acid binding protein 4) 중 적어도 하나의 발현을 억제하는 것인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물은 GLUT4(Glucose transporter type 4)의 발현을 증가시키는 것인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물은 동결건조된 것인, 유산균 발효물.
- 제2항에 있어서,
상기 유산균 발효물은 멸균된 것인, 유산균 발효물.
- 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 고구마를 포함하는 조성물에 기탁번호 KCTC 13517BP로 기탁된 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하는 단계; 및
상기 조성물을 발효시키는 단계를 포함하는, 유산균 발효물의 제조방법.
- 제13항에 있어서,
접종 전에 멸균하는 단계를 더 포함하는, 유산균 발효물의 제조방법.
- 제14항에 있어서,
상기 조성물의 멸균 전 pH 값은 5 내지 8인, 유산균 발효물의 제조방법.
- 제13항에 있어서,
상기 발효시키는 단계는, 20℃ 내지 40℃의 온도에서 발효시키는 전발효 단계를 포함하는, 유산균 발효물의 제조방법.
- 제13항에 있어서,
상기 발효시키는 단계는, 1℃ 내지 10℃의 온도에서 발효시키는 후발효 단계를 더 포함하는, 유산균 발효물의 제조방법.
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| KR1020180087270A KR102097509B1 (ko) | 2018-07-26 | 2018-07-26 | 신규 유산균 및 이를 이용한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 유산균 발효물의 제조방법 |
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