KR102407042B1 - 젖산균 및 효소를 이용한 천년초 발효액의 제조방법 - Google Patents

젖산균 및 효소를 이용한 천년초 발효액의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1) 세절한 후 살균한 천년초와 설탕 용액을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액과 효소를 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천년초 효소 발효액의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 천년초 효소 발효액에 관한 것이다.

Description

젖산균 및 효소를 이용한 천년초 발효액의 제조방법{Method for producing Opuntia humifusa fermented solution using lactic acid bacteria and enzyme}
본 발명은 젖산균 및 효소를 이용한 천년초 효소 발효액의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 젖산균 및 효소를 이용한 천년초 효소 발효액에 관한 것으로, 본 발명의 천년초 효소 발효액은 수율이 높고, 플라보노이드, 이소람네틴 및 퀘르세틴 등과 같은 기능성 성분과 항산화 및 항당뇨 활성과 같은 생리활성 효과가 증진된 고품질의 발효액을 제공할 수 있다.
천년초(Opuntia humifusa)는 손바닥 선인장과에 속하며 백년초와는 달리 영하 20℃의 혹한과 환경 속에서도 생존이 가능하여 수년에서부터 수십년 동안 경작할 수 있는 다년생 식물로써, 예로부터 식품대용이나 식용으로 사용되어 왔다. 천년초는 인체에 중요한 각종 영양성분인 식이섬유와 칼슘, 무기질 및 아미노산이 풍부하며 항산화 물질인 플라보노이드, 폴리페놀, 비타민 C 등을 함유하고 있으며 비타민 E 중 α-토코페롤이 다량 함유되어 있다. 또한, 손바닥 선인장은 당뇨, 고혈압, 관절염, 위염, 변비 등과 같은 성인병에도 효능이 있으며 식욕을 증진시키고, 장운동의 활성화 등에도 효과가 있는 것으로 본초강목에 기록되어 있다.
선인장 엽상경 내에 존재하는 점질물은 주로 갈락투론산(galacturonic acid), D-갈락토스(D-galactose), D-자일로스(D-xylose), L-람노스(L-rhamnose)와 L-아라비노스(L-arabinose)로 구성된 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose)와 펙틴(pectin)과 같은 다당체로 알려져 있다. 천년초의 다양한 생리활성에 관한 연구가 진행되고 있으나, 천년초 엽상경 내의 점질 물질은 천년초에 존재하는 생리활성 물질의 추출률을 낮출 뿐 아니라, 주스와 같은 가공식품으로의 제조시 점도가 높아 공정 관리 및 물성 조절에 많은 어려움을 야기하는 원인이 되고 있다.
효소를 활용한 산업적 용례는 다양한 산업분야에서 적용되고 있으며, 특히 식품산업분야에서 과일 주스 가공시 침전물의 생성 억제를 위하여 펙틴분해효소를 사용하는 것은 일반화되어 있다. 하지만 소재화를 위한 추출 공정시 추출 수율을 개선하거나 섬유소와 같은 불용성 성분의 저분자화를 위한 공정기술은 많은 시도는 있었지만 일반화되지는 못한 실정이다. 특히 식물체의 섬유소는 섬유상의 복잡한 구조를 가지고 있어 단일효소 처리를 통한 가수분해가 용이하지 않으며, 이는 많은 식물체 조직에 섬유소 성분들이 리그닌과 복합체를 형성하고 있는 경우가 많기 때문이다. 하지만 최근에 도입된 여러 가지 나노 분쇄기술이나 초고압 균질기술 및 나노플라즈마 처리기술의 도움으로 섬유소를 포함한 불용성의 고분자물질의 저분자화를 통한 가용화 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
발효는 식물체의 영양학적 가치를 증진시킬 뿐 아니라 항산화능과 같은 생리활성도 증진되는 것으로 보고되어 있다. 전통적인 자연발효법이 과채류에 널리 이용되어 왔으나, 미생물 관리가 쉽지 않기 때문에 제품 획일화를 기대하기 힘들다는 단점이 있다. 손바닥 선인장은 신선한 상태로는 보관과 저장 기간이 길지 않기 때문에, 젖산균을 이용한 발효를 이용한 가공법이 종종 이용되고 있으나 수율이 낮고 점질물로 인한 점도가 높아 유용성분 추출이 용이하지 않을 뿐 아니라 발효에 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한, 천년초 원료 자체의 pH가 약 4.5 정도로 낮아 내산성이 있는 균주만이 생육이 가능한 특징이 있어 일반적인 발효를 적용하기 어려운 특징이 있다.
최근, 산업적으로 알코올생성을 위해 당화(saccharification)와 발효(fermentation)를 동시에 진행하는 SSF(simultaneous saccharification and fermentation) 방식이 적용되고 있는데, 이는 효소를 이용하여 다당체를 가수분해시키면서 생성되는 글루코스와 같은 저분자 물질이 미생물의 생육에 필요한 탄소원으로 이용되는 발효 작용이 동시에 진행되도록 하는 방법으로써, 효소 가수분해에 의해 생성되는 저분자물의 축적이 효소작용을 저해하게 하는 현상을 미생물이 분해된 탄수화물 분해물을 영양원으로 사용하면서 막을 수 있기 때문에 발효와 효소분해가 동시에 모두 진행이 가능한 장점을 보이는 것으로 알려져 있다.
한국공개특허 제2016-0034009호에는 천년초 열매에 발효미생물을 혼합하여 발효시키는 단계를 포함하는 천년초를 이용한 액상발효산물의 제조방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1727201호에는 천년초 원물, 원당 희석액, 엿기름액 및 아마씨를 혼합한 후 바실러스 균주를 이용하여 발효하는 단계를 포함하는 천년초 발효액의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 젖산균 및 효소를 이용한 천년초 발효액의 제조방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 젖산균 및 효소 선정과 발효조건 등의 제조조건을 최적화하여 천년초 효소 발효액을 제조함으로써, 기능성 성분 및 생리활성 효과가 증진될 뿐만 아니라 기호도가 우수한 천년초 효소 발효액의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
(1) 세절한 후 살균한 천년초와 설탕 용액을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액과 효소를 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천년초 효소 발효액의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 천년초 효소 발효액의 제조방법에서, 상기 효소는 비스코자임(Viscozyme)일 수 있는데, 상기 비스코자임(Viscozyme)은 상용 효소로서, 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus) 유래 아라비나아제(arabinase), 셀룰라아제(Cellulase), 베타-글루카나아제(Beta-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 자일라나아제(xylanase)를 포함하는 복합 효소이다.
또한, 본 발명의 천년초 효소 발효액의 제조방법에서, 상기 (c)단계의 발효는 바람직하게는 34~40℃에서 12~60시간 동안 발효할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 36~60시간 동안 발효할 수 있다. 상기와 같은 발효조건으로 발효하는 것이 제조된 발효액의 기능성 성분 및 생리활성 효과를 최대로 증진시키면서, 충분히 발효되어 발효취는 나지 않고 관능적 특성도 향상시킬 수 있었다.
본 발명의 천년초 효소 발효액의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 가로 0.4~0.6 cm 및 세로 0.4~0.6 cm의 크기로 세절한 후 110~130℃에서 10~20분간 살균한 천년초 450~550 g과 8~12%(w/v) 설탕 용액 450~550 g을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액 8~12 mL를 첨가하고, 여기에 비스코자임(Viscozyme)을 천년초 1 g 당 3~5 unit가 되도록 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 34~40℃에서 12~60시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 가로 0.5 cm 및 세로 0.5 cm의 크기로 세절한 후 121℃에서 15분간 살균한 천년초 500 g과 10%(w/v) 설탕 용액 500 g을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액 10 mL를 첨가하고, 여기에 비스코자임(Viscozyme)을 천년초 1 g 당 4 unit가 되도록 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 37℃에서 36~60시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 천년초 효소 발효액의 제조방법에서, 상기 (2)단계의 3종의 젖산균을 이용하여 발효하는 것이 다른 젖산균을 이용하거나 일부만 이용하는 것에 비해 제조된 발효액의 향, 맛 및 목넘김과 같은 기호도를 더욱 향상시킬 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 천년초 효소 발효액을 제공한다.
본 발명의 천년초 효소 발효액은 가공 수율이 높고, 점도를 낮춰 물성이 개선될 뿐만 아니라, 플라보노이드, 이소람네틴 및 퀘르세틴 등과 같은 기능성 성분과 항산화 및 항당뇨 활성과 같은 생리활성 효과가 증진되는 효과가 있으며, 맛, 향 및 기호도가 증진되어 소비자들이 더욱 선호하는 발효액을 제공할 수 있다.
도 1은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 pH(A) 및 산도(B) 변화를 비교한 그래프이다.
도 2는 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 당도 변화를 비교한 그래프이다.
도 3은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 젖산균 생균수 변화를 비교한 그래프이다.
도 4는 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 점도 변화를 비교한 그래프이다.
도 5는 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 60시간 발효 후 수율 변화를 비교한 그래프이다.
도 6은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 총 폴리페놀 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 7은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 총 플라보노이드 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 8은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 이소람네틴 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 9는 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 퀘르세틴 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 10은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 11은 젖산균 및 효소 첨가 천년초 효소 발효액의 발효기간에 따른 환원력을 비교한 그래프이다.
도 1 내지 도 11의 Oh: 천년초, Oh-P: 천년초+펙티나아제(pectinase), Oh-C: 천년초+셀룰라아제(cellulase), Oh-PC: 천년초+펙티나아제+셀룰라아제(P:C=1:1), Oh-V: 천년초+비스코자임(viscozyme), Oh-Px: 천년초+펙티넥스, Oh-VPx: 천년초+비스코자임+펙티넥스(V:Px=1:1)를 이용한 천년초 효소 발효액을 의미한다(표 1 참고).
이하, 본 발명의 제조예 및 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 천년초 발효액 제조
(1) 시약
본 실험에 이용된 시약 및 용매는 특급 및 HPLC 등급을 사용하였다.
(2) 효소
가수분해 효소 펙티나아제(EC Number 3.2.1.15; activity: 848 U/mL)와 셀룰라아제(EC Number 3.2.1.4; activity: 1.1 U/mg solid)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 비스코자임®L(activity: 120 U/mL)과 펙티넥스® Ultra SP-L(activity: 26,000 U/mL)은 노보자임 A/S(Krogshoejvej, Bagsvaerd, Denmark)에서 각각 구입하여 사용하였다.
(3) 젖산균 분리 및 동정
스타터(Starter)로 이용된 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa sp. 20), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum 32)과 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius 27)는 경상대학교 식품공학과 미생물실험실에서 분리한 장내 유래 젖산균을 분양받아 사용하였다. 분리된 균주는 탄소원 이용 패턴(API 50 CHL kit, BioMerieux, France)과16S rDNA 시퀀스 분석(GenBank of National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)을 통해 동정되었으며 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성이 높고 MRS 젖산균 배지에서 빠른 성장을 보이는 균주를 선발하여 사용하였다. 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa sp. 20), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum 32)과 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius 27) 각 균주는 10 mL의 젖산균 MRS 배지에 도말하여 37℃에서 12~15시간 동안 배양하였다. 스타터로 배양된 3종 균주는 MRS 배지에서 배양 후 1:1:1(v/v/v) 비율로 혼합한 후 혼합 균주 배양액(107~8 cfu/mL) 형태로 시료에 접종하였다.
(4) SSF(simultaneous saccharification and fermentation) 방법을 이용한 천년초 발효액 제조
어린 천년초(O. humifusa ) 엽상경은 순천만천년초(전남 순천)에서 구입하였고, 황설탕은 지역마켓에서 구입하여 사용하였다. 천년초는 수세하여 물기를 제거 후 0.5×0.5 cm 크기로 잘라 121℃에서 15분간 살균하였다. 황설탕을 멸균 증류수에 10%로 용해시킨 용액을 슬라이스된 천년초와 1:1(v/w) 비율로 혼합하였다. 가수분해 효소들은 천년초 g 당 4 Units이 되도록 첨가되었고, 젖산균 스타터는 천년초와 설탕 총량의 1%가 되도록 접종하였으며 각 시료 배합률은 표 1과 같다.
최종 혼합시료들은 각각 37℃에서 60시간 동안 발효하였다. 샘플링은 살균된 피펫을 이용해 12시간 간격으로 하였으며, 초기 발효 3시간과 6시간 샘플은 젖산균 분석을 위해 샘플링하였다.
천년초 효소 발효액 배합비
시료1 ) 천년초(g) 설탕용액(mL) 스타터(mL) 효소
Oh(control) 500 500 10 -
Oh-P 500 500 10 2.35 mL
Oh-C 500 500 10 1.82 g
Oh-PC 500 500 10 1.18 mL(P), 0.91 g(C)
Oh-V 500 500 10 16 mL
Oh-Px 500 500 10 0.077 mL
Oh-VPx 500 500 10 8.33 mL(V), 0.039 mL(Px)
1) Oh: 천년초, Oh-P: 천년초+펙티나아제(pectinase). Oh-C: 천년초+ 셀룰라아제(cellulase), Oh-PC: 천년초+펙티나아제+셀룰라아제(P:C=1:1), Oh-V: 천년초+비스코자임(viscozyme), Oh-Px: 천년초+펙티넥스, Oh-VPx: 천년초+비스코자임+펙티넥스(V:Px=1:1)
실험방법
1. pH, 산도 및 당도 측정
천년초 발효액의 pH는 pH 미터(SevenEasy pH, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 당도는 전자 당도계(PR-101, Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하여 °Brix로 나타내었다.
2. 젖산균 수 측정
천년초 발효액의 젖산균 수는 37℃ 항온기에서 24시간 동안 배양한 후, 젖산균 집락 수를 계수하여 CFU(colony forming units)/mL로 나타내었다.
3. 점도 측정
점도는 15°로 기울어진 레저보어(reservoir) 용기에 샘플을 넣은 후 일정 거리(11.5 cm)를 이동하는데 소요된 시간(sec)을 측정하여 표시하였다.
4. 수율
천년초 발효액의 수율은 진공 여과 시스템에 연결된 도자기 부흐너(Buchner) 깔때기로 고형물질을 여과한 후 여과액의 부피를 측정하였다.
수율(%) = (발효액 부피/전체 원재료 무게)×100
5. 총 페놀함량(Total phenolic content, TPC)
총 폴리페놀 함량은 시료 200 ㎕와 증류수 1000 ㎕를 잘 혼합한 후 50% 폴린-시오칼토 페놀 시약(Folin-Ciocalteu's phenol reagent) 100 ㎕와 5% 탄산나트륨 용액 200 ㎕를 차례로 가하여 잘 혼합한 다음 1시간 동안 암실에 방치하였다. 분광광도계(Gen 5.2 Eon, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 반응액의 흡광도를 750 nm에서 측정하여 총 폴리페놀 함량을 갈산(gallic acid)을 표준물질로 하여 ㎍ GAE(gallic acid equivalents)/mL로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였다.
6. 총 플라보노이드 함량(Total flavonoid content, TFC)
총 플라보노이드 함량은 시료 100 ㎕에 80% 에탄올 400 ㎕, 5% 아질산나트륨(sodium nitrite) 30 ㎕를 차례로 가하여 혼합한 다음 실온에서 5분간 반응시켰다. 다음으로 10% 염화알루미늄(aluminium chloride) 30 ㎕와 1M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 200 ㎕를 가하여 혼합한 후 1분간 정치하였다. 반응액에 1M NaOH 200 ㎕ 및 증류수 200 ㎕를 가한 후 3000×g에서 10분간 원심분리(HM-150 IV, Hanil Science Industrial, Inchun, Korea)하여 상등액을 취하여 420 nm에서 흡광도를 측정한 다음 퀘르세틴(quercetin)을 사용하여 총 플라보노이드 함량을 계산하고 ㎍ QE(quercetin equivalents)/mL로 나타내었다.
7. 이소람네틴(isorhamnetin)과 퀘르세틴(quercetin) 함량
이소람네틴(isorhamnetin)과 퀘르세틴(quercetin) 함량은 각 시료 400 ㎕를 1.6 mL 메탄올 용액(80%)과 혼합하여 5분간 초음파 처리 후 10,000×g에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 분리하여 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과 후 HPLC에 주입하였다. 분석조건은 다음 표 2 및 3에 나타내었다.
HPLC 조건
구성 설명
HPLC 시스템 Agilent 1200(Agilent, Santa Clara, CA, USA)
컬럼 YMC-PACK ODS-AM(C18, 250 mm × 4.6 mm, 5 ㎛, YMC, Kyoto, Japan)
컬럼 온도 40℃
유속 1 mL/분
주입 용량 20 ㎕
검출기 DAD(Diode array detector), 365 nm
HPLC 이동상 조건
시간(분) A(%)
물:아세트산:아세토나이트릴=94.5:0.5:5(v:v:v)		 B(%)
100% 아세토나이트릴
0 100 0
5 90 10
35 60 40
50 100 0
55 100 0
65 100 0
8. DPPH 라디칼 소거능
발효액의 DPPH 라디칼 소거능은 시료 200 ㎕에 0.1 mM DPPH 용액 800 ㎕를 가하여 잘 혼합한 다음 암실에서 30분간 방치하였다. 그 다음 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한 후 갈산(gallic acid)을 표준물질로 사용하여 검량선을 작성하여, DPPH 라디칼 소거능을 ㎍ GAE/mL로 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
9. 환원력(Reducing power)
발효액의 환원력은 시료 200 ㎕, 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 6.6) 200 ㎕, 1% 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 용액 200 ㎕를 차례로 가하여 잘 혼합한 후 50℃ 진탕항온수조에서 20분간 반응시킨 다음 10% 트리클로로아세트산 200 ㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 1000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 100 ㎕를 96-웰 마이크로플레이트에 취한 다음 증류수 100 ㎕과 0.1% 염화철 20 ㎕를 차례로 가하여 잘 혼합한 후 분광광도계를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하고 ㎍ GAE/mL로 환원력을 나타내었다.
10. α-글루코시다아제 저해능(α-Glucosidase inhibitory activity)
α-글루코시다아제 저해능 분석은 효소 α-글루코시다아제(0.06 U/mL)와 PNP-G 용액(2 mM)은 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)를 이용하여 제조하였다. 발효액들은 같은 완충액을 이용해 적당한 농도로 희석하여 이용하였다. 96-웰 플레이트에 희석한 발효액 20 ㎕에 효소용액을 넣고 잘 혼합하여 균질화시킨 후 25℃에서 5분간 정치하였다. 다음으로 2 mM ρ-NPG 용액 100 ㎕를 가하여 잘 혼합한 후 25℃에서 10분간 반응시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-글루코시다아제 저해 활성능(%)은 다음 식에 따라 계산하였다.
α-글루코시다아제 저해능(%) = [(Ao - As)/Ao] × 100
Ao: 대조구 흡광도
As: 시료 흡광도
11. 통계분석
모든 통계 분석은 SAS(ver 9.3, SAS Inst. Inc., 2011)를 이용하였고, 유의성 검증은 one-way ANOVA를 한 후 α=0.05 수준에서 Duncans multiple range test에 의해 나타내었다. 상관관계 분석은 마이크로소프트 엑셀(ver 15.0.4569.1506, Microsoft Co., 2013)에 있는 CORREL 기능을 이용하여 분석하였다.
실시예 1: 천년초 효소 발효액의 pH 및 산도
효소 가수분해와 젖산 발효가 동시에 진행하는 SSF 공정에 의한 천년초 효소 발효액의 pH와 산도 변화는 도 1과 같다. 발효 전의 천년초 초기 pH는 약 4.3으로 젖산발효가 끝난 발효유나 숙성된 김치의 적정 pH(4.2~4.5)와 유사한 수준을 보이는 산성 조건에서 발효가 시작하였는데, 본 실험에 사용된 효소들은 이러한 산성 조건에서 작용이 가능하며, 선발된 3개 젖산균의 경우도 이러한 산성 조건에 생육이 가능한 내산성을 보이는 균주로 천년초의 발효에 적용 가능한 것으로 판단된다.
이러한 산성을 나타내는 천년초 초기 pH는 SSF 공정 60시간 동안 3.60~4.06으로 낮아졌는데, 이는 사용된 혼합 젖산균 스타터의 생육으로 인한 젖산이 생성되기 때문으로 보여진다. 사용된 효소의 종류에 따라 pH 감소 정도가 다르게 나타났는데, P(펙티나아제), C(셀룰라아제), PC(펙티나아제+셀룰라아제), Px(펙티넥스)를 첨가한 시료에서는 SSF 공정 24시간 이후 pH 감소가 두드러지게 나타나지 않은 반면 V(비스코자임)와 VPx(비스코자임+펙티넥스)를 이용한 천년초 효소 발효액의 경우 SSF 공정 24시간 이후에도 산도가 지속적으로 증가하고 이에 따라 pH가 빠르게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 pH가 점점 낮아지면서 젖산균이 생육을 위해 분비하는 효소 및 이들의 활동이 둔화되게 되면서 젖산 분비가 감소되는데, V와 VPx의 경우 이러한 산성에서 효소활성이 둔화되지 않고 젖산균이 필요로 하는 탄소원을 지속적으로 분해하여 젖산균의 생육을 돕기 때문으로 생각된다.
실시예 2: 천년초 효소 발효액의 당도(sugar content)
SSF 처리에 의한 천년초 효소 발효액의 가용성 당 함량은 초기 9.57°Bx에서 SSF 처리 60시간 동안 시료에 따라 감소 또는 증가를 보이며 최종 9.93~12.10°Bx 범위를 나타내었다(도 2). 이는 효소 가수분해에 의해 생성되는 당류들이 젖산발효에 의해 소비되기 때문에 발효액의 당도는 크게 증가하거나 감소하지 않은 것으로 보여진다. 시료 중에서는 비스코자임 효소가 사용된 Oh-V와 Oh-VPx에서 당도가 가장 높은 것으로 나타났는데, 이는 비스코자임에 의한 가수분해가 다른 효소에 비하여 보다 활발히 진행되었기 때문으로 보여진다. 반면, Oh(control)는 가장 낮은 당도를 나타내었는데, 이는 효소에 의한 당 생성 효과가 없이 젖산균이 분비하는 효소에 의한 당의 생성과 생육으로 인한 당 소비로 나타나는 현상으로 생각된다.
실시예 3: 천년초 효소 발효액의 젖산균 생육
SSF 처리에 의한 천년초 효소 발효액의 젖산균 변화는 도 3과 같다. 젖산균은 초기 6~12시간 처리 동안 급격하게 증가하여, 모든 시료가 105 CFU/mL 수준에서 107 CFU/mL 이상으로 증가하여 천년초 원료의 낮은 pH에서도 혼합젖산균 생육이 잘 이루어진 것으로 보여진다. 효소 종류에 의해서 두드러진 차이는 나타나지 않았으나 P(펙티나아제)가 첨가된 Oh-P와 Ph-PC 시료의 경우 48시간 이후 다른 시료와 달리 젖산균 생육이 감소하는 특성을 보여 펙티나아제 효소의 분해력은 젖산균 생육에 크게 도움을 주지 못하는 것으로 보여진다.
실시예 4: 천년초 효소 발효액의 점도
SSF 처리된 천년초 효소 발효액의 점도 변화는 단위 거리 이동에 필요한 시간을 측정하여 도 4에 나타내었다. SSF 과정이 진행됨에 따라 사용된 효소에 따라 점도에 차이를 나타내었으나 모든 시료 추출액의 이동하는 시간이 증가하여 점도가 높아진 것을 확인할 수 있었다. 효소를 첨가하지 않고 젖산균만으로 발효된 대조구 Oh가 가장 긴 시간을 나타내어 점도가 가장 높은 것으로 확인되었으며, Oh-V가 가장 짧은 이동 시간을 보여 점도가 가장 낮음을 알 수 있었다. P(펙티나아제), C(셀룰라아제), PC(펙티나아제+셀룰라아제), Px(펙티넥스)를 첨가한 시료 모두 시료 간의 차이는 있었으나 60시간의 SSF 처리기간 동안 점도가 조금씩 증가한 반면, V(비스코자임)를 첨가한 Oh-V와 Oh-VPx는 SSF 처리기간 동안 점도의 증가가 매우 미미하게 증가하는 것으로 나타났다. 이는 C, P, CP, Px와 같은 효소는 천년초 엽상경으로부터 점질물을 효과적으로 분리해 내어 점도가 증가하지만 이들을 분해하여 점도를 낮추는 속도는 느린 반면, V에 존재하는 혼합 효소들은 천년초 다당체 점질물을 조직으로부터 추출 후 효과적으로 분해하여 추출액 점도를 낮추는 것으로 보여진다.
실시예 5: 천년초 효소 발효액의 수율
SSF를 60시간 동안 처리한 후 측정된 각각의 천년초 효소 발효액의 수율(%)은 도 5와 같이 처리 효소에 따라 차이를 나타냈다. Oh-V(92.6%)가 가장 수율이 높았고, 다음으로 Oh-VPx(90.5%) > Oh-P(84.9%) > Oh-PC(84.4%) > Oh-Px(78.1%) 순이었다. 셀룰라아제를 단독으로 처리한 Oh-C가 가장 낮은 수율(66.6%)을 보였다. 본 실험에서는 비스코자임과 펙티넥스 혼합처리 시료인 Oh-VPx가 비스코자임 단독 처리 시료인 Oh-V보다 오히려 낮은 수율을 보여 펙티넥스 혼합으로 인한 시너지 효과는 없는 것으로 보이므로 비스코자임 단독으로 사용하는 것이 천년초의 다당류 분해에 보다 효과적인 것으로 보인다.
실시예 6: 천년초 효소 발효액의 총 폴리페놀 함량(Total phenolic content)
SSF 처리 천년초의 총 폴리페놀 함량(TPC) 변화는 도 6과 같다. 초기 88.68 ㎍ GAE/mL인 TPC는 SSF 발효 60시간에는 171.41~407.49 ㎍ GAE/mL를 보였다. 효소가 첨가된 모든 시료는 발효만 진행되는 대조구 Oh 시료보다 총 페놀 함량이 모두 높게 나타났는데, 특히, 비스코자임 효소를 사용한 Oh-VPx 및 Oh-V가 높은 TPC를 보였는데 이는 Oh에 비하여 약 3배 정도 높은 수치였다. 이는 천년초 엽상경 내의 복잡하게 얽힌 다당체 구조물을 분해하여 폴리페놀류 같은 기능성 물질을 용출하는 데 비스코자임 효소가 효과적인 것으로 보인다.
실시예 7: 천년초 효소 발효액의 총 플라보노이드 함량(Total flavonoid content)
젖산균 및 효소를 첨가한 천년초 효소 발효액의 총 플라보노이드 함량(TFC) 변화는 도 7과 같다. 모든 시료가 발효기간 동안 TFC가 증가하여, 발효 초기 TFC 121.99 ㎍ QE/mL에서 발효 60시간 후에는 348.12~634.01 ㎍ QE/mL 수준으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 가장 높은 TFC는 Oh-V에서 관찰되었고, Oh-C가 가장 낮은 TFC를 나타내었다.
실시예 8: 천년초 효소 발효액의 이소람네틴(isorhamnetin)과 퀘르세틴( quercetin ) 함량
플라보노이드는 생리활성기능 성분의 하나로 잘 알려져 있지만, 구조에 의해 그 기능면에서 차이를 보인다. 플라보노이드 배당체 형태에서 글라이코사이드 결합으로 연결된 당 부분이 가수분해되어 아글리콘 구조의 플라보노이드 형태가 기능성에서 더 우수한 것으로 알려져 있다.
본 실험에서는 SSF 처리에 의하여 천년초의 기능성 성분으로 알려진 플라보노이드 비배당체인 이소람네틴(isorhamnetin)과 퀘르세틴(quercetin)의 함량 변화를 조사하여 도 8 및 9에 나타내었다. 이소람네틴은 SSF 기간 동안 모든 시료에서 증가하는 추세를 보였는데 효소를 첨가한 시료가 첨가하지 않은 대조구보다 모든 처리구간에서 높게 나타났으며 특히, Oh-V에서 가장 빠른 속도로 증가하여 60시간 처리 후 시료 중 가장 높은 함량인 43.14 ㎍/mL을 나타내었고, 이어서 Oh-VPx(35.94 ㎍/mL) > Oh-PC(35.37 ㎍/mL) 순으로 높은 이소람네틴 함량을 보였다(도 8).
한편, 퀘르세틴 함량도 모든 시료에서 SSF 처리기간 동안 증가하였으며 효소 첨가 시료가 대조구에 비하여 모두 높은 퀘르세틴 함량 증가를 나타내었다. 시료 중에서는 Oh-V(13.94 ㎍/mL)와 Oh-VPx(13.52 ㎍/mL) 시료가 가장 높은 퀘르세틴 함량을 나타내었으며, 대조구 Oh(9.55 ㎍/mL)는 가장 낮은 퀘르세틴 함량을 보였다(도 9).
실시예 9: 천년초 효소 발효액의 DPPH 라디칼 소거능
SSF 처리기간에 따른 천년초의 DPPH 라디칼 소거능 변화는 도 10과 같다. 초기 0h의 DPPH 라디칼 소거능은 3.94 ㎍ GAE/mL으로, 처리기간 36시간까지는 증가하다가 그 이후 시료군에 따라 증가 또는 감소하는 경향을 나타내었다. SSF 처리 60시간 후 천년초 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 6.22~14.06 ㎍ GAE/mL의 범위를 보였는데, 이 중에서 Oh-VPx 및 Oh-V가 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였고, Oh-C가 가장 수치를 나타내었다. 이는 효소 첨가로 인하여 천년초의 TPC와 TFC 함량이 증가하면서 DPPH 라디칼 소거능도 함께 증가한 것으로 보인다.
실시예 10: 천년초 효소 발효액의 환원력
SSF 처리에 의한 천년초의 환원력 변화는 도 11과 같다. 모든 시료군에서 SSF 처리기간이 길어지면서 환원력이 증가하여, 60시간 후 환원력은 52.86~113.75 ㎍ GAE/mL 범위를 나타내었다. 이러한 환원력의 증가는 특히 Oh-V와 Oh-VPx에서 두드러지게 나타났으며 Oh와 Oh-Px는 가장 낮은 환원력을 보였다. DPPH 라디칼 소거능과 더불어 환원력이 증가하는 결과를 볼 때, 천년초의 항산화능은 발효와 함께 다당류 가수분해 효소를 이용하는 것이 보다 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 11: 천년초 효소 발효액의 α- 글루코시다아제 저해능
α-글루코시다아제(α-glucosidase)는 탄수화물을 단당류로 분해하여 혈당증가에 관여하는 효소로, 식후 고혈당증에 관여하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 α-글루코시다아제 억제 활성은 당뇨 위험이 있는 사람들에게 혈당의 급속한 증가를 늦추는데 도움을 줄 수 있기 때문에 항당뇨능을 측정하기 위한 지표로 활용이 된다.
본 실험에서는 SSF 처리기간 중에 항당뇨능을 보이는 것으로 알려진 천년초의 α-글루코시다아제 억제 활성이 어떻게 변하는지 표 4에 나타내었다. α-글루코시다아제 억제능은 IC50(mg/mL)으로 표시하였으며, 이는 IC50의 수치가 낮을수록 α-글루코시다아제 억제 활성이 큰 것을 가리킨다. 대조구에 비하여 효소가 첨가된 시료군이 모두 IC50가 낮아 α-글루코시다아제 억제 활성이 더 높아진 것을 확인할 수 있었으며, 효소 처리 시료 군 중에서는 Oh-V(0.06 mg/mL)와 Oh-VPx(0.08 mg/mL)가 가장 낮은 IC50을 보여 α-글루코시다아제 억제 활성이 가장 우수함을 알 수 있었다. 항당뇨능이 우수한 것으로 알려진 아카보스(1.40 mg/mL)와 비교해 볼 때 SSF 처리한 천년초가 α-글루코시다아제 저해 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
젖산균 및 효소 첨가한 후 60시간 발효한 천년초 효소 발효액의 α-글루코시다아제 저해능
시료 IC50(mg/mL)
Oh(천년초, control)1) 0.24
Oh-P 0.11
Oh-C 0.14
Oh-PC 0.11
Oh-V 0.06
Oh-Px 0.17
Oh-VPx 0.08
아카보스(Acarbose) 1.40
1) Oh: 천년초, Oh-P: 천년초+펙티나아제(pectinase). Oh-C: 천년초+ 셀룰라아제(cellulase), Oh-PC: 천년초+펙티나아제+셀룰라아제(P:C=1:1), Oh-V: 천년초+비스코자임(viscozyme), Oh-Px: 천년초+펙티넥스, Oh-VPx: 천년초+비스코자임+펙티넥스(V:Px=1:1)(표 1 참고)
실시예 12: 젖산균 종류를 달리한 천년초 효소 발효액의 관능평가
천년초 효소 발효액의 관능적 특성은 패널 20명을 선발하여 색(color), 향(flavor), 맛(taste), 목넘김(Swallowing feeling), 전체적 기호도(overall acceptability)를 5점 척도법으로 평가하였다. 여기에서 척도 점수는 1점; 대단히 싫다, 2점; 약간 싫다, 3점; 보통이다, 4점; 약간 좋다, 5점; 대단히 좋다로 분류하였다.
천년초 효소 발효액의 제조방법은 제조예 1의 방법으로 제조하되 효소로 비스코자임을 사용하고, 60일 동안 발효한 천년초 효소 발효액(제조예 1), 제조예 1의 방법으로 제조하되, 젖산균을 사용하지 않고 60일 동안 발효한 천년초 효소 발효액(비교예 1), 제조예 1의 방법으로 제조하되, 락토바실러스 파라플란타룸을 사용하지 않고 락토바실러스 애시도필러스 균주 배양액을 사용하여 60일 동안 발효한 천년초 효소 발효액(비교예 2), 제조예 1의 방법으로 제조하되, 스트렙토코커스 살리바리우스 균주를 사용하지 않고 60일 동안 발효한 천년초 효소 발효액(비교예 3)을 의미한다(표 5).
제조조건에 따른 천년초 효소 발효액 제조
구성 제조예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa) ○ × ○ ○
락토바실러스 파라플란타룸
(Lactobacillus paraplantarum)		 ○ × × ○
스트렙토코커스 살리바리우스
(Streptococcus salivarius)		 ○ × ○ ×
락토바실러스 애시도필러스
(Lactobacillus acidophilus)		 × × ○ ×
효소(비스코자임) ○ ○ ○ ○
제조조건에 따른 천년초 효소 발효액의 관능검사를 실시한 결과, 제조예 1과 같이 웨이셀라 콘푸사, 락토바실러스 파라플란타룸 및 스트렙토코커스 살리바이루스의 젖산균 3종을 모두 사용하여 제조한 천년초 효소 발효액이 상기 3종의 젖산균을 일부만 사용하거나, 다른 젖산균을 사용하여 제조한 비교예들의 천년초 효소 발효액에 비해, 향, 맛 및 목넘김에서 높은 점수를 나타내었고, 전체적인 기호도에서도 높은 관능적 특성을 나타내었다.
천년초 효소 발효액의 관능검사
시료 색 향 맛 목넘김 전체적 기호도
제조예 1 4.2 4.4 4.6 4.4 4.4
비교예 1 4.0 3.6 3.6 4.0 3.8
비교예 2 4.1 3.8 4.0 4.1 4.0
비교예 3 4.0 4.0 4.1 4.2 4.1
결론
천년초는 엽상경 내의 점질 다당체로 인해 생리활성물질의 용출이 어렵고 발효를 이용시 시간이 오래 걸리면서도 수율이 낮고 점도가 높으며 고점도로 인하여 여과가 용이하지 않은 어려움이 있다. 효소를 이용한 가수분해는 가수분해물의 농도가 높아질수록 효소 작용이 억제되는 특성이 있으며 젖산발효만 적용하는 경우 다당체 분해능이 떨어져 원하는 유용성분의 추출에 시간이 오래 걸릴 뿐 아니라 추출효율이 떨어지게 되지만 본 연구는 식물체 다당류를 분해할 수 있는 효소를 젖산발효에 동시에 적용하는 SSF 동시공정(simultaneous saccharification and fermentation)을 적용함으로써 이러한 두 공정의 한계를 상호보완하여 점질다당체가 많은 천년초의 생리활성 물질 추출의 효율성을 높이고자 하였다. SSF 처리는 인체 장내 유래 젖산균 3종 혼합균주와 비스코자임을 혼합하여 37℃에서 진행시 젖산발효가 효율적으로 진행되었고 점도가 낮아지고 수율이 높아지며 기능성 성분과 생리활성능이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 다당체 분해 효소로 인하여, 배당체 플라보노이드인 이소람네틴-글루코사이드(isorhamnetin-glucoside)와 이소람네틴-루티노사이드(isorhamnetin-rutinoside) 추출이 많아지고 이것이 기능성이 우수한 비배당체 이소람네틴(isorhamnetin)과 퀘르세틴(quercetin) 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. DPPH 라디칼 소거능과 환원력도 SSF 처리 공정에 의하여 항산화능이 발효만 진행된 시료보다 높은 것을 확인할 수 있었으며 항당뇨와 관계된 α-글루코시다아제 저해능(α-glucosidase inhibition activity)도 표준품인 아카보스(acarbose)보다 IC50보다 높은 값을 보여 항당뇨능이 우수한 것을 알 수 있었다.
본 연구에서 장내 유리 젖산균 3종과 비스코자임 효소(천년초 g 당 4 Unit)를 적용하여 시도된 SSF 공정은 발효만으로 진행되는 과정에 비하여 천년초 추출액 제조 수율 증대, 점도 감소, 항산화능 개선, 항당뇨능 개선, 기능성 TPC, TFC, 이소람네틴 등의 성분을 증가시키는 효과적인 방법이라 사료되며 이는 천년초의 기능성 개선 및 소재 개발에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Claims (5)

  1. (1) 세절한 후 살균한 천년초와 설탕 용액을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액과 비스코자임(Viscozyme)을 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천년초 효소 발효액의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    (1) 세절한 후 살균한 천년초 450~550 g과 8~12%(w/v) 설탕 용액 450~550 g을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액과 비스코자임(Viscozyme)을 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 34~40℃에서 12~60시간 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천년초 효소 발효액의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    (1) 가로 0.4~0.6 cm 및 세로 0.4~0.6 cm의 크기로 세절한 후 110~130℃에서 10~20분간 살균한 천년초 450~550 g과 8~12%(w/v) 설탕 용액 450~550 g을 혼합한 혼합물을 준비하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 준비한 혼합물에 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 및 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 혼합 균주 배양액 8~12 mL를 첨가하고, 여기에 비스코자임(Viscozyme)을 천년초 1 g 당 3~5 unit가 되도록 첨가하여 천년초 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 준비한 천년초 효소 혼합물을 34~40℃에서 12~60시간 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천년초 효소 발효액의 제조방법.
  5. 제1항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 천년초 효소 발효액.
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