KR101846713B1 - 항비만 활성을 가진 다시마 발효물의 제조방법 - Google Patents

항비만 활성을 가진 다시마 발효물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다시마를 다시마 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액을 추출용매로 추출하여 다시마 추출물을 제조하는 단계 및 상기 다시마 추출물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법, 구체적으로 다시마를 30% 에탄올 수용액 추출물을 추출용매로 추출하여 다시마 추출물을 제조하는 단계; 상기 다시마 추출물에 셀루클라스트를 처리하여 다시마 추출물 효소 처리물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물 효소 처리물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것이다.

Description

항비만 활성을 가진 다시마 발효물의 제조방법{A METHOD OF PREPARING FERMENTED LAMINARIA JAPONICA HAVING ANTI-INFLAMMATORY}
본 발명은 다시마를 발효시킨 다시마의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항비만 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항비만 활성을 가진 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것이다.
경제수준 향상에 의한 영양과잉, 환경오염, 운동부족, 스트레스 증가 등에 따른 각종 생활습관병 및 만성퇴행성질환의 만연이 우리 사회의 큰 문제로 대두되고 있다. 이 중, 최근에 가장 관심이 집중되고 있는 질병이 비만이다.
비만은 일반적으로 음식물로 섭취한 에너지(energy intake)가 신체활동 등으로 소비한 에너지(energy expenditure)와 균형을 이루지 못하여, 잉여의 에너지가 체내에 지방세포(adipocyte)의 양적, 수적 증가를 일으켜 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 유전적 요인, 환경적 요인, 정신적 요인 또는 식사습관 및 운동부족 등의 생활습관 등에 의하여 신체 내 에너지 밸런스가 무너져 생기는 질환을 의미한다.
상기 비만과 관련하여 지방화(Adipogensis)에 대한 연구가 진행되고 있다. 상기 지방화란 전구지방세포로부터 지방세포가 분화되어 지방을 축적하게 되는 과정을 말하며, 상기 지방화는 비만, 당뇨병, 지방간 및 관상 심장질환 등 대사성질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상기 지방세포는 단순히 에너지 저장고 역할 뿐만 아니라 내분비 기관으로서 adipocytokine이라는 단백질성 호르몬을 분비하여 체내 에너지 항상성 유지를 위한 다양한 기능을 수행하고 있다. 그러나, 과다한 지방세포의 분화와 불균형적인 에너지 대사는 지방세포의 비정상적인 유전자 발현과 신호전달 체계 이상을 초래하여 adipocytokine의 분비 이상을 야기시킬 수 있다.
상기 지방세포의 분화과정을 유도하는 전사인자(transcription factors)로는 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ) 및 C/EBP(CCAAT enhancer binding protein)가 보고되어 있다. 상기 전사인자는 지방세포 분화과정 중 각기 다른 시점에서 발현이 유도되며, 서로 상호작용을 통하여 지방세포 특이 유전자들의 발현을 조절하고 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 점진적으로 유도해 나간다.
우선, PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)는 핵수용체에 속하며, 지방세포 특이적인 fatty acid binding protein인 aP2뿐 만 아니라 다른 많은 유전자들의 발현을 유도한다. 이와 관련하여, 기존 연구에서는 레트로바이러스를 이용하여 전구지방세포가 아닌 섬유아세포에 PPARγ를 과발현시킨 경우, 일반적인 섬유아세포에서도 지방세포 분화가 일어난다는 것이 보고되어 있다.
상기 전사인자들에 의해 유도되는 지방세포의 분화는 confluence, hormonal induction, clonal expansion, growth arrest 및 terminal differentiation의 단계로 진행된다. 먼저, 전구지방세포는 confluence 상태가 되면 세포주기가 G0/G1 시기가 되어 growth arrest가 일어난다. 이후, 적당한 분화 자극과 C/EBPβ와 C/EBPδ의 발현에 의해 한 번 혹은 두 번의 세포분열이 일어나는 clonal expansion 단계에 들어간다. 이어 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 통하여 전구지방세포는 완전한 분화의 형태를 보이기 직전의 단계인 growth arrest의 시기로 접어들게 된다. 마지막 단계인 terminal differentiation은 수 일에서 수 주의 시간이 걸리고, 지속적인 growth arrest가 일어나면 성숙된 지방세포의 특징이 점차 나타나게 된다.
구체적으로, 분화 초기에 섬유아세포와 유사했던 전구지방세포는 형태적으로 둥글게(morphological rounding-up)되고, lipoprotein lipase 등의 mRNA가 발현되기 시작하며, 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPδ의 transient induction이 일어난다. 이후, PPARγ와 C/EBPα가 발현되어 실제로 지방세포의 표현형을 결정짓는 대부분의 유전자들을 조절하거나 그 발현을 활성화 시킨다. 이러한 과정을 통해서 지질 방울들이 세포질로 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 방울(droplet)이 된다.
또한, 상기 비만은 당뇨병과 같은 대사증후군과 함께 문제가 되기도 하고, 상기 대사증후군에 의하여 비만이 초래되거나 비만에 의하여 대사증후군이 초래되기도 한다.
상기 비만과 같은 대사증후군을 해소하고 적정한 체중을 유지하기 위한 비만치료기전으로는 식욕의 조절, 지방의 소화 및 흡수 방해, 에너지 소비의 증가, 지질대사의 조절 등이 있는데, 기존의 비만 치료제의 경우에는 상당한 부작용을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물 중에서 비장세포의 성장 및 분화 조절, 지방조직의 과다나 지방대사 이상으로 유발되는 대사성 질환을 치료할 수 있는 약물의 개발이 요구되고 있다.
또한, 발효란 효소 작용에 의해 복잡한 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유 에너지를 내놓는 현상으로, 일반적으로 미생물이 유기물을 분해해서 대사산물을 축적하는 현상을 말한다. 또 다른 측면에서, 발효는 고분자량의 유기 화학물로부터 보다 간단한 물질을 얻기 위해 대사과정을 수행하는 생화학반응을 의미한다.
발효는 필수 아미노산을 생합성하거나 단백질 함량과 섬유질의 소화가능성을 개선함으로써, 식품의 영양학적 가치를 증가시킨다. 또한, 발효는 칼슘이나 인 또는 다양한 비타민과 같은 미량영양소(micronutrient)의 생물학적 이용가능성(bioavailability )도 개선시킨다.
이러한 발효과정에 사용되는 대표적인 미생물로, 유산균, 효모, 아세트산균 등이 있으며, 이 중 오랜 시간 동안 발효식품의 제조에 관여하여 안전성이 확보된 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)이 주로 관심을 받고 있다.
상기 유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물로 젖산균이라고도 불리운다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 미생물이다. 상기 유산균은 형태학적으로 포자를 형성하지 않고(non-spore forming), 그람 양성(gram-positive )이며, 간균(rods)과 구균(cocci)으로 구분된다.
전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품 등 널리 식품으로 사용된 유산균은 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받고 있다. 따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물을 이용한 방법들에 대한 연구가 진행되고 있으며, 최근에는 각국의 연구진에 의하여, 식이요법과 함께 사용될 각종 기능성 식품이나 식이보충제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
이러한 유산균의 안정성 및 유산균이 건강에 좋다는 인식을 기초로 하여 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 최근 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다.
또한, 우리나라는 3면이 바다와 접해 있는 지형을 가지고 있으며, 약 750여 종의 해조류가 분포되어 있다. 또한, 육상생물자원의 고갈 및 전염병 등에 의한 오염과 새로운 자원의 보고로서 해양에 대한 관심이 증가되며, 최근에는 해양생물자원 유래의 기능성 천연 생리활성물질에 대한 관심이 지속적으로 높아지고 있다. 특히, 해조류 유래의 생리활성물질이 영양적인 측면은 물론 각종 질병의 치료 및 건강 유지 등에 도움이 된다는 많은 연구결과가 지속적으로 보고되고 있는 실정이다. 이러한 관심에도 불구하고, 우리나라의 경우, 우리나라의 해안에 서식하고 있는 다양한 해조류 중 극히 일부분인 30 여종을 식용으로 소비하거나, 식품첨가물이나 공업용 다당류의 원료 또는 비료 및 사료의 원료 등으로 이용하고 있는 것으로 보고되고 있다.
다양한 생리활성물질을 가지고 있는 해조류의 경우, 주로 해조류 내의 유용성분을 열수로 직접 추출하거나, 알칼리, 산 또는 효소 등을 처리하여 추출한 후 가공하는 방법으로 이용하고 있다. 그러나, 이러한 추출공정만으로는 해조류에 포함된 성분들을 효과적으로 추출해내지 못하는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, 최근에는 미생물을 이용하여 해조류를 발효하려는 시도들이 행해지고 있지만, 해조류 발효 추출물에 대한 체계적인 생리활성검증에 대한 보고는 미흡하며, 개별 해조류 별 생리활성을 개선시킬 수 있는 적합한 미생물에 대한 연구가 제한된 실정이다. 따라서, 해조류의 발효물에 대해 기능성을 부여하는 등 해조류의 품질 향상을 위한 제조방법 또는 이를 위한 미생물에 대한 연구의 필요성이 점차 증가하고 있다.
KR 1020040037011 A KR 1020030055219 A KR 1020150137647 A
상기와 같은 필요성에 따라, 본 발명은 다시마 추출물의 발효물의 생리활성을 개선할 수 있는 유산균을 이용한 다시마 추출물의 발효물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 필요성에 따라, 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및 상기 효소로 처리한 효소 처리물을 유산균으로 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 다시마 발효물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다시마를 발효시킨 다시마의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항비만 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항비만 활성을 가진 다시마 추출물의 발효물 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다시마(Laminaria japonica)를 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액을 추출용매로 추출하여 다시마 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
상기 추출용매는 30% 에탄올 수용액인 것일 수 있다.
상기 다시마 발효물 제조단계는 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 6 내지 7 Brix로 농축한 다시마 30% 에탄올 수용액 추출물 77 중량부, 포도당(glucose) 4 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 4 중량부 및 증류수 15 중량부를 포함한 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 상기 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)을 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 다시마 발효물 제조단계는 상기 다시마 추출물이 포함된 발효대상물에 상기 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)을 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효액을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물을 제조하는 단계는 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조과정; 및 상기 다시마 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 과정은 상기 다시마 추출물에 셀루클라스트(celluclast)를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 다시마 추출물 제조단계; 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법은 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물의 효소처리물을 포함한 발효대상물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계는 상기 다시마 추출물에 셀루클라스트(celluclast)를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물 을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물에 관한 것일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 BJ20 균주를 이용하여 발효시키는 경우, 다시마 추출물의 발효물의 항비만 효과를 현저하게 개선시킬 뿐만 아니라, 해당 유산균은 GRAS 미생물로서, 해당 유산균을 이용하여 식용인 다시마를 발효시켜 제조된 발효액을 안전한 에탄올 용매를 이용하여 추출하는 것으로서 안전성도 확보되므로, 다시마 추출물의 발효물의 다양한 산업적 용도, 특히 화장품 소재 등으로의 활용 및 관련 제품의 품질 향상에 이바지할 수 있다는 점에서 관련 산업에 다양하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 종류에 따른 효소 처리물의 항비만 효과를 확인하기 위한 PTP1B 저해 효과를 확인한 그래프로, STE는 다시마 추출물을 의미하고, STE + Saczyme은 다시마 추출물의 사크짐 효소 처리물을 의미하며, STE + Celluclast는 다시마 추출물의 셀루클라스트 효소 처리물을 의미하고, STE + Viscozyme은 다시마 추출물의 비스코자임 효소 처리물을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다시마 효소 처리물의 발효물(FST)의 항비만 효과를 3T3-L1 세포를 이용하여 Oil red staining 결과를 통해 지방세포 분화정도를 확인한 사진으로, FST는 실험군인 다시마 효소 처리물의 발효물을 의미하고, STE는 대조군인 다시마 효소 처리물을 의미하며, 수치는 다시마 추출물의 효소 처리물의 발효물의 처리량을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 다시마 효소 처리물의 발효물(FST)의 항비만 효과를 3T3-L1 세포를 이용하여 지방세포의 분화에 중요한 전사인자인 PPARγ 또는 C/EBPα의 함량을 확인한 그래프로, 도 3a 및 도 3b는 다시마 효소 처리물을 처리한 결과를 나타내고, 도 3c 및 도 3d는 다시마 효소물을 처리한 결과를 나타내며, 도 3a 및 도 3c는 다시마 효소 처리물(STJ)을 의미하고, 도 3b 및 도 3d는 다시마 효소 처리물의 발효물을 처리한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 다시마 효소 처리물의 발효물(FST, 도 4b)과 다시마 효소 처리물(STJ, 도 4a)을 처리한 결과, 3T3-L1 세포를 이용하여 지방세포의 분화에 중요한 전사인자인 C/EBPα의 전사여부를 확인한 사진으로, 도 4a는 다시마 효소 처리물의 발효물을 처리한 결과로,'-'는 미처리를 의미하고, '+'는 시료 처리를 의미하며, 수치는 시료를 처리한 양을 의미한다.
본 발명은 다시마를 발효시킨 다시마의 발효물의 생리활성, 구체적으로 항비만 활성을 현저하게 개선시킬 수 있는 유산균, 구체적으로 락토바실러스 브레비스 균주로 발효시키는 단계를 포함하는 항비만 활성을 가진 다시마 추출물의 발효물 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물의 산업적 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 다시마 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 락토바실러스 브레비스 균주를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 다시마(Laminaria japonica)은 갈조식물 모자반과에 속하는 해조류로, 우리나라에서 식용으로 널리 이용되고 있는 바닷말의 일종이다. 우리나라의 서해안, 남해안 및 제주지역뿐만 아니라 일본과 중국 등지에 널리 분포하고 있다. 상기 다시마는 칼슘과 철 등의 무기질과 비타민뿐만 아니라 아미노산과 식이섬유가 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 연구에서는 항균, 항산화, 항고지혈증, 항콜레스테롤 효과 등 다양한 기능성이 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 다시마의 기능성을 이용하기 위한 연구는 주로 다시마의 열수 또는 주정을 이용한 추출물이나 알칼리 및 산 처리 또는 효소 처리한 처리물과 관련된 것이나, 이들 방법에 의한 추출물 또는 처리물은 해조류에 다량 포함된 비소화성 복합다당류 등의 유용성분을 효과적으로 추출하기 어렵다는 단점을 가지고 있으며, 해조류 특유의 이취와 관련된 문제를 해결하지 못한다는 단점이 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 생촉매(biocatalyst)란 여러 가지 화학반응 또는 생화학반응에서 촉매의 역할을 하는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 포함하는 것일 수 있고, 일 예로 화학반응 또는 생화학반응을 촉매하는 미생물, 미생물 배양액 및 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배지(culture medium)란 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 포함하거나, 특수한 목적을 위하여 상기 주성분 외에 추가적인 물질을 더욱 포함하는 것을 의미하며, 배양배지, 배양기 또는 배양액이라고도 한다. 상기 배지는 천연배지, 합성배지 또는 선택배지가 있고, 성상에 따라 고체배지 또는 액체배지가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 유효성분이란 조성물, 구체적으로 의약 조성물 또는 식품 조성물에 있어서 항비만 효과를 제공하는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 비만은 체내에 지방세포(adipocyte)가 양적, 수적 증가로 인해 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하고, 이러한 지방세포의 양적 수적 증가는 지방화 즉, 지방세포의 분화와 지방의 축적에 의하여 발생하는 것을 의미한다.
본 발명자들은 다시마의 항비만활성을 개선하는 방법을 연구하던 중, 우선적으로 효소처리에 있어서, 셀루클라스트(celluclast)를 처리하는 경우 다른 효소와 달리 항비만 효과가 개선됨이 확인되었고, 추가로, 상기 효소 처리물에 다양한 유산균을 접종하여 발효시킨 결과, 락토바실러스 브레비스 균주(Lactobacillus brevis)인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20) 균주로 다시마를 발효하는 경우, 다른 유산균 및 미생물에 비해 항비만 활성을 우수하게 개선시킨다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 다시마 추출물을 제조하는 단계; 및 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것이다.
상기 다시마 추출물을 제조하는 단계는 다시마(Laminaria japonica)를 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액, 바람직하게는 10%(v/v) 내지 90%(v/v)의 에탄올 수용액, 더욱 바람직하게는 다시마에 30% 에탄올 수용액(v/v)을 추출용매로 추출하여 다시마 추출물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 다시마 추출물을 제조하는 단계는 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조과정; 및 상기 다시마 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 셀룰라아제는 셀룰로오스를　가수분해하는　효소의 총칭으로, 협의의 의미로는 엔도-1,4-β-글루카나아제(endo-1,4-β-glucanase,　EC, 3.2.1.4)를 의미하고, 광의의 의미로는 그 작용특성에 따라 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-glucanase,　EG,　EC　3.2.1.4),　exo-β-1,4-glucancellobiohydrolase (exocellobiohydrolase,　CBH,　EC　3.2.1.91),　cellobiase(β-glucosidase　G,　EC　3.2.1.21)로 분류된다. 상기 셀룰라아제는 바람직하게는 셀루클라스트(celluclast) 또는 Novo사가 제조한 셀루클라스트일 수 있다.
이러한 측면에서, 상기 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 과정은 상기 다시마 추출물에 셀루클라스트(celluclast)를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 다시마 추출물에 첨가되는 셀루클라스트의 첨가량은 6 brix의 다시마 추출물 100 중량부를 기준으로 5 내지 20 중량부, 바람직하게는 11 중량부로 첨가될 수 있다.
상기 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계는 상기 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 다시마 발효물 제조단계는 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 6 내지 7 Brix로 농축한 다시마 30% 에탄올 수용액 추출물 77 중량부, 포도당(glucose) 4 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 4 중량부 및 증류수 15 중량부를 포함한 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 상기 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)을 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 다시마 발효물 제조단계는 상기 다시마 추출물이 포함된 발효대상물에 상기 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)을 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효액을 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물의 효소처리물을 포함한 발효대상물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계는 상기 다시마 추출물에 셀루클라스트(celluclast)를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 관한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물 을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물의 발효물은 상기 다시마 추출물의 발효물을 시료로 하여 실험을 수행한 결과, 다시마 자체, 다시마 효소 처리물 또는 다른 미생물을 이용하여 제조된 추출물의 발효물에 비하여, 항비만활성 개선 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
이러한 측면에서, 본 발명은 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물에 관한 것이다.
상기 유효성분은 상기 다시마 추출물의 발효물 제조방법에 의해 제조된 다시마의 추출물의 발효물 일 수 있으며, 바람직하게는 다시마를 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액을 추출용매로 추출하여 다시마 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물이 포함된 발효 대상 조성물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법으로 제조된 것 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및 상기 다시마 추출물의 효소처리물을 포함한 발효대상물에 락토바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법으로 제조된 것 일 수 있다.
본 발명의 다시마 추출물의 발효물이 식품 조성물로 사용되는 경우, 비만의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에 있어서, 기능성이라 함 은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻 을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 비만 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물 일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 조성물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.
상기 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물 100 중량부 당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g이다.
또한, 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물은 다른 효소로 처리한 처리물을 발효시키거나, 다른 유산균으로 발효시킨 경우와 비교하여 항비만 효과, 구체적으로 지방세포 분화 억제 효과 및 지방세포 분화 관련 전사인자 억제능이 현저하게 우수하다는 것이 확인되어, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 뛰어난 비만 예방 또는 개선 효과를 보이는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분 즉, 다시마 추출물의 발효물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
상기 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 20 중량% 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분 즉, 다시마 추출물의 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
더 나아가, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은, 상기 유효성분 이외에 공지의 비만 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 천연물에 대한 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 200 중량부로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시 할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 실험은 각각 동일한 실험을 3회 수행하였으며, 각각의 실험결과로 얻어진 자료는 SPSS+/WIN12.0(Statistical Package for Social Science, version 12.0, IBM, Armonk, NY, USA) 통계프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차(Mean ± SEM)로 표시하였다. 집단간의 유의성 검증 위해, 일원배치 분산분석(ANOVA)을 통해 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test를 실시하여 P < 0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
실시예 1. 항비만 효과 향상을 위한 다시마 추출방법의 최적화
본 실험에 사용한 다시마(Laminaria japonica) 시료는 부산 기장 지역에서 채취한 다시마를 유수에서 세척 및 탈염시킨 후, 건조시킨 다음, 건조된 다시마를 초미세 기류식 분쇄기(KMS-200, Korea Medi Co., 대한민국)로 분쇄하여 제조하였다. 상기 제조된 다시마 시료는 밀봉하여 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
상기 다시마 추출물은 용매 추출법으로 제조하였으며, 구체적으로 다시마 시료 100 g에 물, 30% 에탄올(30% 주정) 및 70% 에탄올(70% 주정) 각 1,500 g을 첨가하고, 70℃에서 30분간 추출하여 추출물을 제조한 후, 상기 추출물을 상온에서 냉각하고, 여과지를 이용하여 여과하였다. 상기 여과된 추출물은 120 내지 125℃에서 30분간 고온가압 멸균한 후, 냉각하고, 실험에 사용될 때까지 - 20℃에서 보관하였다.
상기 추출용매에 따른 각각의 추출물에 대해 물성과 성분을 확인하였고, 다시마의 항비만 관련 유효성분인 글루타메이트(glutamate)을 조사하여, 항비만 효과를 갖는 다시마 발효물 제조를 위해 적합한 추출용매를 확인하였다. 상기 확인결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구 분 pH Brix(%) NaCl(%) Glutamate 함량(%)
100% 물 6.9 내지 7.2 2.0 내지 3.2 2.0 내지 2.2 3.32
30% 주정 6.5 내지 7.2 5.0 내지 6.2 0.9 내지 1.3 7.00
70% 주정 6.8 내지 7.0 3.5 내지 4.5 0.6 내지 0.7 5.80
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 30% 주정을 이용하여 제조된 용매 추출물은 글루타메이트 함량도 가장 높으며, 이는 단순히 물 함량이 높거나 에탄올 함량이 높은 경향성과 관련이 없는 것으로, 상기 30% 주정이 포함된 용매는 추출용매의 항비만 효과 개선이란 측면에서 임계적 의의가 인정되는 것으로 평가되었다.
실시예 2. 항비만 효과 향상을 위한 최적화 효소의 선택
상기 실시예 1에서 최적의 추출용매로 확인된 30% 에탄올 수용액을 이용하여 제조된 다시마 추출물의 항비만 효과를 증진하기 위해 효소처리 방법을 검토하였고, 여러 효소의 종류에 따른 항비만 효과 개선 정도를 확인하였다.
구체적으로, 다시마 추출물에 대하여 Novo사(Novozyme Nordisk, Denmark)로부터 구입한 3종의 상업용 효소인 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(Viscozyme) 및 사크자임(Saczyme)을 이용하여 하기 표 2와 같은 조건에서 효소반응을 수행하였다. 상기 효소반응은 하기 표 2의 조건에서 진탕배양(150 rpm)하며 24시간 동안 수행하였고, 이 후 100℃에서 10분간 처리하여 효소를 실활하였다.
사크자임
(Saczyme)		 셀루클라스트
(celluclast)		 비스코자임
(Viscozyme)
기원 Asperillus aculeatus Trichoderma reesei Asperillus niger
최적 pH
(pH)		 3.3 내지 5.5
(5)		 4.5 내지 6
(5)		 3.5 내지 4.5
(4)
최적 온도
(℃)		 25 내지 55
(50)		 50 내지 60
(50)		 60 내지 70
(60)
특징 complex carbohydrases Cellulase Glucoamylase
활성 100 FGBG/g 700 EGU/g 750 AGU/g
6 Brix의 기질당
처리조건		 8%(w/w) 11%(w/w) 10%(w/w)
상기 효소 처리방법으로 처리된 효소 처리물의 항비만효과는 PTP1B 분석으로 수행하였다.
구체적으로, PTP1B 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, Protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B, human, recombinant)는 BIOMOL Research Laboratories, Inc.로부터 구입하였다. 효소활성은 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol(DTT)가 포함된 50 mM citrate(pH 6.0) 완충용액에 2 mM p-nitrophenyl phosphate(pNPP) 및 2.5 ng/well PTP1B와 상기 다시마 효소 처리물 시료로 조성된 반응혼합물을 이용하여 측정하였다. 상기 다시마 효소 처리물 시료는 DMSO를 이용하여 stock solution을 제조한 후 0 내지 100 μg/mL 범위로 희석하며 사용하였다. 상기 반응혼합물은 30℃에서 30 분간 반응시킨 후, 1 N NaOH를 이용하여 반응을 정지하였다. 상기 생산된 p-nitrophenol의 농도는 405 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 양성대조구로 50 μg/mL의 ursolic acid를 이용하였다. 상기 측정결과를 기초로 항비만 효과는 다음 계산식의 방법으로 계산하였다.
[계산식 1]
저해효과(%) = {[(DMSO 흡광도 값 - DMSO blank 흡광도 값) - (시료 처리 후 흡광도 값 - 시료 무 처리 흡광도 값)] / (DMSO 흡광도 값 - DMSO blank 흡광도 값) x 100 }
[계산식 2]
IC50 (μg/mL) = [(50% - 저농도의 저해효과(%))/(고농도의 저해효과(%) - 저농도의 저해효과(%))] X (고농도의 저해효과(%) - 저농도의 저해효과(%)) + 저농도의 저해효과(%)
상기 계산식을 통하여, 반응 후 PTP1B 분석(PTP1B assay)을 이용한 항비만 효과(IC50, μg/ml)를 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
항비만 활성(IC50, μg/ml)
STE 0.97 ± 0.03
STE + Saczyme 0.13 ± 0.01
STE + Celluclast 0.05 ± 0.01
STE + Viscozyme 0.12 ± 0.02
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 대조구인 다시마 추출물(STE)의 항비만 효과에 의한 IC50인 0.97±0.03 μg/ml인 반면, 효소를 처리하는 경우 현저하게 우수한 항비만 효과 개선능이 확인되었고, 특히, Saczyme과 Viscozyme의 경우 항비만 효과가 0.1 μg/ml 정도로 다시마 추출물의 약 13% 정도의 투약만으로도 유사한 효과를 나타내었으나, Celluclast는 0.05 μg/ml 정도로 다시마 추출물의 약 6% 정도의 투약만으로도 유사한 효과를 나타내었다. 상기 결과로부터 다시마 추출물의 효소 처리를 위한 최적 효소는 셀루클라스인 것으로 확인되었다.
실시예 3. 다시마 추출물의 발효물 기능성 향상을 위한 최적 균주 선택
3-1. 최적 균주의 선택
상기 실시예 1 및 2에서 확인된 30% 에탄올 수용액으로 제조된 다시마 추출액을 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Bix의 다시마 추출물을 제조한 후, 셀루클라스트를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하여 발효대상 시료를 제조하였다.
상기 발효대상 시료를 발효할 유산균으로 총 6종의 유산균, 구체적으로 기존 기탁된 3종의 균주와 본 발명에서 해조류 발효 대상 균주로 선택된 3종의 하기 표 4의 유산균을 이용하였다. 우선, 상기 6종의 유산균을 효모추출물 3%(w/w), 포도당 1%(w/w) 및 증류수가 포함된 전배양 배지에서 24시간 배양한 후, 상기 전배양액을 6 내지 7 Brix의 다시마 추출물의 효소처리물 77%(w/w), 효모추출물 4%(w/w), 포도당 4%(w/w), 및 증류수 15%(w/w)로 혼합한 본 배양액에 25%(v/v) 접종하고, 48시간 배양하였다. 상기 배양 후, 본 배양액은 121℃의 조건에서 15분간 처리하여 멸균한 다음, 원심분리를 통하여 상층액을 회수하여 PTP1B assay에 의한 항비만 효과를 조사하였다. 대조군은 유산균을 첨가하지 않은 배양액으로 하였다. 상기 PTP1B assay에 의한 항비만 효과 결과를 표 4에 나타내었다.
균주 종류 항비만 활성(IC50, μg/ml)
대조구(추출물 효소 처리물) 1.25
Lactobacillus brevis BJ20(KCTC11377BP) 0.80
Lactobacillus plantarum B-134 2.57
Lactobacillus casei(KACC12413) 3.65
Lactobacillus parabuchneri B-139 3.29
Lactobacillus sakei(KACC12414) 2.42
Lactobacillus pentosus B-115 4.38
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 다른 유산균에서는 오히려 항비만 활성이 감소하는 결과가 나타난 반면, 다시마 추출물의 효소 처리물이 첨가된 혼합배양액에서 Lactobacillus brevis BJ20이 접종되어 배양된 혼합배양액에서는 항비만 효과가 현저하게 개선되는 것이 확인되었다. 상기 결과로부터, Lactobacillus brevis BJ20는 다른 유산균과 달리 항비만 개선 효과를 가지는 유일한 균주인 것으로 확인되었다.
상기 항비만 개선 효과가 우수한 것으로 확인된 Lactobacillus brevis BJ20의 처리에 따른 개선 효과가 가수분해 효소 종류에 따라 상이하게 변화될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 실시예 2에서 사용된 3종의 효소를 이용한 효소 처리물에 상기와 같이 Lactobacillus brevis BJ20를 접종하고 발효하여, 최종적으로 수득한 발효물에 대해 PTP1B assay를 수행하였다. 상기 PTP1B assay은 상기한 바와 같이, 균주를 접종하여 발효한 배양액을 121℃의 조건에서 15분간 처리하여 멸균한 다음, 원심분리를 통하여 상층액을 회수하고, 상기 회수된 상층액에 대해 PTP1B assay에 의한 항비만 효과를 조사하는 방법으로 수행하였다. 상기 PTP1B assay에 의한 항비만 효과 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 셀루클라스트(celluclast)를 처리하고 BJ20으로 발효한 경우, IC50값은 0.8 ug/ml로 항비만 효과가 가장 유사하였고, 사크자임(Saczyme)의 IC50값은 1.03 ug/ml, 비스코자임(Viscozyme) 의 IC50값은 1.12 ug/ml 순으로 확인되어, 상기 실시예 2와 같이 BJ20으로 발효하는 경우에도 셀루클라스트를 처리하는 것이 가장 바람직한 것이 확인되었다.
3-2. 최적 균주에 의한 항비만 효과 개선능 확인
최적 균주에 의한 발효를 통한 항비만 효과 개선은 전구지방세포인 3T3-L1 세포주를 이용하여 확인하였다.
우선, 전구지방세포 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)으로부터 분양을 받아서 사용하였다. 상기 전구지방세포 3T3-L1 세포는 100 Units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin과 10% newbone calf serum(FCS, Hyclone)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Hyclone) 배지의 조건에서 5% CO2와 37℃의 세포배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다.
상기 최적 균주로 발효시킨 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물에 의한 전구지방세포의 지방세포로의 분화를 억제하는 효과를 확인 하기 위하여, 상기 계대배양한 전구지방세포 3T3-L1 세포를 6-well plate에 분주하여 2일간 배양하고, 세포가 well plate에 완전히 성장하더라도 다시 2일 배양한 후, 분화유도 배양액(MDI(10 μg/ml insulin, 0.5 μM dexamethasone, 0.8 mM isobutylmethyl xanthine)를 함유한 DMEM 배지)로 교환하여 2일간 분화를 유도하였다. 그 다음에 다시 10 μg/ml insulin만이 함유된 DMEM배지로 교환하여 2일간 배양하고, 다시 10% FBS가 함유된 DMEM배지로 교환하여 4일 후에 실험에 이용하였다.
상기 6-well plate 배양된 세포에 분화유도와 함께 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물을 첨가하여 분화정도를 실험하였다. 대조군은 다시마 추출물 효소 처리물을 첨가한 것으로 확인하였다. 상기 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물 또는 다시마 추출물 효소 처리물을 각각 첨가하여 분화를 유도한 후, 지방 생성량은 분화유도가 끝난 세포를 PBS로 washing 하여 10% formalin으로 실온에서 30분간 고정시킨 후에 4% Oil Red O 용액으로 30분간 염색하여 Oil Red O 용액에 의하여 적색으로 염색된 지방을 현미경으로 지방의 염색 정도를 평가하여 효능을 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물과 대조군은 다시마 추출물 효소 처리물을 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 mg/ml 처리한 결과, 분화를 유도하지 않은 처리 군에서는 염색이 되지 않은 것을 확인하였고, 분화를 유도한 처리 군에서 붉게 염색된 것을 확인할 수 있었으며, 대조군에 다시마 추출물 효소 처리물인 실험군에서 모든 농도에서 농도 의존적으로 붉게 염색된 수준이 감소함으로써 지방세포의 분화가 억제된 것을 확인할 수 있었다.
추가로, 지방세포의 분화에 중요한 전사인자인 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)와 C/EBP α(CCAAT/enhancer binding protein α)이 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물과 다시마 추출물 효소 처리물 처리 시 지방세포 분화에 관련된 인자들의 발현 양에 어떠한 영향을 미치는지 mRNA 수준으로 Real-time PCR으로 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물과 대조군은 다시마 추출물 효소 처리물을 0.5, 및 1 mg/ml 처리한 결과, 모든 농도에서 감소 효과가 확인되었으며, 다시마 추출물 효소 처리물에 비하여 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물의 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물과 다시마 추출물 효소 처리물 처리 시 지방세포의 분화에 중요한 전사인자인 C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein)의 발현 양에 어떠한 영향을 미치는지 단백질 수준으로 Western blot으로 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물과 대조군은 다시마 추출물 효소 처리물을 0.5, 및 1 mg/ml 처리한 결과, 모든 농도에서 농도 의존적으로 감소하여, 항비만 효과가 증대됨이 확인되었으며, 다시마 추출물 효소 처리물에 비하여 다시마 추출물 효소 처리물의 발효물의 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
한국생명공학연구원 KCTC11377BP 20080819

Claims (9)

  1. 다시마에 30% 에탄올 수용액을 첨가하여 용매 추출하여 다시마 추출액을 제조한 후, 여과 및 감압농축하여 6 내지 7 Brix 다시마 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계;
    상기 다시마 추출물에 셀루클라스트(celluclast)를 첨가하고 pH 4.5 내지 pH 6.0의 pH 조건 및 50℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 효소반응시켜 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 다시마 추출물의 효소처리물을 제조하는 단계; 및
    전체 조성물 100 중량부를 기준으로 6 내지 7 Brix로 농축한 상기 다시마 추출물의 효소처리물 77 중량부, 포도당(glucose) 4 중량부, 효모 추출물(yeast extract) 4 중량부 및 증류수 15 중량부를 포함한 상기 다시마 추출물의 효소처리물이 포함된 발효 대상 조성물에 바실러스 브레비스 균주로, 다시마의 발효물의 항비만 활성을 개선하는 기탁번호 KCTC 11377BP인 락토바실러스 브레비스 BJ20(Lactobacillus brevis BJ20, KCTC 11377BP)를 접종하고 30℃에서 30일 동안 발효시켜 다시마 발효물을 제조하는 다시마 발효물 제조단계
    를 포함하는 항비만 활성을 갖는 다시마 추출물의 발효물 제조방법.
  2. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 다시마 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물.
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