KR20230129136A - 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효모, 초산균, 및 유산균으로 발효한 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 2단계 발효 잗구콩 잎 추출물은 유기산 함량이 높고, 우수한 항균, 항염증, 및 항산화 활성을 나타내는 바 의약용, 의약부외용, 화장료용, 향장소재용, 기능성 바이오 소재용 및 기능성 식품소재용 등 다양한 방면으로 이용될 것으로 기대된다.

Description

발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물{Composition for antibacterial, antioxidant, or anti-inflammatory comprising fermented extracts of Canavalia gladiata leaf as an active ingredient}
본 발명은 효모, 초산균, 및 유산균으로 발효한 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물 등에 관한 것이다.
일반적으로 콤부차(kombucha)는 녹차나 홍차를 우린 물에 설탕을 넣고 '스코비(SCOBY; symbiotic colony of bacteria & yeast)' 유익균을 첨가한 뒤 발효해 만드는 음료를 지칭하는 것으로, 발효할 때 생기는 효모균종과 미생물로 이뤄진 배양체의 모습이 버섯과 닮아 '홍차 버섯'으로도 불린다. 시큼하면서도 달콤한 식초 맛과 향이나며, 발효 과정에서 탄산이 생성돼 마실 때 청량감이 든다.
이러한 콤부차는 발효 과정에서 프로바이오틱스를 생성해 면역력 증강과 위장 건강에 도움이 되고, 콤부차에 들어 있는 글루쿠론산이 체내 독소를 해독하고 배출하는 효과와 더불어 간 독소를 감소시켜 간 건강을 증진시킬 뿐 아니라 폴리페놀, 비타민 등 항산화 성분들이 들어 있어 활성산소를 배출해 주는 효과가 있는 것으로 알려져 있어서, 최근에는 건강 및 성인병 예방을 위한 건강 음료로 인식되면서 가정에서도 제조하여 음용하고 있다.
일반적으로 콤부차는 홍차 및 녹차에 효모와 초산균을 접종하여 발효시킴으로써 제작되고 있으며, 최근 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조를 통한 기능성 향상 연구가 진행되고 있다. 본 발명자들은 콤부차 제조에 적용할 수 있는 다양한 기능성 식품 소재와 그 기능성 향상 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2002-0055441
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 효모, 초산균, 및 유산균으로 발효한 발효 작두콩 잎 추출물에서 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, 및 Salmonella enterica에 대한 항균활성 활성산소 소거 활성 및 염증을 유도하는 NO와 염증매개인자의 생성을 억제하는 활성을 호가인하여 상기 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 및/또는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 활성이 강화된 2차 발효 작두콩 잎 추출물 제조방법과 그 방법으로 제조된 2차 발효 작두콩 잎 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품, 특히 콤부차를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 효모, 초산균, 및 유산균으로 발효한 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 및/또는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 발효 작두콩 잎 추출물은 작두콩 잎 추출물을 효모 및 초산균으로 1차 발효 후 상기 1차 발효물에 유산균을 혼입하여 2차 발효시킨 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명에서 상기 효모는 Saccharomyces cerecisiae 균주일수 있으며, 구체적으로, S. cerecisiae C3 (KCTC 14865BP) 균주일 수 있으며 막걸리로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 초산균은 Acetobacter pasteurianus 균주일 수 있으며, 구체적으로 A. pasteurianus P2 (KCTC14866BP) 균주일 수 있으며 식초식부터 분리된 것일 수 있다. 그리고, 상기 유산균은 Lactobacilus paracasei 균주일 수 있으며 구체적으로 L. paracasei DK215 (KCTC 14990BP) 일 수 있고 김치로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 발효 작두콩 잎 추출물은 작두콩 잎 추출물을 효모 및 초산균으로 1차 발효 후 상기 1차 발효물에 유산균을 혼입하여 2차 발효시킨 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, 및 Salmonella enterica 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세균에 대해 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 산화질소 (nitric oxide: NO)의 생성을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 대식세포에서 산화질소의 생성을 억제하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 염증 유도 물질의 자극 하에서 대식세포의 산화질소 생성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 TNF-α (tumor necrosis factor-α), 인터루킨-1 (interleukin-1), 및 인터루킨-6 (interleukin-6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염증매개인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 발효 작두콩 잎 추출물을 제조하는 방법을 제공한다:
(1) 물 1 리터당 70g의 설탕을 혼합하는 단계;
(2) 상기 설탕물 1 리터당 5g의 작두콩 잎을 혼합하는 단계;
(3) 상기 작두콩 잎을 혼합한 혼합물을 가열하는 단계;
(4) 상기 가열된 혼합물을 여과하는 단계;
(5) 상기 여과액에 효모 및 초산균을 접종 후 1차 발효하는 단계; 및
(6) 상기 1차 발효액에 유산균을 접종후 2차 발효하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (3) 단계의 가열은 80~100 ℃에서 20~100분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 구체적으로 85~95 ℃에서 20~50분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 90 ℃에서 30분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (4) 단계의 여과는 가열된 혼합물을 멸균 후 수행되는 것일 수 있으며, 상기 제조방법은 (4) 단계의 여과 후 여과액을 실온에서 냉각 후 (5) 단계를 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (5) 단계의 1차 발효는 20~40 ℃에서 36~60시간 동안 수행되는 것일 수 있으며, 구체적으로 25~35 ℃에서 40~56시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 30 ℃에서 48시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (6) 단계의 2차 발효는 20~40 ℃에서 4 내지 10일 동안 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 9일, 더욱 바람직하게는 6 내지 8일 동안 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 항균, 항산화, 및 항염증 효과를 나타내는 2차 발효 작두콩 잎 추출물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 2차 발효 작두콩 잎 추출물은 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, 및 Salmonella enterica 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세균에 대해 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 2차 발효 작두콩 잎 추출물은 대식세포에서 산화질소의 생성을 억제하고, TNF-α, 인터루킨-1, 및 인터루킨-6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염증매개인자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 2차 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 건강기능식품은 콤부차 일 수 있다.
본 발명의 발효 작두콩잎 추출물은 Two-stage 발효 방법으로 제조되어 항균 및 항산화 활성이 강화되었고 나아가 면역 기능 개선 효과가 있다. 특히, 유산균을 접종한 2차 발효 작두콩 잎 추출물은 유산균을 접종하지 않은 것과 비교하여 유기산 생산량 높고, 다양한 대조군을 설정하여 비교한 결과 4종 병원균에 대해 높은 항균 활성을 나타내며, 항산화 활성 및 항염증 활성이 우수한 효과가 있다. 이에 본 발명의 발효 작두콩잎 추출물은 의약용, 의약부외용, 화장료용, 향장소재용, 기능성 바이오 소재용 및 기능성 식품소재용 등 다양한 방면으로 이용이 가능하다.
도면 1은 콤부차 발효액 제조를 위한 Two-stage 제조공정도이다.
도면 2는 발효시간에 따른 One-stage와 Two-stage 방법에 따라 제조된 콤부차 발효액의 생균수 결과이다.
도면 3는 발효시간에 따른 One-stage와 Two-stage 방법에 따라 제조된 콤부차 발효액의 생균수 결과이다.
도면 4는 발효시간에 따른 One-stage와 Two-stage 방법에 따라 제조된 콤부차 발효액의 pH 및 T.A 결과이다.
도면 5는 발효시간에 따른 One-stage와 Two-stage 방법에 따라 제조된 콤부차 발효액의 pH 및 T.A 결과이다.
도면 6은 유기산 표준물질을 측정한 결과이다.
도면 7는 유산균을 접종하지 않은 콤부차의 발효 시작 후 1일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 8은 유산균을 접종하지 않은 콤부차의 발효 시작 후 3일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 9은 유산균을 접종하지 않은 콤부차의 발효 시작 후 7일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 10는 유산균을 접종한 콤부차의 발효 시작 후 1일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 11은 유산균을 접종한 콤부차의 발효 시작 후 3일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 12은 유산균을 접종한 콤부차의 발효 시작 후 7일차 유기산 생성량을 측정한 결과이다.
도면 13은 Kombucha sample의 ABTS radical scavenging 측정 결과이다.
도면 14는 Kombucha sample의 DPPH radical scavenging 측정 결과이다.
도면 15은 Kombucha sample의 FRAP assay 측정 결과이다.
도면 16은 Kombucha sample의 TPC assay 측정 결과이다.
도면 17는 Kombucha sample의 세포생존률을 측정한 결과이다.
도면 18은 Kombucha sample의 NO 생성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도면 19는 Kombucha sample을 이용한 사이토카인 (TNF-α, IL-1, IL-6) 측정 결과이다.
본 발명자들은 콤부차 제조에 적용할 수 있는 다양한 기능성 식품 소재와 그 기능성 향상 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
작두콩(Canavalia gladiata)은 콩과의 한해살이 덩굴성 식물로서 6~7월에 꽃이 피고, 8~10월에 꼬투리를 맺어 늦가을에 열매가 익는다. 식용 콩 중에서 제일 큰 콩이며, 그 모양이 작두를 닮았다고 하여 작두콩 혹은 도두(刀豆)라 부르기도 한다. 작두콩에는 urease, hemaglutinine, canavanine, canavalia gibberellin I 과 II를 함유하고 있으며, 항산화, 항균, 항암, 항염증, 혈액순환 촉진 등의 효과가 있다고 보고되고 있다.
본 발명자들은 작두콩의 잎을 소재로 하여 추출물을 제조하고 상기 추출물을 발효하여 그 항산화, 항균, 및 항염증 활성이 향상됨을 확인하였다.
또한, 종래 발효 식품 개발 연구에 있어 주류는 Lactic acid bacteria(LAB) 첨가에 의한 생물학적 활성 향상에 있었다. 본 발명자들은 한국의 전통 식품인 막걸리, 식초, 및 김치에서 각각 효모, 초산균 및 유산균을 분리하고 동정하여 2 단계 발효에 이용함으로서 식물 소재의 기능성이 보다 향상됨을 확인하였다.
한편, 본 발명자들은 효모 및 초산균에 의한 1차 발효 후 유산균에 의한 2차 발효를 수행하는 방법으로 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 제작하고, 상기 추출물은 1차 발효만 수행한 One-stage 발효 작두콩잎 추출물보다 아세트산, 젖산, 글루콘산, 및 글루쿠론산과 같은 유기산의 수준이 높고, 세균의 증식을 억제하며 높은 항산화능 및 염증 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 2단계 발효를 통해 확보되는 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 항균, 항염증, 및/또는 항산화용 조성물로 제공하고, 본 발명의 조성물은 상기 용도의 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 건강기능식품은 염증의 억제 또는 개선하거나, 세균의 성장 및 생장을 억제하거나, 인체 내에서 활성산소를 소거하는 기능을 가지며 높은 유기산을 함유할 수 있다. 또한, Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 상술한 기능의 발휘를 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 이소퀘르시트린은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 발효 작두콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 발효 작두콩잎 추출물을 유효 성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 발효 균주 동정
유산균을 접종한 콤부차 제조를 위하여 한국전통식품인 막걸리 유래 효모 2종을 각각 YM agar (Difco Lab, USA)에 표면도말(Spread plate method) 후 30℃ Incubator에서 약 72시간 배양하고, YM agar 표면에 형성된 Colony 를 Loop & Needle로 채집 후 도말평판(Streak plate method)을 진행 후 30℃ Incubator에서 약 72시간 배양하였다. 이후 동정을 실시하여 Saccharomyces cerecisiae를 확보하였고, 유전서열 분석을 통해 S. cerecisiae C3로 명명하고 기탁하였다(KCTC 14865BP).
한국전통발효식품인 식초 유래 초산균 2종을 각각 Nutrient agar(Difco Lab, USA)에 표면도말(Spread plate method) 후 30℃ Incubator에서 약 72시간 배양, Nutrient agar 표면에 형성된 Colony 를 Loop & Needle로 채집 후 도말평판(Streak plate method)을 진행 후 30℃ Incubator에서 약 72시간 배양하였다. 이후 동정을 실시하여 Acetobacter pasteurianus를 확보하였고, 유전서열 분석을 통해 A. pasteurianus P2로 명명하고 기탁하였다(KCTC14866BP).
한국전통식품인 김치 유래 유산균주 10종을 MRS agar(Difco Lab, USA)에 각각 표면도말(Spread plate method) 후 37℃ Incubator에서 약 72시간 배양, MRS agar 표면에 형성된 Colony 를 Loop & Needle로 채집 후 도말평판(Streak plate method)을 진행 후 37℃ Incubator에서 약 72시간 배양하였다. 이후 동정을 실시하여 Lactobacillus paracasei를 확보하였고, 유전서열 분석을 통해 L. paracasei DK215로 명명하고 기탁하였다(KCTC 14990BP).
실시예 2. 작두콩잎 추출 및 Two-stage 발효
도 1에 도식화된 방법으로 작두콩잎을 추출하고 two-stage 발효를 진행하였다. 구체적으로, 70g 의 설탕을 1L의 탈이온수에 첨가하여 100℃에서 5분간 끓여 녹인 후, 작두콩잎을 5g을 첨가하고 90 ℃에서 30분간 추출하였다. 이어서, 상기 추출물을 300 MESH 멸균기를 사용하여 여과하고 실온에서 냉각시켰다. 이후 멸균 용액에 1x10³ CFU/mL로 희석한 균주(효모, 초산균)를 접종 후 멸균 거즈로 입구를 막고 30 ℃에서 48시간 동안 호기성 발효 및 정치 발효를 수행하였다(One-stage 발효). 이후 멸균 용액에 1x10³ CFU/mL로 희석한 유산균을 접종하여 30℃에서 7일동안 2차 발효를 진행하고(Two-stage 발효), 발효 시간에 따른 생균수, pH 및 산도를 측정하였다(도 3 및 도 5)
대조군으로는 효모(yeast), 초산균(AAB), 및 유산균(LAB)을 동시 접종한 One-stage 발효액을 제조하여, 발효 시간에 따른 생균수, pH 및 산도를 측정하였다(도 2 및 도 5).
이하 실험에서 대조군은 유산균을 접종하지 않은 Kombucha로 설정하였고, 본 명세서에서 유산균을 접종하지 않은 Kombucha, 즉 발효 없는 작두콩잎 추출물은 KWOL, 유산균을 접종한 Kombucha는 One-stage 발효 작두콩잎 추출물, 즉 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물을 KWL으로 명명하였다.
실시예 3. Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 유기산 생산량 측정
Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 유기산(글루루론산 및 초산)을 측정하기 위하여 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 분석을 수행하였다. 대조군으로는 유산균을 접종하지 않은 작두콩잎 추출물을 이용하였으며, 각각 발효 시작 후 1, 3, 및 7일 차에 유기산 생성량을 측정하였다. 구체적으로 각 시료(sample)를 12,000 x g 및 4 ℃에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 준비하고, 0.45 μm SIGL(sterile syringe membrane filter)로 여과하였다. 10 μm의 여과액을 HPLC injector에 주입하고 Hydrosphere C8 column상에서 20mM NaH2PO4(pH 2.8)를 이용하여 HPLC 분석하였다. 유기산 분석을 위한 HPLC 조건은 하기 표 1에 나타내었으며, 유기산의 농도는 해당 Peak 면적을 표준 곡선과 비교하고 희석 계수를 곱하여 측정하였다.
유기산 표준물질의 HPLC 측정 결과는 하기 표 2 및 도 6와 같다.
대조군으로는 유산균을 접종하지 않은 작두콩잎 추출물을 이용하였으며, 대조군의 발효 시작 1, 3, 및 7일차에 유기산 생성량 측정은 도 7 내지 9에 나타내었고, Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 발효 시작 1, 3, 및 7일차에 유기산 생성량 측정은 도 10 내지 12에 나타내었다.
실시예 4. Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 항균 활성 확인
Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 항균활성을 확인하기 위하여 인간 병원성 세균인 그람 양성 Staphylococcus aureus (KCTC3881, Korea) 및 Bacillus cereus (KCTC362A)과 그람 음성 Escherichia coli (KCTC1682, Korea) 및 Salmonella enterica (KCTC2054, Korea)를 사용하였다. 구체적으로 TSA Agar(20 mL)를 각 Petri dish(90 mm 직경)에 붓고 후 24시간 동안 배양한 표적 균주의 현탁액(100 μL)을 plate에 균일하게 도포하고 sterile cork borer로 직경 9 mm의 Well을 만들었다.
이어서, Two-stage 발효 작두콩잎 추출물은 4℃에서 15분 동안 8,000 x g로 원심분리하고 PVDF 0.45 μm SIGL를 통해 여과하여 SCOBY 세포 파편을 제거하였다.
대조군으로 유산균을 접종하지 않은 작두콩잎 추출물을 이용하였으며, 발효 7일차의 상기 대조군의 발효 7일차에 초산 농도 7.6 g/L의 대조군 샘플을 준비하였다. 같은 방법으로 1M HCl 또는 1M NaOH로 pH를 4.0과 7.0으로 조절한 미발효차 샘플(KWOL)과 발효 0, 1, 4, 및 7일차 발효차 샘플을 준비하였다. 또한 열변성(Heat-denatured) 샘플을 위해 발효 7일차의 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물 샘플을 100 °C에서 5분 동안 처리하였다.
각 샘플 100 μL을 표적 균주가 접종된 Plate의 Well에 분주한 후 4 ℃에서 2시간 동안 사전 확산시켰다. 확산 후 30 ℃에서 배양하여 균주 억제 영역의 직경은 12-15시간 후에 측정하였다. 측정 결과는 표 3 및 표 4는 아래와 같다. 표 3은 유산균을 접종하지 않은 Kombucha sample 및 대조군에 의한 항균활성을 측정한 결과이고, 표 4는 two-stage 발효 작두콩잎 추출물 및 대조군에 의한 항균활성을 측정한 결과이다.
실시예 5. Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 항산화 활성 확인
Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 항산화 활성 확인을 위하여 아래의 실험을 수행하였다.
5-1. ABTS radical scavenging 측정
ABTS 라디칼 소거 활성 측정을 위해 ABTS를 메탄올(methanol)에 용해시키고 7mM 농도로 조정하였다. ABTS stock solution을 최종 농도로 2.45mM potassium sulfate과 혼합하고 사용하기 12-16시간 전에 암실에 보관하였다. ABTS stock solution은 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 에탄올(ethanol)에 희석하였다. 150 μL의 시료에 희석된 ABTS·+ solution 3 mL를 넣고 혼합한 후 3분 후에 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 하기 식 1을 사용여 계산하였으며, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
[식 1]
ABTS radical scavenging activity (%) = {1-(S-SC)/(BS-BC)}x100
S : sample (sample/ABTS)
SC : control (H2O/ABTS)
BS : blank of sample (sample/H2O)
BC : blank of control (H2O/H2O)
5-2. DPPH radical scavenging 측정
100 μL DPPH 라디칼 용액(0.2 mM)을 100 μL 샘플에 첨가하고 5 μL 에탄올을 첨가하였다. 혼합물을 vortexing 후 37 ℃ 암실에서 30분 동안 반응시켰다. Blank에 대해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 mM/L 단위의 Trolox 등가 항산화 활성 단위로 표시하여 도 14에 나타내었다.
5-3. ferric reducing antioxidant power (FRAP) 측정
FRAP 시약은 [300mM acetate buffer(pH 3.6) : 10mM TPTZ in 40mM HCl : 20mM FeCl3: 20mM Iron(Ⅲ) Chloride Hexahydrate solution = 10:1:1(v/v/v)]으로 생성하였다. 전처리된 샘플과 FRAP 시약을 1:19(v/v)의 비율로 혼합하고 암실에서 30분간 반응시켰다. 생성된 용액의 흡광도를 593 nm에서 3회 측정하였다. 결과는 mM/L 단위의 Trolox 등가 항산화 활성 단위로 표시하여 도 15에 나타내었다.
5-4. total polyphenol contents (TPC) 측정
Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 비색법에 따라 수정 후 분광광도계로 측정하였다. 100 μL의 샘플을 100 μL의 Folin-Ciocalteu 반응성 용액(50%, v/v)과 혼합하고 혼합물을 실온에서 5분동안 반응시켰다. 그 후, 2% sodium carbonate 수용액 2mL를 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 흡광도는 분광광도계를 사용하여 760 nm에서 측정하였다. 총 폴리페놀 화합물의 함량은 mM/L 단위의 gallic acid equivalents(GAE) 항산화 활성 단위로 표시하여 도 16에 나타내었다.
실시예 6. Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 세포 독성 확인
Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 세포 독성 확인을 위하여 MTT assay를 수행하였다. 세포생존률 확인을 위한 실험에는 단국대학교에서 분양받은 RAW 264.7 대식세포 (Cheonan, Korea)을 이용하였으며 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)이 혼합된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다.
75 T cell culture flask에 배양된 RAW 264.7 세포를 1,000 rpm의 조건에서 5분 동안 원심분리 후 상등액 제거하여 동량의 10% FBS+DMEM 배지 첨가 후 96-well plate에 각 웰당 5 x 105 cells/mL로 가한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에 16-18 시간 동안 배양하였다.
배지 제거 후, 각 샘플을 초산농도별(0.001-100 mg/mL)로 준비하여 100 μL 분주 후 20-22 시간 동안 배양한 뒤, 상등액을 제거하여 5 mg/mL 농도의 MTT solution을 분주하였다. 이어서, 37 ℃, 5% CO2 incubator에 3 시간 동안 배양 후 상등액을 제거한 뒤 DMSO 100 μL 첨가하여 상온에서 5분 반응시키고 micro plate reader기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 초산농도 0.001 mg/mL을 제외하고 모든 샘플에서 80% 이상의 세포생존률을 나타내어 낮은 세포독성을 확인할 수 있었다(도 17).
실시예 7. Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 염증 억제 활성 확인
정상적인 염증반응은 외부 물질이나 상처에 대응하는 면역세포인 대식세포의 활성화에 의해 조절되며 이는 염증 반응에 중요한 역할을 하는 산화질소 (nitric oxide: NO), 인터페론 (interferon), 사이토키안 (cytokine)과 같은 다양한 염증성 매개 인자의 조절을 통해 이루어진다. 그러나 외부 자극에 의해 과도하게 활성화된 비정상적인 대식세포는 NO의 생성을 촉진시켜 만성염증을 유발시킬 뿐만 아니라 TNF-α (tumor necrosis factor-α), 인터루킨-1 (interleukin-1: IL-1), 및 인터루킨-6 (IL-6)과 같은 염증매개인자 (pro-inflammatory factor)의 발현을 촉진하여 염증을 악화시킨다.
이하에서는 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 항염증 활성을 확인하기 위하여 NO 생성과 염증매개인자 발현에 미치는 Two-stage 발효 작두콩잎 추출물의 영향을 확인하였다.
7-1. 산화질소(NO) 억제 효과 확인
단국대학교에서 분양받은 RAW 264.7 (Cheonan, Korea) 세포를 10% FBS이 혼합된 DMEM 배지에서 배양하였다. 75 T cell culture flask에 배양된 상기 RAW 264.7 세포를 1,000 rpm, 5 min의 조건에서 원심분리 후 상등액을 제거하여 동량의 10% FBS+DMEM 배지 첨가 후 96-well plate에 각 웰당 5 x 105 cells/mL로 가한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에 16-18 시간 동안 배양하였다.
배지 제거 후, 각 샘플을 초산농도별(0.001-100 mg/mL)로 준비하여 100 μL 분주 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 2-3 시간 동안 배양하였다.
최종농도 100 ng/mL의 LPS를 제조하여 각 웰에 100 μL 분주 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 20-22 시간 동안 배양한 뒤, NO 시약(Griess reagent) 100 μL 분주 후 상온에서 15분간 반응하여 micro plate reader기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 모든 초산 농도의 발효 작두콩 추출물이 대식세포에서 NO 생성을 억제하며, 특히 Two-stage 발효 작두콩 추출물에 의한 NO 생성 억제 효과가 보다 뛰어남을 알 수 있었다.
7-2. 염증성 사이토카인 발현 억제 효과 확인
세포생존률 및 NO 생성 억제 효과 결과로부터 각 샘플의 초산 농도 0.1 mg/mL로 사이토카인 측정 진행하였다. 사이토카인 측정 (TNF-α, IL-1, IL-6)은 Mouse IL-1, Mouse IL-6, Mouse TNF-α ELISA kit (KOMA biotech, Korea)를 사용하여 진행하였다.
단국대학교에서 분양받은 RAW 264.7 (Cheonan, Korea) 세포를 10% FBS이 혼합된 DMEM 배지에서 배양하였다. 75 T cell culture flask에 배양된 상기 RAW 264.7 세포를 1,000 rpm, 5 min의 조건에서 원심분리 후 상등액을 제거하여 동량의 10% FBS+DMEM 배지 첨가 후 96-well plate에 각 웰당 5 x 105 cells/mL로 가한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator에 24 시간 동안 배양하였다.
1차 항체가 코팅된 96-well ELISA microplate에 300 μL의 세척 용액(washing solution)을 첨가하여 3회 세척하고, 표준(standard) 및 샘플(sample)을 각 웰에 100 μL 첨가한 뒤 상온에서 2시간 반응한 뒤 세척 용액으로 4회 세척을 수행하였다.
이어서, 2차 항체를 각 웰에 100 μL 첨가한 뒤 상온에서 2시간 반응시킨 후 세척 용액으로 4회 세척을 수행하고, Streptavidin-HRP를 각 웰에 100 μL 첨가한 뒤 상온에서 30분 반응한 뒤 세척 용액으로 4회 세척을 수행하였다. 그리고, TMB 용액을 각 웰에 100 μL 첨가하여 상온에서 발색 반응 확인 후 발색이 충분히 진행되면 stop solution을 각 웰에 100 μL 첨가하여 발색 반응을 종료시킨 뒤, micro plate reader기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 발효 작두콩 추출물을 처리한 대식세포에서는 LPS 자극에도 불구하고 3종 사이토키안의 분비 수준이 낮으며, 특히 Two-stage 발효 작두콩 추출물에서 IL-1alpha 및 IL-6의 분비 억제 활성이 우수함을 확인하였다(도 19).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (18)

  1. 효모, 초산균, 및 유산균으로 발효한 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효 작두콩 잎 추출물은 작두콩 잎 추출물을 효모 및 초산균으로 1차 발효 후
    상기 1차 발효물에 유산균을 혼입하여 2차 발효시킨 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효모는 막걸리로부터 분리된 Saccharomyces cerecisiae C3 (KCTC 14865BP) 균주인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 초산균은 식초로부터 분리된 Acetobacter pasteurianus P2 (KCTC14866BP) 균주인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 Lactobacillus paracasei DK215 (KCTC 14990BP) 균주인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, 및 Salmonella enterica 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세균에 대해 항균 활성을 갖는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 대식세포에서 산화질소의 생성을 억제하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 TNF-α (tumor necrosis factor-α), 인터루킨-1 (interleukin-1), 및 인터루킨-6 (interleukin-6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염증매개인자의 발현을 억제하는 것인, 조성물.
  9. (1) 물 1 리터당 70g의 설탕을 혼합하는 단계;
    (2) 상기 설탕물 1 리터당 5g의 작두콩 잎을 혼합하는 단계;
    (3) 상기 작두콩 잎을 혼합한 혼합물을 가열하는 단계;
    (4) 상기 가열된 혼합물을 여과하는 단계;
    (5) 상기 여과액에 효모 및 초산균을 접종 후 1차 발효하는 단계; 및
    (6) 상기 1차 발효액에 유산균을 접종 후 2차 발효하는 단계;를 포함하는 2차 발효 작두콩 잎 추출물 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 가열은 80~100 ℃에서 20~100분 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (4) 단계의 여과는 가열된 혼합물을 멸균 후 수행되며,
    상기 제조방법은 (4) 단계의 여과 후 여과액을 실온에서 냉각 후 (5) 단계를 수행하는 것인, 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (5) 단계에서 효모는 막걸리로부터 분리된 Saccharomyces cerecisiae C3 (KCTC 14865BP) 균주이고, 초산균은 식초로부터 분리된 Acetobacter pasteurianus P2 (KCTC14866BP) 균주이며, 상기 (5) 단계의 1차 발효는 20~40 ℃에서 36~60시간 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (6) 단계에서 유산균은 Lactobacillus paracasei DK215 (KCTC 14990BP) 균주이고, 상기 (6) 단계의 2차 발효는 20~40 ℃에서 4일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  14. 제9항의 방법으로 제조된 항균, 항산화, 및 항염증 효과를 나타내는 2차 발효 작두콩 잎 추출물.
  15. 제14항의 2차 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 건강기능식품 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, 및 Salmonella enterica 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세균에 대해 항균 활성을 갖는 것인, 건강기능식품 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 대식세포에서 산화질소의 생성을 억제하고,
    TNF-α (tumor necrosis factor-α), 인터루킨-1 (interleukin-1), 및 인터루킨-6 (interleukin-6)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염증매개인자의 발현을 억제하는 것인, 건강기능식품 조성물.
  18. 제14항의 2차 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 콤부차.
KR1020220077071A 2022-02-28 2022-06-23 발효 작두콩 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 또는 항염증용 조성물 KR20230129136A (ko)

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