KR101970320B1 - 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 설탕 용액과 모과 분쇄물을 이용하여 발효한 본 발명의 모과 발효액은 전통적 방식(모과를 세절하여 설탕과 혼합)의 모과 발효액에 비해 효소 활성이 높고, 발효기간이 단축되며, 항산화 활성이 증진된다. 또한, 모과 에탄올 추출물에 비해 항염증 효과가 우수하므로, 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 의약외품 또는 호흡기 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

Description

모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for preventing, improving or treating respiratory diseases comprising fermented solution of Chaenomeles sinensis as effective component and production method thereof}
본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 건강기능식품, 약학 조성물 또는 의약외품으로 사용할 수 있는 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현대인들은 대기오염, 알레르기 원(동물의 털, 꽃가루 등), 흡연 등으로 인해 알레르기성 기관지 질환에 빈번하게 노출되고 있으며, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기성 비염, 기침, 가래, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염과 같은 호흡기 질환은 선진국에서 빈번하게 발생하는 질환 중 하나이다.
천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기성 비염, 기침, 가래, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염 등의 호흡기 질환은 그 발병 원인과 증상에 있어 일부 차이는 있지만, 염증성 질환이라는 측면에서 공통점이 있다. 현재 사용하고 있는 약물 중 기도확장제는 질병을 악화시키는 염증엔 효과가 없이 단순히 증상만 완화하기 때문에 장기간 사용시 약제 내성이 발생되어 병증 악화의 우려가 있으며, 염증에 효과가 있다고 알려진 스테로이드제는 심각한 부작용으로 인해 장기간 사용시 문제가 된다.
또한, 오염된 대기환경에 노출되고, 잦은 스트레스, 불규칙한 생활 등으로 인해 면역력이 저하되어 경미한 증상으로 기관지의 불편감을 호소하는 사람들이 증가하고 있는 추세에 있다. 이러한 환경 속에서 기관지 등 호흡기 질환을 예방하고 기관지 등의 건강을 유지하기 위해 건강기능활성을 가진 다양한 보조적 식품 섭취에 대한 관심이 증가하고 있다. 따라서 천연 식품 소재를 활용하여 간편하게 기관지 약화를 예방할 수 있는 제품 개발 및 호흡기 질환에 취약한 계층인 어린이 및 노인층을 위한, 보다 안전한 한방 및 천연물을 활용한 제품의 개발이 요구되고 있다.
한편, 모과(Chaenomeles sinensis)는 중국이 원산지이고, 장미과에 속한 원형 또는 타원형의 과실이다. 오래전부터 식용 및 약용으로 이용되어 왔다. 모과는 알칼리성 식품으로 당분, 칼슘, 인, 철, 칼륨, β-카로틴 및 비타민 C 등이 풍부하고, 약 2% 사포닌, 2~3% 유기산, 플라보노이드 및 탄닌 등이 함유되어 있으며, 이외에도 다양한 영양 성분이 함유되어 있으나, 일반 과실에 비해 수분함량이 적고 떫은 맛이 강하며, 석세포 및 목질이 발달하여 육질이 거친 편으로 다양한 가공화에 어려움이 있다. 따라서 상품성이 낮은 단순 가공기술로 만든 모과 가공식품 또는 방향제 등으로 이용되고 있는 실정이므로 모과의 활용성 확대를 위한 가공기술개발이 필요하다.
한편, 발효는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정이다. 발효공정을 거치게 되면 미생물의 분해 작용을 통해 새로운 유기산 및 각종 분해 산물로 인한 활성 성분의 생성, 풍미 향상, 독성의 감소 등과 같은 많은 장점을 가지고 있어, 발효제품의 인기가 점점 높아지고 있다.
한편, 한국등록특허 제1230715호에는 발효 모과 원액의 제조방법 및 이의 제조된 발효 모과 원액을 이용한 모과음료 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 모과 발효액을 제조하는 최적의 조건을 확립하고, 확립된 조건으로 발효한 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 조성물이 항염증 효과가 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 45~65°Brix의 설탕 용액을 1~3 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 28~32℃의 조건에서 4~12일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 모과 발효액의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 설탕 용액과 모과 분쇄물을 이용하여 발효한 본 발명의 모과 발효액은 전통적 방식(모과를 세절하여 설탕과 혼합)의 모과 발효액에 비해 효소 활성이 높고, 발효기간이 단축되며, 항산화 활성이 증진된다. 또한, 모과 에탄올 추출물에 비해 항염증 효과가 우수하다. 또한, 모과의 발효가공으로 모과의 활용성이 증대되어 폐기되던 모과가 농가의 새로운 소득원으로 이용될 수 있으며, 천연재료를 활용함으로써 부작용 부담없는 호흡기 질환의 예방 및 개선제로 사용할 수 있다.
도 1은 설탕 용액의 농도(50, 60 또는 70°brix) 및 모과의 형태(절편 또는 분쇄)에 따른 모과 발효액의 발효 기간별 당도(A), pH(B) 및 적정 산도(C)의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 설탕 용액의 농도(50, 60 또는 70°brix) 및 모과의 형태(절편 또는 분쇄)에 따른 모과 발효액의 발효 기간별 총균수(A) 및 효모 및 곰팡이 수(B)를 확인한 결과이다.
도 3은 설탕 용액의 농도(50, 60 또는 70°brix) 및 모과의 형태(절편 또는 분쇄)에 따른 모과 발효액의 발효 기간별 자당효소(A), 아밀라아제(B) 및 섬유분해효소(C)의 변화를 확인한 결과이다. 1unit은 1㎍/분/㎖의 포도당을 방출하는 효소의 양을 의미한다.
도 4는 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 발효 기간별 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 확인한 결과이다.
도 5는 설탕 용액의 농도(50, 60 또는 70°brix) 및 모과의 형태(절편 또는 분쇄)에 따른 본 발명의 제조방법으로 제조한 8일째 모과 발효액의 DPPH 라디칼 소거능(A), ABTS 라디칼 소거능(B), SOD 유사활성(C) 및 아질산염 소거활성(D)을 확인한 결과이다.
도 6은 20~100일 동안 전통 방식으로 발효한 모과 발효액의 잔틴산화효소 저해활성(A) 및 본 발명의 제조방법으로 제조한 8일째 모과 발효액의 잔틴산화효소 저해활성(B)을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 제조방법으로 제조한 8일째 모과 발효액(MB) 및 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물(MP)의 COX-2 발현억제를 확인한 결과이다. LPS를 처리하여 COX-2의 발현을 유도하였으며, Con은 LPS 및 시료 무처리 음성대조군이다. MB25는 모과 발효액 25%(v/v)와 세포 배양 배지 75%(v/v)의 혼합물, MB50은 모과 발효액 50%(v/v)와 세포 배양 배지 50%(v/v)의 혼합물 및 MB100은 모과 발효액 100%이고, MP25는 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 25%(v/v)와 세포 배양 배지 75%(v/v)의 혼합물, MP50은 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 50%(v/v)와 세포 배양 배지 50%(v/v)의 혼합물 및 MP100은 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 100%이다.
도 8은 본 발명의 제조방법으로 제조한 8일째 모과 발효액(MB) 및 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물(MP)의 농도별 NO 생성량을 확인한 결과이다. LPS를 처리하여 NO의 생성을 유도하였으며, Con은 LPS 및 시료 무처리 음성대조군이다. MB25는 모과 발효액 25%(v/v)와 세포 배양 배지 75%(v/v)의 혼합물, MB50은 모과 발효액 50%(v/v)와 세포 배양 배지 50%(v/v)의 혼합물 및 MB100은 모과 발효액 100%이고, MP25는 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 25%(v/v)와 세포 배양 배지 75%(v/v)의 혼합물, MP50은 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 50%(v/v)와 세포 배양 배지 50%(v/v)의 혼합물 및 MP100은 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물 100%이다.
본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기성 비염, 기침, 가래, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이며, 상기 기관지염은 급성 기관지염, 만성 기관지염, 세기관지염, 카타르성 기관지염 및 폐쇄성 및 염증성 기관지 질병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 저해하고, NO의 생성을 억제하는 효과가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 호흡기 질환의 예방 또는 치료을 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 조성물을 호흡기 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
본 발명의 의약외품은 그 제형에 따라 제제화에 필요한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 45~65°Brix의 설탕 용액을 1~3 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 28~32℃의 조건에서 4~12일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 모과 발효액의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 3)에서 혼합되는 설탕 용액의 당도는 바람직하게는 50 또는 60°Brix이지만 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 4)에서 혼합물의 발효는 바람직하게는 30℃의 조건에서 8일 동안 자연발효하는 것이지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 모과 발효액의 제조방법은
1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 50 또는 60°Brix의 설탕 용액을 2 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 30℃의 조건에서 8일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 것이지만 이에 제한되지 않는다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 모과 발효액의 제조
모과 발효액 제조를 위해 모과를 세척하고, 물기를 제거한 후 제핵 및 분쇄 또는 절편하였다. 그 후 분쇄 또는 절편한 모과 1kg에 당도를 달리하여 제조한 설탕 용액(50, 60 및 70°Brix) 2ℓ를 옹기에 넣은 후 각각 30℃로 유지된 항온실에서 주 3회씩 뒤적여 호기적 상태를 유지하면서 20일 동안 자연 발효시켜 여과 후 실험의 시료로 사용하였다.
제조예 2. 전통적 방식을 이용한 모과 발효액의 제조( 비교예 )
전통적인 방법을 이용한 발효액 제조를 위해 모과를 세척하고, 물기를 제거한 후 제핵 및 세절하였다. 그 후 세절된 모과 30kg에 설탕 30kg을 첨가하여 옹기에 담은 후 20±2℃로 유지된 항온실에서 주 3회씩 뒤적여 호기적 상태를 유지하면서 최종 100일 동안 자연 발효시켜 여과 후 실험의 시료로 사용하였다.
실시예 1. 발효 방법에 따른 모과 발효액의 발효 특성
제조예 1 및 제조예 2의 모과 발효액을 이용하여 발효 방법에 따른 발효 특성을 비교하였다.
(1) 물리화학적 특성
제조예 1 및 제조예 2의 당도는 마스터굴절계(Master Refractometer, ATAGO, N-1E, brix 28.0-62.0%, Japan)를 이용하여 측정하였다. 또한, pH는 시료 1 중량부에 대하여 2 중량부의 증류수를 더하여 희석한 후, pH 미터(pH meter, Orion 410A, Orion Research In., LA, USA)로 측정하였고, 적정 산도는 시료 1 중량부에 대하여 2 중량부의 증류수를 가하여 희석한 후, 0.1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH가 8.3이 될 때까지 소비된 수산화나트륨의 양을 젖산량으로 환산하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 제조예 1의 모과 발효액의 당도는 발효기간이 경과함에 따라 감소하였다. 70°Brix 설탕 용액을 첨가한 모과 발효액의 발효중 당도는 발효 초기에는 모과 절편 발효액이 높았으나, 발효 6일 이후부터는 모과 분쇄물 발효액이 높았다. 50°Brix 및 60°Brix 설탕 용액 첨가구도 발효 초기 이와 유사한 경향을 나타내었으나, 발효 14일 이후부터는 모과 절편 및 분쇄물의 형태에 따른 당도의 차이는 뚜렷하지 않았다. 또한, 모과 발효액 담금시 pH는 모과 절편 첨가구가 pH 3.14~3.46을 나타내었고, 모과 분쇄물 첨가구의 pH는 2.79~2.89로 모과 절편 첨가구에 비해 모과 분쇄물 첨가구가 낮았으나, 발효 기간이 경과한 후 모과 형태 및 설탕 용액의 농도에 따른 처리구 사이의 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다. 산도는 발효액 담금시 모과 절편 첨가구 보다 모과 분쇄물 첨가구가 높았다. 모과 절편을 첨가한 경우, 담금 직후 산도는 낮았으나, 발효 2일 후 급격히 증가하여 0.56~0.72%의 범위로 설탕 용액의 농도가 높을수록 산도가 높았다. 모든 처리구에서 발효 2일부터 발효 18일까지는 산도의 변화가 크지 않았으나, 발효 20일째 모든 처리구의 산도가 증가하는 경향을 나타냈다.
한편, 표 1에 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 당도 및 pH는 발효기간이 경과함에 따라 감소하고, 적정 산도는 발효 40일째 증가했다가 이후 유지하는 것을 확인하였다.
전통적 방식을 이용한 모과 발효액의 물리화학적 특성
발효기간(일)
20 40 60 80 100
당도(°Brix) 63.3±0.30 61.6±0.40 61.7±0.30 60.0±0.00 60.8±0.20
pH 3.51±0.00 3.24±0.00 3.14±0.01 2.99±0.02 2.83±0.03
적정 산도(%) 0.54±0.00 0.72±0.00 0.73±0.00 0.72±0.00 0.72±0.00
도 1 및 표 1을 통해 발효방법에 따른 발효기간 동안의 모과 발효액의 물리적 특성은 비슷한 양상을 나타내는 것을 확인하였다.
(2) 미생물 수 변화
시료는 0.1% 펩톤수로 적정 희석한 후, 총균수는 PCA(plate count agar, Difco, Detroit, MI, USA), 효모 및 곰팡이는 PDA(potato dextrose agar, Difco, Detroit, MI, USA) 및 대장균은 VRBA(violet red bile agar)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 나타나는 콜로니를 계수하여 CFU(colony forming unit)/㎖로 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 제조예 1의 모과 발효액의 총균수, 효모 및 곰팡이 수는 발효 6일까지 급격히 증가하였다가 이후 발효 10일까지 급격히 감소하여 12일까지 유지하는 경향을 나타냈다. 모과 형태(절편 또는 분쇄물)에 따른 차이 및 설탕 용액의 농도에 따른 차이는 크지 않았다. 대장균의 경우, 발효기간 동안 검출되지 않았다.
한편, 표 2에 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 총균수, 효모 및 곰팡이 수는 발효 40일까지 증가하였다가 그 후 60일까지는 감소하는 경향을 나타냈고, 발효 100일까지는 유지되는 경향을 나타냈다. 개선된 방식을 이용한 모과 발효액과 동일하게 대장균은 검출되지 않았다.
전통적 방식을 이용한 모과 발효액의 미생물 수 변화(log No. CFU/㎖)
발효기간(일)
20 40 60 80 100
총균수 3.98±0.02 5.59±0.01 4.86±0.01 4.76±0.02 4.61±0.03
효모 및 곰팡이 3.86±0.01 5.63±0.00 4.34±0.04 4.00±0.02 3.70±0.03
대장균 미검출 미검출 미검출 미검출 미검출
도 2 및 표 2를 통해 미생물 수가 가장 높은 제조예 1의 6일째 모과 발효액의 총균수, 효모 및 곰팡이 수와 제조예 2의 40일째 모과 발효액의 총균수, 효모 및 곰팡이 수를 비교하였을 경우, 제조예 2의 모과 발효액보다 제조예 1의 모과 발효액의 미생물 수가 더욱 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 제조예 1의 모과 발효액에서 미생물의 분해 작용이 더 잘 일어날 수 있음을 알 수 있었다.
(3) 효소 활성의 변화
효소 활성 확인을 위해, 시료를 원심분리한 후, 분리된 상등액 2㎖에 차가운 메탄올 8㎖를 가하여 두번째 원심분리를 하였다. 분리된 침전물에 10㎖의 정제수를 가하여 침전물을 용해시킨 후, 세번째 원심분리를 진행하여 원심분리된 상등액을 효소 활성 측정용 시료로 사용하였다. 아밀라아제(amylase)는 1% 가용성 녹말(soluble starch)을 기질로 사용하여 40℃에서 30분 동안 반응하였고, 자당효소(invertase)와 섬유분해효소(cellulase)는 1% 자당(sucrose)과 0.5% CMC(carboxymethyl cellulose)를 각각 기질로서 사용하여 40℃에서 30분 동안 반응시켰으며, 단위시간당 생성된 반응액의 포도당(glucose) 함량을 측정하여 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 제조예 1의 모과 발효액의 경우 모든 시료군에서 발효 8일째에 효소(아밀라아제, 자당효소 및 섬유분해효소)의 최대 활성을 나타내었고, 이후부터는 서서히 감소하는 경향을 확인하였다. 최대 균수를 나타내었던 발효 6일째에 비해 발효 8일째 효소 활성이 더 높게 나타난 것은 발효에 관여하는 효모나 기타 미생물 세포가 자가 분해되면서 세포 내부에 존재하였던 효소들이 당 발효액 중으로 용출되어 나왔기 때문이다.
한편, 표 3에 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 효소 활성은 자당효소는 발효 40일째, 아밀라아제 및 섬유분해효소는 발효 20일째 가장 높았고, 그 이후 발효기간의 경과에 따라 효소 활성이 서서히 감소하였다.
전통적 방식을 이용한 모과 발효액의 효소 활성 변화(1unit=1㎍/분/㎖의 포도당을 방출하는 효소의 양)
효소 활성 발효기간(일)
20 40 60 80 100
자당효소 1.97±0.16 6.20±0.00 5.36±0.03 4.98±0.03 2.23±0.36
아밀라아제 6.53±0.31 5.85±0.65 4.72±0.23 4.13±0.49 4.72±0.38
섬유분해효소 12.17±0.31 6.94±0.34 5.38±0.03 5.31±0.03 4.50±0.17
도 3 및 표 3을 통해 제조예 1의 모과 발효액의 효소활성이 전통적 방식을 이용한 제조예 2의 모과 발효액에 비하여 높은 것을 확인할 수 있었으며, 제조예 1의 모과 발효액 제조시 발효 미생물 성장은 발효 6일째, 효소활성은 발효 8일째 가장 양호한 것을 확인하여, 이후 8일째 모과 발효액을 시료로 이용하여 분석하였다.
(4) 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량
총 폴리페놀 함량 측정은 폴린-데니스(Folin-Denis) 법에 따라 시료 1㎖에 0.2N 폴린-시오칼투 페놀 시약(Folin-ciocalteu's phenol reagent) 1㎖를 첨가하여 실온에서 3분 동안 반응시킨 후, 반응액에 7.5%(w/v) 탄산나트륨(Na2CO3) 1㎖를 첨가하여 암소에서 1시간 동안 방치한 후, 765nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 탄닌산(tannic acid)을 표준물질로 한 표준곡선에 의하여 산출하였다. 또한, 총 플라보노이드 함량은 제조예 1 및 제조예 2의 시료 0.1㎖를 취하여 10%(w/v) 질산암모늄(aluminum nitrate)과 1M 아세트산칼륨(potassium acetate)을 함유하는 80%(v/v) 에탄올 4.3㎖에 혼합하여 실온에서 40분 동안 정치한 후 415nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 루틴 수화물(rutin hydrate, Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 작성한 검량선으로부터 산출하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 제조예 1의 8일째 모과 발효액의 총 폴리페놀 함량은 모과를 분쇄하여 발효한 경우 절편에 비해 높게 나타났으며, 설탕 용액의 농도가 높을수록 총 폴리페놀 함량이 높아졌으나, 60 및 70°Brix에서는 큰 차이를 나타내지 않았다. 총 플라보노이드 함량 또한 모과 절편에 비해 모과 분쇄물을 이용하여 발효액을 제조한 경우 높게 나타났다.
8일째 모과 발효액의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량(㎎/㎖)
설탕 용액 농도 모과 형태 총 폴리페놀 함량 총 플라보노이드 함량
50°Bx 절편 2.24±0.01 0.62±0.02
분쇄 3.06±0.02 0.94±0.04
60°Bx 절편 3.31±0.00 0.72±0.00
분쇄 4.17±0.01 1.16±0.03
70°Bx 절편 3.35±0.04 0.97±0.03
분쇄 3.93±0.02 1.12±0.04
한편, 도 4에 나타난 바와 같이 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 발효기간에 따른 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 큰 변화가 없었다.
표 4 및 도 4를 통해 제조예 1 및 제조예 2의 모과 발효 방법에 따른 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량의 변화는 거의 동일한 것으로 확인하였다.
(5) 항산화 활성
항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, SOD(Superoxide dismutase) 유사활성 및 아질산염 소거활성을 확인하였다.
DPPH 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 변형하여 추출물 0.4㎖에 0.4mM DPPH(α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 에탄올 용액 0.8㎖를 진탕 혼합하고, 10분 동안 방치한 후 분광광도계(Pharmacia Biotech Ultrospec 1000, Cambridege, UK)를 사용하여 525㎚에서 흡광도를 측정하여, 하기 식 1에 준하여 환산하였다.
[식 1]
DPPH 라디칼 소거능(%) = [1-(샘플 흡광도 / 대조구 흡광도)] × 100
ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt; A9941, Sigma-Aldrich Co.] 라디칼 소거능은 Re 등의 방법에 따라 측정하였다. 7.4mM의 ABTS와 2.6mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 실온 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시킨 다음, 실험 직전에 ABTS 용액을 732nm 파장에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 인산완충용액(phosphate- buffered saline, PBS, pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 시료 50㎕에 ABTS 용액 950㎕를 첨가하여 암소에서 10분 동안 반응시킨 후, 732nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식 2의 방법으로 활성을 산출하였다.
[식 2]
ABTS 라디칼 소거능(%)= [1-(샘플 흡광도 / 대조구 흡광도)] × 100
SOD 유사활성은 Marklund 등의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료 0.2㎖에 pH 8.5로 보정한 트리스 완충액(tris-HCl buffer, 50mM tris[hydroxymethyl] amino-methane＋10mM EDTA) 3㎖와 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.2㎖를 첨가한다. 그 후, 25℃에서 10분 동안 반응시키고, 1N 염화수소(HCl) 0.1㎖를 더해 반응을 정지시킨 다음 420㎚에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도 감소율로 나타내었다.
아질산염 소거활성은 1mM 아질산염 용액에 시료를 가하고, 0.1N 염화수소를 첨가해 pH 1.2로 조정한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 그리스 시약(Griess reagent, Sigma, Co., USA)을 혼합하였다. 이후 15분 동안 실온에 방치한 후 520㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 식 3의 방법으로 잔존 아질산염의 양을 측정하였다.
[식 3]
아질산염 소거활성(%)=[1-(A-C)/B]×100
A는 1mM 아질산염 용액에 시료를 첨가하여 반응시킨 후의 흡광도이고, B는 1mM 아질산염 용액의 흡광도이며, C는 시료의 흡광도이다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 제조예 1의 8일째 모과 발효액의 DPPH 라디칼 소거능은 87.55% 이상, ABTS 라디칼 소거능은 85.44% 이상으로 매우 높았다. DPPH 라디칼 소거능은 설탕 용액의 농도가 높을수록 다소 낮아지는 경향을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능은 모과 절편보다는 모과를 분쇄한 형태가 높았으며, 모과를 분쇄한 발효액은 설탕 용액 농도에 따른 ABTS 라디칼 소거능의 뚜렷한 차이를 나타내지 않았으나, 모과 절편 발효액의 경우, 설탕 용액의 농도가 높을수록 활성은 낮아지는 경향을 나타내었다. SOD 유사 활성의 경우, 첨가하는 설탕 용액의 농도가 높을수록 다소 증가하는 경향을 나타내었고, 모과 절편 형태보다는 모과를 분쇄하여 발효액을 제조한 것이 SOD 유사활성이 높았다. 아질산염 소거활성은 모든 시료에서 60% 이상으로 나타났다. 모과 분쇄물로 제조한 발효액에 첨가되는 설탕 용액의 농도에 따른 아질산염 소거활성의 차이는 뚜렷하지 않았으며, 모과 절편보다 모과 분쇄물을 이용하여 발효액을 제조하였을 경우 아질산염 소거활성이 더 높게 나타났다.
한편, 표 5에 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 40일째 모과 발효액의 DPPH 라디칼 소거능은 84.96%. ABTS 라디칼 소거능은 92.71%, SOD 유사활성은 28.98% 및 아질산염 소거활성은 61.42%로 제조예 1 및 제조예 2의 모과 발효액 모두 항산화 활성이 우수했다.
전통적 방식을 이용한 모과 발효액의 항산화 활성
항산화 활성 측정(%) 발효 40일 경과
DPPH 라디칼 소거능 84.96±0.20
ABTS 라디칼 소거능 92.71±0.29
SOD 유사활성 28.98±2.27
아질산염 소거활성 61.42±0.00
(6) 잔틴산화효소(xanthine oxidase, XO) 저해활성
XO 저해활성은 Stripe와 Corte의 방법에 따라 측정하였다. 시료용액 0.1㎖와 0.1M 칼륨인산완충액(PPB, potassium phosphate buffer, pH 7.5) 0.6㎖에 2mM 크산틴(xanthine)을 녹인 기질액 0.2㎖를 첨가하고, XO(0.2unit/㎖) 0.1㎖를 가하여 37℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 1N 염화수소(HCl) 1㎖를 가하여 반응을 종료시킨 다음 반응액 중에 생성된 요산(uric acid)의 양을 292nm 흡수 파장에서 측정하였다. 잔틴산화효소 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이 제조예 2의 전통 방식을 이용한 모과 발효액의 경우, 발효 40일째에 최대 XO 저해활성을 나타내었다가 이후 감소하였다. 한편, 도 6B에 나타난 바와 같이 제조예 1의 8일째 모과 발효액의 XO 저해활성은 33.08~38.85%의 범위로, 모과 절편은 50°brix 설탕 용액 첨가구보다는 60°brix 설탕 용액을 첨가한 것이 XO 저해활성이 높았으나, 60°brix와 70°brix 설탕 용액에서는 거의 유사한 활성을 나타내었다. 모과 분쇄물의 경우, 설탕 용액의 농도가 높을수록 XO 저해활성이 다소 증가하는 경향을 나타내었으나, 37.48~38.85%의 범위로 뚜렷한 차이를 보이지는 않았다. 발효 방법에 따른 XO 저해활성을 비교해 보았을 때, 제조예 1의 모과 발효액 제조방식이 제조예 2의 전통적인 발효액의 제조방식에 비해 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 발효 방법에 따른 모과 발효액의 발효 특성 비교를 통하여 모과 발효액의 제조를 위한 최적 조건을 50 또는 60°brix의 설탕 용액을 모과 분쇄물에 첨가하여 30℃의 온도하에 8일 동안 발효시키는 것으로 확립하였다.
실시예 2. 모과 발효액의 항염증효과 확인
실시예 1을 통해 확립한 본 발명의 발효조건으로 발효된 8일째 모과 발효액의 호흡기 질환에서의 항염증효과를 확인하기 위해, COX-2의 발현 및 NO의 생성량의 변화를 분석하였다.
(1) COX-2 발현 변화 확인
COX-2 발현 측정을 위해 사용된 폐동맥혈관 평활근 세포(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)를 6~8주령 C7 쥐의 폐를 적출하여 1% 제1형 콜라겐 분해효소(collagenase type 1) 용액을 이용하여 추출하였다. 그 후, 내피세포와 평활근 세포를 각각 분리하여 60㎜ 배양접시에 3일 동안 배양하였다. 이 중 평활근 세포를 2일에 1회 계대배양 하였으며, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 후, 1㎍/㎖의 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리하고, 12시간 동안 배양하여 실험에 이용하였다. 이때, LPS를 처리하지 않은 실험군을 음성대조군으로 사용하였고, 배양 후 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 시행하여 COX-2의 발현변화를 확인하였다.
실험에 사용된 모과 발효액의 희석은 세포에 사용한 배지를 이용하였으며, 모과 동결건조 분말은 50g의 분말에 75%(v/v) 에탄올을 첨가한 후, 7일간 실온 침지하여 추출하였다. 시료의 희석은 모과 발효액과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 폐동맥혈관 평활근 세포에서 LPS 처리에 의해 COX-2의 발현이 증가된 것을 확인하였고, 모과 발효액(MB)을 농도별(25, 50 및 100%(v/v))로 처리시 농도 의존적으로 COX-2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물(MP)은 COX-2의 발현을 감소시켰으나, 모과 발효액의 억제효과에 비하여 효과가 미미하였다.
(2) NO(Nitric Oxide) 생성량 확인
NO 생성량을 확인하기 위해서 대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주를 이용하였으며, 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 1% 항생제(antibiotics, penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM(Dulbeco’s modified Eagle’s medium high glucose, Welgene, Daegu, Korea)배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양기에서 1주일에 2~3회 계대배양하였다.
세포를 96 웰 배양접시에 1×105cells/㎖로 분주한 후, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였으며, 1㎍/㎖의 LPS를 첨가하여 12시간 배양시킨 후 실험에 이용하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 그리스 시약(Griess reagent, 1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid) 100㎕를 혼합하여 96 웰 배양접시에서 10분 동안 반응시킨 후, biotekmicroplate spectrophotometer를 이용하여 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이산화질소(NO2) 표준곡선은 아질산 나트륨(NaNO2)을 농도별로 조제하여 사용하였다.
실험에 사용된 모과 발효액의 희석은 세포에 사용한 배지를 이용하였으며, 모과 동결건조 분말은 50g의 분말에 75%(v/v) 에탄올을 첨가한 후, 7일간 실온 침지하여 추출하였다. 시료의 희석은 모과 발효액과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 모과 발효액(MB)을 농도별(25, 50 및 100%(v/v))로 처리시 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하였으며, 모과 동결건조 분말의 에탄올 추출물(MP)의 감소효과에 비해 더욱 우수하였다.
COX-2 및 NO의 감소효과를 확인한 결과 실시예 1을 통해 최적화된 제조방법으로 발효된 모과 발효액은 모과 에탄올 추출물에 비해 항염효과가 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

Claims (7)

1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 50 또는 60°Brix의 설탕 용액을 2 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 30℃의 조건에서 8일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조되는 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기성 비염, 기침, 가래, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제2항에 있어서, 상기 기관지염은 급성 기관지염, 만성 기관지염, 세기관지염, 카타르성 기관지염 및 폐쇄성 및 염증성 기관지 질병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 모과 발효액은 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 저해하고, NO의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 50 또는 60°Brix의 설탕 용액을 2 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 30℃의 조건에서 8일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조되는 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
1) 모과 세척 후 물기를 제거하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 물기가 제거된 모과의 핵을 제거하고 분쇄하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 분쇄된 모과 1 중량부에 대하여 50 또는 60°Brix의 설탕 용액을 2 중량부로 혼합하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 혼합물을 30℃의 조건에서 8일 동안 자연발효하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조되는 모과 발효액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품.
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