KR101694739B1 - 천년초 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 그 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 그 제조방법 - Google Patents

천년초 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 그 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본원은 복합 유산균으로 발효된 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 비만 또는 이로인한 합병증의 예방 또는 치료용 조성물, 식품 조성물 및 그 제조 방법을 개시한다. 본원의 발효물 또는 그 추출물은 발효되지 않은 경우와 비교하여 항산화 물질 및 아미노산이 현저히 강화된 것은 물론, 세포에 독성이 없으며, 이와 함께 비만 또는 당뇨, 고지혈증과 관련된 인자를 억제하여 비만 또는 그 합병증의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

천년초 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 그 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 그 제조방법 {Pharmaceutical composition comprising fermented Opuntia humifusa for preventing and treating obesity or complications thereof and method for preparing the same}
본 발명은 기능성 천연물 분야이며, 구체적으로 천년초 발효물의 용도에 관한 것이다.
비만에 대한 늘어나는 경각심과 비만의 원인을 이해하고 이에 대응하고자 하는 전 지구적 노력에도 불구하고, 비만은 가속적으로 증가하는 추세이다. (Mitchell et al., Implications for female fertility and obesity. Reproduction. 2005;130:583-97). 2007년 국민건강영양조사 결과에 의하면 최근 5년 동안 국내 비만인구 비율이 해마다 3%씩 증가하여, 현재 비만자 비율이 전체 인구 중 32.7%(남 33.1%, 여 32.2%)이며, 연령별로는 중장년층이 평균 44%로 청년층(22%)의 두 배나 되고, 비만으로 인한 질환이 늘어나면서 2007년 기준으로 사회경제적 비용은 1조8239억 원에 이르는 것으로 추정되고 있다.
비만 문제가 심각해짐에 따라 비만 자체가 곧 질병이라는 인식이 확산되고 있다. 비만 진행 여부의 판단은 대표적으로 과체중 여부로 판단할 수 있으며, 구체적으로 특정 부위에서의 체지방의 증가(예를 들어, 복부 비만 등)로 판단할 수 있다. 비만으로 분류된 경우 즉, 비만자는 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높고 정상체중을 가진 사람과 비교하여 당뇨병 질환으로 인한 사망률은 4배, 간병경증 질환으로 인한 사망률은 2배, 뇌혈관질환으로 인한 사망률은 1.6배 및 관상동맥질환으로 인한 사망률은 1.8배 정도 높은 것으로 보고되고 있다. 또한, 복부 비만은 동맥경화성 죽종형성(atheroma formation)의 원인으로 보고되었으며 (Kunitomi M et al., Relationship between reduced serum IGF-I levels and accumulation of visceral fat in Japanese men. Int J Obes Relat Metab Disord. 2002;26:361-9), 기타 고혈압, 고지혈증, 면역체계의 이상 및 고인슐린증 등의 여러 질환의 원인으로 보고되고 있으며, 결과적으로 심혈관질환의 이환률(morbidity)과 사망률(mortality) 증가의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다 (Hida K, et al., Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor: a unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:10610-5). 현재 알려진 과학적인 치료법들은 이러한 유발 인자들을 저해하거나 항진시켜 비만을 일으키는 요소들을 저해하여 비만의 정도를 완화 혹은 개선하고자 한다.
현재 비만을 치료하기 위한 다양한 방법이 제공되고 있다. 일반적으로 비만증의 치료법은 식이요법, 운동요법, 식욕 억제제, 이뇨제, 설사제 혹은 포만감을 주기 위한 섬유질 등을 사용하는 약물요법, 잘못된 식습관과 생활습관을 교정해 주는 행동수정요법, 외과에서 장이나 위의 용적을 줄이는 수술요법, 성형외과 등에서 초음파를 이용하여 지방세포를 분해, 제거하는 방법 등의 지방제거수술 등이 있다. 또한 대표적 비만 치료제로서 지방흡수 억제제인 제니칼(Roche 사)과 식욕억제제인 리덕틸(Abbott사)이 세계 시장의 80%를 점유하고 있으나, 국내 시장에서는 각각 마이너스 성장에 머물고 있으며(2007년 각각 -10% 정도), 향정신성 의약품으로 분류된 제품의 경우 우울증, 불면증이나 소화장애 등을 포함하는 심각한 부작용으로 장기 복용을 금지하고 있는 문제점이 있다. 국내 제약사들의 제네릭 및 개량신약 제품이 시장 성장을 견인하고 있으나, 실제 의료기관을 방문하여 비만치료를 받는 환자들은 단지 5%, 실제 비만 환자인 경우도 10%에 불과하며, 2008년 비만치료제 시장규모는 약 800억원정도로 전체 비만 시장의 10%미만에 그치고 있는 실정이다.
반면 건강기능식품 시장에서 다이어트 식품 시장이 가장 큰 성장세를 기록하며, 현재 약 2천억원의 규모로 업계는 추산하고 있다. 한국건강기능식품협회 2008년도 자료에 따르면 건강기능식품의 소비자 요구에 가장 적합한 기능성의 우선순위 조사 결과, 비만 38%, 면역력 증진 22%, 아토피 14%, 관절건강(류마티스) 11% 순으로 나타났으며 2009년 기능성 유망소재의 결과도 유사하였다. 따라서 보다 천연물질을 유래의 보다 안전하고 우수한 효과를 나타내는 비만억제 또는 치료용 물질 개발이 절실히 필요한 상황이며, 다양한 약용 식물과 농업생명자원으로부터 새로운 작용 기전을 가진 우수한 소재의 개발에 대한 시장의 요구도가 매우 높다. 요즈음 고지혈증은 비만 및 다양한 심혈관계 질환을 포함한 각종 성인병과 관련된 제 2형 당뇨병의 발병과 더불어 현저히 증가되고 있는 추세이다. 이들 질병은 만성적 경과를 취함과 동시에, 다양한 합병증을 유발하므로, 사회적으로 매우 심각한 질환으로 간주되고 있는 실정이다.
근래에 들어 다양한 천연추출물에 대한 연구들이 최근 많이 진행되고 있으며, 천연추출물을 이용한 기능성 식품에 대한 수요도 꾸준히 증가하는 추세이다.
대한민국 공개특허 제2014-0127118호에는 손바닥선인장(천년초) 프로바이오틱스 제조방법 및 조성물에 관한 것이 개시되어 있다.
대한민국 등록특허 1142154호는 노팔 뿌리 추출물에 관한 것으로, 노팔 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다.
따라서 천연물질을 유래의 보다 안전하고 우수한 효과를 나타내는 비만 또는 그 합병증의 예방 또는 치료용 물질 개발이 절실히 필요한 상황이며, 다양한 약용 식물과 농업생명자원으로부터 새로운 작용 기전을 가진 우수한 소재의 개발에 대한 시장의 요구가 매우 높다.
본원은 천연물질을 이용한 비만 또는 그 합병증의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있는 추출물, 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p) 단독, 또는 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균으로 발효된 천년초 발효물 또는 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 그 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 상기 복합 유산균 발효에서 상기 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 1:1 중량비로 사용된다.
다른 구현예에서 상기 발효에서 상기 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)는 각각 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml, 및 1.2x107 CFU/ml 내지 1.4x109 CFU/ml로 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서는 특히 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균으로 발효된 발효물 또는 그 에탄올 또는 열수 추출물이 사용된다.
다른 양태에서 본원은 또한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p) 단독, 또는 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균으로 발효된 천년초 발효물 또는 발효 추출물을 포함하는 비만 또는 그 합병증의 개선용 식품 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 상기 복합 유산균에서 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 1:1 중량비로 사용된다.
다른 구현예에서 본원의 식품 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 음료 또는 식품첨가제로 제공될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 천년초 발효물의 제조방법으로서, 물에 천년초를 0.1~10 중량%로 혼합하고 여기에 비스코자임 또는 엿기름 중 하나 이상의 복합 다당류 분해 효소를 0.01~10% (v/v)로 추가하여 천년초를 전처리 하는 단계; 상기 전처리된 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p), 또는 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균 1:1의 중량비 로 접종하는 단계; 및 상기 접종물을 35℃~37℃에서 교반하면서 5-10 일간 배양하는 단계를 포함하는, 유산균을 이용한 천년초 발효물의 제조 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서는 상기 락토바실러스 플란타룸은 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml로 포함된다.
다른 구현예에서는 특히 복합 유산균이 사용되며 복합 유산균의 경우 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 각각 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml, 및 1.2x107 CFU/ml 내지 1.4x109 CFU/ml의 범위, 상기 1;1의 비율로 1.0x109 CFU/ml 내지 1.2x107 CFU/ml로 포함된다.
다른 구현예에서, 본원의 방법은 상기 배양하는 단계 후에, 10~15℃에서 5 내지 15일간 숙성시키는 숙성 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 본원의 방법은 상기 배양단계 후에 상기 발효물을 열수 또는 에탄올 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 본원의 방법은 상기 숙성 단계 후에 상기 발효물을 열수 또는 에탄올 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
본원은 단독 또는 복합 유산균으로 발효된 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 비만 또는 그 합병증의 예방 또는 치료용 조성물, 식품 조성물 및 그 제조 방법을 개시한다. 본원의 발효물 또는 그 추출물은 발효로 인해 발효되지 않은 경우와 비교하여 항산화 물질 및 아미노산이 현저히 강화된 것은 물론, 세포에 독성이 없으며, 비만 또는 그 합병증, 내당장애, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 간병증 또는 신병증과 같은 질환의 예방, 치료, 개선 및/또는 완화에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초를 페이퍼 디스크 어세이(paper disc assay)로 항박테리아활성 분석을 한 것이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초의 hTHP-1 세포에서의 세포생존율을 나타낸 그래프이다. A는 유산균발효 천년초(락토바실러스 플란타룸 단독 유산균), 그리고 B는 열수추출 천년초의 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초의 마우스 비장 세포에서의 세포생존율을 나타낸 그래프이다. A는 유산균발효 천년초(락토바실러스 플란타룸 단독 유산균), 그리고 B는 열수추출 천년초의 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초가 hTNF-α의 발현을 억제한다는 것을 나타낸 그래프이다. A는 락토바실러스 플란타룸 단독 유산균발효 천년초, B는 복합 유산균(락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스 GG) 발효 천년초, 그리고 C는 열수추출 천년초의 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초에 의한 MMP-9 생성량을 분석한 것이다. A는 hTHP-1 세포에서, B는 마우스 비장 세포(mouse spleenocytes)에서 분석한 것이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 유산균발효 천년초가 싸이토카인 hIL-8의 생성에 미치는 영향을 분석한 것이다. A는 락토바실러스 플란타룸 단독 유산균발효 천년초, B는 복합 유산균(락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스 GG) 발효 천년초, 그리고 C는 열수추출 천년초를 처리한 것이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 동물 실험 설계를 나타낸다. 총 160마리의 암컷 ICR 마우스를 준비하여, 7일간 실험실 환경에 순응시킨 후, 1 주일간 고지방식이(HFD)에 적응시킨 다음 일정한 체중 증가를 나타내는 실험동물만 군당 8마리씩, 총 8군 (56 마리의 HFD 공급 마우스 - 평균 체중 31.20 ± 1.80 g, 28.90~35.70 g와 8수의 정상 사료 공급 마우스 평균 체중 28.35 ± 1.60 g, 26.00~30.80 g)으로 구분하여 실험에 사용하였으며, 84일간의 연속 경구투여 후, 최종적으로 체중을 기준으로 군 당 6 마리의 실험동물을 선별하였다. HFD = 45%Kcal 고지방식이(high fat diet). OH = 천년초 과실(Opuntia humifusa)추출물, fOH = 락토바실러스 플란타룸으로 발효된 천년초 추출물.
도 8은 본원의 일 실시예에 사용된 마우스의 체지방 밀도 측정을 나타낸다. 모든 정상식이 또는 고지방식이 마우스에서의 체중 및 복부 지방 밀도를 각각을 개별적으로 DEXA(in live dual-energy x-ray absorptionmetry)로 측정하였다(InAlyzer, Medikors, Seungnam, Korea). NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고지방식이.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 정상 식이 또는 고지방 식이 마우스에서의 체중 변화를 나타낸다. 정상 식이와 비교하여, 고지방 식이 마우스는 1 주일 후에 체중이 현저하게 증가하였다(p<0.01)(화살표). 그러나 고지방 식이와 비교하여, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg을 투여한 마우스에서는 투여후 28 내지 35일에의 체중이 현저하게 감소하였다(p<0.01 or p<0.05)(점 화살표). 서로 다른 세 용량의 fOH를 투여한 마우스에서의 체중 변화는 OH 400mg/kg을 투여한 마우스의 체중 변화와 유의하게 다른 점이 없었다. 수치는 6 마리 마우스의 평균 ± SD로 나타내었다. NFD = 정상 지방 펠렛 식이; HFD = 45%Kcal 고 지방 식이; OH = 천년초 열매 (Opuntia humifusa) 추출물; fOH = 락토바실러스 플람타름-발효된 OH 추출물. 심바스타틴 및 메트포르은 각각 10 및 250 mg/kg 용량 레벨로 투여하였다. 초기 시험 물질 투여 전 및 희생전에 모든 동물들에게 밤새 먹이를 주었다. LSD 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05, 고지방식이 대조군과 비교하여 cp<0.01.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD 식이 마우스에서 얻은 전신 DEXA 이미지가 있는 대표적 전신 및 복부 지방체를 나타낸다. 본원 실시예에 따른, HFD 공급과 관련이 있는 전형적인 제 2형 당뇨에서, 체중의 현저한 증가 및 이와 관련된 지방 축적이 정상 지방식이 대조군과 비교하여 고지방식이 대조군에게서 나타나 있다. 그러나 OH 400 mg/kg를 포함한 모든 시험물질을 처치받은 마우스에게서, 체중 및 지방 축적이 현저히 저해되는 것이 체중 조사 분석 및 in live DEXA 이미지에서 각각 관찰되었다. 특히 fOH 400 및 200 mg/kg를 처치한 마우스 또한 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 체중, 전신 및 복부 지방 밀도가 각각 현저하게 감소하였다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 체중, 전신 및 복부 지방 밀도가 각각 현저하게 변화하지 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, DEXA = Dual-energy x-ray absorptionmetry; 스케일 바 = 35 mm.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD 공급 마우스에서의 전신 및 복부 지방 밀도를 나타낸다. 정상식이 대조군과 비교하여, HFD 대조군에서는 전신 및 복부 지방 밀도가 각각 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 반대로, in live DEXA분석에서, OH 400 mg/kg을 포함한 모든 시험물질에서 전신 및 복부 지방 양이 각각 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 특히, fOH 400 및 200 mg/kg을 처치한 HFD 마우스 또한 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 전신 및 복부 지방 양이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 체중, 전신 및 복부 지방 양은 각각 유의하게 변화하지 않았다. 수치는 6 마리 마우스의 평균 ± SD로 나타내었다. NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, DEXA = Dual-energy x-ray absorptionmetry; OH는 400 mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. 심바스타틴 및 메트포르민은 각각 10 및 250 mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. LSD 테스트에 의하여 정상식이 대조군과 비교하여 ap<0.01, LSD 테스트에 의하여 고지방 식이 대조군과 비교하여 bp<0.05, LSD 테스트에 의하여 OH 400mg/kg과 비교하여 cp<0.01.
도 12는 본원의 일 실시예에 따른, 정상식이 또는 고지방식이를 공급받은 마우스의 페리오배리안(Periovarian) 및 복부 벽에 위치한 지방체에서 채취한 지방세포의 대표적 조직 이미지를 나타낸다. 정상식이 대조군과 비교하여 고지방 식이 대조군에서 검출한 각 지방체의 페리오배리안 및 복부 백색 지방세포 지름 두께는 각각 현저하게 증가하였다. 그러나, 이러한 지방세포 및 지방 침착의 비대는 HFD 대조군과 비교하여 메트포르민 250mg/kg을 포함한 6개의 모든 시험물질의 처치에 의해 각각 현저하게 저해되었다. 특히, fOH 400 및 200 mg/kg을 처치받은 HFD 마우스 또한 OH 400 mg/kg 을 처치받은 HFD 마우스와 비교하여 페리오배리안 및 복부에 침착된 지방체 백색 지방세포 지름 및 그 두께가 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 페리오배리안 및 복부에 침착된 지방체 백색 지방세포 지름 및 그 두께가 각각 현저하게 변화하지 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, 모두 헤마톡실린 & 에오신 염색, 스케일 바 = 80 μm.
도 13은 본원의 일 실시예에 따른 정상 식이 또는 고지방식이를 공급받은 마우스 췌장의 대표적이고 일반적인 조직 이미지를 나타낸다. 외분비 췌장 효소원(zymogen) 과립 함량(효소원 과립이 차지하는 외분비 췌장의 퍼센트)이 현저히 감소하는 것은 효소원 과립의 방출에 기인한 것일 수 있음을 주의하여야 하며, 정상 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서 췌장 섬 자체 또는 구성성분 내분비 세포가 과형성되어 췌장섬 수 및 평균 지름이 증가하는 것일 수 있다. 그러나, 외분비 췌장 효소원 과립 함량은, 효소원 과립이 차지하는 외분비 췌장의 퍼센트가 HFD 대조군과 비슷한 심바스타틴 10 mg/kg 처치 마우스를 제외하고는, HFD 대조군과 비교하여 시험 약물을 처치한 모든 마우스에게서 극적으로 증가하였다. 또한, 췌장 섬의 확장 또한 모든 시험물질의 처치에 의하여 각각 현저하게 저해되었다. 특히 OH 400mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200mg/kg을 처치한 HFD 마우스 또한, 효소원 과립이 차지하는 외분비 췌장 부위 퍼센트의 감소, 및 췌장섬 수 및 평균 지름의 증가에 반대되어 더 유리하게 저해하는 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 췌장 외분비 효소원 과립 및 내분비섬의 조직이 각각 유의하게 변화하지는 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, IS = 췌장 섬, PD = 췌장 분비관, 모두 헤마톡실린 & 에오신 염색, 스케일 바 = 80 μm.
도 14는 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD를 공급받은 마우스에서의 혈청 인슐린 및 혈액 HbA1C를 나타낸 것이다. 정상식이 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서 혈액 HbA1C 및 혈청 인슐린 함량이 각각 상당히 증가한 것으로 관찰되었다. 그러나, 혈액 HbA1C 및 혈청 인슐린 함량은, 심바스타틴 10 mg/kg을 처치한 마우스를 제외하고 HFD 대조군과 비교하여 모든 6개의 시험물질의 처치에 의하여 상당히 감소하였으며, 심바스타틴 10 mg/kg을 처치한 마우스에서는 혈액 HbA1C 및 혈청 인슐린 함량이 HFD 대조군과 유사한 것으로 나타났다. 특히, OH 400mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200mg/kg을 처치한 HFD 마우스 또한 혈액 HbA1C 및 혈청 인슐린 함량이 상당히 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 혈액 HbA1C 및 혈청 인슐린 함량이 각각 유의하게 변화하지 않았다. 수치는 6 마리 마우스의 평균 ± SD로 나타내었다. NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, HbA1c = 당화 헤모글로빈, 헤모글로빈 A1c, OH는 400mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. 심바스타틴 및 메트포르민은 각각 10 및 250 mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. LSD 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 ap<0.01, LSD 테스트에서 HFD 대조군과 비교하여 bp<0.01, LSD 테스트에서 OH 400 mg/kg과 비교하여cp<0.01, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 dp<0.01 및 ep<0.05, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 fp<0.01 및 gp<0.05, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 hp<0.01.
도 15는 본원의 일 실시예 따른 NFD 또는 HFD를 공급받은 마우스에서 채취한, 췌장에서의 인슐린 및 글루카곤-면역반응 세포의 대표적 조직 이미지를 나타낸다. 정상식이 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서 인슐린 및 글루카곤-면역반응 세포, 및 인슐린/글루카곤 세포 각각이 현저하게 증가하는 것이 탐지되었다. 그러나 HFD 대조군과 비교하여, 인슐린 및 글루카곤-면역반응 세포, 및 이들의 비율(인슐린/글루카곤 세포)이 비정상적으로 증가하는 것이 fOH 100mg/kg을 포함한 모든 시험물질의 처리에 의해 각각 상당히 정상화되었다. 특히, OH 400 mg/kg을 처리한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200 mg/kg을 처리한 HFD 마우스에서 역시 인슐린 및 글?굅? 면역라벨 세포 수, 인슐린/글루카곤 세포비율이 각각 상당히 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 내분비 췌장 인슐린 및 글루카곤 면역반응세포 수 및 이들의 비율이 각각 유의하게 변화하지는 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, IS = 췌장 섬, PD = 췌장 분비관, 모두 아미딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체로 염색하였다, 스케일 바 = 80 μm.
도 16은 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD 공급하우스에서의 분변 TC 및 TG 함량을 나타낸다. 정상식이 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서는 분변 TC 및 TG가 다소 현저하지 않은 증가를 보였지만, fOH 400mg/kg을 포함하는 6개 시험물질을 처치한 모든 마우스에게서 분변 TC 및 TG 함량 각각은 HFD 대조군 마우스와 비교하여 현저하게 상승하였다. 특히, OH 400 mg/kg을 처리한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200 mg/kg을 처리한 HFD 마우스에서 역시 분변 TC 및 TG 함량 각각이 상당히 증가한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 분변 TC 및 TG 함량이 각각 유의하게 변화하지는 않았다. 수치는 6 마리 마우스의 평균 ± SD로 나타내었다. NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, TC = 총 콜레스테롤, TG = 트리글리세라이드, OH는 400mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. 심바스타틴 및 메트포르민은 각각 10 및 250 mg/kg의 용량 레벨로 투여하였다. LSD 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 ap<0.01, LSD 테스트에서 HFD 대조군과 비교하여 bp<0.01, LSD 테스트에서 OH 400 mg/kg과 비교하여 cp<0.01, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 dp<0.01, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 ep<0.01, MW 테스트에서 정상식이 대조군과 비교하여 fp<0.01.
도 17은 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD를 공급받은 마우스에서 채취한, 간의 대표적 조직 이미지를 나타낸 것이다. 정상식이 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서, 간실질(liver parenchyma)에서 지방으로 변한 부위의 퍼센트, 즉 지방간이 극적으로 증가한 것은 세포내 지질 축적과 관련있는 간세포가 심각하게 비대한 결과라는 것을 주목해야 한다. 그러나, 이러한 지방간이 처치한 fOH 100mg/kg을 포함한 모든 6개 시험물질 각각에 의해 유효하게 정상화되었다. 특히, OH 400 mg/kg을 처리한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200 mg/kg을 처리한 HFD 마우스각각에서 역시 지방간 및 관련 간세포 비대가 상당히 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 간실질에서 간세포의 지름과 지방이 변한 부위의 퍼센트가 유의하게 변화하지는 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, CV = 중심 정맥, PT = 간세동이(Portal triad). 스케일 바 = 80 μm.
도 18은 본원의 일 실시예에 따른 NFD 또는 HFD를 공급받은 마우스에서 채취한, 신장의 대표적 조직 이미지를 나타낸 것이다. 정상식이 대조군과 비교하여 HFD 대조군에서는 퇴행성의 공포성 세뇨관이 상당히 증가하는 것이 지방 소적이 침착된 방뇨병성 신병증때문이지만, 심바스타틴 10mg/kg을 포함한 6개의 시험물질을 처치한 마우스에서는 HFD 대조군과 비교하여 이러한 당뇨병성 신병증이 상당히 정상화가 되었다는 것을 주목하여야 한다. 특히, OH 400 mg/kg을 처리한 HFD 마우스와 비교하여 fOH 400 및 200 mg/kg을 처리한 HFD 마우스 각각에서 공포화된 세뇨관의 수가 상당히 감소한 것으로 나타났다. 한편, fOH 100 mg/kg를 처치한 마우스는 OH 400 mg/kg을 처치한 HFD 마우스와 비교하여 신장 조직이 유의하게 변화하지는 않았다. A = 정상 대조군 : 정상 펠렛 식이를 공급받은 대조군 마우스 ; 10 ml/kg의 증류수를 경구투여한 마우스, B = HFD (vehicle) 대조군 : HFD 공급과 더불어 10 ml/kg의 증류수를 경구 투여한 마우스, C = 심바스타틴: HFD 공급과 더불어 10 mg/kg의 심바스타틴을 경구투여한 마우스, D = 메트포르민: HFD 공급과 더불어 250 mg/kg of 메트포르민을 경구투여한 마우스, E = OH400 : HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 OH를 경구투여한 마우스, F = fOH400: HFD 공급과 더불어 400 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, G = fOH200: HFD 공급과 더불어 200 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스, H = fOH100: HFD 공급과 더불어 100 mg/kg의 fOH를 경구투여한 마우스; NFD = 정상 지방 펠렛 식이, HFD = 45%Kcal 고 지방 식이, OH = 천년초 열매(Opuntia humifusa) 추출물, fOH = 락토바실러스-플란타룸으로 발효한 OH 추출물, 모두 헤마톡실린 & 에오신 염색, 스케일 바 = 80 μm.
한 양태에서 본원은 천년초 발효물 또는 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 그 합병증의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
본원의 ‘천년초(cactus fruit, Opuntia humifusa; OH)’는 선인장과에 속하는 다육질의 여러해살이 풀로 줄기는 일반적인 선인장처럼 다육질로서 몇 군데가 마디처럼 잘록하며 이것을 경절(莖節)이라고 한다. 경절은 원통 모양, 공 모양, 타원 모양 등 그 모양이 여러 가지이며, 그 모양에 따라 분류하기도 한다. 이 경절에 헛물관이 있으며 표피 가까이에 관다발이 있다. 새순에 달리는 잎은 바늘처럼 생겼으며 육질로서 완전히 자란 다음에 떨어진다. 떡잎은 바소(한방에서, 곪은 데를 째는 데 쓰는 날이 있는 기구)꼴 또는 삼각형이며 같은 육질로서 화피와 포(변형된 잎)가 서로 다르다. 영하 20℃에서도 월동이 가능하다. 줄기의 형태가 손바닥과 비슷하여 손바닥선인장으로도 불리운다. 일 구현예에서 본원에 사용되는 천년초는 특히 열매(천년초 cactus fruit)가 사용된다. 하지만 생리활성을 포함하는 한, 종피, 잎, 줄기 및 종자를 제외하는 것은 아니다.
본원에서 발효물이란 본 발명에 따른 발효과정을 거친 최종 산물을 칭하는 것으로 발효 후 고형분을 제거 하거나 하지 않을 수도 있으며, 모두 본원에 포함된다. 한 구현예에서 발효 후 고형분은 체, 예를 들면 100 메쉬의 체로 걸러진다. 본원의 발효에는 유산 (Lactic acid)을 생성하는 다양한 유산균이 사용될 수 있다.
발효는 다양한 발효균 예를 들면 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, L.casei) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p)와 같은 유산균, 효모균(Saccharomyces sp.), 바실러스균 (Bacillus subtilis)을 이용하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서는 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) 예를 들면 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및/또는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG)가 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 상기 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 각각 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml, 및 1.2x107 CFU/ml 내지 1.4x109 CFU/ml로 포함된다.
본원에 사용되는 천년초는 발효공정을 통해 원료내의 유효성분들이 다양한 유용성 성분으로 전이되며, 특히 발효를 통해 다양한 효소성분들이 생성되고 단백질의 저분자화가 일어나며, 아미노산이 강화되고 또한 총 폴리페놀 함량이 풍부하게 되는 등 그 유용성이 극대화되었다.
본 명세서에서 사용된 용어 ‘비만’은 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 25.0 이상인 경우는 비만이라고 정의하고, 23이상 25미만은 과체중(위험체중)으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만 (내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인); 증식성 비만 (지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형비만 (지방세포의 크기 증대로 인한 비만); 상반신 비만, 하반신비만; 및 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 비만으로 인한 합병증은 대사증후군, 고지혈증, 제2 형 당뇨병, 동맥결화, 당뇨병 또는 간병증을 포함한다.
본원에서 대사증후군은 제2 형 당뇨병, 고지혈증, 비만, 신병증, 및/또는 간병증과 같은 질환이 동시에 발생하는 것을 의미한다 (Pershadsingh HA, Dual Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha/gamma Agonists : In the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus and the Metabolic Syndrome. Treat Endocrinol. 2006;5(2):89-99).
본원의 ‘고지혈증’은 혈액 중에 지방성분 특히 콜레스테롤과 중성지방(triglyceride)의 농도가 높은 경우로 일반적으로 240mg/㎗을 넘거나 중성지방이 200mg/㎗ 이상일 때를 고지혈증 이라고 한다. 고지혈증은 유전적 소인, 비만, 식이습관, 당뇨병, 신증후군, 갑상선기능저하증에 의해서 유발될 수 있다.
본원의 발효물 또는 그 추출물이 효과를 나타내는 고지혈증은 비만, 대사증후군, 당뇨, 식이습관, 갑상선기능저하증, 신증후군으로 인한 고지혈증을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서, 본원의 고지혈증은 비만으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 당뇨병으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 대사증후군으로 인한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 ‘추출물(extract)’란 천연물 또는 그 발효물 로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다. 본원에 따른 일 구현예에서는 물 또는 에탄올을 이용하여 추출된다.
본 명세서에서 사용된 용어 ‘치료’란 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 그 합병증 예를 들면 고지혈증 또는 이로 인한 다른 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 비만 또는 그 합병증에 대하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어‘예방’은 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 그 합병증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 비만 또는 그 합병증에 치료효과가 있는 본원의 추출물은 비만 또는 그 합병증의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 이들 혼합물을 단독으로 또는 비만 또는 그 합병증의 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수 있다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 비만 또는 그 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제형은 천년초 발효물 또는 그 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 슈크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제형으로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
더 나아가 본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 천년초 발효물 또는 그 추출물의 유효 투여량은 통상적으로 성인(60kg)의 경우, 약 1 내지 100 g/일, 특히 약 10 내지 50g/일, 더욱 바람직하게는 약 30g/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본원의 추출물을 포함하는 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 약학 조성물은 비만 또는 그 합병증에 대하여 우수한 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다. 이에 따라, 상기 본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물이 식품의 주, 부원료 및 식품 첨가제로서 사용이 가능하다.
따라서, 이러한 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 천년초 발효물 또는 그 추출물을 포함하는 식품 조성물, 예를 들면, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "기능성식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 특히 "건강기능식품"을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "건강보조식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 가공한 식품으로서, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품원료에 들어있는 성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말한다.
특히 본 발명에서 기능성식품 또는 건강보조식품은 상기 식품을 섭취하기 전과 비교하여 비만 또는 그 합병증의 증상을 개선하거나, 이의 경감 또는 해소에 도움을 줄 수 있는 효과가 있는 식품을 의미하며, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 이러한 질환의 정확한 기준을 알고, 개선된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
상기 기능성식품 및 건강보조식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효 음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본원에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
본원에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미하며, 바람직하게는 비만 또는 그 합병증의 개선을 위한 음료를 의미한다.
상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 발효물 또는 그 추출물 100 중량부 당 0.001 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
비만 또는 그 합병증의 개선을 목적으로 하는 식품에 있어서, 상기 본원의 천년초 발효물 또는 그 추출물은 전체 식품 중량의 약 0.01 내지 90 중량%, 약 0.1 내지 80 중량%, 약 1% 내지 70%, 약 1% 내지 50%, 약 1% 내지 40%, 약 1% 내지 30%, 약 1% 내지 20%의 범위로 포함할 수 있으나, 상기 범위를 벗어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 예를 들면 음료 조성물은 100mL 를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원의 조성물에 사용되는 천년초 발효물 또는 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 물에 천년초를 0.1~10 중량%로 혼합하고 여기에 비스코자임 또는 엿기름 중 하나 이상의 복합 다당류 분해 효소를 0.01~10% (v/v)로 추가하여 천년초를 전처리 하는 단계; 상기 전처리된 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p), 또는 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균 1:1의 중량비 로 접종하는 단계; 및 상기 접종물을 35℃~37℃에서 교반하면서 5-10 일간 배양하는 단계를 포함한다. 본원에 따른 방법에서 상기 복합 다당류 분해 효소인 비스코자임 및/또는 엿기름(천연 복합 분해효소 함유)을 이용하여 전처리 되는 경우 발효 효율을 극대화할 수 있다.
본원에 따른 방법에서는 상기 락토바실러스 플란타룸은 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml로 포함된다.
다른 구현예에서는 특히 복합 유산균이 사용되며 복합 유산균의 경우 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 상기 1;1의 비율로 1.0x109 CFU/ml 내지 1.2x107 CFU/ml로 포함된다.
다른 구현예에서, 본원의 방법은 상기 배양하는 단계 후에, 10~15℃에서 5 내지 15일간 숙성시키는 숙성 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 본원의 방법은 상기 숙성 단계 후에 상기 발효물 또는 그 추출물을 열수 또는 에탄올 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 천년초 원료: 엿기름 추출 멸균수 = 1 : 50 (w/v) = 2% (w/v)의 비율로 하여 얻은 천년초 엿기름 효소추출액인 유산균 배지로 제조하는 제 1 단계; 및 상기 유산균 배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p) 단독, 또는 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균을 접종하여 배양하는 제 2 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가로 상기 제 2단계의 배양액을 10~15℃ 상온에서 10일간 숙성시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서 상기 제 2 배양하는 단계는 제2 단계는 35℃, 80rpm에서 7일간 배양간 배양된다. 상기 천년초는 1 내지 4 중량%로 포함되고, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 각각 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml, 및 1.2x107 CFU/ml 내지 1.4x109 CFU/ml로 접종된다.
본원에 따른 방법에 사용되는 천년초는 앞서 언급한 바와 같다. 아울러 천년초는 건조된 형태, 또는 가공되지 않은 형태로 사용될 수 있으며, 또는 이는 절편 또는 분쇄와 같은 방식으로 전처리 될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실 시 예
제조예 1. 천년초 발효 제조에 적합한 미생물 선별 및 천년초 발효물 제조
1-1. 발효 효율 증대를 위한 천년초 원료 전처리
유산균에 의한 천년초 발효의 효율을 증대시키기 위하여 복합 다당류 분해 효소인 비스코자임(viscozyme)과 엿기름(천연 복합 분해효소 함유)을 이용하여 유산균 생육 및 항산화능에 미치는 효과를 검토하였다.
1) 비스코자임 L(Novozymes Co., Denmark) - 천년초 원료: 멸균수 = 1 : 50 (w/v)(2% (w/v))에 비스코자임 3%(v/v)를 주입한 후, 30℃, 200rpm, 12시간 교반하여 수득한 추출액을 유산균 배지로 사용하였다.
2) 엿기름(가야맥식품, 경북 성주) - 천년초 원료: 엿기름 추출 멸균수 = 1 : 50 (w/v)(2% (w/v))로 하여 40℃, 200rpm, 12시간 교반하여 수득한 천년초 엿기름 효소추출액을 유산균 배지로 사용하였다. 엿기름 추출 멸균수는 40~60℃의 멸균수 100ml에 엿기름 15g을 넣어 2시간 처리 후, 고형분을 제거한 액체 추출액을 말한다.
3) 전처리에 따른 유산균 생육과 항산화 관련 SOD 활성변화를 살펴보면 하기 표 1과 같다.
[표 1]
Figure 112015050633917-pat00001
즉, 유산균 생육에는 비스코자임 전처리가 다소 우세했지만, 항산화 활성까지 고려할 때 엿기름 전처리법이 유리하였다.
1-2. 유산균 선별
1) 천년초 발효용 유산균 선별
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum (김치 유래)), 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG (요구르트 유래)) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei (요구르트 유래)) 중에서 선별하였다.
2) 천년초 원료를 주원료로 한 유산균 생육 특성
상기 후보유산균으로 천년초를 발효할 때의 생육 특징은 하기 표 2와 같다. 하기 표를 보면 락토바실러스 플란타룸 단독으로 발효할 때와, 락토바실러스플란타룸 및 락토바실러스 람노서스의 복합 유산균으로 발효할 때 우수한 결과를 수득하였다.
[표 2]
Figure 112015050633917-pat00002
따라서, 천년초 열매를 락토바실러스 플란타룸 단독 유산균, 또는 락토바실러스플란타룸 및 락토바실러스 람노서스의 복합 유산균으로 발효시켰다.
1-3. 유산균 발효 천년초 추출물의 제조
1) 천년초 원료는 경북 의성군 비안면 강변길 111에 소재한 좋은먹거리 영농조합법인에서 분말형태 구입하였다.
2) 열수 추출물 및 유산균발효 천년초 추출물의 제조
가. 열수 추출물의 제조
- 천년초 원료:증류수 = 1 : 50 (w/v)이 비율로 혼합하고 80℃에서 3일간 100 rpm으로 교반시키면서 추출하였다.
나. 유산균발효 천년초 추출물의 제조
천년초 원료 대 멸균수를 1 : 50 (w/v) (2% (w/v))의 비로 포함하는 용액에 종균 접종 김치 유래 유산균인 L. 플란타룸(plantarum) 단독, 또는 L. 플란타룸 및 L. 람노서스 복합(복합제제) 배양액 5%(v/v)를 접종하여 35℃, 80rpm에서 7일 동안 발효시켰다. 그 후, 배양액 자체를 100℃, 5분간 살균하고 나서, 10~15℃ 상온에서 10일간 숙성시켰다. 여과를 통한 고형분 제거하고, 여액을 수거하여 농축시킨 후, 동결건조하였다.
3) 단일 유산균과 복합 유산균 발효액 특성분석
가. 발효액의 특성분석
[표 3]
Figure 112015050633917-pat00003
상기 표 3을 통해 천년초 원료에 포함된 복합다당류가 유산균 발효에 의해 분해되어 저분자화 됨을 알 수 있다.
나. 유산균 발효 천년초의 항박테리아 활성 분석
MIC 테스트 및 페이퍼 디스크 어세이를 통해 유산균 발효 천년초의 항박테리아 활성을 분석하였으며, MIC 테스트 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC test) 결과는 하기 표 4, 그리고 페이퍼 디스크 어세이 결과는 도 1에 기재되어 있다.
[표 4]
Figure 112015050633917-pat00004
다. 항산화 관련 성분 기초 분석
또한 락토바실러스 종류의 유산균 발효 후에, 항산화와 관련이 있는 총폴리페놀 함량은 발효시키지 않은 일반 열수 추출 천년초 대비 1.2~1.4배, SOD 활성도는 2.0~2.1배로 각각 증가하였다. 또한 유산균 발효 천년초의 총 아미노산 함량 분석결과 아미노산 함량도 증가한 것으로 나타났다.
1-4. 유산균 발효 천년초의 세포독성 평가
hTHP-1 세포 및 마우스 비장 세포에서의 세포 생존율을 실험하였다. 락토바실러스 플란타룸으로 발효하여 제조한 유산균 발효 천년초는 사람의 대식세포주인 THP-1 세포(도 3)와 마우스 비장세포(도 4)에 처리시 500μg/ml 농도까지 세포 생존율에는 크게 영향을 주지 않았다. 또한 열수 추출한 천년초의 경우도 동일 농도까지 뚜렷한 세포독성은 보이지 않았다. 결과는 도 2 및 도 3에 나타나있다.
발효천년초의 효과에 대한 실험
천년초의 비만 및 그 합병증 예를 들면 고지혈증, 당뇨와 그 합병증에 대한 약리효과가 유산균 (Lactobacillus plantarum) 발효에 의해 현저히 증가될 것인지를 알아보기 위하여, 본원에서는 유산균 발효 천연초 열매 추출물 (fOH)의 다양한 약리효과를 투여용량 의존적으로 실험했는데, 45%Kcal 고지방사료 (high fat diet; HFD, Table 1) 공급 마우스 [Kim et al., Molecules. 2014;19:18493-510.]를 실험동물 모델로 이용하여, 원재료인 천년초와 비교 평가하였다. 또한 현재 대표적인 Type II 당뇨병 및 비만 치료제로 사용되고 있는 메트포르민 [Park et al., J Ethnopharmacol. 2005;102:326-35] 250 mg/kg 투여군 [Kang et al.,. Nutrients. 2014;6:3536-71.] 및 대표적인 지질 저하제로 당뇨병성 고지혈증 및 신장질환 예방제로 사용되고 있는 심바스타틴 [Joseph and Golden, Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2014;21:109-20] 10 mg/kg 투여군 [Kim et al., Nutrients. 2013;5:4316-32]과 각각 비교하였다.
실험 재료
실험동물 총 160마리의 6주령 암컷 SPF/VAF CrljOri:CD1[ICR] 마우스 [OrientBio, Seungnam, Korea; ANNEX I, II]를 7일간 실험실 환경에 순응시킨 후, 1 주일간 고지방식이(HFD)에 적응시킨 다음 일정한 체중 증가를 나타내는 실험동물만 군당 8마리씩, 총 8군 (표 5; 56 마리의 HFD 공급 마우스 - 평균 체중 31.20 ± 1.80 g, 28.90~35.70 g와 8수의 정상 사료 공급 마우스 평균 체중 28.35 ± 1.60 g, 26.00~30.80 g)으로 구분하여 실험에 사용하였으며, 84일간의 연속 경구투여 후, 최종적으로 체중을 기준으로 군 당 6 마리의 실험동물을 선별하였다. 모든 실험동물은 대구한의대학교 실험동물윤리위원회의 사전승인 하에 동물실험윤리 기준에 따라 취급하였다.
군 분리 (총 8 개군; 군 당 8마리 - 최종 군당 6 마리)
정상 대조군 (정상 사료 공급 매체 투여군)
HFD 대조군 (HFD 공급 매체 투여군)
심바스타틴 10 mg/kg 투여 HFD공급 대조약물군
메트포르민 250 mg/kg 투여 HFD공급 대조약물군
천년초(OH) 400 mg/kg 투여 HFD공급 비교 실험군
fOH 400 mg/kg 투여 HFD공급 고용량 실험군
fOH 200 mg/kg 투여 HFD공급 중간용량 실험군
fOH 100 mg/kg 투여 HFD공급 저용량 실험군
투여 경로 및 빈도: 경구투여로 1일 1회, 84일동안 투여(매체 : 멸균 증류수)하였으며, 투여용량: 10 ml/kg (표 5, 도 6)이었다.
실험물질 투여용량의 선정: 본 실험에서 OH의 농도 400 mg/kg은 이전의 OH에 대한 동물실험 결과 [Kang et al., Int J Mol Sci. 2012;13:6747-56]를 바탕으로 선정하였으며, OH와의 직접적인 약효 비교를 위해 fOH의 최고 농도 역시 400 mg/kg으로 선정하였고, 공비 2로 200 및 100 mg/kg을 중간 및 저 농도 투여군으로 설정하였다. 또한 대조약물로 사용한 메트포르민 및 심바스타틴의 투여 용량은 각각 이전의 참고문헌을 바탕으로 각각 250 mg/kg [Jung et al., Nutr Res. 2011;31:387-96.] 및 10 mg/kg [Kim et al., Nutrients. 2013;5:4316-32.]으로 설정하였다.
HFD 공급: 실험물질 투여 시작 1주일 전부터 실험 물질 투여 전 기간 동안 45%Kcal HFD (표 6; Research Diet, New Brunswick, NJ, USA)를 공급하였으며, 정상 대조군에서는 일반 설치류 pellet사료 (Superfeed Co., Seoul, Korea)를 동일한 방법으로 공급하였다.
실험물질의 투여: 1 주일간의 HFD 적응기간 후, 심바스타틴 10 mg, 메트포르민 250 mg, OH 400 mg, fOH 400, 200 및 100 mg을 10 ml의 멸균 증류수에 용해 시켜, 10 ml/kg의 용량으로 1일 1회씩, 84일간 경구 투여하였으며, 정상 및 HFD 대조군에서는 실험물질 대신 멸균 증류수만 동일한 용량으로 동일한 기간동안 경구 투여하였다 (Table 2, Fig 1).
[표 5]
Figure 112015050633917-pat00005
[표 6]
Figure 112015050633917-pat00006

실시예 1. 유산균발초 천년초 추출물의 고지혈증에 대한 인비트로에서 효과 확인
고지혈증이 있을 경우에 이에 관련되는 사이토카인인 hTNF-alpha 생성에 미치는 영향을 분석하여, 유산균발표 천년초 추출물의 고지혈증에 대한 효과를 확인하였다.
1-1. hTNF-alpha 발현 억제 확인
사람 대식세포인 THP-1에 천년초 시료를 농도별로 처리할 경우, 전체적으로 저농도(5μg/ml)에서 LPS로 유도되어 생성되는 염증성 사이토카인 hTNF-alpha 생성을 억제시키는 경향성을 나타내었으며, 5μg/ml 이상 고농도로 처리할 경우에는 큰 영향이 없었다. 특히 Lactobacillus plantarum 단독 균주로 발효하여 제조한 경우, 일반 열수 추출이나 유산균 2종(Lactobacillus plantarum, Lactobacillus ramhnosus GG) 복합균주 발효물 보다 hTNF-alpha 생성을 억제하는 효과가 보다 강한 것으로 나타나는 것을 확인하였다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
1-2. 유산균 발효 천년초 처리에 따른 MMP-9 생성량 분석(gelatin zymography)
사람 대식세포주인 THP-1와 마우스 비장세포에서 LPS 유발 염증 반응에 동반되는 MMP 생성량을 젤라틴 자이모그램(gelatin zymogram)으로 분석한 결과, THP-1에서는 천년초 처리에 따라 MMP-9, MMP-2 발현이 관찰되었으며, 특히 락토바실러스 플란타룸 유산균으로 발효시킨 천년초의 경우 고농도 처리보다 저농도(5μg/ml) 처리할 경우가 MMP-9 생성량 감소에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 결과는 도 5A에 나타나있다.
또한, 마우스 비장 세포주에서는, THP-1 세포주에서와 달리 MMP-9 발현만 관찰되었으며, 마우스 비장세포에서도 고농도 처리보다는 저농도 처리가 MMP-9 생성을 다소 감소시키는 효과가 있음을 기초적으로 확인하였다. 결과는 도 5B에 나타나있다.
1-3. 유산균 발효 천년초가 cytokine hIL-8 생성에 미치는 영향 분석
사람 대식세포주인 THP-1에서 천년초 처리에 따른 사이토카인 IL-8 생성량을 ELIZA로 분석한 결과, 유산균으로 발효 시킨 천년초의 경우도 일반 열수 추출한 천년초와 유사하게 농도 유의적으로 IL-8 생성량을 증가시켰다. 기존 자료에 의하면, IL-8 생성량 증가는 말초혈관 신생 촉진과 관련이 있다고 알려지고, 특히 고지혈증 치료제인 스타틴 약물 처리시에도 IL-8 생성량이 증가하는 경향성과 부합하는 결과로, 본원의 유산균 발효추출물이 고지혈증에 효과가 있다는 것을 알 수 있다. 결과는 도 6에 나타나있다.
실시예 2. 유산균발초 천년초 추출물의 비만 및 그 합병증에 대한 효과 확인
2-1. 체중 변화 감소 효과 확인
HFD 사료 공급 1주 후 일정한 체중 증가를 나타내는 실험동물 (HFD 공급 마우스 - 평균 체중 31.20 ± 1.80 g, 28.90~35.70 g; 정상 사료 공급 마우스 평균 체중 28.35 ± 1.60 g, 26.00~30.80 g)만을 선별하였으므로, HFD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 증가는 고지방사료 공급 7일 후부터 인정되었으며, 1주일간의 HFD 적응기간 및 84일간의 실험물질 투여기간 동안의 증체량 역시 각각 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가를 나타내었다. 한편 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 각각 투여시작 28 또는 35일 후부터 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 인정되기 시작하였으며, 84일간의 증체량 역시 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 각각 나타내었다. 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해 현저한 증체량의 감소가 인정되었고, fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 증체량의 변화를 나타내었다 (도 9, 표 7).
투여기간 84일 동안의 증체량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 308.04%의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -75.82, -64.11, -55.36, -69.37, -61.60 및 -57.44% 의 변화를 나타내었다.
[표 7]
Figure 112015050633917-pat00007
2-2. 평균 사료 섭취량의 변화
정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 평균 사료 섭취량의 감소가 모든 HFD 공급군에서 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 의미 있는 평균 사료 섭취량의 변화는 심바스타틴 10 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서 인정되지 않았다 (상기 표 7).
평균 사료 섭취량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -21.31% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 0.67, -0.77, 1.46, 1.43, 4.70 및 2.04% 의 변화를 나타내었다.
2-3. 체지방 및 복부 지방량의 감소 확인
HFD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체지방 및 복부 축적 지방량의 증가가 인정된 반면, OH 400 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 체지방 및 복부 축적 지방량의 유의성 있는 (p<0.01) 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 체지방 및 복부 지방량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 체지방 및 복부 지방량의 변화는 인정되지 않았다 (도 10 및 13).
체지방 량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 222.44% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -51.42, -37.48, -30.70, -53.73, -46.76 및 -30.86% 의 체지방량의 변화를 나타내었다.
복부 지방량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 227.17% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -49.54, -36.89, -20.79, -50.99, -42.39 및 -22.34% 의 변화를 각각 나타내었다.
2-4. 난소주위축적 지방 중량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 축적 지방의 상대 및 절대 중량의 증가 인정되었으나, fOH 400 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 축적 지방 중량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 축적 지방 상대 및 절대 중량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 난소주위 축적 지방 중량의 변화는 인정되지 않았다 (표 8 및 9; 도 10).
난소주위 축적 지방의 절대 및 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 2314.91 및 1489.41% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -84.28, -76.23, -55.14, -75.69, -71.50 및 -57.25% 의 절대 중량의 변화를 나타내었고, -78.62, -68.91, -41.93, -66.77, -62.65 및 -45.98% 의 난소주위 축적 지방 상대 중량의 변화를 각각 나타내었다.
2-5. 복벽 축적 지방 중량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우 난소주위 축적 지방 중량의 변화와 유사하게, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 복벽 축적 지방의 상대 및 절대 중량의 증가 인정되었으나, 메트포르민 250 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 복벽 축적 지방 중량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 복벽 축적 지방 상대 및 절대 중량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 복벽 축적 지방 중량의 변화는 인정되지 않았다 (표 8 및 9; 도 10).
복벽 축적 지방의 절대 및 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 908.46 및 554.26%의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -75.90, -57.17, -42.79, -77.46, -70.86 및 -44.01% 의 절대 중량의 변화를 나타내었고, -67.13, -44.55, -25.73, -69.20, -61.41 및 -28.78% 의 복벽 축적 지방 상대 중량의 변화를 각각 나타내었다.
[표 8]
Figure 112015050633917-pat00008
[표 9]
Figure 112015050633917-pat00009
2-6. 난소주위 및 복벽 축적 지방의 조직병리학적 변화
지방축적은 비만시 초래되는 가장 일반적인 현상으로 조직병리학적 검사시 지방세포의 비대가 초래되는 것으로 알려져 있다 [DiGirolamo et al., Am J Physiol. 1998;274:R1460-7; Morange et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000;20:1150-4.; Jung et al., Nutr Res. 2011;31:387-96.]. 지방조직은 단순 에너지 저장소로서의 역할 뿐만 아니라 내분비와 분비를 동시에 수행하는 장기이며, adipokine을 분비하는 것으로 알려져 있고, 이들의 분비 변화는 비만과 인슐린 저항성과 같은 복합적인 질병을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다 [Fujita et al., Endocr J. 2005;52:427-33.; Mitchell et al., Reproduction. 2005;130:583-97.; Kang et al., Nutrients. 2014;6:3536-71.].
본원의 실험 결과를 살펴보면, HFD 대조군의 경우, 현저한 지방세포의 비대가 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 및 복벽 축적 지방조직의 두께 및 지방세포 직경의 증가가 각각 인정되었으나, 메트포르민 250 mg/kg 투여군을 포함한 모든 6종의 실험 물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 난소주위 축적 지방 두께 및 지방세포 직경의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 난소주위 및 복벽 축적 지방조직의 두께 및 지방세포 직경의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 난소주위 및 복벽 축적 지방조직의 두께 및 지방세포 직경의 변화는 각각 인정되지 않았다 (표 10, 도 11).
난소주위 축적 지방조직의 두께 및 지방세포 평균 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 289.26 및 207.47%의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -51.09, -44.87, -27.65, -49.68, -39.77 및 -28.83%의 축적 지방 두께의 변화를 나타내었고, -47.84, -40.05, -33.38, -63.96, -52.29 및 -33.59% 의 지방세포 평균 직경의 변화를 각각 나타내었다.
복벽 축적 지방조직의 두께 및 지방세포 평균 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 213.76 및 175.09% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -49.70, -32.24, -22.81, -51.89, -44.92 및 -22.96% 의 축적 지방 두께의 변화를 나타내었고, -39.21, -33.88, -24.19, -50.24, -42.14 및 -26.05% 의 지방세포 평균 직경의 변화를 각각 나타내었다.
[표 10]
Figure 112015050633917-pat00010
2-7. 췌장 외분비부 Zymogen과립의 조직병리학적 변화
췌장 외분비부의 zymogen 과립은 주로 지방과 단백질의 소화에 관여하는 효소를 함유하고 있으며 [Gartner and Hiatt, 2007], 비만시 췌장은 지방축적과 함께 이들 zymogen과립의 현저한 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다 [Wilson et al., Dig Dis Sci. 1988;33:1250-9; Kang et al., Nutrients. 2014;6:3536-71.].
본원의 실험 결과를 살펴보면, HFD대조군의 경우, 외분비 세포로부터 zymogen과립의 분비증가가 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 췌장 외분비 중 zymogen과립이 차지하는 비율의 감소가 인정되었다. HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 현저한 축적 zymogen 과립의 감소가 조직병리학적으로 초래되어, 지방 소화에 관여하는 췌장 효소의 분비가 촉진된 것으로 판단되며, 이에 따라 지방흡수 증가에 의한 비만 소견이 인정된 것으로 생각된다.
그런데, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) zymogen 과립이 차지하는 비율의 증가가 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 췌장 외분비 중 zymogen과립이 차지하는 비율의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 췌장 zymogen과립의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았으며, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군과 비교하여 유의성 있는 췌장 외분비 중 zymogen과립이 차지하는 비율의 변화는 인정되지 않았다 (표 11, 도 12).
췌장 외분비 중 zymogen과립이 차지하는 비율은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -71.57% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 15.00, 221.95, 76.22, 222.40, 153.73 및 76.53%의 변화를 나타내었다.
[표 11]
Figure 112015050633917-pat00011
종합하면, HFD대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 체중의 증가가 고지방사료 공급 7일 후부터 인정되었으며, 1주일간의 HFD 적응기간 및 84일간의 실험물질 투여기간 동안의 증체량 역시 각각 정상 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다. 그런데 이러한 체중 및 증체량의 증가가 fOH 400, 200 및 100 mg/kg, 투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었으며, OH 400 mg/kg, 심바스타틴 10 mg/kg 및 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 감소가 각각 인정되었다. 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해 현저한 증체량의 감소가 인정되었고, fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 증체량의 변화를 나타내었다. 또한, 본 실험의 결과, fOH 400, 200 및 100 mg/kg은 HFD 마우스의 지방축적, 지방세포 비대를 유의적으로 억제하였으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 지방 축적 및 지방세포 비대 억제 효과의 증가를 나타내어, 유산균 발효는, OH의 비만 개선 효과를 상승적으로 증가시키는 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg은 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 항비만 효과를 HFD 마우스에서 나타내었으며, 심바스타틴 10 mg/kg 및 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 현저한 지방 축적 및 지방세포 비대 억제가 인정되었다. 또한, 조직병리학적으로 췌장내 zymogen 과립이 차지하는 비율 역시 fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었으며, 특히 fOH 추출물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 췌장 내zymogen 함량의 증가가 각각 인정되었다.
실시예 3. 유산균발초 천년초 추출물의 항당뇨 효과 확인
혈당의 증가는 당뇨병의 가장 기본적인 현상으로 [Sathishsekar and Subramanian, Biol Pharm Bull. 2005;28:978-83; Jung et al., Nutr Res. 2011;31:387-96.], HFD 공급 마우스 역시 전형적인 Type 2 당뇨병 모델로 현저한 고혈당 상태를 나타내고 있으며 [Yun et al., Arch Pharm Res. 2004;27:790-6.], Type 2 당뇨병이 진행됨에 따라, 인슐린 저항의 일환으로 혈중 insulin 함량의 증가와 함께 장기간의 고혈당에 수반되는 HbA1c 함량의 증가가 일반적으로 초래된다 [Chung et al., Nutrients. 2014;6:4610-24.]. 이와 함께 혈당의 항상성 유지를 위한 노력으로 췌장섬의 증생과 확장, insulin과 glucagon 생산세포, insulin/glucagon 세포의 증가가 조직병리학적으로 초래된다[Milburn et al., J Biol Chem. 1995;270:1295-9; Terauchi et al., J Clin Invest. 2007;117:246-57.], 본 실험에서는 상기의 관점에서 유산균발효 천년초추출물의 항당뇨효과를 확인하여 보았다.
3-1. 혈당의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈당의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 유의성 없는 혈당의 경미한 증가를 나타낸 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외하고, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈당의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈당의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈당의 변화는 인정되지 않았다 (표 12).
혈당은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 208.84% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 11.00, -43.27, -34.01, -57.18, -53.54 및 -35.75% 의 변화를 나타내었다.
[표 12]
Figure 112015050633917-pat00012
3-2. 혈중 인슐린 함량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 인슐린 함량의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 인슐린 함량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 인슐린 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 인슐린 함량의 변화는 인정되지 않았으며, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군과 유사한 혈중 인슐린 함량의 변화를 나타내었다 (도 13).
혈중 인슐린 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 257.99% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 2.04, -45.49, -22.70, -57.90, -43.06 및 -23.28% 의 변화를 나타내었다.
3-3. 혈중 HbA1c 비율의 감소 확인
HbA1c은 장기간의 고혈당에 노출된 적혈구에서 생산되며, 임상적으로 장기간의 고혈당을 판단하는 중요한 지표로 사용되고 있다 [Larsen et al., N Engl J Med. 1990;323:1021-5.].
본원의 실험을 살펴보면, HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HbA1c 비율의 증가가 인정되었으나, HFD 대조군과 유사한 혈중 HbA1c 비율의 변화를 나타내 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HbA1c 비율의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HbA1c 비율의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 HbA1c 비율의 변화는 인정되지 않았다 (도 13).
혈중 HbA1c 비율은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 86.33% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 1.95, -22.62, -19.37, -39.82, -31.74 및 -20.75% 의 변화를 나타내었다.
3-4. 췌장 상대 중량의 증가 확인
정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 췌장 상대 중량의 감소가 HFD 대조군에서 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 췌장 상대 중량의 증가가 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서 각각 인정되었으며, fOH 100 mg/kg 투여군에서도 유의성은 인정되지 않았으나, HFD 대조군에 비해 현저한 췌장 상대 중량의 증가가 관찰되었다. 한편 정상 대조군에 비해 의미 있는 췌장 절대 중량의 변화는 모든 HFD 공급군에서 인정되지 않았으며, OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 췌장 중량의 변화 역시 모든 세 용량의 fOH 투여군에서 인정되지 않았다 (표 8 및 9).
췌장 절대 및 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 0.70 및 -33.34% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -2.36, -2.45, -4.89, -4.28, -0.87 및 -4.63% 의 절대 중량의 변화를 나타내었고, 31.22, 24.92, 20.38, 28.30, 28.10 및 18.15% 의 췌장 상대 중량의 변화를 각각 나타내었다.
3-5. 췌장섬의 일반 조직병리학적 변화
HFD 대조군의 경우, 현저한 췌장섬의 증식이 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 췌장섬의 수 및 평균 직경의 증가가 인정되었으나, OH 400 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 췌장섬의 수 및 직경의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 췌장섬의 수 및 직경의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 췌장섬의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다 (표 11, 도 12).
단위 면적당 평균 췌장섬의 수 및 평균 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 277.78 및 182.99% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -47.65, -43.53, -27.65, -48.24, -44.12 및 -29.41% 의 췌장섬의 수적 변화를 나타내었고, -38.56, -41.26, -37.76, -63.82, -52.12 및 -38.21% 의 췌장섬 평균 직경의 변화를 각각 나타내었다.
3-6. 췌장섬의 면역조직화학적 변화
HFD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 인슐린 및 글루카곤 면역반응세포의 수적 증가와 인슐린/글루카곤 세포 비율의 증가를 나타내었으나, fOH 100 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 인슐린 및 글루카곤 면역반응세포의 수적 감소와 인슐린/글루카곤 세포 비율의 감소가 각각 인정되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 췌장섬내 인슐린 및 글루카곤 면역반응세포의 정상화가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 추출물 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 췌장섬내 인슐린 및 글루카곤 면역반응세포의 수적 변화 및 이들의 비율의 변화는 인정되지 않았다 (표 11, 도 14).
단위 면적당 인슐린 면역반응세포의 수는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 365.82% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -51.89, -66.99, -24.32, -55.29, -47.38 및 -26.49% 의 변화를 나타내었다.
단위 면적당 글루카곤 면역반응세포의 수는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 100.10% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -39.04, -49.78, -13.06, -35.28, -27.07 및 -14.55% 의 변화를 나타내었다.
인슐린/글루카곤 면역반응세포의 비율은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 133.80% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -20.74, -34.29, -13.15, -30.77, -27.59 및 -13.90% 의 변화를 나타내었다.
종합하여 보면, 본 실험의 HFD 대조군에서는 현저한 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1c 함량의 증가와 함께 췌장섬의 수적 증가와 확장, insulin, glucagon 및 insulin/glucagon 세포의 증가가 조직병리학적으로 인정되어, 전형적인 insulin 저항성 type II 당뇨병이 유발되었다. 그런데 fOH 400, 200 및 100 mg/kg은 HFD 공급에 의한 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1cHbA1c 함량, 췌장 내분비 부분의 조직학적 및 면역 조직학적 변화 역시 투여 용량 의존적으로 억제하는 것으로 관찰되었고, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1c 함량의 감소와 췌장섬의 수적 감소와 확장 억제, insulin, glucagon 및 insulin/glucagon 세포의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는 유산균 발효에 의해 췌장 내분비부 조절을 통한 OH 혈당 개선 효과가 상승적으로 증가되는 직접적인 증거로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1c 함량, 췌장 내분비부의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다. 본 실험에서 대조약물로 사용한 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1c 함량의 감소와 췌장섬의 수적 감소와 확장 억제, insulin, glucagon 및 insulin/glucagon 세포의 감소가 인정되었고, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 췌장섬의 수적 감소와 확장 억제, insulin, glucagon 및 insulin/glucagon 세포의 감소가 인정되었으나, 혈중 glucose, insulin 및 HbA1c 함량은 HFD 대조군과 유사한 것으로 관찰되었다.
실시예 4. 유산균발초 천년초 추출물의 고지혈증에 대한 효과 확인
고혈당 상태가 지속됨에 따라 합병증의 형태로 고지혈증이 초래되며 [Chen et al., J Food Sci. 2009;74:C469-74] 일반적으로, 고지혈증시 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량 증가와 함께 HDL 감소가 문제시 되고 있다 [Kamada et al., Dig Liver Dis. 2005;37:39-43.]. 따라서 본원 실험에서는, 항고지혈증 효과를 혈중 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량 감소와 함께 HDL함량의 증가 여부로 살펴보았다.
4-1. 혈중 TC 함량의 감소 효과
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 TC 함량의 증가가 인정되었으나, fOH 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중TC 함량의 감소가 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중TC 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중TC 함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 12).
혈중 TC 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 135.44% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -46.17, -30.04, -19.96, -44.96, -40.50 및 -21.36% 의 변화를 나타내었다.
4-2. 혈중 TG함량의 감소 효과
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 TG 함량의 증가가 인정되었으나, fOH 100 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중TC 함량의 감소가 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중TG 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중TG 함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 12).
혈중 TG 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 365.04% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -45.84, -38.80, -17.38, -51.90, -32.90 및 -18.35% 의 변화를 나타내었다.
4-3. 혈중 LDL함량의 감소 효과
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 LDL함량의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중LDL 함량의 감소가 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중LDL 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중LDL 함량의 변화는 인정되지 않았다(표 12).
혈중 LDL 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 184.88% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -52.24, -44.49, -29.80, -48.16, -41.22 및 -31.84% 의 변화를 나타내었다.
4-4. 혈중 HDL 함량의 증가 효과
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HDL함량의 감소가 인정되었으나, 메트포르민 250 mg/kg투여군을 포함한 모든 후보물질 투여군에서는 HFD대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 HDL 함량의 증가가 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 HDL 함량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 HDL 함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 12).
혈중 HDL 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -66.50% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 170.20, 87.37, 71.21, 172.73, 141.41 및 68.69% 의 변화를 나타내었다.
4-5. 분변 중 TC 및 TG 함량의 증가 확인
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 없는 경미한 분변 중 TC 및 TG 함량의 증가가 인정되었으나, fOH 400 mg/kg 투여군을 포함한 모든 후보물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 분변 중 지질 함량의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 분변 중 지질 함량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 분변 중 TC 및 TG 함량의 변화는 인정되지 않았다 (도 15).
분변 중 TC 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 6.69% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 114.94, 94.83, 70.30, 136.90, 110.15 및 71.40% 의 변화를 나타내었다.
분변 중 TG함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 7.67% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 193.16, 151.85, 98.29, 253.28, 211.97 및 99.72% 의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과, fOH 400, 200 및 100 g/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 현저한 혈중 LDL, TG 및 TC 함량 감소와 함께 HDL함량의 증가가 투여 용량 의존적으로 인정되어, fOH가 비만 또는 당뇨 합병증으로 초래되는 고지혈증을 현저히 억제하는 것으로 관찰되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 혈중 지질 함량의 감소가 HDL 함량의 증가와 함께 인정되었으므로, OH의 항고지혈증 효과가 유산균 발효에 의해 현저히 상승되는 것으로 생각된다. 또한 OH 및 fOH 에 의한 항고지혈증 소견은, 분변 TC 및 TG 함량의 증가와 함께, 췌장 외분비부의 zymogen 함량의 조직병리학적 증가를 동반하였으므로, 췌장의 소화 효소 분비 조절을 통한 지질의 소화 억제 및 흡수 저하에 따른 지질 분비 증가에 의한 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 지질 함량의 변화는 인정되지 않았으며, 메트포르민 250 mg/kg 및 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성 혈중 LDL, TG 및 TC 함량 감소와 함께 HDL함량의 증가가 인정되었다.
실시예 5. 유산균발초 천년초 추출물의 간 손상에 미치는 효과 확인
당뇨병이 진행됨에 따라, 섬유화 및 비정상적인 해당작용에 의한 간세포의 손상에 의해 간 중량의 증가와 함께 간세포의 지방 축적과 변성에 따른 혈중 AST 및ALT 함량의 증가, 즉 당뇨병성 간병증이 유발되며 [Quine and Raghu, Pharmacol Rep. 2005;57:610-5]된다. SGOT로 알려진 AST와 SGPT로 알려진 ALT는 간 손상을 측정하는 가장 일반적인 혈액화학 수치[Sodikoff, A guide to laboratory diagnosis. 2nd ed., Mosby: St. Louise, 1995:1-36.]이므로, 본원 실험에서는 간중량 증가와 더불어 상기 수치에 대해 살펴보았다.
5-1. 간 중량의 감소 확인
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 중량의 증가 인정되었으나, fOH 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 중량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 중량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 정상 대조군에 비해 의미 있는 간 상대 중량의 변화는 모든 HFD 공급군에서 인정되지 않았으며, OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 중량의 변화 역시 모든 세 용량의 fOH 투여군에서 인정되지 않았다 (표 8 및 9).
간 절대 및 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 43.16 및 -5.32% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -27.02, -23.09, -19.17, -29.61, -28.33 및 -21.94% 의 절대 중량의 변화를 나타내었고, -1.67, -2.48, 2.86, -5.03, -7.88 및 -2.67% 의 간 상대 중량의 변화를 각각 나타내었다.
5-2. 혈중 AST함량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST함량의 증가를 나타내었으나, fOH 100 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 AST함량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 AST함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 AST함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 13).
혈중 AST 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 198.41% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -51.60, -43.24, -20.74, -51.52, -41.19 및 -21.73% 의 변화를 나타내었다.
[표 13]
Figure 112015050633917-pat00013
5-3. 혈중 ALT함량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 ALT함량의 증가를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 ALT함량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 ALT함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 ALT함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 13).
혈중 ALT 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 399.49% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -59.76, -41.97, -24.19, -58.64, -46.65 및 -25.61% 의 변화를 나타내었다.
5-4. 간 지방변화율의 조직병리학적 변화
HFD 대조군의 경우, 현저한 간 세포내 지방축적에 의한 간세포 비대를 특징으로 하는 지방간 소견이 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지방변화율의 증가가 인정되었으나, 메트포르민 250 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지방변화율의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 지방변화율의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 유의성 있는 지방변화를 나타내는 간 실질의 비율 변화는 인정되지 않았다 (표 14, 도 16).
간 지방변화율 (지방변화를 나타내는 실질의 비율)은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 925.87% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -55.09, -49.37, -26.87, -72.77, -57.97 및 -28.00% 의 변화를 나타내었다.
[표 14]
Figure 112015050633917-pat00014
5-5. 간 세포 직경의 조직병리학적 변화
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간세포 직경의 증가가 인정되었으나, OH 400 mg/kg 투여군을 포함한 모든 후보물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 평균 간세포 직경의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간세포 직경의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 평균 간세포 직경의 변화를 나타내었다 (표 14, 도 16).
간세포 직경은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 157.39% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -49.24, -38.98, -33.44, -52.51, -47.46 및 -34.32% 의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과, fOH 400, 200 및 100 mg/kg은 간 절대 중량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가를 투여 용량 의존적으로 억제 하였고, 조직병리학적 검사결과, 간의 지방변화와 이로 인한 간세포의 비대 역시 투여 용량 의존적으로 현저히 억제하는 것으로 관찰되어, 당뇨병성 간병증을 효과적으로 차단하였다. 특히, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 당뇨병성 간 손상의 억제 소견이 인정되었으므로, OH의 간 지방병증에 대한 보호 효과가 유산균 발효에 의해 현저히 상승되는 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 간 보호 효과를 나타내었으며, 메트포르민 250 mg/kg 및 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서도 각각 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 간 절대 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소와 함께 간 지방병증의 감소가 조직병리학적으로 인정되었다.
실시예 6. 유산균발초 천년초 추출물의 신장 손상에 미치는 효과 확인
당뇨병 상태가 만성화함에 따라 사구체 위축과 섬유화, 염증세포 침윤 및 세뇨관 괴사와 이에 따른 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가를 주요 증상으로 하는 당뇨병성 신병증이 초래된다 [Kim et al., Nutrients. 2013;5:4316-32.; Kang et al., Nutrients. 2014;6:3536-71]. 이중 혈중 BUN과 creatinine 함량은 신장의 상태를 나타내는 가장 대표적인 혈액화학 수치이다 [Sodikoff, 1995]. 본원 실험에서는 신장 중량과 함께 이들 수치에 대하여 살펴보았다.
6-1. 신장 중량의 감소 확인
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 중량의 증가 인정되었으나, fOH 400 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 절대 중량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 신장 절대 중량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 신장 상대 중량의 감소가 HFD 대조군에서 인정되었으나, HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 신장 상대 중량의 증가를 나타낸 OH 400 mg/kg 투여군을 제외하고, 모든 실험물질 투여군에서 HFD 대조군과 비교하여 유의성 있는 신장 상대 중량의 변화는 인정되지 않았으며, OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 신장 상대 중량의 변화 역시 모든 세 용량의 fOH 투여군에서 인정되지 않았다 (표 8 및 9).
신장 절대 및 상대 중량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 각각 31.22 및 -13.39% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -21.38, -16.25, -9.81, -22.04, -20.94 및 -10.47% 의 절대 중량의 변화를 나타내었고, 5.88, 7.44, 14.70, 4.98, 2.32 및 11.73%의 신장 상대 중량의 변화를 각각 나타내었다.
6-2. 혈중 BUN함량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 BUN함량의 증가를 나타내었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 BUN함량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 BUN함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 BUN함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 13).
혈중 BUN함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 192.02% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -43.35, -38.25, -26.05, -54.10, -48.09 및 -27.50% 의 변화를 나타내었다.
6-3. 혈중 Creatinine함량의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 크레아티닌 함량의 증가를 나타내었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 크레아티닌 함량의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 크레아티닌 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 혈중 크레아티닌 함량의 변화는 인정되지 않았다 (표 13).
혈중 크레아티닌 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 228.21% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -53.91, -39.84, -25.00, -56.25, -48.44 및 -27.34% 의 변화를 나타내었다.
6-4. 신장 조직병리학적 변화
HFD 대조군의 경우, 지방소적 축적에 의한 세뇨관 공포화를 특징으로 하는 신장 변성 소견이 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 변성 세뇨관 수의 증가가 인정되었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 변성 세뇨관의 수적 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 변성 세뇨관 수의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 신장의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다 (표 14, 도 17).
지방소적 축적에 의한 세뇨관 공포화를 특징으로 하는 변성 세뇨관 수는 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 2950.00% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -44.96, -34.89, -26.93, -75.64, -67.68 및 -27.63% 의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과, HFD 대조군에서는 신장 절대 중량의 현저한 증가와 함께 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가가 인정되었고, 지방 소적의 침윤을 특징으로 하는 세뇨관 공포화 소견이 조직병리학적으로 인정되었으나, 이러한 당뇨병성 신병증 소견이 fOH 400, 200 및 100 mg/kg투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었다. 특히, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 당뇨병성 신병증 억제 소견이 인정되었으므로, 유산균 발효에 의해 OH 의 신장 보호 효과가 현저히 상승되는 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 신장 보호 효과가 인정되었으며, 심바스타틴 10 mg/kg 및 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 신장 절대 중량, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 감소와 함께 변성 세뇨관의 수적 감소가 조직병리학적으로 각각 인정되었다.
실시예 7. 유산균발초 천년초 추출물의 간 항산화 방어 시스템에 미치는 영향
근래의 연구 결과에 따르면, 당뇨 및 당뇨 합병증의 유발에 free radical에 의한 항산화 방어기전의 억제가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 [Garg et al., Indian J Exp Biol. 1997;35:264-6.], oxidative stress에 의한 세포 손상이 여러 가지 당뇨 합병증의 유발과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다 [Ceriello et al., Diabet Med. 1992;9:297-9.]. 특히, 내인성 항산화제의 억제와 함께 oxidative stress의 증가는 당뇨병시 더 많은 free radical을 형성하고 [Collier et al., Diabet Med. 1990;7:27-30. ], 이렇게 형성된 free radical 들은 당뇨 합병증의 주 원인이 된다 [Giugliano et al., Diabetes Care. 1996;19:257-67.]. 지질 과산화에 의해 형성되는 다양한 유독성 물질, 특히 활성 산소류 (Reactive oxygen species; ROS)는 주변 조직의 파괴를 초래하는 것으로 알려져 있고 [Comporti, Lab Invest. 1985;53:599-623.], 당뇨병성 마우스에서도 간과 같은 주요 실질 장기에서 지질 과산화의 증가가 비교적 잘 알려져 있다 [Lee et al., Nutr Res Pract. 2009;3:156-61.; ]. GSH는 대표적인 내인성 항산화제로, 세포내에서 형성되는 활성 산소류를 감소시켜 다양한 조직 손상을 억제하는 것으로 알려져 있어, 조직에서 대표적인 항산화 인자로 작용한다 [Odabasoglu et al., J Ethnopharmacol. 2006;103:59-65.]. 또한 SOD 는 세포내의 대표적인 항산화 효소로 세포에서 다양한 산화 물질을 제거하는 역할을 담당하며, CAT 역시 강력한 활성 산화 물질인 H2O2를 H2O로 변환 시키는 효소이다 [Cheeseman and Slater, Br Med Bull. 1993;49:481-493.]. 따라서 지질과산화, GSH 함량의 감소, SOD 및 catalase 활성의 억제는 당뇨 및 관련 합병증의 치료에 있어 매우 중요한 위치를 차지하고 있다 [Erejuwa et al., . Int J Mol Sci. 2011;12:829-43]. 이에, 본원 실험에서는 본원 추출물의 항산화 효과를 살펴보았다.
7-1. 지질 과산화의 감소 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지질 과산화의 증가, 즉 MDA 함량의 증가가 인정되었으나, fOH 100 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 지질 과산화의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직내 MDA 함량의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 지질 과산화의 변화는 인정되지 않았다 (표 15).
간 조직내 MDA 함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 148.73% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -37.11, -25.98, -23.93, -44.59, -38.39 및 -25.35% 의 변화를 나타내었다.
[표 15]
Figure 112015050633917-pat00015
7-2. GSH 함량의 증가 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 내인성 항산화제인 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) GSH 함량의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직내 GSH 함량의 증가가 각각 인정되었다. fOH 100 mg/kg 투여군은 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 간 GSH 함량의 변화를 나타내었다 (표 15).
간 조직내 GSH함량은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -63.47%의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 44.12, 43.03, 33.58, 107.09, 72.09 및 33.80% 의 변화를 나타내었다.
7-3. CAT 활성의 증가 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 내인성 항산화 효소인 CAT 활성의 감소가 인정되었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) CAT 활성의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 CAT 활성의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 간 CAT 활성의 변화를 나타내었다 (표 15).
간 조직내 CAT 활성은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -67.43% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 87.45, 71.00, 50.69, 95.17, 83.35 및 51.87% 의 변화를 나타내었다.
7-4. SOD 활성의 증가 확인
HFD대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 내인성 항산화 효소인 SOD 활성의 감소가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) SOD 활성의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 SOD 활성의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 SOD 활성의 변화는 인정되지 않았다 (표 15).
간 조직내 SOD활성은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -61.29% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 98.98, 91.02, 50.34, 99.15, 87.29 및 51.86% 의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과에서도, 이전의 연구들 [Chung, et al., Nutrients. 2014;6:4610-24.]에서와 유사하게, HFD 대조군에서는 지질 과산화에 의한 간 실질내 MDA 함량의 증가와 함께, 내인성 항산화제, GSH 함량의 감소, 내인성 항산화 활성 효소인 SOD 및 CAT 활성의 감소가 초래되었다. 한편 이러한 항산화 방어 시스템의 교란과 이와 관련된 지질 과산화 소견이 fOH 400, 200 및 100 mg/kg투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었으며, 특히, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 당지질 과산화의 억제와 항산화 방어 시스템의 활성 소견이 인정되었다. 따라서 유산균 발효에 의해 OH의 항산화 방어시스템의 활성을 통한 간 및 신장 보호 효과가 현저히 상승되는 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 항산화 방어 시스템의 활성과 지질 과산화 억제 소견이 인정되었고, 심바스타틴 10 mg/kg 및 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군과 비교하여 유의성 있는 간 조직내 MDA의 감소, GSH 함량의 증가와 함께 CAT 및 SOD 활성의 증가가 각각 인정되었다.
실시예 8. 유산균발초 천년초 추출물의 당대사 관련 간 효소활성의 변화
GK는 혈당 조절을 담당하는 대표적인 간 조직내 효소로, 혈당의 에너지로의 활용을 촉진하거나, 간 조직내 glycogen으로의 저장을 유발하여, 혈당을 감소 [Ferre et al., FASEB J. 1996;10:1213-8.]시키는 반면, G6pase 및 PEPCK는 당신생과 관련된 간 조직내의 또 다른 효소로 간 조직내에서 당분의 방출을 유도하여, 혈당을 증가시킨다 [She et al., Mol Cell Biol. 2000;20:6508-17.]. 일반적으로 고혈당 상태가 초래됨에 따라, HFD 공급 마우스에서는 현저한 GK 활성의 감소와 함께 G6pase 및 PEPCK 활성의 증가가 수반되어 왔다 [Chung et al., Nutrients. 2014;6:4610-24.]. 따라서 본원 실험에서는 이들 효소의 활성 변화를 살펴보았다.
8-1. 간 조직내 GK 활성의 증가 확인
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 당 분해효소인 간 GK활성의 감소가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직내 GK 활성의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 GK 활성의 증가가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 GK 활성의 변화는 인정되지 않았으며, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군과 유사한 간 조직내 GK 활성의 변화가 관찰되었다 (표 16).
간 조직내 GK 활성은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 -29.71% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 2.65, 20.26, 16.05, 43.42, 33.09 및 16.29% 의 변화를 나타내었다.
8-2. 간 조직내 G6pase 활성의 감소 효과
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 당 합성 효소인 간 G6pase 활성의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 G6pase 활성의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 G6pase 활성의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 G6pase 활성의 변화는 인정되지 않았으며, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군과 유사한 간 조직내 G6pase 활성의 변화가 관찰되었다 (표 16).
간 조직내 G6pase 활성은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 45.64% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -4.78, -17.44, -16.15, -30.06, -23.58 및 -16.88% 의 변화를 나타내었다.
8-3. 간 조직내 PEPCK 활성의 변화
HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 당 합성 효소인 간 PEPCK 활성의 증가가 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 PEPCK 활성의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직내 PEPCK 활성의 감소가 각각 인정되었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 간 PEPCK 활성의 변화는 인정되지 않았으며, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에 서는 HFD 대조군과 유사한 간 조직내 PEPCK 활성의 변화가 관찰되었다 (표 16).
간 조직내 PEPCK 활성은 HFD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 109.63% 의 변화를 나타내었으나, 심바스타틴 10 mg/kg, 메트포르민 250 mg/kg, OH 400 mg/kg, fOH 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군에 비해 각각 -0.63, -33.33, -21.26, -42.52, -36.03 및 -22.88% 의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과에서도 HFD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 간 조직내 GK 활성의 감소와 함께 G6pase 및 PEPCK 활성의 증가가 각각 인정되었다. 한편 이러한 간 조직내 당대사 관련 효소인 GK, G6pase 및 PEPCK 활성의 변화가 fOH 400, 200 및 100 mg/kg투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었으며, 특히, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 GK 활성의 증가와 함께 G6pase 및 PEPCK 활성의 감소가 인정되었다. 따라서 유산균 발효에 의해 OH의 당대사 관련 효소 조절 효과가 현저히 상승되는 것으로 판단된다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 유사한 간 조직내 당대사 관련 효소의 활성 변화를 나타내었으며, 메트포르민 250 mg/kg 투여군에서도 HFD 대조군과 비교하여 유의성 있는 간 조직내 GK 활성의 증가와 함께 G6pase 및 PEPCK 활성의 감소가 각각 인정되었으나, 심바스타틴 10 mg/kg 투여군에서는 HFD 대조군과 유사한 간 조직 내 당대사 관련 효소 활성의 변화가 인정되었다.
[표 16]
Figure 112015050633917-pat00016

이상에서, 유산균 (Lactobacillus plantarum) 발효는 간 조직내 당대사 관련 효소 활성의 조절, 항산화 및 췌장 지방 소화 효소 분비 조절을 통한 Type II 당뇨병 및 관련 합병증에 대한 OH 의 개선 효과를 상승적으로 증가시키는 것으로 관찰되었다. 즉, fOH 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군에 비해 서도 유의성 있는 항산화 효과의 증가와 함께 당뇨 및 관련 비만, 고지혈증, 간 및 신장 병증 개선 효과의 증가를 나타내었다. 한편 fOH 100 mg/kg 투여군에서는 OH 400 mg/kg 투여군과 비교하여 의미 있는 약효 상승 효과는 인정되지 않았으며, fOH 400 mg/kg 은 심바스타틴 10 mg/kg 투여군과 유사한 혈중 지질 저하 효과를 나타내었고, fOH 200 mg/kg은 메트포르민 250 mg/kg 투여군과 유사한 항당뇨 및 당뇨 합병증에 대한 개선 효과를 나타내었다. 심바스타틴 10 mg/kg은 HFD 대조군과 비교하여, 혈당, 혈중 insulin 및 HbA1c 함량, 간 조직내 당대사 관련 효소 활성 및 췌장 외분비부에서 zymogen 과립이 차지하는 비율에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 따라서 fOH는, 새로운 효과적인 고지혈증 개선 또는 치료제로 의의가 클 뿐만 아니라, 당뇨 및 합병증 개선제 또는 치료제로서도 의의가 클 것으로 기대된다.
제제예 1. 액제의 제조
발효물 또는 그 추출물 10,000mg
설탕 200mg
이성화당 100mg
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예 2. 건강 음료의 제조
발효물 또는 그 추출물 10,000mg
구연산 1000mg
올리고당 100g
메실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
제제예 3. 건강 식품의 제조
발효물 또는 그 추출물 5000mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70mg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산칼슘 0.5mg
비타민 E 1.0mg
무기질 혼합물 적량
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산 마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립 제형의 건강식품을 제조하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

  1. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균으로 발효된 천년초 발효물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인, 지방간 개선용 식품 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 음료 또는 식품첨가제로 제공되는 것인, 지방간 개선용 식품 조성물.
  4. 천년초 발효물의 제조방법으로서,
    물에 천년초를 1 내지 4 중량%로 혼합하고 여기에 비스코자임 또는 엿기름 중 하나 이상의 복합 다당류 분해 효소를 0.01~10% (v/v)로 추가하여 천년초를 전처리 하는 단계;
    상기 전처리된 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, L.p) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus GG, L.GG)의 복합 유산균 1:1의 중량비로 접종하는 단계로, 상기 락토바실러스 플란타룸은 0.8x107 CFU/ml 내지 1.0x109 CFU/ml로 포함되고, 상기 1:1의 중량비의 복합 유산균 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 람노서스는 1.0x109 CFU/ml 내지 1.2x107 CFU/ml로 포함되고, 그리고
    상기 접종물을 35℃~37℃에서 교반하면서 5-10 일간 배양하는 단계를 포함하는, 유산균을 이용한 천년초 발효물의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 배양하는 단계 후에, 10~15℃에서 5 내지 15일간 숙성시키는 숙성 단계를 추가로 포함하는, 유산균을 이용한 천년초 발효물의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 배양 단계 후에 또는 상기 숙성 단계 후에 상기 발효물 또는 그 추출물을 열수 또는 에탄올로 추출하는 단계를 추가로 포함하는, 유산균을 이용한 천년초 발효물의 제조 방법.
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