KR102414355B1 - 김치로부터 분리된 유산균을 이용한 미강 발효물 제조방법 및 그로부터 제조된 미강 발효물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미강 발효물 제조방법 및 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 미강 발효물의 제조에 사용된 균주는 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주로 아르기닌으로부터 시트룰린 및 오르니틴을 생산할 수 있는 생산능이 우수할 뿐만 아니라 고농도의 미강 혼합액에서도 생육이 가능하고 발효 효율이 우수한 특징이 있어, 미강 발효 과정에서 고농도의 시트룰린 및 오르니틴을 생산할 수 있어서, 시트룰린 및 오르니틴이 고농도로 포함되어 기능성이 강화된 미강 발효물을 제조할 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명의 미강 발효물 제조방법은 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물은 미강 발효물 내에 시트룰린과 오르니틴이 고함량으로 들어 있어, 우수한 기능성을 갖는다. 이러한 측면에서, 상기 미강 발효물은 기능성 식품으로 활용될 수 있으며, 상기 기능성 식품은 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방용 식품 조성물 또는 건강기능성 식품일 수 있다.

Description

김치로부터 분리된 유산균을 이용한 미강 발효물 제조방법 및 그로부터 제조된 미강 발효물{METHOD FOR PREPARING FERMENTED RICE BRAN BY USING WEISSELLA KOREENSIS AND FERMENTED RICE BRAN PREPARED THEREBY}

본 발명은 유산균을 이용한 발효 미강 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 발효 미강에 관한 것이다.

경제수준 향상에 의한 영양과잉, 환경오염, 운동부족, 스트레스 증가 등에 따른 각종 생활습관병 및 만성퇴행성질환의 만연이 우리 사회의 큰 문제로 대두되고 있다. 이 중, 최근에 가장 관심이 집중되고 있는 질병이 비만이다. 상기 비만은 일반적으로 음식물로 섭취한 에너지(energy intake)가 신체활동 등으로 소비한 에너지(energy expenditure)와 균형을 이루지 못하여, 잉여의 에너지가 체내에 지방세포(adipocyte)의 양적, 수적 증가를 일으켜 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 유전적 요인, 환경적 요인, 정신적 요인 또는 식사습관 및 운동부족 등의 생활습관 등에 의하여 신체 내 에너지 밸런스가 무너져 생기는 질환을 의미한다.

국민건강영양조사에 따르면 우리나라 비만 유병률은 점점 증가하는 추세를 나타내고 있으며, 보건복지부는 우리나라 인구의 38%가 권장섭취 기준 이상의 칼로리를 섭취하고 있으며, 이로 인한 심혈관 질환의 위험 또한 증가하고 있다고 보고하였다. 이러한 식습관의 변화로 인해 신체는 여러 위험요소에 노출되고 있으며, 특히 포화지방산이 다량 함유된 식품은 혈중 지질 농도를 증가시켜 고콜레스테롤혈증을 유발하며, 나아가 고지혈증, 심근경색 등 순환기 계통의 질환 발병률을 증가시킨다.

상기 비만과 관련하여, 지방화(Adipogensis)에 대한 연구가 진행되고 있다. 상기 지방화란 지방전구세포로부터 지방세포가 분화되어 지방을 축적하게 되는 과정을 말하며, 상기 지방화는 비만, 당뇨병, 지방간 및 관상 심장질환 등 대사성질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

상기 지방세포에서는 지방분해(lipolysis)와 지방합성(lipogenesis)을 통하여 지질대사가 일어나고, 상기 지방 합성 시, 상기 지방전구세포(preadipocyte)가 증식과 분화과정을 거쳐 성숙한 지방세포로 분화되어 궁극적으로 지질 방울들이 세포질로 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 지방 방울(lipid droplet)이 된다.

상기 비만을 해소하고 적정한 체중을 유지하기 위한 비만치료기전으로는 식욕의 조절, 지방의 소화 및 흡수 방해, 에너지 소비의 증가, 지질대사의 조절 등이 있다. 현재 보편적으로 사용되는 비만 치료제로는 세로토닌(serotonin)과 지방분해효소의 활성을 억제하여 콜레스테롤(cholesterol) 및 중성지방(triglyceride)의 가수분해를 방해하며 산화되지 않은 지방을 변으로 배설시키도록 돕는 약물인 올리스타트(orlistat, XenicalR)등이 있다.

그러나, 세르토닌의 경우 혈압을 높여 심혈관계 질환을 가진 환자에게 주의하여 사용해야 하고, 올리스타트의 경우 소화기 장애, 지방변, 배변실금, 지용성 비타민 흡수 방해 등을 유도한다고 보고되고 있는 등 기존의 비만 치료제의 경우에는 상당한 부작용을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물로부터 비만세포의 성장 및 분화를 억제하여, 지방조직의 과다나 지방대사 이상으로 유발되는 비만에 대한 항비만 효과는 높고 부작용은 미약한 비만 치료, 예방 또는 개선을 위한 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 인류의 식량자원으로서 오랜 역사가 있는 벼는 왕겨층, 쌀겨층, 눈 및 배유로 구성되어 있다. 상기 벼는 도정하는 정도에 따라 왕겨층을 제거한 현미와 현미를 도정하여, 쌀눈, 과피, 종피, 호분층 등 쌀겨를 제거한 백미의 형태로 얻게 되며, 상기 현미나 백미를 제외하고 남게 되는 벼의 겉껍질인 왕겨층이나 쌀눈과 호분층, 싸라기 등을 포함하는 쌀겨층 등의 부산물을 미강이라고 한다.

기존에 부산물로 취급되던 미강은 최근 연구 결과에 따라 감마 아미노부티르산(GABA), 레시친, 옥타코사놀, 오리자놀, 토코페롤, 페룰산 등 벼에 포함된 생리활성물질의 약 95%가 분포되어 있다고 보고되고 있다. 상기 미강에는 많은 생리활성 물질이 존재하기 때문에 항비만 활성, 항콜레스테롤 활성, 항고혈압 활성, 숙취해소 활성, 중금속 해독 활성 및 항변비 활성 등의 다양한 생리활성 효과가 있는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 현재 미강은 대부분 가축사료로 이용되고 있는 실정이다.

이와 관련, 공개된 선행 특허는 유산균 발효를 통해 소화촉진 효과나 풍미 개선 효과와 관련된 내용이 주를 이룰 뿐, 미강에 포함된 유효성분으로부터 특정 기능성 강화를 위한 유효물질 함량 개선에 대한 선행연구는 극히 제한된 면이 있다. 따라서, 다양한 성분을 가지고 있으면서도 사료 등으로 제한적으로 이용되거나 폐기되는 미강의 활용을 통해 농가의 수익개선과 자연 활용을 통한 환경 개선을 가능하게 할 수 있도록 기존 방법과 구분되는 연구의 필요성이 점차 증가하고 있다.

10-1733967B 10-1618953B 10-1523139B 10-1357663B 10-1177245B 10-0880382B 10-2018-0133372A 10-2017-0086196A 10-2012-0021788A

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 미강의 기능성 개선을 위해 보편적으로 안전성이 확보된 미생물(GRAS)인 유산균 특히, 우리나라 고유의 발효식품으로 다양한 기능성을 갖는 유산균의 보고인 김치로부터 유래된 유산균 중, 발효 미강 제조에 적합한 유산균을 선택하여 이를 이용하여 발효 미강을 제조하기 위해 적합한 제조방법 즉, 유산균을 이용한 미강 발효물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 미강 발효물 제조방법에 의해 제조된 미강 발효물과 이를 이용한 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서, 미강 발효에 최적인 유산균, 구체적으로 미강으로부터 항비만 효과를 갖는 물질인 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine)을 효과적으로 생산할 수 있는 미생물을 제공한다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 제공한다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주는 바람직하게는 아르기닌(Arginine)이 첨가된 배지에서 최적 생육 pH가 pH 5.0인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 다른 측면에서, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 이용하여 기능성이 강화된 미강 발효물, 구체적으로, 시트룰린(Citrulline, C₆H₁₃N₃0₃) 및 오르니틴(Ornithine, C₅H₁₂N₂0₂) 함량이 증가된 미강 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 미강 발효물 제조방법에 있어서, 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 미강, 아르기닌(Arginine) 및 물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계; 상기 혼합물을 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계; 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계; 및 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법을 제공한다.

상기 발효원물 제조단계는 상기 혼합물에 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 발효원물 제조단계는 물, 미강 및 아르기닌을 혼합하여 제조된 상기 혼합물 전체 부피를 기준으로 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 호화 미강 제조단계는 상기 혼합물을 100℃ 내지 140℃의 온도 조건 및 0.9 기압 내지 1.5 기압의 압력 조건에서 10분 내지 20분 동안 가열하여 미강을 호화시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 발효 단계는 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물의 초기 pH가 pH 6.0 내지 pH 6.5이고, 발효 온도가 25℃ 내지 30℃인 조건에서 발효시키는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 상기 미강 발효물 제조방법은 상기 미강 발효물을 건조하는 미강 발효물 건조 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건조 단계는 30℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 1시간 내지 40시간 동안 열풍 건조법으로 수행하거나 - 50℃ 내지 - 80℃의 온도 조건에서 20시간 내지 100시간 동안 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 또 다른 측면에서, 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물을 제공한다.

상기 미강 발효물은 바람직하게는 미강 발효물 내에 시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 내지 3,500 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 내지 10,500 mg/kg인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 또 다른 측면에서, 상기 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방용 식품 조성물을 제공한다.

상기 비만 예방용 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능성 식품일 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주로 발효시킨 미강은 미강 내에 시트룰린 및 오르니틴의 함량이 현저하게 개선되므로, 미강 자체가 가지고 있는 여러 기능성에 추가로 항비만 활성을 더욱 개선시킬 수 있으므로, 기존 미강 또는 미강 발효물에 비해 항비만 활성을 현저하게 개선시킬 뿐만 아니라, 상기 발효 과정에 사용된 균주인 유산균은 GRAS 미생물이어서 안전성도 확보되고, 기존에 사료 또는 폐기물로 그 사용이 한정되는 미강을 고부가가치 식품으로 제조할 수 있어, 벼 재배농가는 물론 관련 산업계의 수익 향상에 이바지할 수 있으므로, 경제적인 효과가 매우 크고, 오래 식품으로 안전성이 확보된 미강과 GRAS 미생물인 유산균을 이용한 것이어서, 건강기능성 식품 소재 등으로 다양한 용도로 활용가능하여서, 그 산업적 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 김치 유산균 확보를 위해 우리나라의 다양한 지역에서 수득한 김치의 산지를 표시한 지도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 지역에서 수득한 김치로부터분리한 유산균의 오르니틴(Ornithine) 생성능을 확인한 결과로, 사진의 아래는 균주 번호를 나타낸 것이고, 사진의 윗 부분의 영문약자는 균주 명칭을 나타낸 것이며, Arginine 및 Ornithine은 아르기닌 및 오르니틴의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 온도에 따른 생육활성도를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양 시간(hr)을 나타내고, 상기 그래프의 세로축은 미생물 생육 정도(흡광도, A₆₀₀)를 나타내며, 상기 그래프 상단의 숫자는 배양 온도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 pH에 따른 생육활성도를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양 배지의 pH 조건을 나타내고, 상기 그래프의 세로축은 미생물 생육 정도(log CFU/mL)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 배지에서 pH에 따른 생육활성도를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양 배지의 pH 조건을 나타내고, 상기 그래프의 세로축은 미생물 생육 정도(흡광도, A₆₀₀)를 나타낸다. 상기 그래프에서 Control은 MRS 배지에 1%(w/v) 아르기닌이 첨가하고 별도로 pH를 조절하지 않은 대조군을 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 안전성을 확인하기 위하여, 용혈반응을 확인한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 안전성을 확인하기 위하여, 생체아민 생성여부를 확인한 결과로, 도 8a는 양성대조군인 엔테로코커스 파에칼리스 균주(Enterococcus faecalis ATCC 29212)와 비교하여, 탈탄산효소능 확인 실험(Decarboxylase plate method, Bover-Cid)을 수행한 것으로, ATCC 29212는 엔테로코커스 파에칼리스 균주(Enterococcus faecalis ATCC 29212)를 의미하고, DB1은 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 의미하며, 도 8b는 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 배양액을 HPLC로 분석하여 생체아민 생성 여부를 확인한 그래프로, Standard는 생체아민 표준액의 HPLC 수행결과를 의미하고, DB1은 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주 배양액의 HPLC 수행결과를 의미한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 1%(w/v) 아르기닌 및 20%(w/v) 미강이 혼합된 미강 혼합물에서 pH에 따른 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 생육활성도를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양 배지의 pH 조건을 나타내고, 상기 그래프의 세로축은 미생물 생육 정도(log CFU/mL)를 나타내며, 보라색(24 h)은 24시간 배양한 결과를 나타내고, 파란색(48 h)은 48시간 배양한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 1%(w/v) 아르기닌 및 20%(w/v) 미강이 혼합된 미강 혼합물에서 발효 온도에 따른 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 생육활성도를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양 온도 조건을 나타내고, 상기 그래프의 세로축은 미생물 생육 정도(log CFU/mL)를 나타내며, 보라색(24 h)은 24시간 배양한 결과를 나타내고, 파란색(48 h)은 48시간 배양한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 건조법에 따른 최종 미강 발효물의 결과를 나타낸 사진으로, 도 11a는 동결건조법으로 건조한 미강 발효물을 촬영한 사진이고, 도 11b는 열풍건조법으로 건조한 미강 발효물을 촬영한 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 부고환 조직의 지방세포를 Hematoxylin과 Eosin(H&E)으로 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 사진으로, ND는 정상식이군을 의미하고, HFCD는 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하며, HFCD-RB는 미강원물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하고, HFCD-FRB는 미강 발효 열풍 건조물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 부고환 조직의 지방세포를 Hematoxylin과 Eosin(H&E)으로 염색하여 지방세포의 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 세로축은 지방세포의 평균 크기(Adipocyte size)를 의미하고, 상기 그래프의 가로축은 각각의 실험군을 의미하며, ND는 정상식이군을 의미하고, HFCD는 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하며, HFCD-RB는 미강원물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하고, HFCD-FRB는 미강 발효 열풍 건조물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미한다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 간 조직을 Oil-Red O 용액으로 염색하여 간 조직의 지방침착도를 확인한 결과를 나타낸 사진으로, ND는 정상식이군을 의미하고, HFCD는 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하며, HFCD-RB는 미강원물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미하고, HFCD-FRB는 미강 발효 열풍 건조물 첨가 고지방고콜레스테롤식이군을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 항비만 활성이 개선된 발효 미강 즉, 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine) 함량이 증가된 미강 발효물의 제조 및 활용에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 미강 발효에 최적인 유산균, 구체적으로 미강으로부터 항비만 효과를 갖는 물질인 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine)을 효과적으로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주에 관한 것이다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주는 바람직하게는 아르기닌(Arginine)이 첨가된 배지에서 최적 생육 pH가 pH 5.0인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 이용하여 기능성이 강화된 미강 발효물, 구체적으로, 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine) 함량이 증가된 미강 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 미강 발효물 제조방법에 있어서, 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 미강, 아르기닌(Arginine) 및 물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계; 상기 혼합물을 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계; 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계; 및 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법에 관한 것이다.

상기 발효원물 제조단계는 상기 혼합물에 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 발효원물 제조단계는 물, 미강 및 아르기닌을 혼합하여 제조된 상기 혼합물 전체 부피를 기준으로 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 호화 미강 제조단계는 상기 혼합물을 100℃ 내지 140℃의 온도 조건 및 0.9 기압 내지 1.5 기압의 압력 조건에서 10분 내지 20분 동안 가열하여 미강을 호화시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 발효 단계는 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물의 초기 pH가 pH 6.0 내지 pH 6.5이고, 발효 온도가 25℃ 내지 30℃인 조건에서 발효시키는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 상기 미강 발효물 제조방법은 상기 미강 발효물을 건조하는 미강 발효물 건조 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건조 단계는 30℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 1시간 내지 40시간 동안 열풍 건조법으로 수행하거나 - 50℃ 내지 - 80℃의 온도 조건에서 20시간 내지 100시간 동안 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물에 관한 것이다.

상기 미강 발효물은 바람직하게는 미강 발효물 내에 시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 내지 3,500 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 내지 10,500 mg/kg인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 비만 예방용 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능성 식품일 수 있다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미한다. 상기 배양물 또는 배양물의 농축물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 상기 제형은 액체 또는 고체일 수 있다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배지(culture medium)란 특정 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이나 동식물의 조직이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이고, 성상에 따라 고체배지 또는 액체배지를 포함하는 개념이다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양하는 것을 의미한다. 또한, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 발효용 스타터(stater)란 발효에 관여하는 유산균 또는 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 상기 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산 시 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다.

상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효 식품을 제조할 수 있다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 종균이란 발효에 이용되는 미생물로서, 발효를 위하여 기질 또는 식품에 접종되는 미생물을 의미하고, 종균 조성물이란 발효를 개시하는데 필요한 하나 이상의 접종균체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 호화(gelatinization)란 전분 등을 수중에서 가열하거나 알칼리 용액과 같은 용매로 처리하는 경우, 열과 수분에 의해 팽창되어 그 물리 화학적 성질이나 구조가 변하여 점도 증가, 수용성 증가나 부피 증가 등의 성질을 가지는 쪽으로 변화되는 과정 또는 전체가 반투명인 거의 균일한 콜로이드 물질이 되는 현상을 의미하며, 젤라틴화라고도 불리운다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서 발효식품, 기능성 식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 발효식품이란 유산균이나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 발효식품 모두가 포함된다.

본 발명자들은 미강의 활용도를 높이기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 미강의 항비만 효과, 배변 촉진 즉, 항변비 효과의 기능성에 착안하여 미강의 항비만 효과를 개선하는 것을 선택하여, 식품에 사용할 수 있는 GRAS 미생물인 유산균을 이용하여 항비만 효과 개선을 위해 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine)의 함량을 증가시키는 방법을 연구하였으며, 대한민국 전 지역에서 수집된 김치로부터 분리된 다양한 미생물을 대상으로 실험을 수행한 결과, 신규한 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주가 물에 아르기닌(Arginine) 및 미강을 첨가하여 제조된 아르기닌이 첨가된 미강 혼합물에서 효과적으로 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine) 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였고, 이에 추가로 연구를 진행하여 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 아르기닌이 첨가된 미강 혼합물 배지에서 최적 배양 pH 및 최적 배양 온도를 확인하였으며, 최종 제품 생산과 관련하여 최적 건조 조건을 확인하여 이를 기초로 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 미강 발효에 최적인 유산균, 구체적으로 미강으로부터 항비만 효과를 갖는 물질인 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine)을 효과적으로 생산할 수 있는 미생물에 관한 것이다.

상기 미생물은 구체적으로 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주일 수 있다.

상기 DB1 균주는 본 발명자에 의해 분리 및 동정되어 최초로 보고된 균주로, 김치로부터 분리된 유산균이며, 그람 양성의 단간균으로 확인되었다. 상기 DB1 균주는 D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), L-아라비노스(L-Arabinose), 리보스(Ribose), D-자일로스(D-Xylose) 및 N-아세틸 글루코사민(N-Acetyl glucosamine)에 대한 당대사능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 16S rRNA 염기서열이 웨이셀라 코리엔시스 S-5623^T와 99.86%의 상동성을 가져 웨이셀라 코리엔시스로 동정되었다. 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 10월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13653BP를 부여 받았다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 통상의 유산균 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 MRS 액체배지 또는 MRS 고체배지나 상기 MRS 액체배지 또는 MRS 고체배지에 아르기닌(Arginine)이 첨가된 배지에서 배양할 수 있다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 아르기닌(Arginine) 또는 미강으로부터 항비만 활성이 우수한 물질인 시트룰린 및 오르니틴을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 균주 및 웨이셀라 속의 다른 균주에 비해 시트룰린 생산능 및 오르니틴 생산능이 현저하게 우수하다. 또한, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 생육 활성은 pH 6.0 내지 pH 8.0의 pH 범위에서 최적인 반면, 아르기닌이 첨가된 배지에서는 pH 5.0에서 최적이고, 아르기닌이 첨가된 미강 혼합물에서는 pH 6.0 내지 pH 6.5의 pH 범위에서 최적인 것으로 확인되었으며, 용혈성 시험, 항생제 내성 및 바이오제닉아민(Biogenic amine) 생성능을 통해 확인한 결과 안전성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.

구체적으로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 MRS 배지에서의 생육 최적 pH가 pH 6.0 내지 pH 8.0인 반면, 아르기닌이 첨가된 MRS 배지, 구체적으로 아르기닌이 배지 전체 부피를 기준으로 1%(w/w) 첨가된 MRS 배지에서 최적 pH는 pH 5.0이며, 아르기닌이 첨가된 미강 혼합물, 구체적으로 아르기닌이 전체 혼합물 부피를 기준으로 1%(w/v) 첨가되고, 미강이 전체 혼합물 부피를 기준으로 20%(w/v) 첨가된 미강 혼합물 에서 생육 최적 pH가 pH 6.0 내지 pH 6.5인 균주일 수 있다.

상기 오르니틴(Ornithine, C₅H₁₂N₂0₂)은 단백질을 구성하는 아미노산은 아니나, 식품에 통상 함유돠어 있는 아미노산으로, 일 예로 담수성 쌍각류조개나 재첩 등에 다량으로 포함되어 있다. 상기 오르니틴은 항비만 활성, 근육합성 유도, 성장호르몬(Growth Hormone, GH) 분비, 기초대사 촉진, 간기능 개선 및 피부미용 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 일 예로, 상기 상기 오르니틴은 성장호르몬을 분비시켜 근육의 합성을 증가시키며, 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 미국이나 유럽 국가를 중심으로 식이보조제나 의약품으로 많이 이용되고 있으며, 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 효과 등 새로운 기능성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 일본에서는 L-오르니틴 염산염의 형태로 식품소재로서 사용가능한 현실이나, 국내에서는 아직 식약청에 식품첨가물로 등재되어 있지 않아 사용이 곤란한 실정이다. 따라서, 국내에서는 오르니틴을 첨가물로 첨가하는 것이 아닌, 발효과정에서 오르니틴의 함량을 증가시켜 오르니틴의 함량이 증가된 발효식품 형태로 사용될 수 있다.

현재까지 발효과정에서 오르니틴을 생성하여 발효식품의 오르니틴 함량을 증가시키는 연구는 서구의 대표적 발효식품인 치즈와 같은 유제품 관련하여 진행되어 있으며, 우리 전통 발효식품인 김치, 장류 또는 젖갈과 관련해서는 그 연구가 매우 제한적인 실정이다. 현재까지 발표된 연구 결과도 한국등록특허 제096258호나 한국공개특허 제2017-0073839호 또는 한국공개특허 제2012-0021788호와 같이 오르니틴을 생성할 수 있는 유산균에 대한 것으로, 오르니틴 생성능이 산업적으로 이용되기에는 제한적인 연구만이 진행된 실정이다.

상기 시트룰린(Citrulline, C₆H₁₃N₃0₃)은 박과 식물의 씨 속에 존재하는 아미노산으로, 유리 아미노산으로서 자연계에 존재하는 것이 밝혀져 있을 뿐, 단백질을 구성하는 아미노산 성분으로 존재하는지는 여부는 분명하지 않은 것으로 알려져 있다. 상기 시트룰린은 항비만 활성, 근육합성 유도, 이뇨작용 및 혈행 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 일 예로, 상기 시트룰린은 체내에서 산화물질 즉, 활성산소 제거능 혈관 확장에 의한 혈류 개선능을 갖고 있어 고혈압에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 신장병 및 변비에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 근육합성을 유도하고, 근육을 이완하여, 신체 기능을 개선하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미국이나 유럽 등 서구 국가에서는 시트룰린을 의약품이나 기능성 식품 등의 형태로 섭취하고 있다.

다만, 우리나라에서는 한국등록특허 제1754227호나 한국공개특허 제2017-0033101호와 같이 시트룰린의 기능성을 확인하거나, 한국등록특허 제1038433호과 같이 수박 과피로부터 시트룰린을 추출하는 등 식물 특히, 박과 식물 소재로부터 시트룰린을 추출하는 연구만이 제한적으로 진행될 뿐, 발효균주 특히 우리 전통 발효식품 유래 유산균을 이용하여 시트룰린을 생산하는 연구는 전혀 진행되지 않은 것으로 조사되었다.

또한, 본 발명은 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 이용하여 기능성이 강화된 미강 발효물, 구체적으로, 시트룰린(Citrulline) 및 오르니틴(Ornithine) 함량이 증가된 미강 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 미강 발효물을 제조하는 방법은 미강 발효물 제조방법에 있어서, 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 단계 즉, 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하여 발효하는 즉, 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하여 미강을 발효시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 미강 발효물을 제조하는 방법은 미강을 세척한 후, 미강, 아르기닌(Arginine) 및 물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계; 상기 혼합물을 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계; 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계; 및 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 발효란 효소 작용에 의해 복잡한 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유 에너지를 내놓는 현상으로, 일반적으로 미생물이 유기물을 분해해서 대사산물을 축적하는 현상을 의미한다. 상기 발효는 필수 아미노산을 생합성하거나 단백질 함량과 섬유질의 소화가능성을 개선함으로써, 식품의 영양학적 가치를 증가시키며, 칼슘이나 인 또는 다양한 비타민과 같은 미량영양소(micronutrient)의 생물학적 이용가능성(bioavailability )도 개선시킨다.

이러한 발효과정에 사용되는 대표적인 미생물로, 유산균, 효모, 아세트산균 등이 있으며, 이 중 오랜 시간 동안 발효식품의 제조에 관여하여 안전성이 확보된 균주인 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)이 주로 사용된다. 상기 유산균은 전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 발효 식품 등 널리 식품으로 섭취되거나 식품의 발효 균주로 사용되어 안전성을 인정받은 미생물(GRAS, Generally Recognized As Safe)이다.

상기 발효원물 제조단계는 상기 혼합물에 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v) 또는 12%(w/v) 내지 70%(w/v), 바람직하게는 15%(w/v) 내지 60%(w/v), 더 바람직하게는 17%(w/v) 내지 50%(w/v) 또는 20%(w/v) 내지 50%(w/v) 또는 19%(w/v) 내지 30%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/w) 내지 5%(w/w), 바람직하게는 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v), 더 바람직하게는 0.2%(w/v) 내지 1.7%(w/v), 더더욱 바람직하게는 0.5%(w/v) 내지 1.5%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 발효원물 제조단계는 물, 미강 및 아르기닌을 혼합하여 제조된 상기 혼합물 전체 부피를 기준으로 미강을 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다. 일 예로, 상기 발효원물 제조단계는 물에 미강, 구체적으로 세척 후 건조한 미강을 물, 미강 및 아르기닌을 혼합하여 제조된 상기 혼합물 전체 부피를 기준으로 10%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 물, 미강 및 아르기닌을 혼합하여 제조된 상기 혼합물 전체 부피를 기준으로 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가한 후, 잘 섞일 수 있도록 교반하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 호화 미강 제조단계는 상기 혼합물을 80℃ 내지 160℃ 또는 100℃ 내지 140℃, 바람직하게는 110℃ 내지 130℃의 온도 조건 및 0.7 기압 내지 2.0 기압 또는 0.9 기압 내지 1.5 기압, 바람직하게는 1.0 기압 내지 1.25 기압의 압력 조건에서 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 40분, 더 바람직하게는 10분 내지 20분 동안 가열하여 미강을 호화시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 호화 미강 제조단계는 고온의 열을 가하는 것이므로, 미강을 호화시켜 발효 효율성을 증가시킬 뿐만 아니라, 상기 혼합물 즉, 미강 혼합물을 살균하여 발효 과정에서 본 발명의 균주가 아닌 다른 미생물에 의한 발효 효율의 저하나 부산물의 발생을 제어할 수 있다. 상기 호화 미강 제조단계는 가열 후, 상온, 일 예로 10℃ 내지 25℃ 또는 15℃ 내지 20℃까지 가열하여 호화시킨 미강 혼합물을 냉각하는 과정을 더 포함할 수 있다.

상기 균주 첨가 단계는 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 균주 첨가 단계는 상기 균주 현탁액 또는 배양액을 상기 호화 미강 혼합물에 부피비를 기준으로 0.1%(v/v) 내지 10%(v/v) 또는 0.2%(v/v) 내지 5.0%(v/v) 또는 0.5%(v/v) 내지 2.0%(v/v)로 첨가할 수 있으며, 상기 균주 현탁액 또는 배양액의 균주 농도는 4 log CFU/mL 내지 9 log CFU/mL 또는 5 log CFU/mL 내지 8 log CFU/mL 또는 6 log CFU/mL 내지 7 log CFU/mL일 수 있다.

상기 발효 단계는 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물의 초기 pH가 pH 5.0 내지 pH 8.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 7.0, 가장 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 6.5인 pH 조건 및 발효 온도가 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 30℃인 온도 조건에서 발효시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 발효 단계는 상기 균주의 생육 최적 pH 또는 상기 균주의 아르기닌이 첨가된 배지에서의 생육 최적 pH와 달리 미강 발효에서의 최적 생육 pH로 발효를 수행함으로써, 발효 효율을 개선시킬 수 있다. 통상의 유산균이 배지 조성이 다른 경우에도 생육 최적 pH가 동일하거나 유사한 범위를 가지는 반면, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주는 미강 발효에 있어서 통사의 유산균 또는 웨이셀라 코리엔시스 균주의 최적 생육 pH와 다른 조건의 pH에서 최적 생육 활성을 갖는 것으로 확인되었고(도 7), 이러한 최적 pH에서 오르니틴 생성량도 최적인 것으로 확인되었으므로, 이러한 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 특성을 활용하여 미강 발효의 효율을 현저히 개선시킬 수 있다.

또한, 상기 미강 발효물 제조방법은 상기 미강 발효물을 건조하는 미강 발효물 건조 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건조 단계는 열풍 건조법으로, 바람직하게는 30℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 1시간 내지 40시간 동안 열풍 건조법으로 수행하거나 동결 건조법, 바람직하게는 - 50℃ 내지 - 80℃의 온도 조건에서 20시간 내지 100시간 동안 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

상기 열풍 건조는 30℃ 내지 60℃, 바람직하게는 40℃ 내지 50℃의 온도 조건에서 1시간 내지 40시간, 바람직하게는 5시간 내지 30시간, 더욱 바람직하게는 10시간 내지 20시간 동안 수행할 수 있다.

상기 동결 건조는 - 50℃ 내지 - 80℃, 바람직하게는 - 70℃ 내지 - 80℃의 온도 조건에서 20시간 내지 100시간, 바람직하게는 40시간 내지 80시간, 더욱 바람직하게는 48시간 내지 72시간 동안 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물일 수 있다.

구체적으로, 상기 미강 발효물은 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물 또는 미강, 아르기닌(Arginine) 및 물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계; 상기 혼합물을 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계; 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계; 및 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물일 수 있다.

상기 미강 발효물은 미강 발효물 내에 미강 발효물 전체 중량을 기준으로시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 이상인 것, 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,700 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 7,000 mg/kg 이상인 것, 더욱 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,800 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 8,000 mg/kg 이상인 것일 수 있다.

또한, 상기 미강 발효물은 미강 발효물 내에 미강 발효물 전체 중량을 기준으로 시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 내지 3,500 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 내지 10,500 mg/kg인 것, 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,700 mg/kg 내지 3,200 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 7,000 mg/kg 내지 9,500 mg/kg인 것, 더욱 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,800 mg/kg 내지 2,900 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 8,000 mg/kg 내지 8,800 mg/kg인 인 것일 수 있다.

상기 미강 발효물은 시트룰린과 오르니틴이 고 함량으로 포함되어 있으므로, 기존 미강 또는 미강 유산균 발효물이 갖는 기능성 외에 추가로 시트룰린과 오르니틴에 의해 항비만 활성, 혈행 개선능, 간기능 개선능, 이뇨 작용, 신체 기능 개선능이나 주름 개선과 같은 피부미용 개선능이 부가되거나 기존 미강 또는 미강 유산균 발효물이 갖는 기능성이 강화된 것일 수 있다.

이러한 차원에서 본 발명의 미강 발효물은 기능성 식품 또는 기능성 식품의 원료, 바람직하게는 비만을 예방 또는 개선하기 위한 기능성 식품 또는 기능성 식품의 원료나 고지혈증을 예방 또는 개선하기 위한 기능성 식품 또는 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것일 수 있다.

상기 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능성 식품일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것일 수 있다.

상기 고지혈증 개선 또는 예방용 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능성 식품일 수 있다.

상기 유효성분은 바람직하게는 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물 또는 미강, 아르기닌(Arginine) 및 물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계; 상기 혼합물을 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계; 상기 호화 미강 혼합물에 상기 김치로부터 분리되고, 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계; 및 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물일 수 있다.

상기 미강 발효물은 미강 발효물 내에 미강 발효물 전체 중량을 기준으로시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 이상인 것, 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,700 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 7,000 mg/kg 이상인 것, 더욱 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,800 mg/kg 이상이고, 오르니틴 함량이 8,000 mg/kg 이상인 것일 수 있다.

또한, 상기 미강 발효물은 미강 발효물 내에 미강 발효물 전체 중량을 기준으로 시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 내지 3,500 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 내지 10,500 mg/kg인 것, 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,700 mg/kg 내지 3,200 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 7,000 mg/kg 내지 9,500 mg/kg인 것, 더욱 바람직하게는 시트룰린 함량이 2,800 mg/kg 내지 2,900 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 8,000 mg/kg 내지 8,800 mg/kg인 인 것일 수 있다.

상기 비만은 체내에 지방세포(adipocyte)가 양적, 수적 증가로 인해 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하고, 이러한 지방세포의 양적, 수적 증가는 지방화 즉, 지방세포의 분화와 지방의 축적에 의하여 발생한다.

상기 고지혈증이란 혈액 속의 지방 성분이 높아 질병을 유발할 수 있는 상태 또는 혈중 지방의 높은 함량에 의해 발병되는 질병을 의미한다. 상기 고지혈증은 내인성 고지혈증과 외인성 고지혈증으로 구분되는데, 내인성 고지혈증은 콜레스테롤 대사 이상이 원인인 경우가 많으며, 외인성 고지혈증은 음식의 과잉섭취 등에 의해 발병하는 경우가 많다. 상기 외인성 고지혈증의 발병 원인과 관련하여, 음식물의 섭취에 의한 중성지방의 혈중 농도의 상승이 밀접한 관련이 있는 것으로 보고 되어 있다.

콜레스테롤 조절이란 체내 콜레스테롤 수준을 적절한 범위로 조절하여 혈장과 조직, 특히 혈관에 콜레스테롤의 축적이 일어나지 않게 함을 의미하는데, 상기 콜레스테롤 조절 기능에 이상이 생겨 즉, 콜레스테롤 대상 이상이 발생되면 체내 또는 혈관에 콜레스테롤이 적정 수준 이상으로 축적되는 질환을 고콜레스테롤증이라고 하며, 장기간 콜레스테롤 조절 기능 이상이 발생하여, 고콜레스테롤증이 일정 기간 이상 유지되는 경우 동맥경화증으로 이어질 수 있다.

상기 비만 개선 또는 예방용 식품조성물 또는 상기 고지혈증 개선 또는 예방용 식품조성물은 비만 또는 고지혈증을 억제하거나 개선 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 식품조성물은 기능성 식품조성물, 구체적으로 상기 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능성 식품 조성물일 수 있다. 상기 건강기능성 식품 조성물은 건강기능성 음료일 수 있다.

상기 비만 개선 또는 예방용 식품조성물 또는 상기 고지혈증 개선 또는 예방용 식품조성물은 상기 미강 발효물추출물 제조방법에 의해 제조된 미강 발효물추출물을 전체 식품 중량의 0.0001 중량% 내지 99.999 중량% 또는 0.001 중량% 내지 99.9 중량% 또는 0.01 중량% 내지 99 중량% 또는 0.1 중량% 내지 90 중량% 또는 1 중량% 내지 75 중량% 또는 3 중량% 내지 50 중량% 포함될 수 있다.

상기 미강 발효물 제조방법에 의해 제조된 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 상기 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 상기 고지혈증 개선 또는 예방용 식품 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 미강 발효물 제조방법에 의해 제조된 미강 발효물은 상기 상기 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 상기 고지혈증 개선 또는 예방용 식품 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다

상기 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품으로, 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것일 수 있고, 통상적인 의미로서 건강기능성식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류 등), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실채소류 음료, 발효음료류, 두유류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g일 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 미강 발효물 100 중량부 당 0 내지 200,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 미강 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다.

그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 미강 발효물 100 중량부 당 0 내지 200,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 미강 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 포도당이나 과당 등과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 등과 같은 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등일 수 있다. 상기 향미제는 타우마틴이나 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제일 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 첨가량은 본 발명의 식품 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품조성물 또는 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 개선용 식품조성물에 있어서, 상기 유효성분은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물은 100 mL를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시 할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 실험은 각각 동일한 실험을 3회 수행하였으며, 각각의 실험결과로 얻어진 자료는 SAS 9.1 version 통계프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차(Mean ± SEM)로 표시하였다. 집단간의 유의성 검증 위해, 일원변량분석(one-way ANOVA)을 통해 분석하였고, 사후검증(Post-Hoc test)은 Duncan's multiple range test에 의해 P < 0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

<실시예> 미강 발효물의 제조 및 활용

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

서울경기, 강원, 충청, 영남 및 호남 등 5개 권역의 전국의 가정집, 명가, 식당, 사찰 및 회사 등 36 곳에서 수집한 맛이 좋은 최적 숙성기의 김치 시료로부터 분리된 유산균 중 사전에 오르니틴 생산능을 가진 것으로 확인된 하기 표 1의 40종의 김치 유산균을 분리하여 실험 균주로 사용하였다.

미강 발효물 제조를 위한 유산균을 선별하기 위하여, 1% 아르기닌(Arginine)이 첨가된 MRS 액체배지에서 상기 표 1의 총 40종의 균주를 30℃에서 48시간 정치 배양한 후, 상기 각 균주를 배양한 배양액에서 오르니틴 생성정도를 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 상기 각 균주를 배양한 배양액을 9,950 x g 및 4℃ 조건에서 3분 동안 원심분리 한 후, 상징액을 수득하고, 상기 상징액을 TLC 판(Merck, 독일)에 2 μL 점적한 후, 아세트산(acetic acid, Darjung, 대한민국)과 1-부탄올(1-butanol, Junsei co., 일본) 및 3차 증류수를 부피를 기준으로 3 : 12 : 5(아세트산 : 1-부탄올 : 3차 증류수, v/v)로 조정한 전개용매에서 7 cm 씩 두 번 전개하였다. 상기 전개가 끝난 후, TLC판은 실온에서 건조 후 0.5% 닌하이드린(ninhydrin, Alfa Aesar, USA) 용액에 담가 가열하여 아르기닌과 오르니틴 표준물질에 대비하여 같은 위치에 점(spot)을 보이는지 여부 및 해당 점(spot)이 얼마나 진한지 여부를 비교하여, 각 균주의 오르니틴의 생성 정도를 확인하였다. 상기 TLC판 전개 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 40종의 균주 중 7종의 균주, 구체적으로 3번 균주(GH), 10번 균주(GL), 12번 균주(DB1), 20번 균주(CM), 23번 균주(IS), 38번 균주(CGM1) 및 40번 균주(HJ)가 오르니틴 생성능이 우수한 것으로 육안으로 확인되었다.

상기 도 2의 결과를 기초로 하여, 상기 7종의 균주의 오르니틴 생산능을 확인하기 위해, HPLC를 이용하여 오르니틴 생성 정도를 아미노산 분석법을 통해 확인하였다.

구체적으로, 상기 7종의 균주를 배양한 배양액을 9,950 x g 및 4℃ 조건에서 3분 동안 원심분리 한 후, 상징액을 수득하고, 얻어진 상등액을 0.2 μm의 membrane filter(Sartotius, 독일)로 여과시켜 불순물 등을 제거해 분석에 사용하였다.

OPA(O-phthalaldehyde)-FMOC(fluorenylmethyl chloroformate) 유도체화하여 HPLC(Ultimate 3000, Thremo Scientific Dionex, USA)로 분석하였다. 컬럼 오븐 온도는 40℃로 하였으며 컬럼은 Inno C18 column(4.6 x 150 mm, 5 μm, Youngjin Biochrom, 대한민국)을 사용하였다. 이동상은 40 mM sodium phosphate(pH 7.0), water : acetonitrile : methanol = 10 : 45 : 45로 혼합된 용액을 각각 A와 B로 1.5 mL/min의 유속으로 사용하였다. 구배조건은 A용액 : B용액으로서 0 내지 24분에 95 : 5(v/v, %)에서 24 내지 25분에 45 : 55, 23 내지 34.5분에 20 : 80, 34.5분부터 95 : 5로 설정하여 분석을 시행하였다. 아미노산 함량은 표준 아미노산의 HPLC 분석결과를 토대로 작성한 표준곡선을 이용하여 산출하였다.

상기 7종의 균주의 배양액에 포함된 아미노산의 산출 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2의 각 아미노산의 단위는 분석시료 1 L를 기준으로 mg의 단위(mg/L)로 나타내었다. 또한, 하기 표 2의 N.D는 해당 아미노산이 발견되지 않았다는 것을 의미한다.

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, HPLC 결과에서 오르니틴 생성능이 우수한 것으로 확인된 7종의 균주 중에서도 DB1 균주가 현저하게 우수한 오르니틴 생성능을 가지는 것으로 확인되었다. 7종의 균주 중 DB1 균주를 제외한 균주 대부분이 5,000 mg 내지 6,500 mg, 구체적으로 5,059.53 mg 내지 6,520.55 mg인 반면, DB1 균주는 8,373.59 mg로 오르니틴 생성능이 다른 균주에 비해 더 우수한 것으로 확인되었으며, DB1 균주는 GH 균주와 비교하여 165.5%이고, HJ 균주와 비교해서도 110.1%로 우수한 오르니틴 생성능이 확인되었다. 상기 결과로부터, DB1 균주를 오르니틴 생성능이 가장 우수한 균주로 선정하여 분리하였다.

상기 오르니틴 생성능이 가장 우수한 균주로 선택된 DB1 균주를 동정하기 위하여, 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 관찰하였다. 상기 형태학적 특성의 조사는 그람 염색 여부와 현미경을 이용하여 균의 형태 등을 관찰하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

특성(Characteristics)	균주(DB1)
그람 염색(Gram-stain)	양성(+)
세포 형태(Cell morphology)	단간균

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 분리된 DB1 균주는 그람 양성의 단간균으로, MRS 평판배지를 이용하여 30℃에서 48시간 배양하였을 때 둥글고 매끈하며 아이보리색의 납작한 집락(colony)을 형성하는 것으로 확인되었다. 추가로, 카탈라제 실험(Catalase test) 수행 결과 카탈라제 음성(Catalase-negative)으로 확인되었다.

상기 분리 균주를 동정하기 위하여 생화학적 조사를 수행하였다. 생화학적 조사는 API 50CHL system(BioMerieux, 프랑스)을 이용하여 당이용성을 조사한 후 균주동정 프로그램(http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 API 50CHL system을 이용한 당 이용성 조사결과는 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서, - 또는 +는 당대사능 또는 당이용능을 기준으로 결정한 것으로, 각 당에 대한 당대사능이 없는 경우 - 라고 표시하고, 당대사능이 있는 경우 +라고 표시하였다.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 DB1 균주는 L-아라비노스(L-Arabinose), 리보스(Ribose), D-자일로스(D-Xylose), D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose) 및 N-아세틸 글루코사민(N-Acetyl glucosamine)에 대해 당대사능을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 형태학적 분석 결과 및 당대사능 분석을 통해 수행한 생화학적 분석 결과, DB1 균주는 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)로 추정되었으며, 최종적으로 동정하기 위하여, 16S rRNA 염기서열 분석을 실시하였다. 구체적으로, DB1의 16S rRNA 염기서열을 도 3과 같이 결정하였고, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.

상기 분리균주의 16S rRNA의 염기서열은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 분리균주의 chromosomal DNA를 Genomic DNA purification kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 분리한 후에, 하기 표 5의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

Primers	서열 (5′→ 3′)
785F	GGATTAGATACCCTGGTA
907R	CCGTCAATTCMTTTRAGTTT

상기 PCR은 94℃에서 1분간 전변성단계(pre-denaturation)를 수행한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 과정을 30회 반복하고, 72℃에서 10분간 종료단계(termination)를 수행하는 방법으로 진행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물은 multiscreen filter plate(Millipore Co., USA)를 이용하여 정제하고, BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 sequencing 반응을 수행하였다. 증폭된 산물을 포함하는 DNA sample은 ABI Prism Prism 3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 결정하였으며, 상기 결과로부터 도 3에 나타낸 바와 같이, 총 1,460bp의 염기서열을 확인하였다.

상기 결정된 염기서열을 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank에 ribosomal RNA gene sequence로 등록된 염기서열과 비교하였으며, 염기서열간의 상동성은 Clustal X program을 이용하여 비교분석하였다.

상기 DB1 균주의 16S rRNA 염기서열은 웨이셀라 코리엔시스 S-5623^T 균주(Weissella koreensis S-5623^T)와 99.86% 상동성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 최종적으로 상기 DB1 균주는 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)로 동정되었고, 상기 DB1 균주를 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1)으로 명명하였다.

이하, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 10월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13653BP를 부여받았다.

실시예 2. 분리 균주의 생육 특성 및 기능성 확인

2-1. 분리 균주의 최적 생육 pH 조건 및 온도 조건 확인

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주의 최적 생육 온도 및 생육 pH 조건을 다음과 같이 확인하였다.

우선, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주를 MRS 배지(Difco, USA)에 1%(v/v), 약 6.70 log CFU/mL로 접종하고, 배양온도를 5℃ 간격으로 5℃ 내지 30℃의 온도 범위에서 배양하며, 시간 별로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 생육 정도를 확인하였다. 상기 생육 정도를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 바타낸 바와 같이, 최적 생육 온도는 30℃인 것으로 확인되었다. 구체적으로, 5℃의 경우, 11일이 경과된 시점에서 생육 정도가 정체기에 접어들었으며, 11일이 경과한 시점에 측정된 흡광도(A₆₀₀)는 1.787 ± 0.012로 확인되었고, 10℃의 경우, 4일이 경과된 시점에서 생육 정도가 정체기에 접어들었으며, 4일이 경과한 시점에 측정된 흡광도(A₆₀₀)는 2.535 ± 0.021로 확인되었으고, 15℃의 경우, 4일이 경과된 시점에서 생육 정도가 정체기에 접어들었으며, 4일이 경과한 시점에 측정된 흡광도(A₆₀₀)는 2.955 ± 0.133으로 확인되었고, 25℃의 경우, 20시간이 경과된 시점에서 생육 정도가 정체기에 접어들었으며, 20시간이 경과한 시점에 측정된 흡광도(A₆₀₀)는 3.162 ± 0.157로 확인되었으고, 30℃의 경우, 16시간이 경과된 시점에서 가장 급격한 생육 활성이 확인되었고, 16시간이 경과한 시점부터는 세포수가 점진적으로 증가하였으나, 그 정도가 제한적이었고, 16시간이 경과한 시점에 측정된 흡광도(A₆₀₀)는 3.035 ± 0.174로 확인되어, 가장 최단시간에 흡광도(A₆₀₀)가 3.000 이상으로 증가한 30℃가 최적 생육 온도인 것으로 확인되었다.

상기 최적 생육 온도로 확인된 30℃에서 pH를 달리하며 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 최적 생육 pH를 확인하였다. 구체적으로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 5 N HCl 또는 5 N NaOH를 사용하여 pH를 pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0 및 pH 8.0으로 조정한 MRS 배지(Difco, USA)에 1%(v/v), 약 6.70 log CFU/mL로 접종하고, 배양 pH를 달리하며 16시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 생육 정도를 확인하였다. 상기 생육 정도를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 바타낸 바와 같이, 최적 생육 pH는 pH 6 내지 pH 8인 것으로 확인되었다. 구체적으로, pH 4에서 pH 6까지는 pH가 증가하여 중성에 가까워질수록 생육 활성이 증가한 반면, pH 6 내지 pH 8에서는 세포 수(Viable cell number)가 8.32 log CFU/mL 내지 8.84 log CFU/mL로 유사한 정도를 나타내어, 생육 pH는 pH 6 내지 pH 8인 것으로 확인되었다.

상기 확인된 결과를 기초로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주가 오르니틴을 생성하기 위한 최적 생육 조건 즉, 아르기닌이 첨가된 생육 조건에서의 최적 생육 pH가 상기 확인된 최적 생육 pH 조건인 pH 6 내지 pH 8와 일치하는지 여부를 추가로 확인하였다.

구체적으로, 상기 최적 생육 온도로 확인된 30℃에서 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지를 이용하여 pH를 달리하며 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 최적 생육 pH를 확인하였다. 구체적으로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 5 N HCl 또는 5 N NaOH를 사용하여 pH를 pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0으로 조정한 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에 1%(v/v), 약 6.70 log CFU/mL로 접종하고, 배양 pH를 달리하며 24시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 생육 정도를 확인하였다. 상기 생육 정도를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 바타낸 바와 같이, 최적 생육 pH는 기존 MRS 배지를 이용하여 측정한 경우 즉, pH 6 내지 pH 8와 달리 pH 5인 것으로 확인되었다. 구체적으로, pH 4에서는 생육활성이 낮은 것으로 확인된 반면, pH 5에서는 흡광도(A₆₀₀)가 5.000보다 높아(5.08 ± 0.11) 가장 우수한 것으로 확인된 반면, pH 6(A₆₀₀ 4.52 ± 0.20)부터 pH가 증가하여 중성에 가까워질수록 생육 활성이 감소하였으며, MRS 배지에 1%(w/v) 아르기닌을 첨가한 배지 자체로 pH를 조정하지 않은 경우(초기 pH가 pH 7.2 내지 pH 7.5)에서는 pH 7보다 낮은 것으로 확인되어, 아르기닌이 첨가된 생육 조건에서는 최적 생육 pH가 pH 5로 초기 pH를 조정한 것으로 확인되었다.

2-2. 분리 균주의 최적 오르니틴 생성 조건 확인

상기 2-1에서 확인된 결과를 기초로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주의 배양 조건에 따른 오르니틴 생산능을 확인하기 위해, 30℃에서 초기 pH를 pH 5로 조절한 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지와 pH를 조절하지 않은 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지(pH 7.2 내지 pH 7.5)에서 48시간 동안 배양하며, 24시간이 경과된 시점과 48시간이 경과된 시점에서의 오르니틴 생성 정도를 확인하였다.

상기 오르니틴 생산능은 상기와 같은 방법으로 HPLC를 이용한 아미노산 분석법을 통해 확인하였다.

구체적으로, 상기 각각의 조건에서 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 배양한 배양액을 9,950 x g 및 4℃ 조건에서 3분 동안 원심분리 한 후, 상징액을 수득하고, 얻어진 상등액을 0.2 μm의 membrane filter(Sartorius, 독일)로 여과시켜 불순물 등을 제거해 분석에 사용하였다. OPA(O-phthalaldehyde)-FMOC(fluorenylmethyl chloroformate) 유도체화하여 HPLC(Ultimate 3000, Thremo Scientific Dionex, USA)로 분석하였다. 컬럼 오븐 온도는 40℃로 하였으며 컬럼은 Inno C₁₈ column(4.6 × 150 mm, 5 μm, Youngjin Biochrom, 대한민국)을 사용하였다. 이동상은 40 mM sodium phosphate(pH 7.0), water : acetonitrile : methanol = 10 : 45 : 45로 혼합된 용액을 각각 A와 B로 1.5 mL/min의 유속으로 사용하였다. 구배조건은 A용액 : B용액으로서 0 내지 24분에 95 : 5(v/v, %)에서 24 내지 25분에 45 : 55, 23 내지 34.5분에 20 : 80, 34.5분부터 95 : 5로 설정하여 분석을 시행하였다. 아미노산 함량은 표준 아미노산의 HPLC 분석결과를 토대로 작성한 표준곡선을 이용하여 산출하였다.

상기 최적 생성 조건인 초기 pH를 pH 5로 조절한 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서 배양 후 HPLC를 통해 확인된 각각의 아미노산의 함량을 측정한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 48시간이 경과된 시점에서 초기 pH를 pH 5로 조절한 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서 상기 균주를 배양한 오르니틴의 함량이 11,090.80 mg/L으로 확인되어, 오르니틴 생산능이 매우 우수한 것으로 확인되었으며, 오르니틴 외에 항비만 활성을 가진 것으로 알려진 시트룰린도 319.33 mg/L으로 확인되어, 시트룰린 생산능도 있는 것으로 확인되었다.

구체적으로, 초기 pH를 조절하지 않은 경우에 48시간이 경과한 후에 오르니틴의 함량이 8,373.59 mg/L으로 확인되어, 초기 pH를 pH 5로 조절한 1%(w/v) 아르기닌이 첨가된 MRS 배지에서 48시간 배양한 경우(11,090.80 mg/L)가 초기 pH를 조절하지 않은 대조구에 비해 132.4%로 32% 넘게 생산능이 개선되는 것으로 확인되었다.

또한, 기존 연구 결과(The Korean Journal of Microbiology, Vol 45, No. 4, p. 339 - 345)에서 오르니틴을 생산하는 다른 균주와 비교한 경우에도 , 본 발명의 균주는 현저하게 우수한 오르니틴 생성능이 확인되었다. 상기 기존 연구 결과와 비교를 위해, 상기 기존 연구 결과와 같이 초기 pH를 조절하지 않고 48시간 배양한 경우, 시간 당 배양액 1L에서 생산된 오르니틴 함량을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

균주 명	오르니틴 생산능(mg/L/hr)
Weissella koreensis OK1-4	27.01
Weissella koreensis OK1-6	31.41
Weissella koreensis KCCM 41517	29.23
Lactobacillus hilgardii KCCM 40759	21.27
Weissella koreensis DB1	174.45

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 기존 아르기닌으로부터 오르니틴을 생산할 수 있는 유산균의 경우, 오르니틴 생산능이 21 mg/L/hr 내지 31.5 mg/L/hr 정도로 확인된 반면, 본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주는 174.45 mg/L/hr로 기존 균주에 비하여 약 5.6 내지 8.2배 더 우수한 생산능을 갖는 것으로 확인되었다.

뿐만 아니라, 기존 연구에서는 시트룰린을 생산할 수 있는 유산균이 전혀 확인되지 아니한 반면, 본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 시트룰린도 생산할 수 있는 것으로 확인되었다.

상기 결과롤부터, 본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 오르니틴 생산능이 매우 우수할 뿐만 아니라, 시트룰린 생산능도 있어서, 항비만 또는 고지혈증 개선을 위한 유효성분 생산을 위한 최적 균주로 확인되었다.

2-3. 분리 균주의 안전성 확인

상기 실시예 2-1 및 2-2에서 확인된 결과를 기초로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주의 안전성 여부를 확인하였다.

우선, 유산균이 식품 제조를 위한 발효균주 또는 생균활성제 또는 프로바이오틱 미생물로 활용되기 위해서는 인체에 대한 용혈성 독성이 없는 안전성이 요구된다. 이와 관련하여, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주가 적혈구의 파괴 또는 분해를 유도할 수 있는지 여부와 관련하여, 용혈성 여부를 검사하였다.

구체적으로, 상기 용혈성 확인은 Blood agar base(Oxoid, 영국)를 멸균 후에, 7% horse blood(Oxoid, 영국)를 첨가하여 평판배지를 만든 다음 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 도말(streaking)한 후, 30

에서 48시간 배양하여 균체주위에 투명환의 생성여부로 용혈성을 판단하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1은 용혈성 검사에서 어떤 경우(α-hemolysis 및 β-hemolysis)에도 균체주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환이 전혀 생성되지 않아, 용혈반응을 유도하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1은 용혈성과 같은 인체에 대한 유해작용은 없는 것으로 확인되어, 발효식품의 종균으로서의 안전성이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 식품 또는 의약으로 섭취된 유산균이 자체적으로 생육하기 위해 생성되는 물질로 인해 신체의 면역체계에 변화가 생기는 경우 안전성의 문제가 발생될 수 있으며, 이와 관련 GRAS 미생물인 유산균의 경우, 기본적인 안전성이 보장되므로, 유산균으로 인해 체내에서 항생제 내성 관련 문제가 더 관심을 받고 있다. 이와 관련하여, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 항생제 내성에 대해 검사하였다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 안전성을 확인하기 위하여, 기존 주로 사용되는 8종의 항생제에 대한 감수성을 액체 배지 희석법(Broth microdilution method)을 이용하여 측정하였다. 상기 8종의 항생제는 Ampicillin(AMP), Vacomycin(VAC), Gentamycin(GEN), Kanamycin(KAN), Streptomycin(STR), Erythromycin(ERY), Tetracycline(TET), Chloramphenicol(CHL)이었으며, Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 규정된 용매에 녹인 후 사용하였다. 또한, 상기 항생제 감수성을 측정하기 위한 배지는 0.5% dextrose를 첨가한 Muller-Hinton(MH, BBL Muller Hinton Broth, Becton Dickinson and company, USA) 액체배지에 상기 항생제를 각 농도별로 조정하여 첨가한 것을 사용하였다.

상기 항생제 감수성은 항생제의 최소 생육저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하는 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 상기 균주의 항생제에 대한 최소 생육저해 농도는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, MRS 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 9,950 x g의 조건에서 4분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 후, 상기 0.5% Dextrose가 함유된 MH액체배지(Muller-Hinton broth)에 현탁하여 OD₆₀₀ 값이 0.4 내지 0.5가 되도록 조절한 다음, 상기 현탁액을 MH 액체배지에 1 : 10으로 희석하였다. 항생제를 단계별로 희석하여 준비된 배지에 상기 균주의 현탁액 즉, 희석한 배양액을 넣어준 후 혐기적인 조건하에 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 감수성 여부는 탁도 및 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, 스웨덴)에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하는 방법으로 수행하였다. 탁도 및 생육도의 대조구로는 항생제를 첨가하지 않은 MH 액체배지에서 상기 균주를 배양한 결과를 사용하였다. 상기 균주에 대한 감수성 해석은 European Food Safety Authority(EFSA, 2012)에서 제시한 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)에 대한 제안값(break point)이 없으므로, 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)의 항생제 내성 관련 수행된 타 연구에서 확인된 실험값과 비교하여 항생제 감수성 또는 내성을 결정하였다. 상기 측정 결과와 타 연구에서 확인된 웨이셀라 코리엔의 실험값을 하기 표 8에 나타내었다. 하기 표 8의 단위(Unit)는 MIC(μg / mL)이다.

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 균주인 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주 8 종류의 항생제 모두에 대하여 사전 연구 조사한 결과에 비해 낮은 최소생육저해농도를 보여, 상기 8 종의 항생제 모두에 대해 감수성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 인간의 건강에 위험을 나타내지 않은 기준정도의 항생제 저항성만을 나타내어, 항생제 내성을 갖지 않는 즉, 생균활성제로 사용이 가능한 안전한 균주임을 확인되었다.

추가로, 최근 서구뿐만 아니라 우리나라에서도 발효식품과 관련 문제가 되는 생체아민 생성 여부를 확인하였다. 상기 생체아민 생성여부는 생체아민 생성능이 있는 것으로 기존에 보고된 균주인 엔테로코커스 파에칼리스 균주(Enterococcus faecalis ATCC 29212)와 비교하여, 탈탄산효소능 확인 실험(Decarboxylase plate method, Bover-Cid)와 생체아민 생성 정도를 HPLC로 확인하는 실험으로 확인하였다.

상기 탈탄산효소능 확인 실험을 위해 우선, 전구체 아미노산으로서 Tyrosine을 0.1% 첨가한 액체 배지 9mL에 균주 배양액 1mL를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, 9.0 log CFU/mL의 농도로 준비하였다. 준비된 배양액을 1% Tyrosine이 첨가된 탈탄산효소 배지(Decarboxylase plate)에 10 μL 점적하여 해당 균주가 형성한 집락(colony)의 주변에 색깔 변화를 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 형성된 콜로니의 주변 색깔 변화를 확인한 결과를 도 8a에 나타내었다.

상기 도 8a에 나타낸 바와 같이, 좌측의 ATCC 29212(Enterococcus faecalis ATCC 29212)는 집락(colony) 주변이 선명한 보라색으로 나타내어, 생체아민 생성능이 있음이 확인된 반면, DB1(본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1)은 콜로니 주변이 전혀 변화되지 않아, 생체아민 생성능이 없는 것으로 판단되었다.

추가로, 웨이셀라 코리엔시스 DB1의 생체아민 생성능을 확인하기 위해, 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 배양액에 대해 HPLC를 수행하여, 생체아민 생성 여부 및 생성된 생체아민의 양을 정량적으로 검증하였다.

상기 HPLC를 이용한 검증은 하기와 같은 방법으로 수행하였다. 우선, HPLC를 이용한 생체아민 생성여부를 검증하기 위해, 생체아민 표준용액(BA standard solution)을 조제하였다. 상기 생체아민 표준용액은 총 9종의 생체아민과 내부표준물질(internal standard, IS)을 이용하여 조제하였다. 상기 9종의 생체아민은 구체적으로 트립타민(tryptamine hydrochloride, TRY, 49.12 mg), 퓨트레신 (putrescine dihydrochloride, PUT, 73.2 mg), 카다베린(cadaverine dihydrochloride, CAD, 68.56 mg), 스퍼 미다인(spermidine trihydrochloride, SPD, 70.16 mg), 페닐에틸아민(2-phenylethylamine hydrochloride, PHE, 52.08 mg), 스퍼민(spermine tetrahydrochloride, SPM, 68.8 mg), 히스타민(histamine dihydrochloride, HIS, 66.24 mg), 티라민(tyramine hydrochloride, TYR, 50.72 mg) 및 아그마틴(agmatine sulfate, AGM, 70.16 mg)이며, 상기 9종의 생체아민과 내부표준물질(1,7-diaminoheptane, IS, 40 mg)을 각각 0.1 N HCl 40 mL에 녹여 최종 1 mg/mL 농도로 준비하였다. 상기 생체아민 표준용액(BA standard solution)은 상기 생체아민과 내부표준물질(IS)을 각각 0.1 mg/mL 농도로 혼합하여 제조하였다.

또한, 상기 HPLC를 수행하기 위한 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 배양액으로부터 생체아민을 추출하는 방법은 Hwang 등의 방법(Journal of Chromatography B, Vol 693, pp. 23-30(1997))을 변형하여 사용하였다. 보다 구체적으로, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 각각 30

에서 24시간 전배양한 후, MRS broth와 MRSO broth(상기 MRS broth에 0.1% 오르니틴(Ornithine, 전구체)를 첨가한 배지)에 각각 전배양한 균주를 10%씩 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 24시간 동안 배양한 후, 4

및 9,950 x g의 조건으로 15분간 원심분리한 후, 상등액만을 분리하여 균체를 제거하고 배양 상징액을 회수하였다. 상기 회수한 배양 상징액을 0.2 μm membrane filter로 제균한 후, 동결건조하여 10배 농축하였다. 상기 10배 농축한 농축 배양 상징액 2 mL에 5% trichloroacetic acid(TCA)-0.4 M perchloric acid(HClO4) 10 mL을 가하고, 상기 내부표준물질(IS, 1,7-diaminoheptane)를 0.2 mg/mL첨가하여 추출하였다. 상기 생체아민 및 내부표준물질이 포함된 생체아민 표준용액과 상기 추출된 배양 상징 추출액에 대해 우선 유도 체화를 수행한 후, HPLC를 수행하였다.

상기 HPLC를 수행하기 전에 수행된 유도체화 과정 및 상기 추출된 농축 배양 상징 추출액의 유도체와 과정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 생체아민 표준 물질 혼합용액과 상기 추출된 농축 배양 상징 추출액에 각각 2 M NaOH 1 mL와 benzoyl chloride 10 μL를 가하고 30

에서 40분간 반응시켰다(benzoylation). 상기 각각의 반응액에 포화된 NaCl 용액(saturated NaCl) 2 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 디에틸 에테르(diethyl ether) 3 mL를 첨가하여 추출한 다음, 상징액 1.5 mL을 분취하여 질소 가스로 농축하였다. 상기 질소가스로 농축한 상징액을 50% 메탄올 수용액(이동상) 500 μL에 용해하여 HPLC 분석 시료로 사용하였다. 또한, 상기 생체아민 및 내부표준물질을 이용하여 정확한 생체아민 분석을 위해 HPLC 분석 조건을 설정하였다. 상기 HPLC를 수행한 기계에 관한 사항 및 수행조건과 최종 분석조건으로 결정된 HPLC의 분석조건을 하기 표 9 및 표 10에 나타내었다.

Instrument	Youngin instrument
Detector	UV-730D(254 nm)
Column	SunFire C18(4.6 x 150 nm, 3.5 μm, Waters)
Solvent	A: water : methanol(50 : 50) / B: water : methanol(10 : 90)
Oven temperature	40℃
Injection Vol	20 μL

Time(min)	Flow rate(mL/min)	A(%)	B(%)
0	0.4	100	0
15	0.4	0	100
25	0.4	0	100
30	0.4	100	0
55	0.4	100	0

상기 표 9 및 표 10의 조건으로 수행한 HPLC 결과를 도 8b에 나타내었다. 상기 도 8b에 나타낸 바와 같이, 웨이셀라 코리엔시스 DB1은 정량적인 실험 결과에서도 생체아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1은 GRAS 미생물로 안전성이 보편적으로 확보되어 있을 뿐만 아니라, 용혈성 검사, 항생제 내성 검사 및 생체아민 생성능 검사 결과 모두 음성으로 확인되어, 개별적인 안전성도 확보된 것으로 확인되었다.

실시예3. 분리 균주를 이용한 기능성 미강 생산

3-1. 분리 균주를 이용한 기능성 미강 생산 조건 확인

상기 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가지며, 오르니틴 생산능이 다른 균주에 비해 현저하게 우수한 것으로 확인된 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1) 균주를 활용하여, 미강 발효물을 제조하기 위해 최적의 조건을 확인하였다.

우선, 미강 발효물을 제조하기 위해 발효균주 및 발효원물인 미강은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

상기 발효균주는 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 MRS 배지에 접종한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 배양액의 1%를 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하는 계대 배양을 2회 즉, 1차 및 2차로 수행한 후, 2차 계대배양한 배양액을 10,000 x g 및 4℃ 조건에서 15분 동안 원심분리를 수행한 다음 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 상기 회수한 균체에 멸균수를 가하여 약 6.70 log CFU/mL의 농도로 현탁하여, 미강 발효용 종균으로 사용하였다.

상기 발효원물인 미강은 쌀 도정과정에서 수득한 미강을 3차 증류수에 20%(w/v, 미강 중량/증류수 부피), 45%(w/v, 미강 중량/증류수 부피) 및 50%(w/v, 미강 중량/증류수 부피)의 비율로 첨가한 후, 아르기닌(Arginine)을 1%(w/v, 아르기닌 중량/증류수 부피)의 농도로 첨가 여부로 구분하여 실험예(1% 아르기닌 첨가)와 비교예(1% 아르기닌 미첨가)로 구분하여 제조하였다. 각각 제조된 실험예와 비교예의 미강 혼합액을 고압멸균기(Autoclave)를 이용하여 121℃의 온도조건 및 1.1 기압의 압력조건에서 15분 동안 가열하여 미강을 호화시켰다. 상기 호화시킨 미강을 상온(15℃ 내지 20℃)으로 식혀, 미강 발효 대상물로 사용하였다.

상기 미강 발효 대상물인 아르기닌이 첨가된 미강 혼합액에 상기 약 6.70 log CFU/mL의 미강 발효용 종균을 1%(v/v) 접종하고, 멸균 유리막대를 이용하여 충분히 혼합한 후 30℃에서 48시간 동안 발효를 수행하였다. 상기 발효된 미강 발효물은 24시간 별로 발효물 내 생균수와 아미노산 함량의 변화를 분석하였다.

상기 생균수는 plate count법으로 분석하였고, 아미노산 함량의 변화는 24시간이 경과된 발효물을 상기 실시예 2-2에서수행한 HPLC 분석법으로 분석하였다.

상기 plate count법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 상기 발효물에 부피비를 기준으로 상기 발효물의 4배의 멸균수를 혼합한 후, 멸균가아제를 이용하여 착즙하였다. 상기 착즙한 착즙액을 단계적 희석법(Serial dilution, 10배 희석)으로 10배씩 희석하면서 희석액을 제조하였다. 상기 희석한 단계별 희석액을 MRS 고체배지(MRS plate)에 분주하고 도말한 후, 30℃에서 48시간 동안 배양하며, 24시간 별로 집락(colony) 숫자를 세어 CFU/mL로 계산하였다.

상기 측정된 생균수를 하기 표 11에 나타내었다.

첨가성분 함량		생균수 (log CFU/mL)
미강 함량(w/v)	아르기닌 함량(w/v)	24시간	48시간
20%	0%	7.33±0.50	7.34±0.40
	1%	7.47±0.36	7.48±0.42
45%	0%	7.56±0.34	7.56±0.40
	1%	8.13±0.16	7.49±0.39
50%	0%	7.48±0.25	7.31±0.25
	1%	8.11±0.19	7.46±0.22

상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 24시간 경과 시점을 기준으로 각각의 미강 첨가 함량(20%, 45% 및 50%) 모두에서, 상기 발효균주인 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 생균수는 1%(w/v) 아르기닌 첨가에 따라 생균수가 약 0.1 내지 0.6 log CFU/mL 정도가 증가하는 것으로 확인되어, 아르기닌의 첨가에 의해 생균수가 유의적으로 증가됨이 확인되었다. 특히, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 배양원액의 50% 이상이 고체(50%의 미강 및 1% 아르기닌)인 조건에서도 유효하게 생육하는 것으로 확인되어 발효가 가능한 것으로 확인되었다. 일반적인 미생물의 경우 높은 고형물 농도에서는 미생물 발효가 제한적이어서, 효율이 중요한 미생물 발효균주의 산업화에 있어서 제한적인 효과를 나타내는 반면, 본 발명의 균주인 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 고농도의 고형물 농도에서도 미생물 발효가 유효한 것으로 확인되어, 산업적 효과가 클 것으로 기대되었다.

3-2. 미강 발효를 위한 최적 발효 조건 확인

상기 3-1에서 미강 발효에 적합한 균주로 확인된 상기 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가지며, 오르니틴 생산능이 다른 균주에 비해 현저하게 우수한 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 기능성 미강 발효물 제조를 위한 최적 조건을 확인하기 위해 최적 발효 pH 및 최적 발효 온도를 확인하였다.

상기 최적 발효 pH 및 최적 발효 온도는 각각의 발효 조건에서 상기 3-1에서 확인한 생균수를 측정하는 방법으로 생균수를 측정하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조된 회수한 균체에 멸균수를 가하여 약 6.70 log CFU/mL의 농도로 현탁하여, 미강 발효용 종균을 상기 미강을 3차 증류수에 20%(w/v, 미강 중량/증류수 부피) 의 비율로 첨가한 후, 아르기닌(Arginine)을 1%(w/v, 아르기닌 중량/증류수 부피)의 농도로 첨가한 다음 고압멸균기(Autoclave)를 이용하여 121℃의 온도조건 및 1.1 기압의 압력조건에서 15분 동안 가열하여 미강을 호화시키고 상온으로 식혀 제조한 미강 발효 대상물에 접종한 후, 각각의 조건에서 48시간 동안 발효를 수행하였다. 상기 발효된 미강 발효물은 24시간 별로 발효물 내 생균수를 상기 3-1의 방법과 같이 plate count법으로 측정하였다. 상기 발효 조건을 달리하며 발효를 수행한 것은 우선, 30℃에서 pH를 달리하며 발효를 수행한 후에 최적 pH를 확인하고, 이후 최적 pH에서 온도를 달리하며 발효하는 방법으로 수행하였다.

상기 발효조건, 구체적으로 발효 온도 및 발효 pH 조건에 따른 발효 후 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주의 생균수를 확이한 결과를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.

상기 도 9에 바타낸 바와 같이, 상기 최적 발효 pH는 pH 6.0 내지 pH 6.5인 것으로 확인되었다. 구체적으로, 상기 미강을 호화시킨 미강 발효 대상물을 5 N HCl 또는 5 N NaOH를 사용하여 pH를 pH 4.0 내지 pH 7.0으로 조절한 후, 각 pH 별로 48시간 동안 발효하며 24시간 마다 생균수를 확인한 결과, pH 4.0부터 pH가 증가하여 약산성이 될수록 생균수가 증가하여 pH 6.0에서 생균수가 유의적으로 증가하여 24시간을 기준으로 생균수가 8.10 log CFU/mL인 것으로 확인되었고, pH 6.5에서도 pH 6.0과 유사한 생균수가 8.20 log CFU/mL인 것으로 확인된 반면, pH 7.0에서는 오히려 생균수가 유의적으로 낮아져, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용하여 미강을 발효하는데는 pH 6.0 내지 pH 6.5가 최적인 것으로 확인되었다.

또한, 상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 최적 발효 온도는 25℃ 내지 30℃인것으로 확인되었다. 상기 도 10에서 확인된 최적 pH인 pH 6.5에서 온도를 달리하며 확인된 결과, 발효 온도가 20℃이하에서는 발효가 잘 진행되지 않은 반면, 25℃에서는 생균수가 유의적으로 증가하여 24시간을 기준으로 생균수가 7.97 log CFU/mL인 것으로 확인되었고, 30℃에서는 25℃ 보다 더 발효 효율이 높아, 생균수가 8.10 log CFU/mL인 것으로 확인된 반면, 발효 온도가 37℃에서경우 30℃에 비해 생균수가 유의적으로 낮아, 최적 발효 온도는 25℃ 내지 30℃, 더 바람직하게는 30℃인 것으로 확인되었다.

상기 도 9 및 도 10의 결과에 따라, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 기능성 미강 발효물 제조를 위한 최적 발효 조건은 pH 6.0 내지 pH 6.5의 pH 조건 및 25℃ 내지 30℃의 온도 조건인 것으로 확인되었다.

또한, 상기 최적 발효 pH를 상기 2-2에서 수행한 HPLC 분석을 통해, 아르기닌과 오르니틴, 시트룰린 함량의 변화를 분석하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조된 회수한 균체에 멸균수를 가하여 약 6.70 log CFU/mL의 농도로 현탁하여, 미강 발효용 종균을 상기 미강을 3차 증류수에 20%(w/v, 미강 중량/증류수 부피) 의 비율로 첨가한 후, 아르기닌(Arginine)을 1%(w/v, 아르기닌 중량/증류수 부피)의 농도로 첨가한 다음 고압멸균기(Autoclave)를 이용하여 121℃의 온도조건 및 1.1 기압의 압력조건에서 15분 동안 가열하여 미강을 호화시키고 상온으로 식혀 제조한 미강 발효 대상물에 접종한 후, 상기 미강 발효 대상물의 초기 pH를 달리하며, 각각의 조건에서 48시간 동안 발효를 수행하였다. 상기 48시간 경과된 각각의 발효물 전체를 건조하여 건조된 미강발효물을 수득하였다.

상기 수득한 미강 발효물을 대상으로 상기 실시예 2-2에서 수행한 HPLC 분석법으로 아르기닌과 오르니틴, 시트룰린 함량의 변화를 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

No	Peak Name	아미노산 함량(mg/L)
		pH 5.0	pH 6.0	pH 6.5	pH 7.0
1	Arginine	37,694.66	32,724.56	32,899.84	37,437.62
2	Ornithine	5,864.21	8,495.68	8,358.40	6,092.42
3	Citrulline	201.68	1,897.84	1,882.88	51.21
Total		43,760.56	43,118.08	43,141.12	43,581.24

상기 표 12에 나타낸 바와 같이, 시트룰린 생산량 및 오르니틴 생산량의 측면에서, 최적 pH는 pH 6 내지 pH 6.5인 것으로 확인되어, 생균수를 측정한 것과 같은 결과를 확인하였다. 따라서, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 미강 발효를 위해서는 미강에 아르기닌을 첨가한 발효물을 이용하여 pH 6 내지 pH 6.5에서 발효시키는 것이 최적인 것으로 확인되었다.

상기 결과를 종합하여, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 미강 발효에 적합하고, 미강 발효를 통해 오르니틴을 생성할 뿐만 아니라, 미강 발효물에 아르기닌이 첨가된 경우에 현저하게 높은 수율로 시트룰린과 오르니틴을 생산할 수 있으며, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 미강 발효를 위해서는 미강에 아르기닌을 첨가한 발효물을 이용하여 30℃ 및 pH 6.0 내지 pH 6.5에서 발효시키는 것이 최적인 것으로 확인되었다.

3-3. 미강 발효물의 건조 방법 확인

상기 제조된 미강 발효물의 보관 및 사용의 용이성을 개선하기 위해 건조시켜 미강 발효 건조물을 제조하였다. 상기 미강 발효 건조물의 제조에 적합한 건조법을 확인하기 위하여, 상기 3-2에서 제조된 미강 발효물을 열풍 건조와 동결 건조로 각각 건조하였다.

상기 열풍 건조는 상기 3-2에서 제조된 미강 발효물을 40℃에서 16시간 동안 열풍 건조법으로 수행하였다. 상기 동결 건조는 - 70℃에서 72시간 동안 동결 건조법으로 수행하였다. 상기 각각의 건조법으로 건조하여 수득한 미강 발효물을 도 11a(동결 건조) 및 도 11b에 나타내었다.

상기 각각의 건조법으로 제조된 미강 발효 건조물에 대해 미강 원물(생미강)을 비교예로 하여, 관능검사를 수행하였다. 관능 검사는 6개월 이상 훈련된 조선대학교 식품영양학과 대학생 및 석박사 연구원 중 10명의 관능요원을 대상으로 상긱 각각의 샘플을 흰색의 편평한 플라스틱 접시에 담아 임의의 순서로 관능요원들에게 제공한 후, 묘사적 관능검사법으로 수행하였다.

상기 관능검사 결과, 비교예인 미강 원물은 식감이 거칠고 도정 전 곡류에서 느낄 수 있는 특유의 지푸라기와 같은 맛과 향이 느껴졌으며, 씹고 삼킨 후에도 입안에 잔여물이 많이 남아 거북감을 느끼는 것으로 평가되었다. 한편, 미강 발효 동결 건조물의 경우, 식감이 곱게 갈린 미숫가루 혹은 콩가루와 같고 부드러워 입안에서 녹는 듯하고, 삼킨 후에도 입안에 잔여물이 거의 남지 않아 적절한 신맛과 고소한 맛이 어우러지는 것으로 평가되었다. 또한, 미강 발효 열풍건조물의 경우, 동결건조법으로 건조한 동결 건조물 보다 좀 더 거친 식감이기 때문에 씹히는 맛이 있고, 적당히 부드럽고 신맛과 고소한 맛이 어우러지는 것으로 평가되었다.

상기 평가에서 기호도가 가장 우수한 것으로 평가된 열풍 건조법으로 건조된 미강 발효 열풍 건조물과 미강 원물 자체에 포함된 아미노산 성분 함량을 각 고조물을 3차 증류수에 녹인 후, 상기 실시예 2-2에서 수행한 HPLC 분석법으로 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 하기 표 13의 단위는 분석대상인 건조물 1 kg 당 해당 아미노산의 함량(mg)을 나타낸다(mg/kg). 또한, 하기 표 13의 N.D는 해당 아미노산이 발견되지 않았다는 것을 의미한다.

상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 미강 발효 열풍 건조물에서 시트룰린의 경우 2,816.02 mg의 시트룰린이 확인되어, 생미강에서 17.01 mg인 것에 비해 약 166배의 시트룰린 함량이 증가된 것으로 확인되었고, 오르니틴의 경우에도 미강 원물에서는 오르니틴이 발견되지 않은 반면에, 본 발명의 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 첨가하여 미강을 발효시키는 경우에 발효물 8,744.10 mg의 오르니틴 함량이 확인되어, 오르니틴 함량이 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.

상기 최적의 미강 발효물 제조 조건 및 방법으로 제조된 최종 미강 발효건조물에서 항비만 성분인 오르니틴과 시트룰린 함량이 총 11,560.12 mg/kg으로 나타나, 본 발명의 방법으로 제조된 미강 발효 건조물은 항비만 효과가 우수할 것으로 평가되었다. 상기 항비만 효과가 우수할 것으로 평가된 최종 상기 시트룰린 및 오르니틴 생산능을 가지며, 오르니틴 생산능이 다른 균주에 비해 현저하게 우수한 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 기능성 미강 발효 열풍 건조물의 항비만 효과를 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다.

3-4. 미강 발효물의 항비만 효과 확인

상기 미강 발효 열풍 건조물의 항비만 효과를 동물실험을 통해 확인하였다.

우선, 실험동물은 생후 6주된 수컷 C57BL/6N 마우스 40마리를 중앙실험동물(Seoul, 대한민국)에서 구입하여 조선대학교 실험동물센터에서 1주일간 고형사료로 적응시킨 후 다음 난괴법(randomized block design)에 의해서 각 처리 군 당 10마리씩 나누어 스테인리스 케이지에 1마리씩 분리하여 사육하였다. 상기 실험동물센터 사육조건은 18 ± 2℃의 온도조건 및 상대습도 50 내지 55%의 습도조건을 유지하였으며, 광주기(08:00 내지 20:00) 및 암주기를 12시간 간격으로 조절하였다.

상기 7일 후, 상기 실험 동물은 난괴법(randomized com-plete block desigh)에 따라 정상식이군(normal diet group, ND), 고지방고콜레스테롤식이군(high-fat/high-cholesterol group, HFCD), 고지방고콜레스테롤식이와 5%(w/w, 첨가물 중량/식이 전체 중량) 미강원물 첨가군(high-fat/high-cholesterol group + 5%(w/w) rice bran group, HFCD-RB) 및 고지방고콜레스테롤식이와 5%(w/w) 상기 미강 발효 열풍 건조물 첨가군(high-fat/high-cholesterol group + 5%(w/w) fermented rice bran group, HFCD-FRB)으로 10마리씩 군을 나누어 실험에 사용되었다.

실험 기간 동안 식이 섭취량과 체중은 일주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였으며, 물과 사료는 제한없이 섭취시켰다. 상기 실험에 사용된 식이 중 정상식이와 고지방고콜레스테롤식이는 AIN-93 정제식이(Reeves et al.,J Nutr. 123: 1939-1951, 1993)를 기반으로 제조하였으며, 정상식이는 열량대비 10 kcal% 지방을 공급하여 제조하였고, 고지방고콜레스테롤식이는 열량대비 35 kcal% 지방과 1.25% 콜레스테롤을 첨가 제조하여 공급하였다.

상기 각각의 실험군의 실험동물은 10주 동안 상기 식이를 유지하였다. 상기 10주 동안 식이를 유지한 후, 항비만 효과는 실험동물의 간 및 지방조직 부위별 무게를 측정하는 방법과 간 조직의 병리조직학적 검사 및 지방세포 크기의 측정을 통해 확인하였다.

상기 실험동물의 간 및 지방조직의 무게 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 실험동물을 희생시켜, 장기를 적출하였다. 구체적으로, 상기 실험동물은 물은 급여하면서 12시간 절식시킨 후 에틸 에테르를 이용하여 마취하고, 개복한 후 상기 실험동물의 장기, 구체적으로 간과 백색 지방조직(부고환 지방조직, 장간막 지방조직, 등 지방조직 및 신장주변 지방조직)을 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.

상기 적출한 간과 백색 지방조직의 무게는 부검 전 절식된 체중 100 g에 대한 상대 중량으로 계산하여 산출하여, 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다. 하기 표 14의 단위는 분석대상인 실험동물 100 g 당 지방의 함량(g)을 나타낸다(g/100 g body wt.). 하기 표 14의 AT는 지방조직(adipose tissue)를 의미하고, 총 백색 지방조직(Total white AT, Total white adipose tissue)은 적출된 4개 조직의 지방조직의 측정된 무게를 총 합산한 결과를 의미한다.

구분	정상식이 (ND)	고지방 고콜레스테롤 식이(HFCD)	고지방고콜레스테롤식이+미강 (HFCD-RB)	고지방고콜레스테롤식이+발효미강 (HFCD-FRB)
총 백색 지방조직 (Total white AT)	0.87±0.01	1.44±0.04	1.25±0.04	1.08±0.04
부고환 지방조직 (Epididymal white AT)	0.46±0.02	0.82±0.04	0.69±0.03	0.64±0.02
장간막 지방조직 (Mesenteric white AT)	0.22±0.01	0.32±0.02	0.26±0.05	0.24±0.01
등 지방조직 (Retroperitioneal white AT)	0.09±0.01	0.26±0.02	0.21±0.04	0.21±0.02
신장주변 지방조직 (Perinenal white AT)	0.02±0.00	0.06±0.02	0.05±0.01	0.04±0.01

기존 연구에 의하면, 비만에 의해 유도되는 건강 이상 증상은 체중 증가 자체보다는 복강에 위치한 백색 지방조직의 증가때문인 것으로 확인되었으므로, 상기 미강 발효 열풍 건조물의 항비만 효과를 확인하기 위하여, 백색 지방조직의 무게를 측정하였다. 구체적으로, 백색 지방조직에 해당하는 부고환 지방조직, 장간막 지방조직, 등 지방조직 및 신장주변 지방조직의 무게를 측정하였으며, 그 결과를 상기 표 14에 나타내었다.

상기 표 14에 나타낸 바와 같이, 정상식이군(normal diet group, ND group)에 비하여 고지방고콜레스테롤식이군(high-fat/high-cholesterol group, HFCD group)에서, 총 백색 지방조직의 무게를 비롯하여 부고환 지방조직, 장간막 지방조직, 등 지방조직 및 신장주변 지방조직의 무게가 모두 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 한편, 고지방고콜레스테롤식이를 하는 경우에도, 미강을 5%(w/w) 함께 섭취시킨 미강원물 첨가군(high-fat/high-cholesterol + 5%(w/w) rice bran group, HFCD-RB group)의 경우, 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)에 비해, 총 백색 지방조직의 무게는 물론 부고환 지방조직, 장간막 지방조직, 등 지방조직 및 신장주변 지방조직의 무게가 모두 유의적으로 감소하는 것으로 확인되었다. 특히, 미강 발효 열풍 건조물을 5%(w/w) 함께 섭취시킨 미강 발효 열풍 건조물 첨가군(high-fat/high-cholesterol + 5%(w/w) fermented rice bran group, HFCD-FRB)의 경우, 고지방고콜레스테롤식이군은 물론 미강원물 첨가군에 비해서도 유의적으로 지방조직의 무게가 감소되는 것이 확인되어, 발효과정을 통해 미강이 가지는 항비만 효과가 현저하게 개선되는 것이 확인되었다.

상기 적출된 실험동물의 부고환 조직의 지방세포의 크기를 비교하여, 항비만 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 적출된 부고환 조직의 크기를 일정하게 자른 후, 10% 포르말린(formalin) 용액으로 24시간 동안 고정시킨 후, 흐르는 물에서 과잉의 고정액을 제거하고, 에탄올(ethyl alcohol)을 이용하여 조직 속의 수분을 제거하였다. 이 후, 자일렌(Xylene)을 이용하여 조직 속의 에탄올을 제거한 후, 파라핀(paraffin) 처리를 하여 조직 공간을 채운 다음 3 μm 두께로 박절하여 부고환 조직 절편(slide)을 제작하였다. 상기 부고환 조직 절편을 slide에 부착시켜 말린 다음 헤마톡실린 에오신 염색(H&E stain, Hematoxylin and eosin stain)한 후, 광학 현미경(light microscope, TS100, Nikon, 일본)으로 지방세포를 관찰하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 상기 지방세포를 관찰한 결과 즉, 지방세포를 촬영한 사진을 Image analyzer program(National Institute of Mental Health, USA)을 이용하여 분석하여, 실험군 간의 지방세포의 크기를 비교하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

상기 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 정상식이군(ND group)에 비하여 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)의 경우, 부고환 지방세포의 크기가 비대되어, 더 크고 선명하게 관찰되는 것이 확인되었다. 한편, 섭취시킨 미강 발효 열풍 건조물 첨가군 (HFCD-FRB group)의 경우, 고지방고콜레스테롤식이군 (HFCD group)에 비하여 지방세포의 크기가 유의하게 저하된 것이 확인되었으며, 정상식이군과 유사할 정도로 지방세포의 비대화가 억제된 것이 확인되었다. 미강원물 첨가군(HFCD-RB group)의 경우, 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)에 비하여 지방세포의 크기가 저하되기는 하였으나, 유의적인 차이는 나타나지 않은 것으로 확인되었다.

또한, 상기 적출된 실험동물의 간에 대해 병리조직학적 검사를 수행하여 항비만 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 적출된 간을 4% paraformaldehyde 용액으로 고정시킨 후, - 25

에서 Cryocut Microtme(Leica CM1800, 독일)를 사용하여 3 μm두께로 잘라 간 조직 절편을 제작하였다. 상기 간 조직 절편을 slide에 부착시켜 말린 다음 Oil-Red O 용액으로 1시간 처리하여 염색한 후, 수세, 주화 및 탈수단계를 차례로 수행한 다음 봉입제로 봉입한 후, 광학 현미경(light microscope)으로 관찰하여 지방세포를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 도 14에 나타내었다.

상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상식이군(ND group)에 비하여 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)의 경우, 간 조직에서 지방질이 축적되는 것이 확인되었다. 구체적으로, 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)의 경우 간 조직 전반에서 Oil-Red O 용액에 의해 붉게 염색된 지방구가 확인되어, 간조직에 있는 간세포 내 지방 축적이 뚜렷하게 확인되었다. 한편, 미강 발효 열풍 건조물 첨가군(HFCD-FRB group)과 미강원물 첨가군(HFCD-RB group)의 경우, 고지방고콜레스테롤식이군(HFCD group)에 비하여 간 세포 내에 지방축적이 제한적으로 진행된 것이 확인되었으며, 특히 미강 발효 열풍 건조물 첨가군(HFCD-FRB group)의 경우, 정상식이군(ND group)과 유사한 색깔인 반면, 미강원물 첨가군(HFCD-RB group)의 경우 약간 보라색에 가깝게 확인되어, 미강원물 보다 미강 발효물을 첨가하는 경우, 항비만 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.

상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주는 미강 발효에 적합한 안전성이 우수한 미생물로, 미강을 발효하여 시트룰린과 오르니틴을 생산할 수 있으며, 상기 웨이셀라 코리엔시스 DB1 균주를 이용한 본 발명의 제조방법으로 제조할 경우, 미강 자체에 발견되지 않거나 제한적 성분만 발견된 시트룰린과 오르니틴을 현저하게 증가된 미강 발효물을 제조할 수 있으며, 이러한 고 함량의 항비만 성분 즉, 시트룰린과 오르니틴을 포함한 미강 발효 열풍 건조물은 항비만 효과가 우수할 뿐만 아니라, 기호도도 우수하여 항비만 효과를 발휘하기 위한 여러 용도로 다양하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원 KCTC13653BP 20181002

<110> Industry University Cooperation Foundation Chosun University <120> METHOD FOR PREPARING FERMENTED RICE BRAN BY USING WEISSELLA KOREENSIS AND FERMENTED RICE BRAN PREPARED THEREBY <130> CDP20190912 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1460 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Weissella koreensis DB1 <400> 1 aatacatgca agtcgaacgc attgtggttg aaatgatatg aagaacttgt tcagatttga 60 ttttcaacat tgcaatgagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggaaacc tacctcttag 120 caggggataa catttggaaa caaatgctaa taccgtataa taattaaaac cgcatggttt 180 tagtttaaaa gatggtcttg ctatcactaa gagatggtcc cgcggtgtat tagttagttg 240 gtgaggtaat ggctcaccaa gacaatgata catagccgag ttgagagact gaccggccac 300 aatgggactg agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360 tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgtgtgatga agggtttcgg ctcgtaaaac 420 actgttgtaa gagaagaatg acattgagag taactgttca atgtgtgacg gtatcttacc 480 agaaaggaac ggctaaatac gtgccagcag ccgcggtaat acgtatgttc caagcgttat 540 ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag acggttattt aagtctgaag tgaaagccct 600 cggctcaacc gaggaattgc tttggaaact ggataacttg agtgcagtag aggaaagtgg 660 aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720 ctttctggac tgtaactgac gttgaggctc gaaagtgtgg gtagcaaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccacactgta aacgatgagt gctagttgtt cgagggtttc cgcccttgag 840 tgacgaagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900 aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg accactccag agatggagct ttcccttcgg 1020 ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttattgtta gttgccagca tttagttggg cactctagca 1140 agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggcg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggca agtacaacga gtcgccaacc cgcgagggtg 1260 cgcaaatctc ttaaagcttg tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag 1320 tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggtcttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgagg taacctttta 1440 ttaggagcca gccgcctaag 1460

Claims (15)

1. 물에 미강을 20%(w/w) 내지 50%(w/w)의 농도로 첨가하고, 아르기닌(Arginine)을 1%(w/v)의 농도로 첨가한 후, 혼합하여 혼합물을 제조하는 발효원물 제조단계;
   상기 혼합물을 121℃의 온도 조건 및 1.1 기압의 압력 조건에서 15분 동안 가열하여 미강을 호화시켜 호화 미강 혼합물을 제조하는 호화 미강 제조단계;
   상기 호화 미강 혼합물에 김치로부터 분리되고, 아르기닌(Arginine)을 시트룰린 및 오르니틴으로 전환시키는 전환능을 가진 웨이셀라 코리엔시스 DB1(Weissella koreensis DB1, KCTC 13653BP) 균주를 첨가하는 균주 첨가 단계;
   상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물을 상기 균주가 첨가된 호화 미강 혼합물의 초기 pH가 pH 6.0 내지 pH 6.5이고, 발효 온도가 30℃인 조건에서 발효하여 미강 발효물을 제조하는 발효 단계; 및
   상기 미강 발효물을 40℃의 온도 조건에서 16시간 동안 열풍 건조하는 미강 발효물건조 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 미강 발효물 제조방법.
2. 제 1 항의 미강 발효물 제조방법으로 제조된 미강 발효물.
3. 제 2 항의 미강 발효물은 미강 발효물 내에 시트룰린 함량이 2,500 mg/kg 내지 3,500 mg/kg이고, 오르니틴 함량이 5,500 mg/kg 내지 10,500 mg/kg인 것을 특징으로 하는 미강 발효물.
4. 제 3 항의 미강 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물은 건강기능성 식품인 것을 특징으로 하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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